重組促紅細胞生成素及製備方法

2023-09-21 08:31:50

專利名稱：重組促紅細胞生成素及製備方法
技術領域：
本發明涉及重組促紅細胞生成素及製備方法，具體涉及化學修飾的重組促紅細胞生成素及製備方法。
背景技術：
促紅細胞生成素(Erythropoietin)也稱促紅素,英文簡稱ΕΡ0,是一種糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓紅細胞前體細胞的分化與增殖，因此EPO被認為是促進紅細胞的產生並能夠調節體內的紅細胞總量在最適宜水平的主要調節因子。天然人促紅細胞生成素(hEPO)是一種主要由腎臟合成並分泌的糖蛋白激素。當腎臟功能衰竭時，EPO就無法正常合成，因而導致紅細胞生成數量的減少，即造成貧血。貧血是慢性腎病的常見症狀之一，以前對於慢性腎病引起的貧血沒有有效的預防和治療措施，基本上只能是通過輸血來暫時緩解症狀。

隨著現代基因技術的發展，1984年重組人促紅素(r-HuEPO)首次研究成功並廣泛應用於臨床，大大加速了人們對促紅素的基礎及應用研究，並為腎性貧血病患者提供了新的醫療途徑。現有的研究表明促紅素的作用要比以前所認識到的廣泛，它不僅適用於慢性腎功能衰竭導致的貧血、惡性腫瘤或化療導致的貧血、失血後貧血和愛滋病引起的貧血等，還可以降低病人對輸血的需求，減少愛滋病以及病毒性肝炎等通過血液製品傳播疾病的發生機率。目前，越來越多得貧血患者在接受EPO治療。目前醫藥市場上的促紅素產品以第一代重組促紅素為主，主要在中華豚鼠細胞內表達和然後純化。而第一代重組促紅素，因其血漿半衰期較短以及對蛋白酶降解的敏感性，其在體內的生物利用度較低。針對第一代產品的缺陷，目前已經開發出第二代重組促紅素產品(以羅氏製藥(Roche)開發出來的CERA為代表)，即經聚乙二醇(PEG)修飾的重組促紅素。聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被運用到治療和診斷有重大意義的多肽的共價修飾上。例如PEG共價連接到白介素、幹擾素等治療性多肽上，已經報導PEG的共價修飾可以延長這些治療性多肽在體內的半衰期、和/或降低它們的免疫原性和抗原性。同樣的，PEG的共價修飾也適用於重組促紅素。臨床實驗也證明了，將無體內活性或生物利用度較低的重組促紅素經聚乙二醇共價修飾，可以獲得具有體內促紅細胞生產活性的重組促紅素產品，該產品的半衰期是第一代重組促紅素產品的16倍以上。除了 PEG以外，其他的聚環氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用於修飾重組促紅素，起到延長血漿半衰期的作用。到目前為止，已經公開了重組促紅素的多種類型的聚乙二醇化學修飾方法，例如W094/28024公開了一種具有促紅細胞生成素活性的糖修飾的PEG綴合物，其中PEG與rEPO的被氧化的糖鏈連接，在PEG化學修飾方法中，A)若只是採用純化學的方法綴合到PEG上(例如羅氏製藥的CERA是通過對重組促紅素內的自由氨基進行PEG化學修飾)，這類方法通常都存在選擇性差(無法定向和/或特異性修飾)，以及反應條件惡劣等缺陷；B)採用PEG對重組促紅素的被氧化的糖基進行共價修飾，由於共價修飾前涉及到糖基化以及糖基氧化的步驟，這類方法同樣存在選擇性差、反應不完全的缺陷。WO 90/12874中公開了單甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的製備方法，其中EPO內通過基因工程手段導入了一個半胱氨酸殘基，再將特定的PEG試劑共價連接到該殘基上。將非天然胺基酸用基因編入法引入蛋白質是實現在單胺基酸殘基水平上選擇性標記蛋白質的一種非常有效的方法，該方法利用一琥珀型抑制因子tRNA(tRNAraA)通讀一個存在於mRNA讀碼框內的琥珀型終止密碼子(UAG)，在此過程中，氨醯基_tRNA合成酶對該tRNA進行了非天然胺基酸醯化，該體系與發現於一些產(甲)烷古生菌和一種革蘭氏陽性菌(Desulfitobacterium hafniense)細胞內天然進行的卩比咯賴氨酸(Pyl)引入機制相同，在這些生物細胞內，一個讀碼框內的琥珀密碼子對Pyl進行共同翻譯並插入蛋白質中，這一琥珀密碼子被一類具有CUA反密碼子並且由吡咯賴氨醯基氨醯基-tRNA合成酶(PylRS)進行Pyl醯化的Pyl琥珀型抑制因子tRNA(pylT)所抑制，這些生物體內的PylRS-pylT配對體與細胞內其他類型的合成酶-tRNA配對體正交，即無相互作用，因此該配對體只針對Pyl以確保精確引入Pyl。與Pyl引入機制類似，特定的氨醯基-tRNA合成酶可以將非天然胺基酸特定連接到其同源tRNAo^上,形成正交的合成酶-tRNA·配對體，當這一合成酶-tRNAo^配對體在細胞中表達時，非天然胺基酸在琥珀密碼子處被高效、精確地定點引入到蛋白質中。這一方法可在細菌、酵母、及哺乳動物細胞內將多種非天然胺基酸定點引入蛋白質，並用以研究大量生物學課題。

發明內容
本發明引入了兩種非天然胺基酸，4-乙醯苯丙氨酸(AcF)和2-氨基-8-羰基壬酸(KetoK)，均包含功能性酮基，引入這兩類非天然胺基酸可用於蛋白質定點修飾。本發明將這兩類非天然胺基酸引入促紅細胞生成素(EPO)基因，並成功用於促紅細胞生成素與帶有羥胺基的20K聚乙二醇(PEG)的共價連接。

本發明提供了兩種化學修飾的重組促紅細胞生成素，在第一種重組促紅細胞生成素中，第65位和/或第152位的胺基酸殘基為4-乙醯苯丙氨醯殘基，至少一個4-乙醯苯丙氨醯殘基上共價連接了聚乙二醇；在第二種重組促紅細胞生成素中，第65位和/或第152位的胺基酸殘基為2-氨-8-氧代壬醯殘基，至少一個2-氨-8-氧代壬醯殘基上共價連接
了聚乙二醇。本發明還提供了上述化學修飾的重組促紅細胞生成素的製備方法，該方法採用基因工程技術時促紅素進行重組，在促紅細胞生成素的第65位和/或第152位上引入具有化學活潑酮基的胺基酸殘基，該胺基酸殘基為4-乙醯苯丙氨醯殘基或2-氨-8-氧代壬醯殘基，然後用聚乙二醇對胺基酸殘基進行化學修飾，聚乙二醇特異性地與4-乙醯苯丙氨醯殘基或2-氨-8-氧代壬醯殘基反應，反應完全且不與其他胺基酸殘基發生反應，所需要的反應條件較溫和，解決了現有技術中選擇性差、反應條件惡劣的問題。用來化學修飾4-乙醯苯丙氨醯殘基或2-氨-8-氧代壬醯殘基的聚乙二醇是一類親水聚合物，優選地，羥氨基或聯氨基取代的聚乙二醇，這類聚乙二醇可以更特異地與4-乙醯苯丙氨醯殘基或2-氨-8-氧代壬醯殘基上的化學活潑的酮基反應，反應更完全，所需的反應條件很溫和，一般只需要在生理條件下反應即可。具有4-乙醯苯丙氨醯殘基的重組促紅細胞生成素的製備方法包括(I)構建含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體，編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ ID No.1所述，在第65位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQID No. 3所述，在第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述；(2)將所述重組表達載體轉染宿主細胞，培養所述宿主細胞並從中分離得到在第65位和/或第152位具有4-乙醯苯丙氨醯殘基的重組促紅細胞生成素；(3)採用聚乙二醇對分離得到的所述重組促紅細胞生成素上的至少一個4-乙醯苯丙氨醯殘基進行化學修飾。在一種具體實施方式
中,所述重組表達載體為重組質粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPOtte,所述宿主細胞為將含有編碼4_乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體穩定整合到CHO細胞染色體的CHO細胞。CHO細胞的全稱為中國倉鼠卵巢細胞。類似地，具有2-氨-8-氧代壬醯殘基的重組促紅細胞生成素的製備方法包括(I)構建含有編碼2-氨-8-氧代壬醯-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位 發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體，編碼2-氨-8-氧代壬醯-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 6所述，琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ ID No. 5所述，在第65位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ ID No. 3所述，在第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ IDNo. 4所述；(2)將所述重組表達載體轉染宿主細胞，培養所述宿主細胞並從中分離得到在第65位和/或第152位具有2-氨-8-氧代壬醯殘基的重組促紅細胞生成素；(3)採用聚乙二醇對分離得到的所述重組促紅細胞生成素上的至少一個
2-氨-8-氧代壬醯殘基進行化學修飾。在一種具體實施方式
中，所述重組表達載體為重組質粒pcDNA3. l-pylT-KeoKRS-EPOTAG,所述宿主細胞為將含有編碼2_氨_8_氧代壬醯-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體穩定整合到CHO細胞染色體的CHO細胞。重組促紅細胞生成素的製備方法是利用琥珀密碼子無義抑制的方法在促紅細胞生成素中弓I入特定的胺基酸殘基，該胺基酸殘基為4-乙醯苯丙氨醯殘基或2-氨-8-氧代壬醯殘基，首先在促紅素的原始基因序列中合適的位點(第65位和/或第152位)製造至少一個琥珀無義突變，並在促紅素的表達載體中引入合適的琥珀突變抑制tRNA的基因序列和氨醯基-tRNA合成酶的基因序列，然後，當表達載體在宿主細胞中表達時，發生了琥珀無義突變的位置翻譯成上述特定的胺基酸殘基，從而成功在促紅素中引入4-乙醯苯丙氨醯殘基或2-氨-8-氧代壬醯殘基。
本發明還提供了化學修飾的重組促紅細胞生成素在製備治療貧血藥物中的用途。PEG-EPO綴合物比天然EPO有更好的藥物代謝動力學特徵和更高的活性。本發明還提供了一種藥物組合物，其中，該組合物包含化學修飾的重組促紅細胞生成素和藥學上可以接受的載體。本發明的重組促紅細胞生成素優選哺乳動物或人源化的重組促紅細胞生成素，更優選人源化的重組促紅細胞生成素。


圖1是pKetoAmber_EP065TAG重組表達質粒圖譜；圖2 是 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO 重組表達質粒圖譜；圖3 是 pcDNA3.1-pyl T-KeoKRS-EPO 重組表達質粒圖譜；圖4是帶有羥氨基的聚乙二醇對本發明的重組促紅素進行化學修飾的反應式；圖5是未修飾重組促紅素與聚乙二醇修飾後的促紅素(EP0(AcF65))的SDS膠體電泳圖；圖6是未假飾重組促紅素與聚乙二醇修飾後的促紅素(EP0(AcF152))的SDS膠體電泳圖；圖7是未修飾重組促紅素與聚乙二醇修飾後的促紅素(EP0(KetoK65))的SDS膠體電泳圖；圖8是未修飾重組促紅素與聚乙二醇修飾後的促紅素(EP0(KetoK152))的SDS膠體電泳圖；圖9是天然促紅素 和聚乙二醇修飾後的重組促紅素在不同時間點在血液中的含量變化圖；圖10是注射天然促紅素和聚乙二醇修飾後的重組促紅素後血細胞比容值隨時間的變化圖。
具體實施例方式實施例一聚乙二醇化學修飾在第65位和/或第152位上帶有4_乙醯苯丙氨醯殘基的重組促紅細胞生成素(I)獲得在第65位和/或第152位上帶有4_乙醯苯丙氨醯殘基的重組促紅細胞生成素(Ia)重組表達載體的構建一種方法參見圖1，首先，在體外構建4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因的表達載體(PKeto)，即擴增合成含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶的基因(該基因序列參見SEQ ID No. 2)的DNA片段，將獲得的該DNA片段利用特異性的酶切位點導入合適的載體中，獲得含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶的基因的表達載體。可以用一個帶有XbaI酶切位點的引物和一個帶有ApaI酶切位點的引物，利用PCR擴增出帶有KetoRS (基因序列為圖3所示的SEQ ID No. 2)的DNA片斷，並進過瓊脂糖電泳進行分離，膠回收，得到純化的DNA片斷；再將該DNA片斷用XbaI和ApaI酶切後連接到pcDNA3. 1(+)(美國Invitrogen公司)的XbaI和ApaI位點之間；再將連接好的載體轉化到大腸桿菌ToplO中，利用氨苄青黴素進打篩選，最後提取質粒，即表達載體pKeto (通過測序確認表達載體pKeto的DNA序列)；然後，在體外構建含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶和琥珀突變抑制tRNA的基因的表達載體(pKetoAmber)，即擴增合成含有編碼tRNACUA基因(該基因的序列參見SEQ ID No.1)的DNA片段，將獲得的該DNA片段利用特異性的酶切位點導入到上述的表達載體pKeto中。擴增合成含有編碼tRNAeuA基因(該基因的序列參見SEQ ID No.1)的三聯體DNA片段將含有一個tRNAraA基因序列的DNA片段、四條多聚脫氧核酸鏈、含有人tRNATiT基因啟動子的DNA片段通過PCR方法依次連接，四條多聚脫氧核酸鏈，按連接次序依次為鏈1:GCAACGGAATTCAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACAC ；鏈2 GCCACTTCGCTACCCCTCCGACGTGTACGTGTGTCGGCGTCCCCTGAGGT ；鏈3 CGGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCT ；

鏈4 GCAACGGGATCCTGGAGGGGGACGGATTCGAACCGCCGAACCCAAAGGGAGCGGATTTAGAGTCC。連接完成後，利用EcoRI合BamHI酶切後連接到pUC18表達質粒中形成pUC18-1tRNAcm 採用PCR的方法，利用帶有BglII和BamHI酶切位點的引物，擴增pUClS-tRNA 中的含有一個tRNAraA基因序列的DNA片段和人tRNAT!T基因啟動子的DNA片段，再用BglII和BamHI酶切後連接到pUC18-tRNAeuA的BamHI位點內形成pUC18_2tRNACUA ；採用PCR的方法，利用帶有BglII和BamHl酶切位點的引物，擴增pUClS-tRNA 中的含有兩個tRNAeuA基因序列的DNA片段和人tRNAT!T基因啟動子的DNA片段，再用BglII和BamHI酶切後連接到pUC18-2tRNAeuA的BamHI位點內形成pUC18_3tRNACUA ；採用PCR的方法，利用帶有BglII和EcoRI酶切位點的引物擴增pUClS-StRNA·中的的含有編碼tRNAeuA基因的三聯體DNA片段(3tRNAeuA)，再用BglII和EcoRI酶切純化後連接到表達載體pKeto的BglII和MfeI位點內形成表達載體pKetoAmber。之後，再體外構建含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶、琥珀突變抑制tRNA和包含至少一個琥珀無義突變的促紅素的基因的表達載體(PKetoAmber-EPOTAG)JP :先構建帶有人類野生型促紅素EPO的表達載體，利用定點突變試劑盒對該表達載體進行處理，得到帶有人促紅素基因突變體EP065TAG(EP0基因中第65位的密碼子突變成TAG, SEQ ID No. 3)表達載體，再從該表達載體中擴增出EP065TAG以及相應的啟動子和終止子DNA片段,並利用合適的酶切位點導入到上述的表達載體pKetoAmber中形成表達載體pKetoAmber-EP065TAG。首先可以採用PCR方法，利用帶有XbaI和ApaI酶切位點的引物擴增出人類野生型促紅素，再用XbaI和ApaI酶切後連接到pcDNA4/T0/Myc HisA表達載體內形成pcDNA4-EP0 ；然後用快速點突變試劑盒(美國Stratagene公司)和兩個引物GCTTGAATGAGTAGATCACTGTCCCAGAC 和 gtctgggacagtgatctactcattcaagc 合成表達載體pcDNA4-EP065TAG，該表達載體中的EPO基因中第65位發生琥珀無義突變(EP065TAG的序列參見SEQ ID No. 3)，在65位的天門冬醯胺被突變為TAG琥珀無義密碼子)；採用PCR方法，利用帶有BamHI和Bgl 11酶切位點的引物來擴增pcDNA4_EP065TAG中的EP065TAG基因、以及帶有兩倍Tet02位點的啟動子和BGH pA終止子的DNA片斷，最後用BamHI和BglII酶切純化後連接到pKetoAmber的BglII位點內形成pKetoAmber_EP065TAG,如圖1所示。另外一種方法參見圖2，首先，將雙螺旋多聚核苷酸U6-EctRNACUATylr-BamH1-BglII (訂購自EpochBiolabs)(序列為SEQ ID No. 7)用內切酶BamH1、BglII酶切後，插入質粒pcDNA3.1/hygro (+)的 BglII 位點，得到重組質粒 pcDNA3. 1-EctRNAtyr, EctRNAtyr 的序列為 SEQ IDNo.1 ；然後，使用AcFRS-Apa1-R (序列為 SEQ ID No. 8)和 AcFRS-Xbal-F (序列為 SEQ IDNo. 9)作為引物對AcFRS(4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶)(序列為SEQ ID No. 2)(來自PSffAN-AcFRS7)進行擴增，隨後用內切酶Xba1、ApaI酶切；然後，將上述用內切酶Xbal、ApaI酶切的產物插入重組質粒pcDNA3. 1-EctRNAtyr,插入位點為 Xbal、ApaI,所得質粒 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS 含有U6-EctRNACUATyr 和 AcFRS 序列；之後，利用內切酶Xbal、ApaI 對 EPO-Xba1-ApaI (序列為 SEQ ID No. 10)(訂購自Epoch B iolabs)進行酶切，後插入質粒pcDNA3. 1/hygro (+),然後用CMV-BamH1-F (序列為 SEQ ID No. 11)、BGH-BglI1-R (序列為 SEQ ID No. 12)作為弓 I物，擴增ΕΡ0，該EPO含有CMF啟動子和BGH終止子，擴增產物EPO用內切酶BamH1、BglII酶切後，插入質粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS的BglII位點，構建重組質粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPOo 分別利用 EP0-65TAG-F (序列為 SEQ ID No. 13)和EP0-65TAG-R(序列為 SEQ ID No. 14)為一組、EP0-152TAG-F (序列為 SEQ ID No. 15)和EP0-152TAG-R(序列為 SEQ ID No. 16)為一組對 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO 進行定點誘變，從而引入TAG突變在65和152位得到兩個質粒pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS_EP065TAG 和 pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS_EP0152TAG。EP065TAG 的脫氧核糖核酸序列如 SEQ IDNo. 3. EP0152TAG的脫氧核糖核酸序列為SEQ ID No. 4。(Ib)轉染宿主細胞和分離提純重組促紅素蛋白將重組表達載體轉染宿主細胞，將穩定轉染後的宿主細胞置入含有非天然胺基酸的培養液中培養後，分離提純獲得帶有非天然胺基酸殘基的重組促紅素蛋白。對於重組表達載體pKetoAmber-EP065TAG,將 pKetoAmber-EP065TAG 和 Fugene6 (Roche公司)混合後來轉染中華豚鼠細胞，轉染後的中華豚鼠細胞在帶有25ug/ML溼黴素B的DMEM培養液(美國Invitrogen公司)篩選獲得培養獲得帶有pKetoAmber_EP065TAG的穩定中華豚鼠細胞。又稱穩定細胞穩定細胞在I升帶有ImM 4-乙醯苯丙氨酸和25ug/ML溼黴素B的DMEM培養液，37度和5 %二氧化碳的環境下培養三天後達到穩定細胞量，細胞旋轉沉降後分離，利用超聲波破細胞後，細胞上清液經過高效陰離子交換色譜柱分離得到純化的含有4-乙醯苯丙氨酸殘基(第65位)的重組促紅素蛋白(EP0(AcF65))。在本實施例中，經檢測，純化後得到的重組促紅素蛋白量約為100毫克。對於重組表達載體pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS_EP065TAG 和 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EP0152TAG，將CHO細胞培養在75cm2的組織培養瓶中達到80-90%克隆率後，利用60 μ I FuGENE 6將重組表達載體2 μ g對細胞進行轉染。過夜培育後將培養基換為含有ImM 4-乙醯苯丙氨酸的新鮮培養基。細胞在37°C生長1_2天後收集，並用RIPA裂解液溶解細胞。細胞裂解後的上清液用PBS緩衝液進行平衡與透析，然後裝入抗-EPO瓊脂糖凝膠層析柱。小鼠單克隆抗-EPO抗體(MAIIA Diagnostics)被固定於經NHS活化的瓊脂糖凝膠(GE healthcare),根據生產商提供的說明，每克幹凝膠固定6. 3mg抗-EP03F6。層析柱(直徑7mm)加入O. 3mL抗-EPO凝膠達到8mm高度後使用20mM Tris緩衝液pH 7. 5、30mMNaCl,O. 1% Tween 20,0. 02% NaN3進行平衡。為了保護EPO不被蛋白酶降解，所有緩衝液每毫升均加入O. 01片絕對不含EDTA的片劑。大約IOOmL含EPO的細胞裂解物通過層析柱後用2mL平衡緩衝液洗脫。利用加入了 I μΜ胃蛋白酶抑制劑(Roche)的低pH (2. 2)溶液2. 5mL，將EPO解析。用試管收集洗脫液，並且立即調整其pH至6. 5。最後得到EP0(AcF65)和EP0(AcF152)(含有4-乙醯苯丙氨酸殘基(第152位)的重組促紅素蛋白)。(2)聚乙二醇的化學修飾一種方法首先將得到的重組促紅素放置在5mM的磷酸緩衝液滲析12個小時，滲析後的重組促紅素被稀釋到O. lmg/mL，然後再向其中加入分子量在10，000 20，000道爾頓之間的羥氨聚乙二醇進行反應(反應式參見圖6)，反應約12個小時，高速離心濃縮後，採用SDS膠體電泳分析(如圖7所示)，本實施例中聚乙二醇的修飾率達到99%以上，如圖4。其中羥氨聚乙二醇的合成可以採用以下途徑將帶有羥基的分子量在10，000 20，000道爾頓之間的聚乙二醇(美國Sigma公司)2克、N-羥基酞醯亞胺160毫克、三苯磷250毫克，溶解在15毫升的二氯甲烷內；逐滴加入偶氮二甲酸二異丙脂(173微升)，邊加邊攪拌(溫度處於20度，攪拌約18小時)；再向其中加入乙醚進行沉降，過濾後得到羥氨聚乙二醇。另一種方法在標準多肽耦合條件下，含活性羥胺基的叔丁氧羰基氨氧基乙酸可與胺端基聚乙二醇(PEG)耦合製得分子量為2萬的PEG衍生物。在乙腈中將等量的叔丁氧羰基氨氧基乙酸與1-羥基苯並三氮唑(HOBt)反應30分鐘，然後加入等量的胺端基聚乙二醇室溫攪拌4小時。粗產物通過乙醚沉澱提純後在室溫下與95%的三氟乙酸水溶液共置攪拌3小時，減壓蒸餾除去三氟乙酸，得到的含活性羥胺基的PEG衍生物溶於水配製成IOmM溶液。含活性羥胺基的PEG衍生物與得到的重組促紅素在50%的乙腈水溶液中室溫共置I小時，隨後進行乾燥冷凍，從而完成與酮標記蛋白的結合過程，如圖4所示。反應混合物重新溶於水後用SDS-PAGE分離，如圖5和圖6所示。實施例二 聚乙二醇化學修飾在第65位和/或第152位上帶有2_氨_8_氧代壬醯殘基的重組促紅細胞生成素(I)獲得在第65位和/或第152位上帶有2_氨_8_氧代壬醯殘基的重組促紅細胞生成素參見圖3，首先，將雙螺旋多聚核苷酸U6-pylT-BamH1-BglII(序列為SEQ IDNo. 17)(訂購自Epoch Biolabs)用內切酶BamH1、BglII酶切後，插入質粒pcDNA3.1/hygro (+)的 BglII 位點，得到重組質粒 pcDNA3. 1-pylT, PylT 的序列為 SEQ ID No. 5 ；然後， 用KetoKRS-Xba1-F (序列為 SEQ ID No. 18)，KetoKRS_Apa1-R(序列為 SEQ IDNo. 19)作為引物對2-氨-8-氧代壬醯基-tRNA合成酶(KetoKRS)(序列為SEQ ID No. 6)進行擴增，隨後用內切酶Xbal、ApaI酶切；
然後，將用內切酶Xba1、ApaI酶切的產物插入重組質粒pcDNA3. l_pylT，插入位點為 Xbal、ApaI，所得質粒 pcDNA3. 1-pylT-KetoKRS 含有 U6_pylT 和 KetoKRS 序列；之後，利用內切酶Xbal、ApaI對EPO-Xbal-Apal進行酶切，後插入質粒pcDNA3. 1/hygro (+)。然後將 CMV-BamH1-F、BGH-BglI1-R 作為引物，擴增 EP0，該 EPO 含有CMF啟動子和BGH終止子。將擴增產物EPO用內切酶BamH1、BglII酶切後，插入質粒pcDNA3. Ι-pylT-KetoKRS 的 BglII 位點，構建重組質粒 pcDNA3. 1-pylT-KetoKRS-EPO。分別利用 EP0-65TAG-F 和 EP0-65TAG-R 為一組、EP0-152TAG-F 和 EP0-152TAG-R 為一組對pcDNA3. Ι-pylT-KetoKRS-EPO進行定點誘變，從而引入TAG突變在65和152位得到兩個質粒 pcDNA3. l-pylT-KetoKRS-EP065TAG 和 pcDNA3. l-pylT-KetoKRS_EP0152TAG。重組質粒pcDNA3· l-pylT-KetoKRS-EP065TAG
和pcDNA3. l-pylT-KetoKRS_EP0152TAG被用來表達含非天然胺基酸的突變EPOs。將CHO細胞培養在75cm2的組織培養瓶中達到80-90 %克隆率後，利用60 μ IFuGENE 6將一種重組質粒2 μ g對細胞進行轉染。過夜培育後將培養基換為含有ImMKetoK的新鮮培養基。細胞在37°C生長1-2天後收集，並用RIPA裂解液溶解細胞。細胞裂解後的上清液用PBS緩衝液進行平衡與透析，然後裝入抗-EPO瓊脂糖凝膠層析柱。小鼠單克隆抗-EPO抗體(MAIIA Diagnostics)被固定於經NHS活化的瓊脂糖凝膠(GE healthcare),根據生產商提供的說明，每克幹凝膠固定6. 3mg抗-EP03F6。層析柱(直徑7mm)加入O. 3mL抗-EPO凝膠達到 8mm 高度後使用 20mM Tris 緩衝液 pH 7. 5、30mM NaCl、O. 1% Tween 20、O. 02% NaN3進行平衡。為了保護EPO不被蛋白酶降解，所有緩衝液每毫升均加入O. 01片絕對不含EDTA的片劑。大約IOOmL含EPO的細胞裂解物通過層析柱後用2mL平衡緩衝液洗脫。利用加入了 I μ M胃蛋白酶抑制劑(Roche)的低pH(2. 2)溶液2. 5mL，將EPO解析。用試管收集洗脫液，並且立即調整其pH至6. 5。最後得到EP0(KetoK65)(含有2-氨-8-氧代壬醯殘基(第65位)的重組促紅素蛋白)和EP0(KetoK152)(含有2-氨-8-氧代壬醯殘基(第152位)的重組促紅素蛋白)。(2)聚乙二醇的化學修飾在標準多肽耦合條件下，含活性羥胺基的叔丁氧羰基氨氧基乙酸可與胺端基聚乙二醇(PEG)耦合製得分子量為2萬的PEG衍生物。在乙腈中將等量的叔丁氧羰基氨氧基乙酸與1-羥基苯並三氮唑(HOBt)反應30分鐘，然後加入等量的胺端基聚乙二醇室溫攪拌4小時。粗產物通過乙醚沉澱提純後在室溫下與95%的三氟乙酸水溶液共置攪拌3小時，減壓蒸餾除去三氟乙酸，得到的含活性羥胺基的PEG衍生物溶於水配製成IOmM溶液。含活性羥胺基的PEG衍生物與得到的重組促紅素在50%的乙腈水溶液中室溫共置I小時，隨後進行乾燥冷凍，從而完成與酮標記蛋白的結合過程，如圖4所示。反應混合物重新溶於水後用SDS-PAGE分離，如圖7和圖8。實施例三聚乙二醇化 EP0(AcF65)、EP0(AcF152)、EP0(KetoK65)和EP0(KetoK152)的藥代動力學研究和血細胞比容測定使用無DMSO的PBS反應緩衝液(即用SC-PEG-12K在賴氨酸位點修飾天然ΕΡ0)，製備了聚乙二醇化 EP0(AcF65)、EPO (AcF152)、EPO (KetoK65)和 EPO (KetoK152)同濃度樣品。這些PEG化EPO化合物被用於與下列物質比較藥代動力學特徵天然的、未經修飾的、天然功能的EPO[來自Amgen, Inc. , Thousand Oaks, CA]作為基準，因為它是被FDA核准的產品，且由於蛋白的超糖基化而有較長的半衰期。為了檢測血液中的蛋白質，用本領域已知的氯胺T法，用125I於酪氨酸位點標記五個樣品。每一分子有約1-2個125I連接。每一樣品(SOug)均被標記，使用脫鹽柱將其從殘餘的未結合125I中分離，檢測蛋白質的活性，用聚丙烯醯胺凝膠電泳和反相柱驗證。評估PEG化樣品中的以下亞群綴合了一個PEG分子的EPO亞群(1PEG-EP0)、或綴合了二個PEG分子的EPO亞群(2PEG-EP0)。1PEG-EP0與2PEG-EP0 之比率，在 EP0-PEG201 中為 54 46 ;在 EP0-PEG202 中為 45 55.為了分析四個批次放射標記蛋白的藥代動力學特徵，將蛋白溶液以2Ci/kg體重的計量皮下注射到雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠被分為5個亞組，每亞組4隻動物，以避免每隻動物超過3次血液採樣。在注射後不同時間點(0,0. 5、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72、96和120小時)採集血液樣品。用閃爍計數器測定放射標記蛋白在血液樣本中的量，對所產生的數據進行統計分析。藥代動力學研究結果顯示在圖9中，該圖比較了天然EPO和經基因修飾得到的EPO在不同時間點測得的血液中含量。橫坐標軸記錄測量時間點(單位h)，縱坐標軸代表所測樣品在血液中的含量值(單位pCi/ml blood)。從圖中可以看出，天然EPO注射後立即達到高水平。其在注射約13小時後，血液中含量達到高峰。13小時後，天然EPO血液含量顯著減少，並在40小時內基本被清除。實驗測得四種經基因修飾得到的EPO隨時間變化其在血液中含量變化相似。注射後其血液含量不斷上升，並在37小時左右達到峰值，隨後雖然其含量緩慢下降，但是仍然在很長時間內保持較高值，整個代謝周期持續120小時以上。此夕卜，經基因修飾得到的EPO在血液中濃度均顯著高於天然ΕΡ0，如本實驗中測得基因修飾所得EPO的峰值是天然EPO峰值的大約1. 5倍，另外前者在注射120小時後的殘留值也略高於代謝相同時間的天然EPO殘留值。血細胞比容測定結果如圖10所示，該圖比較了注射天然EPO和經基因修飾得到的EPO後血細胞比容值隨時間的變化。橫坐標軸記錄測量時間點(單位D),縱坐標軸代表在一定容積內全血中紅細胞所佔的百分比。從圖中可以看出，注射天然EPO大約12天後，全血中紅細胞含量達到峰值約51%，隨後不斷下降；注射後25天，血液中紅細胞含量恢復到注射前水平。注射 EP0(A cF152)-20K PEG、EP0 (KetoK65)-20KPEG 和 EPO (KetoK152)-20KPEG後，全血中紅細胞含量隨時間變化基本類似注射大約12天後，全血中紅細胞含量達到峰值約60%，比注射天然EPO後得到的峰值高約8% -9% ;隨後血液中紅細胞含量不斷下降，但含量均仍顯著高於注射天然EPO後同時間點的紅細胞含量；注射後25天，血液中紅細胞含量恢復到，或仍略高於，注射前水平。注射EP0(AcF65)-20K PEG後，血液中紅細胞含量在2-3天時達到最高值約56%，隨後下降，並在第12天時重新升高到大約55%，然後不斷下降；注射25天後，血液中紅細胞含量恢復到注射前水平。目前還不能很好地解釋這一波動。
SEQUENCE LISTING蘇州元基生物技術有限公司重組促紅細胞生成素及製備方法 19
PatentIn version 3.3
I
82
DNA
人工序列
I
ggaggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc60
ggttcgaatc cgtccccctc Ca82
2
1275
DNA 人工序列
2
atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg60
gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcat ttgtggcttc120
gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc180
ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc240
gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg300
gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct360
gctatcgcgg ccaataatta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc420
gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt480
ctcaaccgtg aaggtcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt540
tatggtatgg cctgtgctaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac600
caatggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg660
tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa720
ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaga accagcccgt acaaattcta ccagttctgg780
atcaacactg cggatgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt840
gaagaaatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag900
tatgtactgg cggagcaggt gactcgcctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca960
aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260atttgctggaaataa
1275
3 579 DNA 人工序列
3
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctgcag120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc180
agcttgaatg agtagatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacaga 579
4
579
DNA
人工序列
4
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctgcag120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcgtagtcag ctgctccact ccgaacaatc480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacaga 5795
72
DNA
人工序列
5
ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg60
gggtttccgcca
72
6 1263· DNA 人工序列
6
atgtcagata aaaaaccatt agatgtttta atatctgcga ccgggctctg gatgtccagg60
actggcacgc tccacaaaat caagcaccat gaggtctcaa gaagtaaaat atacattgaa120
atggcgtgtg gagaccatct tgttgtgaat aattccagga gttgtagaac agccagagca180
ttcagacatc ataagtacag aaaaacctgc aaacgatgta gggtttcggg cgaggatatc240
aataattttc tcacaagatc aaccgaaagc aaaaacagtg tgaaagttag ggtagtttct300
gctccaaagg tcaaaaaagc tatgccgaaa tcagtttcaa gggctccgaa gcctctggaa360
aattctgttt ctgcaaaggc atcaacgaac acatccagat ctgtaccttc gcctgcaaaa420
tcaactccaa attcgtctgt tcccgcatcg gctcctgctc cttcacttac aagaagccag480
cttgataggg ttgaggctct cttaagtcca gaggataaaa tttctctgaa tatggcaaag540
cctttcaggg aacttgagcc tgaacttgtg acaagaagaa aaaacgattt tcagcggctc600
tataccaatg atagagaaga ctacctcggt aaactcgaac gtgatattac gaaatttttc660
gtagaccggg gttttctgga gataaagtct cctatcctta ttccggcgga atacgtggag720
agaatgggta ttaataatga tactgaactt tcaaaacaga tcttccgggt ggataaaaat780
ctctgcttga ggccaatggt tgccccgact attttcaact atgcgcgaaa actcgatagg840
attttaccag gcccaataaa aattttcgaa gtcggacctt gttaccggaa agagtctgac900
ggcaaagagc acctggaaga atttactatg gtgaacttct ttcagatggg ttcgggatgt960
^ctcgggaaa atcttgaagc tctcatcaaa gagtttctgg actatctgga aatcgacttc1020
gaaatcgtag gagattcctg tatggtctat ggggatactc ttgatataat gcacggggac1080
ctggagcttt cttcggcagt cgtcgggcca gtttctcttg atagagaatg gggtattgac1140
aaaccatgga taggtgcagg ttttggtctt gaacgcttgc tcaaggttat gcacggcttt1200
aaaaacatta agagggcatc aaggtccgaa tcttactata atgggatttc aaccaatctg1260taa1263
7 368 DNA 人工序列
7
cgggggatcc aaaaaagggg gacggattcg aaccgccgaa cccaaaggga gcggatttag60
agtccgccgc gtttagccac ttcgctaccc ctccggtgtt tcgtcctttc cacaagatat 120 ataaagccaa gaaatcgaaa tactttcaag ttacggtaag catatgatag tccattttaa 180 aacataattt taaaactgca aactacccaa gaaattatta ctttctacgt cacgtatttt 240 gtactaatat ctttgtgttt acagtcaaat taattctaat tatctctcta acagccttgt 300 atcgtatatg caaatatgaa ggaatcatgg gaaataggcc ctcttcctgc ccgaccttag 360 atccgttg 368
8
31
DNA
人工序列
8
aaacgggccc tttccagcaa atcagacagt a31
9
31 DNA
人工序列
9
cgagtctaga atggcaagca gtaacttgat t31
10
603
DNA
人工序列
10
cgagtctaga atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct60
gtcgctccct ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg 120
權利要求
1.一種化學修飾的重組促紅細胞生成素，其中，第152位的胺基酸殘基為4-乙醯苯丙氨醯殘基，所述的4-乙醯苯丙氨醯殘基是通過在促紅細胞生成素基因序列的第152位發生琥珀無義突變後由該琥珀無義突變的位置翻譯而成的，在第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述，所述的4-乙醯苯丙氨醯殘基上共價連接了聚乙二醇。
2.如權利要求1所述的重組促紅細胞生成素，其中，所述的聚乙二醇為羥氨基或聯氨基取代的聚乙二醇。
3.製備如權利要求1所述的重組促紅細胞生成素的方法，其中，該方法包括 (1)構建含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體，所述編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，所述琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ IDNo.1所述，所述在第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述； (2)將所述重組表達載體轉染宿主細胞，培養所述宿主細胞並從中分離得到在第152位具有4-乙醯苯丙氨醯殘基的重組促紅細胞生成素； (3)採用聚乙二醇對分離得到的所述重組促紅細胞生成素上的4-乙醯苯丙氨醯殘基進行化學修飾。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述重組表達載體為 重組質粒 pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS-EPOTAG。
5.如權利要求3所述的方法，其中，所述宿主細胞為將含有編碼4-乙醯苯丙氨醯-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第152位發生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體穩定整合到CHO細胞染色體的CHO細胞。
6.如權利要求1所述的化學修飾的重組促紅細胞生成素在製備治療貧血藥物中的應用。
7.一種治療貧血的藥物組合物,其中，該組合物包含權利要求1所述的化學修飾的重組促紅細胞生成素和藥學上可以接受的載體。
全文摘要
本發明涉及化學修飾的重組促紅細胞生成素及製備方法，採用基因工程技術對促紅素進行重組，在促紅素中引入了具有化學活潑酮基的4-乙醯苯丙氨醯殘基，在聚乙二醇對重組促紅素共價修飾時，聚乙二醇特異性地與4-乙醯苯丙氨醯殘基反應，反應完全，且不與其他胺基酸殘基發生反應，所需要的反應條件較溫和，解決了現有技術中選擇性差、反應條件惡劣的問題。聚乙二醇化的重組促紅素的藥代動力學研究結果、血細胞比容測定結果均優於天然的促紅素。
文檔編號A61P7/06GK103044539SQ201210222130
公開日2013年4月17日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者萬為 申請人:蘇州元基生物技術有限公司