用於檢測受體配體模擬物的方法和組合物的製作方法

2023-09-13 10:22:10

專利名稱：用於檢測受體配體模擬物的方法和組合物的製作方法
專利說明用於檢測受體配體模擬物的方法和組合物 發明領域 本發明涉及確定小分子作為受體配體模擬物的效用的方法及其治療性應用。

背景技術：
發現受體配體模擬物的困難。通過激動性或拮抗性受體配體調節生物學功能，其目的通常在於阻斷或緩和活性明顯的生物化學途徑，或者激活或恢復被認為與某種疾病有關或是其病因的途徑。
與往往表現出高特異性生物學活性的內源或生物異源蛋白和抗體不同，小分子的特異性低得多。由於它們的大小有限，小分子與多種不同的靶結合，這可導致不需要的副作用，使得將它們開發成治療有用的藥劑是一種挑戰。例如，為了建立起治療有用的劑量窗、為了發現脫靶效應(off-target effect)以及它們在藥物開發中的牽連，需要進行仔細的臨床前和臨床研究。特別是開發作為蛋白受體配體的功能性模擬物的選擇性小分子，對藥物開發提出了挑戰，因為受體與其天然配體之間的相互作用位點及其區域遠遠超過小分子所提供的相互作用區域(P.Chene，Chem.Med.Chem 2006，1400-411)。在初級生物學篩選中發現的原型分子通常也具有與其它受體相互作用的能力，在細胞水平上是非特異的。
此外，儘管發現作為給定受體/配體相互作用的拮抗劑的小分子是有可能的，但鑑定激動劑被認為更具有挑戰性。因此，對於可以從「混雜的」、與多種靶以不需要的方式結合的分子中辨別出選擇性和功能性小分子受體配體模擬物的方法，存在著明顯的需求。
發現有用的聯合療法的困難。儘管在許多疾病、特別是腫瘤的治療中已經取得了顯著的進展，但單一療法的單一藥劑通常仍只能提供有限的益處。這並不令人意外，因為造成疾病的分子途徑通常是很多的，並且在患者個體之間或同一患者的細胞亞克隆之間是不定的。因此，在大多數患者中，集中於單一靶的治療通常不可能提供持久的疾病控制或治療(J.E.Dancey和H.X.Chen，Nat.Rev.Drug Discov.2006，5649-659)。運用藥物組合提供了明確的治療原則，特別是在癌症治療中，為患者提供了更好的治療和益處。除了少數例外，可用於癌症的藥物療法使用活性已知和毒性重疊譜最小的藥劑組合，以它們的最適劑量並按照與正常細胞恢復相容的計劃。那些化療組合中僅有少數進行了嚴格的臨床前評價，這些組合中是協同性的則更少，——即它們的組合提供的益處比它們個體活性的累加效應更大。當前的許多聯合療法首先在臨床研究中進行嘗試，——採用以人類患者的試錯法(trial-and-error approach)來進行。
由於缺少鑑定的手段，在臨床開發中這種針對聯合治療的主要是經驗性的方法被證明是有效的，腫瘤可能對個體藥劑的組合敏感由於體外和體內疾病模型的固有局限性，實驗室的體外和體內實驗與人類臨床研究的結果之間明顯缺乏關聯性。此外，永久性的癌細胞系，例如由ATCC這樣的組織提供的或國立癌症研究院(National CancerInstitute)使用的癌細胞系，在與它們所來源的原始腫瘤進行比較時，顯示出在生物學性質和化學敏感性模式的顯著改變。兩項研究顯示，細胞毒性藥劑在國立癌症研究院的60種細胞系組的體外測試、體內異體移植物和臨床功效之間，關聯性有限(J.I.Johnson，Br.J.Cancer 2001，841424-1431；T.Voskoglou-Nomikos等，Clin.Cancer Res.2003，94227-4239)。
其次，還需要方法來提供關於組合療法最佳順序的信息。例如，實驗室研究揭示，EGFR抑制劑吉非替尼與標準的細胞毒性藥劑組合，在紫杉醇之前高劑量「脈衝」給藥，與連續的同時給藥方式相比，體外作用更強(D.B.Solit，Clin.Cancer Res.2005，111983-1989)。
因此，對於合理設計的方法和實驗驗證協同性藥物組合的方法存在著迫切的需求，因為預期它們可以為癌症患者提供更大的和持久的治療益處。
凋亡是通過膜結合受體介導的。被稱為凋亡的程序化細胞死亡，介導了組織穩態的維持，調節從皮膚和胃腸道除去細胞，以及對環境引發物作出響應重塑骨骼。凋亡還通過抑制全身性病毒感染、刪除自身反應性T細胞和B細胞以防止自身免疫、以及消除獲得了潛在致癌性的細胞，來防止疾病。凋亡的調節異常在許多疾病過程中發揮著作用。不適當激活凋亡與神經變性疾病例如帕金森氏病和阿茨海默氏病有關，或者與心肌梗塞後心臟組織再灌注後觀察到的心肌損傷有關。此外，如果在細胞表面上檢測到外源表位，則凋亡可以被免疫系統的自然殺傷(NK)細胞或細胞毒性T淋巴細胞(CTL)選擇性誘導。對凋亡的抗性或細胞經歷凋亡的閾值較高與許多基因的突變有關，例如p53腫瘤抑制基因。在凋亡途徑中有缺陷的過度增殖的細胞可被證明具有存活優勢，導致進一步的惡性發展以及最終成為癌症。
內在的(或線粒體的)和外在的凋亡(或受體介導的)途徑是可能發生凋亡的兩種機制。
在內在途徑中，促凋亡信號傳導的功能性結果是擾亂線粒體膜並將細胞色素c釋放到細胞質中。在這裡，細胞色素c與凋亡蛋白酶活化因子1(APAF1)和失活形式的胱天蛋白酶(caspase)-9形成複合物，命名為凋亡體。該複合物水解腺苷三磷酸以裂解和活化胱天蛋白酶-9。這種起始劑胱天蛋白酶進一步裂解和活化處決者分子胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7。細胞色素c從線粒體中的釋放是凋亡的早期事件，在胱天蛋白酶和內切核酸酶活化之前。細胞色素c的釋放也導致活性氧類別(ROS)的形成。
由外在凋亡途徑誘導的凋亡通過活化細胞表面死亡受體來介導。在配體介導活化死亡受體之後，保守的細胞內死亡結構域吸引了細胞內適配體分子、Fas相關的死亡結構域(FADD)。適配體分子將胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10召集到死亡受體上，形成死亡誘導信號複合物(DISC)，在其中將它們裂解和活化。在某些細胞中，這些起始劑胱天蛋白酶足以裂解和活化終末處決者分子胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7。但是，某些細胞液還需要活化基於線粒體的凋亡系統，以放大死亡受體信號。胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10裂解並活化細胞質促凋亡因子Bcl-2相互作用結構域(BID)，它易位到線粒體中並誘導凋亡起始因子細胞色素c(EK Rowinsky，Clin.Oncol.2005，239394-9407)。死亡受體家族的許多不同受體以及它們的天然配體是已知的(表1) 表1死亡受體及其配體 儘管許多細胞毒性藥劑例如順鉑或阿黴素以及放射療法顯示出活化內在凋亡途徑，但通過外在凋亡途徑定向誘導凋亡代表了尚未開發但新興的破壞癌細胞的治療性策略。通過腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)活化細胞表面受體，導致了對凋亡信號傳導途徑的直接刺激(外在刺激)。直接活化這些受體的分子，例如針對TRAIL或Fas受體(例如CH-11)的激動性單克隆抗體(agonistic monoclonalantibodies)以及重組TRAIL或Fas配體(FasL)，作為可能的單一療法以及作為與現有的化療藥物和其它治療模式的聯合治療的一部分，正在被評估。
TRAIL、TNFβ、FasL以及其它TNF超家族配體證明具有發動凋亡和殺死轉化的細胞、病毒感染的細胞以及慢性活化的T細胞和B細胞的能力(S.R.Wiley等，Immunity 1995，3673-682；P.T.Daniel和P.H.Krammer，J.Immunol.1994，1525624-5632)。
但是，在癌症患者中全身治療性施用重組TNFα(以及在動物研究中類似地施用TRAIL)，導致了嚴重的炎症反應以及直接的肝毒性(A.L.Jones和P.Selby，Cancer.Surv.1989，8817-836)。
一種形式的TRAIL——Apo2L/TRAIL(PRO1762)，目前正在I期臨床試驗中進行研究(A.Almasan和A.Ashkenazi，Cytokine GrowthFactor Rev.2003，14337-348)。
HGS-ETR1(mapatumumab；Human Genome Sciences)，一種靶向TRAIL-R1的完整人激動性單克隆抗體，正在晚期惡性腫瘤患者中進行II期評估。針對TRAIL-R2的完整人單克隆抗體(HGS-ETR2；HumanGenome Sciences)例如HGS-TR2J，也已經進入臨床，目前正處於I期臨床開發中。HGS-ETR2和HGS-TR2J的生理化學和動力學情況略有不同，這保證了二者在臨床中進行探查(R Humphreys等，Ann.Oncol.2004，15iii102，abstr.383PD；R.Humphrey等，Presented at the 16thEORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and CancerTherapeutics(第16屆分子靶和癌症治療的EORTC-NCI-AACR研討會內容)，摘要204，2004年9月28日-10月1日，瑞士日內瓦)。
看來特別有希望的治療策略是將活化外在和內在途徑的藥劑組合起來。因此ETR1或ETR2在體外展現出與順鉑、喜樹鹼、拓撲替康、阿黴素、吉西他濱、FU、長春新鹼或紫杉醇的協同性，甚至在用任何單一藥劑處理時不會進入凋亡的細胞系中也顯示出了活性(E.K.Rowinsky，Clin.Oncol.2005，239394-9407)。
因此，非常希望發現作為FAS受體激動劑的小分子，並且該受體及其激動性抗體CH11將提供一個實例，用於驗證發現本發明的小分子受體配體模擬物的方法。
多藥抗性(MDR)。MDR是有效治療癌症的主要障礙。抗藥的癌症或是本身不可治療的(固有抗性)，或者它們在治療過程中逐漸發展出了對各種各樣抗癌藥劑的抗性(獲得性抗性)。術語MDR被用於描述暴露於單一細胞毒性藥劑的腫瘤細胞發展出對廣範圍的結構和功能不相關的藥物的抗性的能力。已知有許多機製作用於這種現象，包括藥物外排泵的過表達、DNA修復機制的活性增加、藥物靶酶的變化、以及參與藥物脫毒和消除的酶的過表達。因為大多數化療方法最終通過凋亡來引發它們的效能，因此，凋亡控制水平上的變化也提供了另一種可能由此發生藥物抗性的機制。本回顧將集中在某些已經被用於試圖通過操縱異常調節的凋亡途徑來使抗性腫瘤化學致敏的策略。
藥物抗性的機制可由凋亡途徑中的變化所介導決定細胞是經歷凋亡還是繼續通過細胞周期發展要取決於相互作用以調控細胞周期進展的一組複雜的基因和蛋白的相互影響。如果細胞改變了調控細胞受到攻擊、例如化療而產生的信號傳播的蛋白表達，以保護細胞免於凋亡，則能夠出現藥物抗性。儘管凋亡途徑的許多細節仍未被完全了解，但已知有幾種蛋白是該過程的重要調控因子。
小分子原型。為了驗證發現本發明的小分子受體配體模擬物的方法並證明其效用，我們進一步選擇了本技術領域中已經確立的小分子。該分子在本文中被稱為「AP-121」(其它命名是依地福新、ET-18-OCH3、1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼、消旋型1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼，或有時稱為烷基溶血磷脂或ALP)。AP-121是一種醚脂，更準確來說是一種烷基溶血磷脂，具有下面的化學式
AP-121是血小板活化因子(PAF；1-O-烷基-2-乙醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)的合成類似物，一般相信該活化因子參與了多種生理過程，例如炎症、免疫應答、過敏性反應、生殖，並還顯示出在哺乳動物中是有效的抗腫瘤藥劑。
癌症的化療法一般目的在於減緩癌細胞的生長或破壞癌細胞，同時避免附帶損傷到周圍的細胞和組織。因此，最有效的抗癌藥劑是能夠選擇性靶向癌細胞、同時使正常細胞相對不受影響的藥劑。
已知醚脂在體外和動物模型中是有效的抗癌藥劑。對於醚脂對癌細胞的毒性已經提出了幾種作用機制，包括細胞缺少烷基裂解酶。由此導致的醚脂不能代謝使得它們在細胞內積累，從而破壞細胞膜的脂質組織。醚脂作用的其它可能機制包括對細胞內蛋白磷酸化水平的影響和破壞細胞脂類代謝。正常細胞一般具有避免或克服醚脂的潛在毒性作用的手段，而癌細胞不具有。
AP-121看起來顯示出多種生物學活性，包括抑制PI3K-Akt/PKB存活途徑、與蛋白激酶C相互作用、細胞內活化Fas/CD95死亡受體、細胞內酸化作用、促進細胞因子產生、以及改變質膜功能和脂類合成(G.Arthu和R.Bittman，Biochim.Biophys.Acta 1998，139085-102；DBerkovic，Gen.Pharmacol.1998，31511-517)。
已經發現，AP-121的脂質體製劑ELL-12，在較低的和無毒性的劑量安排下，比游離的AP-121更有效對抗白血病、肺癌轉移瘤和黑素瘤(I.Ahmad等，Cancer Res.1997，571915-1921)。
在另一個例子中，在II期試驗中，將AP-121溶解在牛奶中，向晚期非小細胞肺癌患者口服給藥(PDrings等，Onkologie 1992，15375-382)。
具體來說，體外和某些動物數據表明在腫瘤範圍內有非常廣泛的「非特異性」活性，這在已發表的人類試驗中顯然不能得到證明。此外，獲得的某些生物學數據也是矛盾的，這可能是由於分析系統不同，例如使用的細胞系不同，或者實驗條件或參與的科學人員的技能不同。
例如，AP-121已經有描述並作為實驗分子銷售，它在20μg/ml濃度下是HL-60細胞中膜結合的蛋白激酶C(PKC)的活化劑(E.C.Heesbeen等，FEBS Lett.1991，290231-4)。已經發現AP-121與磷酯醯絲氨酸競爭與PKC的調控結構域結合。AP-121也被描述為PKC的抑制劑(L.W.Daniel等，Cancer Res.1995，554844-9)。其他人發現，PKC在中等AP-121濃度下被抑制，但在低和高濃度下被激活(J.D.Aroca等，Eur.J.Biochem.2001，2686369-78)。其他人描述了PKC不參與AP-121在HL-60和K562細胞中的細胞毒性作用(E.C.Heesbeen等，Biochem.Pharmacol.1994，471481-8)。隨著濃度增加到最高為總脂類的30mol％時，AP-121進行性抑制PKCα的活性，高於此濃度後，效應是一種激活。對於PKCε來說，AP-121具有三相效應，在低濃度下激活酶，在稍微高些的濃度下抑制它，然後在較高的濃度下再次激活它(P.Conesa-Zamora等，Biochim.Biophys.Acta 2005，1687110-9)。
還已有描述AP-121抑制Ras和Raf-1之間的結合，這是一種已知的促進腫瘤生長的蛋白相互作用(P.Samadder等，Anticancer Research2003，232291-5)。亞微摩爾劑量的AP-121在A431細胞中誘導已知的抗癌靶表皮生長因子受體(EGFR)的內化，但不激活它，並同時激活MAPK/ERK(G.A.Ruiter等，Int.J.Cancer 2002，102343-50)。在乳腺癌MCF-7和ZR-75-1細胞系中，AP-121減少受體位點的數量而不影響EGF受體的親和性。當以微摩爾濃度(5-25μM)加入時，AP-121以nM劑量(10-500nM)抑制生長因子誘導的MAPK/ERK活化。在A431細胞中MAPK/ERK途徑被AP-121活化而不刺激細胞增殖顯然，在A431細胞中，AP-121(500nM)也引發了EGFR的快速群集和內化(H.Kosano和O.Takatani，Cancer Research 1988，486033-6)。
也已有描述AP-121在MCF-7細胞中抑制了p70S6激酶的磷酸化和活化(G.Arthur等，Anticancer Research 2005，2595-100)。其他人描述了AP-121對Na，K-ATP酶和鈉泵的抑制(K.Oishi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，1571000-6)。A-121對c-Jun NH2-末端激酶的活化和隨後對凋亡的刺激也有描述(C.Gajate等，Mol.Pharmacol.1998，53602-12)。
AP-121對P13K-AKT/PKB途徑的抑制看來是重要的，因為Akt和P13K的活性增加及其負調控因子PTEN中的突變與惡性腫瘤有關並使得細胞對凋亡誘導不敏感性(M.I.Berggren等，Cancer Research 1993，534297-302)。因此，AP-121可以通過胰島素抑制功能性P13K的活化。在AKT的下遊，AKT使SAPK/JNK級聯的激活劑SEK-1失活。因此，用AP-121失活AKT允許促凋亡性SAPK/JNK蛋白活化(參見表2，G.A.Ruiter等，Anticancer Drugs 2003，14167-73)。
表2在人類上皮癌細胞系A431和HeLa中ALP的AP-121、HePC和哌立福新誘導凋亡的ED50值(μM)(三次獨立實驗的平均值±SD)。
AP-121抑制磷脂酶C已有記載，導致蕈毒鹼受體1和阿片受體δ的阻斷，使得AP-121在抗傷害感受中具有潛在的應用(L.F.Horowitz等，J.Gen.Physiol 2005，126243-62)。
AP-121引發的凋亡被磷酸膽鹼胞苷醯轉移酶(CTP)的表達增加所阻止(I.Baburina和S.Jackowski，J.Biol.Chem.1998，2792169-2173)，表明CTP是AP-121的首要靶。
關於抑制鞘氨醇-1-磷酸(S1P)S1P1受體介導抑制T細胞遷移建立了關聯(G.Dorsam等，J.Immunol.2003，1713500-7)。S1P阻止了由TNFα、抗Fas抗體、神經磷脂酶或細胞透性的神經醯胺誘導的神經醯胺水平升高所產生的凋亡標誌。負責其產生的鞘氨醇激酶的上調，可能通過保護細胞免於凋亡而對MDR有貢獻(O Cuvillier等，Nature1996，381800-3)。用抗Fas單克隆抗體(克隆CH-11)處理的Jurkat細胞在3小時內經歷了大量的細胞死亡。Fas連接在Jurkat T細胞中誘導SAPK/JNK活化。Fas連接通過顯著增加胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7的蛋白水解PARP活性，誘導PARP裂解，而S1P顯著降低胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7的活性(OCuvillier等，J.Biol.Chem.，1998，2732910-16)。
Gajate發表了AP-121在脂筏中誘導FAS受體群集的能力，推斷這將導致AP-121誘導凋亡的能力(C.Gajate等，J.Exp.Med.2004，200353-365)。在淋巴細胞和細胞系中也顯示了這種推測的AP-121靶(CGajate和F Mollinedo，Blood 2001，983860-3863)。另一方面，Spiegel及合作者將這些促凋亡性質歸因於細胞色素c從線粒體中的釋放(OCuvillier等，Blood 1999，943583-3582)，而不依賴於FAS受體。AP-121通過胞吞作用內化到腫瘤細胞的脂筏中(A.H.van der Luit等，J.Biol.Chem.2002，27739541；A.H.van der Luit等，J.Biochem.2003，374747)。一旦進入細胞，AP-121開始召集與Fas相關的死亡結構域蛋白、胱天蛋白酶原-8和胱天蛋白酶原-10、c-Jun N-末端激酶和Bid，這些分子對於凋亡的啟動是關鍵的(C Gajate等，Exp.Med.2004，200353)。因此，死亡受體(FAS-R)和線粒體凋亡途徑被廣泛關聯，導致線粒體跨膜電位破壞、活性氧類別產生、胱天蛋白酶-3活化、多(ADP-核糖)聚合酶的裂解以及DNA的片段化(C.Gajate等，Int.J.Cancer 2000，86，208.)。
與所報導的細胞系中低微摩爾範圍內的AP-121生物學活性相比，迄今為止描述的、在我們當前了解範圍內的最強有力的效應是60納摩爾對HMEC1內皮細胞的抗血管生成活性(D.Candal，Cancer Chemother.Pharmacol.1994，34175-178)。
根據這些關於各種不同細胞和細胞系的生物學數據，顯然需要能夠發現AP-121的生物學效應的方法，這種方法如果存在的話，對於具體的治療指徵來說有治療相關性。
儘管其生物學效應具有不確定性，US 5,149,527仍描述了含有醚脂作為適合藥劑的免疫增強性組合物，該藥劑在以前接受過破壞腫瘤並刺激細胞毒性巨噬細胞的成功治療的受試者中導致腫瘤壞死和/或消退。藥劑將在之前的療法已經產生了對腫瘤具有特異細胞毒性的巨噬細胞形成之時施用。但是，沒有提供支持AP-121的這種活性的數據。
AP-121作為可用於治療癌症的化合物已有記載(DE 02 619 686)，通過給哺乳動物施用藥物有效量的AP-121以減小腫瘤的大小，也已經描述在US 6,514,519和EP 1 079 838中，特別適合治療原發和繼發惡性腦腫瘤。
US 6,235,729涉及減緩或抑制腫瘤浸潤和轉移來抑制腫瘤發展的方法，包括給所述個體施用藥物有效劑量的磷脂酶C抑制劑例如AP-121的步驟。優選，該磷脂酶C抑制劑減少磷脂酶Cγ。一般來說，這樣的磷脂酶C抑制劑將以大約0.1mg/kg到大約2mg/kg的劑量給藥。儘管沒有提供數據來支持這種主張，但報導的劑量將不會反映在其它體外試驗中發現的AP-121的低活性。
已經報導AP-121通過抑制活化的CD4+或CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，可用於治療多發性硬化症(MS；EP 2 363 901，DE 03 530767)或類風溼性關節炎(RA)或強直性脊柱炎(AS；EP 474 712)。
發明概述 本發明包含了確定小分子是否是治療有用的受體配體功能性模擬物的方法。本發明還涉及治療有用的療法和診斷方法，以及含有單獨的或與其它治療有用的化合物組合的AP-121的組合物，以及確立它們治療效用的方法。
根據本發明，功能性受體配體例如內源的或人工製造的蛋白、肽或抗體的生物學效應，是針對一組至少兩種不同的原代人類細胞或永久的細胞系單獨或與一組其它的化合物組合起來進行測量的，給出了生物學結果的一個數組。推定的小分子配體模擬物，也平行地針對同樣一組至少兩種不同的原代人類細胞或永久的細胞系單獨或與同樣一組其它化合物組合起來測量，給出生物學結果的第二個數組。當通過常用的數學算法計算時，如果這兩個數組的相似性高於預定的閾值，則小分子可以被認為是真正的受體配體模擬物，可以用作治療藥劑。此外，本發明的方法還投送了有治療效用的小分子組合，所述組合在調節所述受體可以提供治療效應的疾病中可發揮協同作用。
發明詳述 本發明涉及新的方法，用於確定小分子是否是受體配體的功能性和治療有用的模擬物。
本文使用的「小分子」特別包括肽、蛋白、核酸分子、碳水化合物、脂類以及低分子量化合物。
可用於本發明的肽和蛋白包括天然存在的以及人工設計的分子，例如通過重組DNA技術或通過化學合成。它們的最終長度通常為800個胺基酸，優選為最終600個胺基酸，更優選為最終400個胺基酸，並最優選為最終200個胺基酸。
能夠用於本發明的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸類似物。這樣的核酸可以是任何長度的，並可以是單鏈或雙鏈分子。
可以用於本發明的碳水化合物的例子包括單糖例如葡萄糖或果糖，二糖例如乳糖或蔗糖，以及寡糖和多糖例如澱粉，其中優選為單糖。
可以用於本發明的脂類的例子包括脂肪酸、甘油三酯、鞘脂和磷脂。在本發明的優選實施方案中，小分子選自醚脂，優選為烷基溶血磷脂，其中AP-121是特別優選的。
本文中使用的術語「低分子量化合物」是指分子，優選有機分子，含有至少兩個碳原子，但是優選不超過七個碳鍵，分子量在100到2000道爾頓之間，優選在100到1000道爾頓之間，並且任選包含一個或兩個金屬原子。這樣的分子的例子特別包括咪唑、吲哚、異噁唑、噁唑、吡啶、嘧啶和噻唑。
作為本發明的方法的第一步，必須篩選治療相關的受體靶以及執行調節效應的適當配體，其中這裡使用的術語「調節效應」，包括對選定受體的下遊信號傳導的拮抗(即阻斷或抑制)和激動(即激活)效應。該選定的配體可以是選定的受體的內源配體或是已知表現出這種效應的任何其它蛋白或肽，例如抗體。該配體不需要表現出可用作藥物類分子的性質，相反，重要的是配體選擇性表現其效應，並且不具有使它難以或不可能用作基於細胞的篩選工具的性質。此外，作為推定的受體配體模擬物的小分子，必須與一組至少一種、優選至少兩種、更優選至少三種已知表現出生物學活性的其它分子一起進行篩選。
在本方法的第二步中，必須篩選一組至少兩種、但是更優選至少三種不同人類來源的原代細胞和/或永久的、人類來源的細胞系。優選這些細胞系將以不同的水平、和/或具有不同的突變狀態和/或在細胞膜中的不同濃度表達選定的受體，確保從測量到的生物學效應中可以推演出生物學效應與這些受體水平之間的相關性。
在第三步中，測量選定的各種化合物的生物學效應。按照本發明，在術語「生物學效應」之下，可以使用多種基於細胞的生物學分析方法來測量這類效應。例如，可以測量基因表達例如RT-PCR、蛋白水平檢測、或者更複雜的生物學事件例如抑制增殖、集落形成、血管形成或凋亡，但不限於此。
本發明的「生物學效應」也可以是通過重複實驗、使用不同的濃度或涉及不同性質的分析方法的幾個生物學分析的概括或平均的結果。因此，生物學效應可以是50％抑制濃度(IC50)、有效劑量(ED50)、組合指數(CI)等。根據本發明的方法，化合物現在以下面的方式進行測量，獲得生物學結果的兩個數組首先，測量受體配體對每個個體細胞系(從1到N，其中N是不同細胞的數量)的生物學效應，優選通過重複同樣的實驗多次以獲得可靠的結果。接下來，將受體配體以預定的比率與每一種其它個體化合物混合，獲得兩種化合物的混合物。
這些兩種化合物的混合物也可以含有同樣的配體和化合物的混合物，但是比率不同(1到M，其中M是不同化合物混合物的數量)。然後，測量每種混合物對每種個體細胞系(從1到N，其中N是不同細胞的數量)的生物學效應，優選通過重複同樣的實驗多次以獲得可靠的結果。結果，我們獲得了生物學結果的二維數組(A1)。
在第四步中，用推定的小分子代替受體配體重複第三步，這些小分子也以同樣的方式，針對同一組至少兩種不同的原代人類細胞或永久細胞系單獨和與同一組其它化合物的組合來測定，以給出生物學結果的第二個二維數組(A2)。出於說明的目的，數組A1和A2可以採取下面的格式 A1 A2 在本發明方法的第五步中，將數組A1和A2歸一化，使得每個生物學效應被表示成它與每種不同細胞中觀察到的最大生物學效應的比率，產生衍生的數組B1和B2。
這些歸一化的二維數組B1和B2可以採取下面的格式 B1 B2 在本發明方法的第六步中，建立了數組B1和B2之間的相似性。有許多常用的數學算法可以計算這種相似性，這些算法不是本發明的一部分，但是可以從任何現有技術的數學教科書或已建立的用於評估基因表達情況相似性的軟體工具得到。還可以使用不同的相似性指數來計算這種相似性，例如在(J.D.Holliday等，Combinatorial Chemistryand High Throughput Screening(組合化學和高通量篩選)2002，5155-166)中描述的Cosine、Dice、Euclid、Forbes Hamman、Jaccard、Kulczynski、Manhattan、Pearson、Rogers-Tanimoto、Russel-Rao、Simpson、Tanimoto或Yule係數。
作為該計算的中間步驟，我們可以獲得一維的相似性數組(S)，從中可以確定針對每種細胞系的相似性 如果計算出的相似性高於預定的閾值，小分子可以被認為是真正的受體配體模擬物，可用作治療藥劑。該預定的閾值可以通過測量已知具有生物學活性但不是受體配體的小分子來確定。
此外，本發明的方法還投送了有治療效用的小分子組合，所述組合在調節受體來提供治療效應的疾病中可以協同發揮作用。
本發明還涉及治療有用的療法、診斷方法、以及含有單獨的或與其它治療有用的化合物組合的AP-121作為CH-11FAS受體配體模擬物的組合物，以及建立它們的治療效用的方法。優選，本發明的組合物是可以口服應用的藥物劑型，特別優選固體劑型，例如片劑、丸劑、膠囊和顆粒。此外，並且與CH-11不同，AP-121與CH-11或類似的抗體相比，給患者提供了治療益處，因為它有口服生物利用性且耐受性好(P.Drings等，Onkologie 1992，15375-382)。
下面的圖和實施例對本發明進行了進一步的描述，它們的目的僅僅是說明本發明的具體實施方案，而不應該被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。在下面的試驗中使用的材料或是可以商購的，或是本技術領域的專業人員容易從可商購的材料製備的。
附圖

圖1描述了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼(終濃度10μM)、(電離)輻射(吸收劑量為5Gray單位，表示為「RT」)及其組合對LNCaP雄激素敏感性人類前列腺腺癌細胞的程序化細胞死亡(凋亡)和存活率的體外效應。凋亡使用Apo-ONETM同源胱天蛋白酶-3/7分析，Promega，Inc.，Madison，WI，USA，按照製造商的說明書來測定。活的癌細胞的百分率所記載的錐蟲藍染料排斥法來估算(Freshney，R.I.(1994)《動物細胞培養基本技術手冊》第三版(Culture of AnimalCellsA Manual of Basic Technique.3rd Ed.)Wiley-Liss.New York.USA)。將細胞在1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼給藥後6小時(圖1A)、給藥同時(圖1B)和給藥前6小時(圖1C)暴露於輻射。胱天蛋白酶分析在暴露於輻射後12小時進行。顯示的相應數據代表了兩次獨立實驗的平均值。
圖2描述了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼(以30mg/kg體重/天腹膜內給藥15天；圖2A)、(電離)輻射(吸收劑量為5Gray單位，在第7天施用；圖2C)及其組合(圖2B)對原位生長在裸鼠(7隻小鼠/組)前列腺中的LNCaP細胞的體內效應。腫瘤的生長通過使用可商購的測試試劑盒測定前列腺特異性抗原(PSA)的血清水平和通過磁共振成像測定腫瘤體積來評估。
實施例和實驗步驟 實施例1篩選步驟 為了證實方法的實踐應用性，作為一個例子，我們選擇了FAS受體來尋找其激活性小配體，激動性抗體CH-11作為適合的受體配體，AP-121作為推定的CH-11模擬物。已知藥物喜樹鹼、替莫唑胺、阿黴素和特羅凱被選作一組用於組合測量的其它化合物。
作為生物學測試組，我們選擇了腦腫瘤細胞系U87MG、A172、LN-18、LN-229、U118MG和T98G，它們在p53和PTEN中有不同水平的突變以及FAS受體表達 在大多數膠質母細胞瘤細胞中鑑定到了Fas死亡受體，其表達水平與腫瘤的惡性級別相對應(O Tachibana等，Cancer Res.1995，555528-30)。在高級別星形細胞瘤中，凋亡和存活率與腫瘤的Fas(APO-1/CD95)表達相關(Frankel等，Neurooncol.2002，5927-34)。
Fas受體、Fas配體(FasL)、Bcl-2和TGFh2的蛋白表達與初發和復發人類膠質瘤的存活率有關(R.J.Strege等，J.Neurooncol.2004，6729-39)。在惡性膠質腫瘤和細胞系中已經描述有Fas和Fas配體的共表達(N.Husain等，Acta Neuropathol.(Berl)1998，95287-90)。
但是，因為大部分膠質母細胞瘤細胞對Fas配體誘導的凋亡有抗性，因此在膠質瘤中利用死亡誘導的途徑需要通過其它方法致敏離體小兒腦腫瘤表達Fas(CD95)和FasL(CD95L)，並對凋亡誘導有抗性(C.D.Riffkin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，9614871-14876)。對於患有顱內惡性膠質瘤的大鼠來說，腫瘤Fas(APO-1/CD95)的上調導致凋亡和存活時間增加(B.Frankel等，Neurosurgery 2001，49168-75)。
活化性人類抗Fas抗體克隆CH-11來自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY，USA(目錄號#05-201))小鼠免疫親和純化的IgM；該抗體識別Fas(43kD)，並對表達Fas的人類細胞具有細胞裂解活性。用編碼人類FasL的cDNA轉染的鼠類WR19L和L929細胞對抗體作出響應，經歷凋亡。該抗體不識別TNF，不與小鼠FasL發生交叉反應。24小時後，86％的人類Jurkat細胞被殺死。
在一篇研討會論文中(A Algeciras-Schimnich等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，10011445-50)，人類細胞系如果可溶性FasL是細胞毒性的話就被分類為II型，如果不是細胞毒性的話被分類為I型。但是，與可溶性FasL不同的CH-11對某些II型細胞也具有細胞毒性。FasL和CH-11均能夠對細胞發揮協同活性。
因此，我們得出結論，在腫瘤細胞對內源FasL完全不敏感或不夠敏感的情況下，或者當患病組織中沒有表達足夠FasL的情況下，發現作為CH-11模擬物的小分子可能是有治療用途的。
實施例2細胞系和試劑 U-118MG(膠質母細胞瘤/星形細胞瘤，p53突變，PTEN突變)、T98G(多形性膠質母細胞瘤，p53突變，PTEN突變)、A172(膠質母細胞瘤，p53野生型，PTEN突變)和U87MG(膠質母細胞瘤/星形細胞瘤，p53野生型，PTEN突變)從ATCC購買。
按照ATCC的推薦，將U-118MG和A172在添加有10％FBS和P/S的DMEM培養基中溫育，將T98G和U87MG在添加有0.1mM非必需胺基酸溶液(Gibco)、10％FBS和P/S的MEM培養基中溫育。AP-121用無菌蒸餾水配製成5mM儲液；替莫唑胺(TMZ)(HaoruiPharma-Chem，Inc.，Edison，NJ)用無菌過濾的DMSO配製成100mM；阿黴素(ADR)(Sigma)用無菌蒸餾水配製成1mM；喜樹鹼(CTP)(Sigma)用0.1N NaOH配製成10mM的溶液；特羅凱(蛋白激酶，德國)用無菌DMSO配製成5mM溶液。所有化合物儲液保存在-20℃。
實施例3WST-1增殖分析 將2000個細胞鋪於96孔平底板的每個孔中，在37℃和5％CO2下溫育過夜。通過在3個對照孔中加入7.5μM的WST-1試劑(RocheApplied Sciences，德國)，並使用SpectraMax250讀板器分別測量在650nm和450nm處的吸光度，從而對鋪板細胞的生長進行測定。如果OD650-OD450值高於0.5，可以將板的剩餘孔用於與AP-121、其它藥劑或溶劑對照溫育96小時。
溫育後，將WST-1試劑加入到孔中，按前述計算OD650-OD450值。對於每種條件分析6個孔，並確定標準偏差所有實驗至少獨立進行三次。在闡明了每種化合物的個體IC50值後，使用AP-121和化療藥劑以它們的IC50比率進行同時組合處理；組合指數(CI)通過Calcusyn軟體包(Biosoft，Ferguson，MO)確定。數據通過計算組合指數(CI)的平均值來評估，其中分別是CI＜0.3表示強協同效應，0.3＜CI＜0.7表示協同效應，0.7＜CI＜0.9表示中等協同效應，0.9＜CI＜1表示累加效應，CI＞1表示拮抗效應。
為了進行AP-121細胞增殖的藥物組合測量，測定了每種藥物的ED50。在組合指數測量中使用了每種藥物的6個不同濃度，並與+/-細胞比較，並與不含化合物的對照比較。每種組合在兩個不同時間點(24和96小時)重複6次，上述每個實驗重複3次，以獲得有效的結果。
例如，下面顯示了一個這樣的測量，使用了U118細胞系以及AP-121與替莫唑胺(TMZ)的混合物，測量的是450nm與650nm的光吸收差值。上面兩行表示在6種不同比率中的AP-121或TMZ的微摩爾濃度，行A含有培養基和化合物但沒有添加細胞，行B到G中加入了細胞和相應的化合物混合物，行H1-H3含有細胞但不含化合物混合物，加入水代替化合物混合物，H4-H6與H1-H3相同，只是水中含有1％DMSO，WST試劑被加入到除了H1-H3之外的所有孔中。

從這個實驗，以及以前測定的每種個體化合物對每個細胞系的ED50，可以使用Calcusyn程序計算出組合指數，顯示在下面對於每種化合物混合物和細胞系的實驗匯總中。
實驗匯總下面僅僅描述了從全部實驗中選出的一些數據。
實施例4AP-121組合指數(CI)





實施例5CH-11組合指數


在進一步分析中，對於使用的不同AP-121組合測定了下面的IC50(μM)值。
為了計算IC50值，給相應細胞系施用的AP-121組合如下 U87MG組合 A172組合 LN-18組合 LN-229組合 U118MG組合 T98G組合 總結相對於使用細胞的突變狀態來說AP-121與其它化合物的協同性 AP121-組合 p53 PTEN細胞系 1 協同/累加 野生型 突變型 U87MG，A172 2 協同/累加/拮抗 突變型 突變型 U118MG，T98G 3 拮抗突變型 野生型 LN229，LN18 實施例6、受體配體和小分子的生物學ED50數據的數組 從這些數據，使用AP-121和相應的化合物混合物的各自ED50數據，可以得出下面的數據數組A2和A1 對於CH-11來說 因此，計算了歸一化的數組B2 以及B1 從B1和B2，可以通過將每種細胞的每種化合物或化合物混合物的相似性值進行簡單的平均，計算出相似性數組S 其中相似性值為1.00對應於可能的最高相似性，0.00對應於生物活性可能的最低重疊。
總的來說，實施例6的數據證實了通過使用本發明的方法，以特異性針對Fas受體CH-11的激動性抗體作為選擇性受體配體，AP-121作為小分子推定受體配體模擬物，以及在相應化合物混合物中的幾種其它的化合物，可以顯示出AP-121的生物學效應與CH-11所執行的效應相似。
同樣的評估方法也可用於將實施例4和5的組合指數數組代替ED50數組作為生物學效應，由此得出了CH-11和AP-121之間大約0.6的高相似性值。
此外，在所有三種細胞系中，觀察到了與替莫唑胺的強協同效應，替莫唑胺是目前對多形性膠質母細胞瘤和間變型星形細胞瘤的標準治療。
實施例7 使用實施例4和5中概述的步驟，在非小細胞肺癌細胞系中也觀察到了順鉑(DDP)/AP-121和吉西他濱(GMZ)/AP-121的強烈協同效應。DDP和GMZ都購自Sigma-aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA。使用了下列細胞系A549(FAS陰性)、NCI-H460(FAS陽性)和HCC827(FAS陽性)，它們都從ATTC，Rockville，MD，USA獲得。



實施例8 已知前列腺癌細胞系表達FAS受體，它們中的某些對FAS不敏感(OW Rokhlin等，Cancer Res.1997，571758-68)。LNCaP是對輻射敏感性降低的前列腺癌細胞系，而激動性FAS抗體CH-11使細胞對輻射誘導的凋亡敏感(K.Kimura和E.P.Gelmann，Cell Death andDifferentiation 2002，9972-980；也參見下面的實施例)。因此，我們通過將LNCaP細胞注射到小鼠的前列腺中進行了動物實驗，在腫瘤生長後，應用0-30mg/kg的不同劑量AP-121腹膜內注射，同時進行輻射。
在治療的動物中，觀察到了劑量依賴性效應，在治療後幾天，PSA(前列腺特異性抗原)水平降低，在治療後一周，腫瘤尺寸縮小，這顯示了AP-121在治療相關性的體內實驗中模擬激動性抗體CH-11的生物學效應的有效性。
實施例91-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼在前列腺癌治療中的效應 前列腺癌是一種在男性生殖系統腺體——前列腺中發生的癌症。前列腺癌最通常是通過體檢或通過篩查性血檢例如PSA(前列腺特異性抗原)檢驗中發現的。PSA檢驗測量血液中前列腺特異性抗原的水平，這是一種類似激肽釋放酶的絲氨酸蛋白酶。它的正常功能是在射精後液化凝膠狀的精液，允許精子更容易地通過子宮頸。PSA水平高於大約4ng/ml一般認為是發生前列腺癌風險的指徵。但是，PSA不是完善的檢驗，因此應該通過其它分析進行印證，例如檢測尿液中細胞相關的PCA-3mRNA。
局部晚期的或高風險性前列腺癌的兩種最常用療法是放射療法(RT)和雄激素剝奪(AD)，後者是激素療法。
分別研究了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼單獨以及與RT、AD或RT+AD相組合，對前列腺癌細胞的程序化細胞死亡(凋亡)程度和存活的影響。
首先，測量了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼、(電離)輻射及其組合對LNCaP雄激素敏感性人類前列腺腺癌細胞的程序化細胞死亡(凋亡)和存活率的體外效應。LNCaP細胞系是從腺癌的轉移灶建立起來的。細胞用終濃度為10μM的1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼和相當於5Gray單位吸收劑量的(電離)輻射進行處理。
凋亡使用Apo-ONETM同源胱天蛋白酶-3/7分析，Promega，Inc.，Madison，WI，USA，按照製造商的說明書來測定。活腫瘤細胞的百分率按照記載利用錐蟲藍染料排斥法來估算(Freshney，R.I.(1994)《動物細胞的培養基本技術手冊》第三版(Culture of Animal CellsA Manualof Basic Technique.3rd Ed.)Wiley-Liss.New York.USA)。
將細胞在1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼給藥後6小時(圖1A)、給藥同時(圖1B)和給藥前6小時(圖1C)暴露於輻射。胱天蛋白酶分析在暴露於輻射後12小時進行。顯示的相應數據代表了兩次獨立實驗的平均值。
當在將細胞暴露於輻射之前6小時施用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼時，組合治療導致腫瘤細胞的存活率僅僅為大約45％，與此相比，在未處理的對照中為大約85％。因此，在處理過的細胞中，觀察到了凋亡反應的顯著增加(＞2.5倍)(通過胱天蛋白酶-3/7分析測定)。使用輻射或1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼進行單獨處理導致中等水平的存活率，分別為大約75％和大約60％(圖1A)。
在對細胞同時施用輻射和1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼的情況下，測定到的存活率為大約55％，這與單獨化學處理時觀察到的範圍(大約50％)相同。將細胞只暴露於輻射導致存活率為大約80％，與未處理的對照(大約86％)相當。令人吃驚的是，對於單獨和組合處理來說，胱天蛋白酶-3/7分析的結果是相似的(圖1B)。
當在將細胞暴露於輻射之後6小時施用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼時，組合處理導致細胞的存活率為大約40％，與單獨化學處理時觀察到的範圍(大約45％)相同。將細胞只暴露於輻射導致存活率為大約70％。在僅暴露於化學物質的細胞中觀察到的凋亡程度與暴露於組合處理的細胞相比，增加了大約25％。
根據上面的結果，看來似乎在將細胞暴露於輻射之前施用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼，對細胞的存活率和凋亡反應產生最顯著的影響。
在另一種方法中，對LNCaP細胞同時施用10μM 1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼(終濃度；「CHEM」)和(電離)輻射(5Gray單位；「RT」)，但是隨後的溫育時間被延長到24小時。凋亡按照前面的描述使用Apo-ONETM同源胱天蛋白酶-3/7分析進行測定，並表示成相對螢光單位(RFLU)。通過對膜聯蛋白V-PE陽性染色和7-AAD(7-氨基放線菌素D)陰性染色的細胞(都購自BD Biosciences，San Jose，CA，USA)按照已建立的標準方案進行流式細胞術分析，測定了凋亡細胞的百分率。結果總結在下面的表中。數據代表了三次獨立實驗的平均值±SEM。
結果的統計學顯著性使用單向ANOVA、LSD檢驗來計算。*分別與每個單獨的CHEM和RT處理相比，p＜0.0001。
在雄激素不敏感的LNCaP C4-2和LNCaP-Res細胞中，也觀察到了「CHEM+RT」處理的細胞中凋亡增加(數據未顯示)。
接下來，研究了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼給藥(「CHEM」)和雄激素剝奪(「AD」)之間的相互作用。按照本技術領域熟知的確認程序，通過2天的血清木炭吸附，對LNCaP細胞進行雄激素剝奪。加入CHEM至終濃度分別為5μM和10μM。此外，測試了在CHEM給藥之前兩天加入合成雄激素R1881(「R1881」)是否導致了效應的逆轉。
凋亡按照前面的描述使用Apo-ONETM同源胱天蛋白酶-3/7分析進行測定，並表示成相對螢光單位(RFLU)。凋亡細胞的百分率按照前面的描述，通過膜聯蛋白V-PE/7-AAD染色進行測定。胱天蛋白酶-3/7分析和膜聯蛋白染色在CHEM處理後22小時進行。結果概述在下面的表中。
從上面的結果可以明顯看出，對剝奪了雄激素的LNCaP細胞使用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼，導致了凋亡反應的劑量依賴性顯著增加。此外，該效應不能通過在1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼處理之前在培養基中加入合成的雄激素來逆轉。
此外，在初步研究中，研究了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼、(電離)輻射及其組合對裸鼠(7隻小鼠/組)前列腺中原位生長的LNCaP細胞的體內效應。
1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸膽鹼以30mg/kg體重/天的劑量腹膜內給藥15天(圖2A；使用不同的給藥途徑例如口服或管飼法的研究目前正在進行中)。對應於5Gray單位吸收劑量的(電離)輻射在第7天施用(圖2B)。組合處理描述在圖2C中。通過使用可商購的測試試劑盒測定血清中前列腺特異性抗原(PSA)的水平，以及通過磁共振成像測量腫瘤的體積，來評估腫瘤的生長。
可以看到，組合處理與任一單獨處理(「PBS」代表磷酸鹽緩衝鹽水)相比，導致了PSA血清水平的顯著降低，證明了體外結果也可以轉移到體內環境中。
在這裡說明性描述的本發明，可以在不存在本文沒有具體公開的任何成分、限制的情況下，恰當地實施。因此，例如術語「包含」、「包括」、「含有」等應該被廣義和不加限制地理解。此外，本文使用的術語和表述是用作描述的術語而不是限制的，這些術語和表述的使用並不打算排除所顯示和描述的特點或其部分的任何等價物，但是，應該認識到，在要求權利的本發明範圍內可能有各種不同的修改。因此，應該理解，儘管本發明已經被優選的實施方案和任選特徵進行了具體的公開，但本技術領域的專業人員可以對發明進行其中體現了本文描述的特點的修改和改變，這些修改和改變被認為處於本發明的範圍之內。
所有本文引用和參考的文獻包括本文或本文參考的任何文獻中提到任何產品的任何製造商指示、說明、產品說明書以及產品表單，在此引為參考，並可用於本發明的實踐中。本申請中任何文獻的引用或鑑別並非承認這些文獻可用作本發明的現有技術。
在本文中對本發明進行了廣義和一般性的描述。每個屬類公開事物範圍內的較窄的物類和亞屬類分組，也構成了本發明的部分。這包括本發明的一般性說明帶有從屬類中除去任何主題的限制性條件或負性限制，而不論被除去的物質是否在本文中被具體列舉了。
其它的實施方案在下面的權利要求書內。此外，在根據馬庫什(Markush)組描述本發明的特點或方面的情況下，本技術領域的專業人員將會認識到，本發明也因此可以按照馬庫什組的任何個體成員或成員亞組進行描述。
權利要求
1.確定小分子是否是細胞受體的蛋白或肽配體的功能性替代物並提供所述小分子在治療該受體的調節將產生治療效果的疾病中是治療有用的藥劑的方法，所述方法包括測量受體配體和小分子對一組至少3種不同的永久細胞系和/或原代細胞的效應，而這兩種化合物對該細胞組的生物學效應在性質上是相似的，並與該組的相應細胞中受體的存在數量相關聯。
2.權利要求1的方法，其中小分子和蛋白或肽受體配體對細胞的生物學效應被單獨和組合地進行測量。
3.權利要求1或2的方法，其中小分子和蛋白或肽受體配體的生物學效應在至少一種其它化合物的存在下進行測量，其中至少一種其它化合物選自蛋白、肽或小分子。
4.權利要求3的方法，其中小分子和蛋白或肽受體配體、以及它們與其它化合物或其它化合物組的組合的生物學效應的相似性是相似的。
5.權利要求4的方法，其中被測量的化合物的生物學效應的相似性包括至少三種細胞系和至少三種化合物的生物學數據矩陣，這些生物學數據被單獨和/或與兩種化合物組合和/或與三種以上的化合物組合測定，小分子與蛋白或肽受體配體之間的相似性通過已建立的數學方法從該數據矩陣計算。
6.權利要求5的方法，其中小分子和受體配體的相似性從生物學數據矩陣計算，並大於合理的閾值，該閾值將隨機的特定組合與治療有用的化合物和/或化合物組合區分開來。
7.權利要求3的方法，用於確定小分子與其它化合物之一的組合是否產生協同性生物學效應。
8.權利要求1到7任一項的方法，其中所述小分子是磷脂，特別是AP-121。
9.權利要求1到7任一項的方法，其中所述受體配體是蛋白或肽，選自激動性FAS抗體或FAS結合蛋白，並且目標受體是FAS受體。
10.權利要求1的方法，其中小分子被鑑定為FAS受體的激活劑，包括測量FAS受體蛋白或肽配體和小分子二者對具有不同FAS受體表達水平的一組至少三種不同的永久性細胞系和/或原代細胞的效應，並且這兩種化合物對該細胞組的生物學效應在性質上是相似的，並與組的相應細胞中FAS受體的存在數量直接相關聯。
11.權利要求10的方法，其中小分子和FAS受體蛋白或肽配體二者的生物學效應各自被單獨和與至少一種其它化合物組合進行測量，其它化合物是蛋白、肽或其它小分子。
12.權利要求11的方法，其中小分子和FAS受體配體二者的生物學效應各自被單獨和與至少兩種其它化合物的組組合進行測量，其它化合物是蛋白、肽或小分子。
13.權利要求11或12的方法，其中小分子是AP-121，而其它的化合物或化合物組選自一種或多種抗腫瘤藥劑，其中抗腫瘤藥劑選自16-氮雜-埃博黴素B、阿地白介素、氨磷汀、Aranose、貝伐單抗、鹽酸平陽黴素、博萊黴素、BMS-184476、硼替佐米、骨化三醇、喜樹鹼、卡奈替尼、Canfosfamide、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、頭孢克肟、頭孢曲松、塞來昔布、西莫白介素、西妥昔單抗、環孢菌素、順鉑、氯屈膦酸、環磷醯胺、阿糖胞苷、達沙替尼、Deoxorubicin、脫氧埃博黴素B、己烯雌酚、氟替康、多烯紫衫醇、多柔比星、依達曲沙、乙丙昔羅、EKB-569、表柔比星、依帕珠單抗、埃羅替尼、依託泊苷、依喜替康、氟達拉濱、氟代尿嘧啶、亞葉酸、加柔比星、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗、Gimatecan、葡磷醯胺、格拉司瓊、高三尖杉酯鹼、透明質酸、伊班膦酸鹽、替伊莫單抗、異環磷醯胺、伊馬替尼、α-幹擾素、α-2a幹擾素、α-2b幹擾素、伊立替康、異黃酮素、異維甲酸、伊沙匹隆、酮康唑、拉帕替尼、來氟米特、雷諾格拉斯蒂姆、亞葉酸、來昔決南、利奈唑酮、洛美曲索、勒託替康、MEN10755、美法侖、甲氨喋呤、絲裂黴素、奈立膦酸鹽、Neuradiab、尼美舒利、硝酸甘油、06-苄基鳥嘌呤、奧美拉唑、Ortataxel、奧沙利鉑、紫杉醇、帕土匹龍、培非司亭、PEG-非格司亭、培利替尼、培美曲塞、噴司他丁、哌立福新、普來曲塞、Polyprenoic acid、奎奴普裡斯汀、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司瓊、視黃酸、利塞膦酸鹽、利妥昔單抗、羅非昔布、魯比特康、S-9788、Sabarubicin、沙格司亭、沙鉑、SN-38、索拉非尼、Suberanilohydroxamic acid、索坦、他莫昔芬、泰素帝、他扎羅汀、替加氟、替莫唑胺、替米利芬、河豚毒素、沙利度胺、替吡法尼、拓撲替康、曲貝替定、曲妥珠單抗、Traszutumab、曲奧舒凡、維甲酸、瓦他拉尼、長春新鹼、長春瑞濱、長春新鹼、ZD-6474、唑來磷酸鹽或Zosuquidar。
14.權利要求11或12的方法，其中小分子是AP-121，而其它的化合物是選自一種或多種抗病毒藥劑的化合物，其中抗病毒藥劑選自3TC、阿巴卡韋、阿德福韋酯、阿昔洛韋、安普那韋、金剛烷胺、Amoxovir、AZT、克拉夫定、地拉韋定、d4T、恩曲他濱、恩替卡韋、泛昔洛韋、更昔洛韋、茚地那韋、拉米夫定、奈非那韋、奈偉拉平、奧司他韋、金剛乙胺、利託那韋、沙奎那維、西卜淨、替比夫定、泰諾福韋、萬乃洛韋、維託西達定、瓦洛他濱或扎那米韋。
15.權利要求13或14的方法，包括測量AP-121與其它化合物之一的組合，並確定對細胞組的協同生物學效應是否受到所述組合的影響。
16.權利要求15中定義的化合物的組合在用於製備治療選自癌症和病毒疾病的醫學病症的藥物中的應用。
17.權利要求16的應用，其中化合物的組合包括AP-121和另一種化合物，該化合物選自替莫唑胺、順鉑、卡鉑、沙鉑、吉西他濱、多柔比星或喜樹鹼。
18.鑑定治療有用的診斷生物標記物以建立AP-121作為FAS受體配體的治療上有用的功能性替代物的效用的方法，包括測量取自人類患者的人類細胞中FAS受體的活性狀態，以及測量AP-121激活所述人類細胞中FAS受體的能力。
19.權利要求18的方法，還包括根據FAS受體的功能活性狀態及其與具體疾病的相關性而選擇AP-121的治療適應症。
20.AP-121作為治療有用的藥劑用於治療疾病，在該疾病中通過內源FAS配體進行的正常FAS受體信號傳導受損，但是FAS受體仍然在介導具體疾病的細胞中表達和存在，其中所述疾病選自多形性膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌和食管癌。
21.AP-121作為治療有用的藥劑用於治療疾病，在該疾病中通過內源FAS配體進行的正常FAS受體信號傳導被破壞，但是FAS受體仍然在介導具體疾病的細胞中表達和存在，其中所述疾病選自多形性膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌和食管癌。
22.權利要求18或19的方法，其中FAS受體在患者細胞中的表達通過RT-PCR測定。
23.權利要求18或19的方法，其中FAS受體在人類細胞膜上的存在通過結合抗體或其它FAS受體結合蛋白或與FAS受體結合的標記肽來測定。
24.化合物的組合，包括AP-121與FAS受體激動性抗體的組合，所述抗體與AP-121協同激活FAS受體。
25.含有權利要求1的小分子的藥物製劑。
26.權利要求25的藥物製劑，其中所述製劑是口服應用的劑型。
27.權利要求25或26的藥物製劑，其中所述製劑是固體劑型。
28.權利要求25到27任一項的藥物製劑，含有AP-121或其對映異構體或非對映異構體或可藥用的鹽，以及至少一種可藥用的賦形劑。
29.權利要求28的藥物固體劑型，其中AP-121以結晶形式存在。
30.權利要求28或29任一項的藥物固體劑型，其中AP-121的量在30到250mg的範圍內。
31.權利要求30的藥物固體劑型，其中AP-121的量在50到150mg的範圍內。
32.權利要求25到31任一項的藥物固體劑型，其中所述劑型選自片劑、丸劑、膠囊和顆粒。
33.權利要求25到32任一項的藥物固體劑型，其中所述劑型是腸溶劑型。
34.治療癌症的方法，包括給患者施用權利要求25到33任一項的藥物製劑，並與放射療法相組合，以增強放射療法的治療益處。
35.權利要求34的方法，其中癌症選自前列腺癌、非小細胞肺癌、腦癌和頭頸癌。
36.權利要求34或35的方法，其中藥物製劑在癌症放療治療之前、期間和/或之後施用。
全文摘要
本發明描述了確定小分子作為蛋白受體配體的功能性替代物(模擬物)的效用的方法。本發明對包括已知蛋白受體配體和其它生物活性分子的化合物的系統組使用細胞生物學分析，以確定所提出的小分子是否是受體配體的功能性等價物，是否單獨或與其它分子組合具有作為藥物相關和有用的藥劑的治療性效用。
文檔編號C12Q1/68GK101606061SQ200780041801
公開日2009年12月16日 申請日期2007年11月9日 優先權日2006年11月10日
發明者弗拉迪米爾·卡扎克, 盧茨·韋伯 申請人:阿爾法普託斯有限公司