一種青蒿素衍生物及其應用的製作方法

2023-09-22 01:33:40 11

專利名稱：：一種青蒿素衍生物及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於藥物化合物領域，涉及一種青蒿素衍生物及其應用，具體涉及青蒿素衍生物作為腫瘤放射增敏藥物的應用。
背景技術：
：世界上惡性腫瘤，心血管疾病和愛滋病是嚴重威脅人類健康的三大疾病。隨著我國居民的生活方式和居家環境的改變，我國的癌症新增病例數逐年在上升，一些惡性腫瘤的發生率和死亡率呈明顯上升趨勢。目前國際上大多數惡性腫瘤還沒有根治的方法，用於腫瘤治療的主要手段有手術、放療、化療、生物治療和其他(內分泌治療、中醫中藥治療、熱療和射頻消融治療)治療等。腫瘤放射治療(簡稱放療)就是用放射線治療癌症。放療已經歷了一個多世紀的發展。在倫琴發現X線、居裡夫人發現鐳之後，很快就分別用於臨床治療惡性腫瘤，直到目前為止放療仍是惡性腫瘤重要的治療方法。大約70%的癌症病人在治療癌症的過程中需要用放療，約有40%的癌症可以用放療根治。有的腫瘤經過放療甚至可以治癒或代替手術治療，如鼻咽癌、食管癌、淋巴瘤等。更多的癌症病人化療後都需要放療加以鞏固和提高療效，即輔助性放療。因此，放療在腫瘤治療中的作用和地位日益突出。放療已成為治療惡性腫瘤的主要手段之一。放療機制包括(1)直接損傷效應，即主要由射線直接作用於有機分子而產生自由基引起DNA分子出現斷裂、交叉；和(2)間接損傷效應，即主要由射線對人體組織內水發生電離，產生自由基，這些自由基再和生物大分子發生作用，導致不可逆損傷。兩種效應有同等的重要性。雖然放療在治療惡性腫瘤中的作用十分顯著已毫無疑問，但也要看到放射反應和損傷的存在。高劑量射線在殺滅癌細胞同時也會嚴重損傷到腫瘤周圍的正常組織和器官，病人就會出現不同程度的不良反應，如血細胞減少、嘔吐、不同組織或器官炎症。因此，怎樣使放療既能最大限度地抑制和殺滅腫瘤細胞，又要儘可能減少或不產生對正常組織和細胞的損傷是制定腫瘤放療計劃的目也是放療研究界重要的課題之一。放射增敏藥物(一種使腫瘤細胞或組織對放療更加敏感的藥物)是近年來腫瘤放療研究領域的一個新的熱點。開發新的抗腫瘤藥物已成為國內外備受關注的熱門的腫瘤研究領域，也符合我國當前的研究方向，對提高我國基礎和應用醫學研究水平具有一定的意義。目前基礎研究和臨床應用對放射增敏概念的使用上有些混亂，把凡是放療的同時使用另一種(或多種)藥物，療效增加了，就說是增敏了。這其實是混淆了放射增敏的學術概念。藥物與射線疊加在一起的生物效應，大致有三種情況，即相加、加強或增敏。相加是兩種生物效應的簡單相加，1+1=2。加強或增強，指的是射線的生物效應為1，藥物的生物效應小於1，兩者相加的最後生物效應為2，1+<1=2。真正學術意義的增敏指的是射線的生物效應為1，藥物的生物效應為0(或很小)，兩者相加後的生物效應為2，1+0=2。因此真正意義上的放射增敏藥，必須具備兩個特點(1)本身無(或幾乎無)對腫瘤的治療作用；(2)僅對腫瘤細胞有增敏作用。一個增敏藥物要通過專家和藥政部門的審評，必須要提供這兩個特徵的研究數據。目前國際上放射增敏藥物領域的研究主要集中在(1)針對腫瘤乏氧細胞的放射增敏劑的研究，如硝基咪唑類放射增敏劑和甘氨雙唑鈉等。因為腫瘤細胞常常是在乏氧環境下；(2)抑制輻射產生的DNA損傷修復的放射增敏劑的研究，如gemcitabine和甘氨雙唑鈉；(3)細胞周期調節的放射增敏劑的研究，如UCN-Ol和caffeine；(4)調節細胞基因的藥物和蛋白抗體應用的研究，如Cos-2抑制劑；(5)針對放療有關腫瘤抑制基因調控等方面的研究，如將p53，pTEN等腫瘤抑制基因直接導入到腫瘤而產生放射增敏的研究；(6)現有腫瘤臨床化療藥物與放療聯合應用所產生放射增敏的研究。如環磷醯胺、氟尿嘧啶、VP-16、博來黴素、絲裂黴素C、(羥基)喜樹鹼、紫杉醇、阿黴素等；和(7)其它的研究，包括光敏劑Photofrin與多種其他卟啉放射增敏效應的研究等等。針對乏氧細胞的放射增敏劑的硝基咪唑類放射增敏劑是目前國內外研究較為成熟並具有發展前景的一類抗腫瘤放射增敏藥。細胞周期調節的抗腫瘤放射增敏藥物UCN-Ol已進入I或II期臨床實驗。由我國第二軍醫大學研究人員研製出的具有自主智慧財產權的國家一類抗癌新藥一甘氨雙唑鈉也發現有非常好的腫瘤放療增敏效果。雖然有些放射增敏劑已經進入I期或者II期臨床試驗中，但在III期臨床隨機對照試驗結果表明，大多數試驗是失敗的，主要原因是毒性(包括神經毒性)限制了使用劑量，致使腫瘤中藥物濃度達不到增敏的足夠濃度。另外，大部分放射增敏藥物研究基本都未能提供增敏作用兩大基本特徵的實驗證據，即單獨使用沒有殺傷細胞的作用和只對腫瘤細胞有增敏作用。因此，即便證明化療藥物與放射治療有相互增加殺傷細胞的作用，最多也只能是一種相加或加強的作用，是否是學術意義的增敏作用尚待提供實驗證據。另外，現有的大多數放射增敏藥物的腫瘤選擇性、腫瘤特異性都不高或對機體有一定的毒性作用，這些都限制了現有放射增敏藥物在臨床上的廣泛應用。因此，尋找腫瘤選擇性高、特異性強和細胞毒性小或無細胞毒性的放射增敏藥物是國內外腫瘤放射治療界的重要課題。
發明內容本發明目的是提供一種青蒿素衍生物。為達到上述目的，本發明採用的技術方案是一種青蒿素衍生物，其化學結構式formulaseeoriginaldocumentpage4上述技術方案中，所述青蒿素衍生物的分子式為C24H41O9N,該晶體易溶在丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯、冰醋酸、乙醇、甲醇、乙醚、石油醚及水；熔點為143-144°C。對上述技術方案中所述青蒿素衍生物的進一步研究發現(1)藥理毒理，根據體外細胞培養實驗數據顯示所述青蒿素衍生物僅僅在高劑量(>250μΜ)顯示出對不同類型的腫瘤細胞(乳癌、結腸癌白血病、淋巴瘤、子宮內膜癌、腦神經瘤、胰腺癌、肝癌、胃癌和食道癌)生長產生抑制作用，即毒性劑量，這些劑量是所述青蒿素衍生物表現出腫瘤細胞放射增敏劑量的240-250倍；同時，對正常細胞而言，劑量的所述青蒿素衍生物的劑量大於560μM時才顯示出細胞生長抑制作用；(2)所述青蒿素衍生物具有廣譜放射增敏作用其SD5tl(增加50%放療敏感度所需增敏劑的濃度)在不同的腫瘤細胞系(46種不同類型的人類腫瘤細胞株，參見表1)大約為0.9-2.5μΜ之間，這些劑量也僅僅是所述青蒿素衍生物細胞毒性劑量的0.1-0.5%；同時，在大多數腫瘤細胞中達到同樣的放射增敏效果，本發明所述青蒿素衍生物所用的劑量僅為青篙素和其它青篙素衍生物(包括青篙琥酯，篙甲醚、蒿乙醚、雙氫青篙素)劑量的1/5；(3)本發明所述青蒿素衍生物可增加X-線輻射誘發的細胞凋亡，並且顯現為劑量依賴型；(4)採用三種不同的腫瘤模型(自發性腫瘤模型，誘發性腫瘤模型和人類腫瘤細胞裸小鼠移植瘤模型)完成了本發明所述青蒿素衍生物的動物體內放療增敏試驗，結果表明本發明所述青蒿素衍生物在這三種動物模型均顯示出非常有效的放療增敏效果。因此，本發明同時要求保護上述青蒿素衍生物在製備腫瘤放射增敏藥物中的應用；本發明同時要求保護一種腫瘤放射增敏藥物，所述腫瘤放射增敏藥物的活性成分為本發明所述青蒿素衍生物。優選的技術方案中，腫瘤放射治療增敏劑中青蒿素衍生物濃度小於等於5μmol/L，進一步優選的技術方案中，腫瘤放射治療增敏劑中青蒿素衍生物濃度為2μmol/L5μmol/L。由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點1、本發明所述青蒿素衍生物作為腫瘤放射增敏劑的活性成分時，在相同的劑量比青蒿素的放療增敏效果又高出5-8倍；使用低劑量的該青蒿素衍生物單獨處理對細胞生長不產生任何的影響，即無任何細胞毒性；並且，更可喜的是，和腫瘤細胞相比較，該青蒿素衍生物需要高出10-15倍以上的劑量才能在正常細胞看到其放射增敏效果，因此，該青蒿素衍生物完全符合放射增敏藥的兩大基本特徵，即單獨使用(正常的作為腫瘤放療增敏劑的劑量)沒有殺傷細胞的作用和只對腫瘤細胞有增敏作用。2、本發明所述青蒿素衍生物具有廣譜的腫瘤放療增敏效果。3、本發明所述青蒿素衍生物的母物青蒿素已經在臨床上應用了幾十年，證實其副作用極少，是一非常安全的藥物。因此，與現有放射增敏藥物相比，本發明所述青蒿素衍生物有著它的非常強的臨床應用優勢。圖1為實施例四中人類乳癌MDA-MB-231細胞放射增敏誘發的細胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為實施例五中自發腫瘤的放療後大小差異圖；圖3為實施例五中化學致癌物DMBA誘發的乳癌放療後大小差異圖4為實施例五中小鼠乳頭狀瘤放療後大小差異圖；圖5為實施例一所得青蒿素衍生物的分子結構圖。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一將0.284g(Immol)雙氫青蒿素溶於20mL無水二氯甲烷中，加入2.OOg(IOmmol)聚乙二醇500，然後在冰鹽浴冷卻下，加入0.Olg(0.07mmol)無水AlCl3(三氯化鋁)，片刻後撤去冰浴，室溫攪拌。用薄板色譜檢測反應進程(GF2矽膠板，香蘭醛，硫酸溶液顯色)。待反應基本完成，反應液依次用飽和碳酸氫鈉溶液(20mLX3)、水(20mLX2)、飽和氯化鈉溶液(20mLX3)洗滌至呈中性，用無水硫酸鎂乾燥，過濾，減壓蒸去溶劑，殘餘油狀物經矽膠柱層析分離(石油醚_乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫)，減壓濃縮後得0.5g無色油狀化合物，進一步提純、結晶得無色晶體(參考張建新，王峻霞，張瑜，等.具有免疫抑制作用的含有聚乙二醇基的青蒿素衍生物的合成.藥學學報，2006，41(1):65-7)。鑑定上述無色晶體，得其分子式為C24H41O9N,該晶體易溶在丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯、冰醋酸、乙醇、甲醇、乙醚、石油醚及水；熔點為143-144°C。該晶體的分子結構式參見圖5。注以下實施例中青增素1號代表實施例一所得青篙素衍生物。實施例二，藥理毒理測試選用了46種不同類型的人類腫瘤細胞株和5種不同類型的人類正常細胞株，按常規細胞培養法進行指數培養。將不同濃度(0-600μM)的實施例一所得青蒿素衍生物加到指數生長的細胞的培養液中。24小時後使用四氮唑鹽[3-(4，5-dimethylthiaZ0l-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]還原法測定細胞的生存。根據上述體外細胞培養實驗數據顯示實施例一所得青蒿素衍生物僅僅在高劑量(>250μΜ)時才顯示出對不同類型的腫瘤細胞生長產生抑制作用，即毒性劑量。但對正常細胞而言，當實施例一所得青蒿素衍生物劑量大於560μM時才顯示出細胞生長抑制作用。實施例三選用了46種不同類型的人類腫瘤細胞株和5種不同類型的人類正常細胞株，按常規細胞培養法進行指數培養。在X-射線照射之前24或者48小時，採用不同濃度(0_150μΜ)的青篙素或其衍生物(包括青篙琥酯，篙甲醚、蒿乙醚、雙氫青篙素和實施例一所得青蒿素衍生物)或其它已報導的放射增敏藥物加到指數生長的細胞的培養液中。相對量的乙醇(用來溶解青篙素和其衍生物)或其它溶劑也直接地加到細胞培養液中作為陰性對照，這些溶劑並不對細胞的放射敏感性產生任何的影響。然後細胞接受不同劑量的X-射線照射(O-IOGy)。24小時後使用四氮唑鹽[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]還原法測定細胞的生存。採用LOGIT法計算增加50%放療敏感度的濃度SD5tl值，試驗至少重複三次，實驗的平均SD5tl作為評價體外放療敏感性的最終評價指標。結果如表1所示，在不同腫瘤細胞和正常細胞，不同放射增敏藥物顯示出不同的放射增敏效果。在所有的檢測的腫瘤細胞，青篙素和這裡檢測的所有青篙素衍生物都顯示出非常好的放射增敏效果，SD5tl明顯比這裡檢查的其它放射增敏藥物的劑量要小。青篙素和這裡檢測的所有青篙素衍生物的放射增敏劑量對細胞都不產生任何的毒性影響。在所有青篙素和青篙素衍生物中，實施例一所得青篙素衍生物的SD5tl劑量最小，換句話說，實施例一所得青篙素衍生物的放射增敏效果是最好。並且，實施例一所得青篙素衍生物表現出廣譜的放射增敏效果，其SD5tl在不同的腫瘤細胞系也比較一致，大約0.9-2.5μM之間。這些劑量也僅僅是實施例一所得青篙素衍生物細胞毒性劑量的0.1-0.5%。同時，在大多數腫瘤細胞中達到同樣的放射增敏效果，實施例一所得青篙素衍生物所用的劑量僅為青篙素和其它青篙素衍生物劑量的1/5。表1.不同放療增敏藥物增敏效果的比較，以SD5tl(增加50%X-射線放療效果的劑量，平均值(μΜ)士平均差，所有實驗至少重複三次)為比較指標tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8NHEK62+4.645+4.545+6.258+4.547+1.382+3.245+3.180+1.450+4.3HUVEC59+7.237+3.646+4.549+6.049+0.773+1.952+4.251+2.639+2.9NHME53+4.523+2.344+5.249+4.363+0.658+2.779±3.967+1.948+3.8注CAF，caffeine；GEM,gemcitabine。HUVEC為正人臍帶靜脈內皮的細胞；NHME為正常人支氣管上皮細胞；HMEC為正常人乳腺上皮細胞；NHEK為正常人表皮角化細胞。實施例四實施例一所得青篙素衍生物增加輻射所誘發的細胞凋亡為了測定實施例一所得青篙素衍生物放射增敏效果是否由於增加輻射所誘發的細胞凋亡。採用DNA瓊脂糖凝膠電泳分析方法，分析了在不同劑量的實施例一所得青篙素衍生物存在條件下，放射增敏誘發的細胞凋亡的結果。如圖1所示，在人類乳癌MDA-MB-231細胞接受5Gyχ-射線輻射前，實施例一所得青篙素衍生物24小時的預處理可以明顯增加隨後X-射線輻射誘發的細胞凋亡，即可見長度不等的DNA片段電泳條帶程度明顯增加。而且，實施例一所得青篙素衍生物增加χ-射線輻射誘發的細胞凋亡也顯現為劑量依賴型。實施例五青增素1號的體內放療增敏試驗體內腫瘤放療增敏試驗結果是評價侯選放療增敏藥物有效性的最重要指標。動物移植性腫瘤試驗是篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型。因此，我們分別採用了三種不同的腫瘤模型(自發性腫瘤模型，誘發性腫瘤模型和人類腫瘤細胞裸小鼠移植瘤模型)完成了實施例一所得青篙素衍生物的動物體內放療增敏試驗以積累臨床前實驗數據為臨床實驗作好準備。試驗結果表明實施例一所得青篙素衍生物在這三種動物模型均顯示出非常有效的放療增敏效果。詳情的結果描述如下。在所有實驗中，同一批實驗中動物的性別都保持相同，且不同批次的實驗都採用同一品系的小鼠。所有實驗至少重複兩次，但絕大多數實驗至少重複了三次。(1)自發性腫瘤模型實驗動物種群中不經有意識的人工實驗處置而自然發生的一類腫瘤稱之為自發性腫瘤。選用自發性腫瘤型為對象進行研究的優點是自發性腫瘤通常比用實驗方法誘發的腫瘤與人類所患的腫瘤更為相似，有利於將動物實驗結果推用到人，但不可能在短時間內獲得大量腫瘤學材料，觀察時間可能較長和實驗用到人，但不可能在短時間內獲得大量腫瘤學材料，觀察時間可能較長和實驗耗費較大。我們採用了自發瘤模型應用最多的C3H小鼠自髮乳癌。C3H小鼠出生後有高的乳腺癌發生率(自發瘤可高達70%)。我們隨機地將小鼠分成四組無處理或照射的對照組，χ-線輻射照射組，青增素1號組和青增素1號加χ-線輻射組。每組10個小鼠。所有動物耳朵將被標記以便跟蹤鼠個體腫瘤的生長歷史。在我們餵養的C3H小鼠大約在九個月可見乳腺部位腫瘤發生。乳腺腫瘤的發展和生長在各個組別中未見明顯的有差異。當腫瘤生長到大小約200mm2後，青增素1號組和青增素1號加x_線輻射組接受一周三次50mg/kg青增素1號靜脈注射共兩周，而無處理或照射的對照組和χ-線輻射照射組則靜脈注射生理鹽水。Χ-線輻射照射組和青增素1號加Χ_線輻射組然後接受一周兩次7Gy的)c-射線定位照射。在照射期間，青增素1號組和青增素1號加χ-線輻射組繼續接受一周三次的50mg/kg青增素1號靜脈注射直至實驗結束(照射後兩周)。實驗結束時，仔細測量每個小鼠的腫瘤大小並記錄。腫瘤大小的測量為每周2-3次，每次測量時稱鼠重。腫瘤體積的計算公式為V=π/eXaXbXc，其中a、b和c分別表示長、寬和高。並採用非參數曼惠特尼U-檢驗辦法來檢驗實驗組之間腫瘤大小的差異。P0.05)。和這些對照組相比，χ-線輻射照射組(ρ<0.01)和青增素1號加χ_線輻射組小鼠腫瘤(P<0.005)則明顯減小，但青增素1號加χ-線輻射組小鼠腫瘤比χ-線輻射照射組小鼠腫瘤更小。青增素1號加χ-線輻射組小鼠腫瘤和X-線輻射照射組小鼠體重並無明顯差別。這些數據表明青增素1號可以明顯增加自發腫瘤的放療敏感性。(2)誘發性腫瘤模型用化學致癌物、射線或病毒均可在各類動物中誘發不同類型的腫瘤。從病因學角度分析，它與人體腫瘤較為近似，故此模型常用於特定的深入研究。現在已有非常成熟的誘發性腫瘤模型，如強化學致癌物二甲基苯蒽(DMBA)和甲基膽蒽可誘髮乳癌。因此我們採用DMBA誘發雌性大鼠乳癌試驗來檢測青增素1號放療增敏效果。2月鼠齡大小的Sprague-Dawley雄鼠，單次灌餵DMBA20微克/總共3次，一周內完成。兩月後乳房部位可見腫瘤生長，成功率為75%左右。大約四月腫瘤長到170mm2大小後按以上自發性腫瘤模型中描述的實驗方案進行分組和處理。每組10個大鼠。實驗結束時，仔細測量每個大鼠的腫瘤大小並記錄。並採用非參數曼惠特尼U-檢驗辦法來檢驗腫瘤大小的差異。正像圖3所示，青增素1號加χ-線輻射組大鼠腫瘤比未處理或青增素1號單獨處理的對照組的腫瘤要明顯小(P<0.005)，也比χ-線輻射照射組的腫瘤(ρ5mm2大小後開始按以上自發性腫瘤模型中描述的實驗方案進行癌塊大小動物分組和處理。每組10個小鼠。實驗結束時，仔細測量每個鼠的腫瘤大小並記錄。並採用非參數曼惠特尼U-檢驗辦法來檢驗腫瘤大小的差異。正像圖4所示的腫瘤生長的大小，青增素1號加χ-線輻射組小鼠的腫瘤是最小的，有些腫瘤都已測定不到了。這些實驗數據表明注射了青增素1號的小鼠乳頭狀瘤對χ-線放療更加敏感，腫瘤生長明顯地受到了抑制。權利要求一種青蒿素衍生物，其特徵在於，所述青蒿素衍生物化學結構式為FSA00000125142300011.tif2.權利要求1所述青蒿素衍生物在製備腫瘤放射增敏藥物中的應用。3.—種腫瘤放射增敏藥物，其特徵在於有所述腫瘤放射增敏藥物的活性成分為青蒿素衍生物。全文摘要本發明屬於藥物化合物領域，涉及一種青蒿素衍生物及其製備方法和應用，所述青蒿素衍生物的分子式為C24H41O9N，該青蒿素衍生物完全符合放射增敏藥的兩大基本特徵，即單獨使用(正常的作為腫瘤放療增敏劑的劑量)沒有殺傷細胞的作用和只對腫瘤細胞有增敏作用，而且具有廣譜的腫瘤放療增敏效果。文檔編號A61P35/00GK101830945SQ201010179468公開日2010年9月15日申請日期2010年5月24日優先權日2010年5月24日發明者樊賽軍申請人:蘇州基莫夫藥物開發有限公司