具有磷脂酶抑制活性的分離的肽的製作方法

2023-09-21 22:24:25

專利名稱：具有磷脂酶抑制活性的分離的肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及脂肪酶領域。具體而言，其涉及具有磷脂酶抑制活性的分離的肽和 編碼該肽的分離多核苷酸。本發明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主 細胞以及產生和使用該肽的方法。其另外涉及具有磷脂酶抑制活性的多肽和能夠受上述 肽和/或多肽抑制的脂肪酶。
背景技術：
脂肪酶(EC3丄1.3)水解三醯甘油的酯鍵並在非水系統中催化酯化和酯交換(酸 解、醇解和相互酯化)。一些脂肪酶，如磷脂酶，水解磷脂中的酯鍵，所述磷脂為對於 細胞膜結構和功能是極為重要的，且為膜脂質中最豐富的極性脂質。Nagao等，1998， J.Biochem.124 1124-29 描述了異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)磷脂酶的 26 個胺基酸 C-末端肽在增加所述脂肪酶的熱穩定性中起重要作用，且該肽對酶活性無影響。考慮到脂質的廣泛用途，例如，作為消化劑，用於在麵團和麵團焙烤產物中產 生味道；作為治療劑，洗滌劑的成分，作為光學解析(optical resolution)的催化劑等，期 望有控制脂肪酶酶活性的手段。此外，從生產的角度而言，期望控制脂肪分解活性，因 為可選擇製備其酶活性可再現的酶產物。

發明內容
本發明的目標是提供具有脂肪酶抑制活性的肽和編碼該肽的多核苷酸，以及包 含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞和產生並使用所述肽的方法。本發明的 目標另外還在於提供具有脂肪酶抑制活性的多肽和能夠受上述肽和/或多肽抑制的脂肪酶。本發明涉及具有磷脂酶抑制活性的分離的肽，選自(a)分離的肽，包含與SEQ ID NO 1的289-310殘基或SEQ ID NO 9的154-175殘基具有至少65%、至少70%、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或100%同一性的 胺基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的分離的肽，所述多核苷酸在中等嚴格條件或高嚴格 條件下與SEQ ID NO 1的肽編碼序列或所述SEQ ID NO 1的肽編碼序列的互補鏈雜 交；(c)由多核苷酸編碼的分離的肽，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO: 1的289-310 殘基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%,至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)包含具有下列胺基酸序列的基序的 分離的肽M^DAXsL^XsKgl^NnX^WMX^XwDnX^EwU^K^ 其中 X4、X5、 X8、X12、X15、X16、X18和X21獨立地可為任何胺基酸，其中該肽的大小小於60個氨基 酸(aa)。
本發明亦涉及包含所述肽和脂肪酶的多肽，其中所述脂肪酶在平板測定法中具 有低於 50PHLU/mg，低於 45PHLU/mg，低於 40PHLU/mg，低於 35PHLU/mg，低於 30PHLU/mg,低於 25PHLU/mg，低於 20PHLU/mg，低於 15PHLU/mg，低於 10PHLU/ mg，低於5PHLU/mg或低於lPHLU/mg磷脂酶活性，和/或不顯示磷脂酶活性。本發明亦涉及具有磷脂酶抑制活性的多肽，其中具有a-螺旋的至少三個溶劑 可接近的(solvent acessible)殘基位於其表面的親本蛋白質在該a-螺旋中在對應於位置 D3、L6、L10, Y13、V14、D17和X21的至少一個溶劑可接近的殘基處和/或對應於該基序 的位置E7、K9、Nn、乂18和Y2(1邊緣殘基處經修飾。本發明亦涉及分離的多核苷酸、核酸構建體、重組表達載體、包含所述肽或多 肽的重組宿主細胞，以及產生具有磷脂酶抑制活性的分離的肽或多肽的方法。本發明亦涉及將所述肽或多肽結合於所述脂肪酶時，所述肽或所述多肽用於抑 制脂肪酶的酶活性的用途。本發明亦涉及具有在平板測定法中磷脂酶活性低於50PHLU/mg，低於 45PHLU/mg,低於 40PHLU/mg，低於 35PHLU/mg，低於 30PHLU/mg，低於 25PHLU/ mg,低於 20PHLU/mg，低於 15PHLU/mg，低於 10PHLU/mg，低於 5PHLU/mg 或低於 lPHLU/mg和/或不顯示磷脂酶活性的脂肪酶，其能夠受所述肽抑制，其中所述脂肪酶 包含至少一個改變，所述改變獨立地為插入、缺失或取代，由此在結合(a)具有磷脂酶抑 制活性的分離的肽；或(b)在所述多肽中包含的具有磷脂酶抑制活性的肽中至少之一時 所述脂肪酶的活性受到抑制。附圖簡述

圖1顯示尖鐮孢(F.oxysporam)磷脂酶的序列比對。圖2顯示a - 3和全a蛋白質序列。圖3顯示來自尖鐮孢a螺旋的殘基的溶劑可接近性(solvent accessiblility)。圖4顯示GZEL的晶體。圖5顯示GZEL晶體的代表性衍射圖樣。圖6顯示FoL PI的肽誘導改變。圖7顯示莫尼糖蛋白(Monellin)變體1(即MON1)和莫尼糖蛋白變體2(即 MON2)序列。圖8顯示對於多種肽的初始反應速率的變化。圖9顯示對於多種肽和脂肪酶的％抑制的變化。序列表SEQIDNO: 1:尖鐮孢，FoLSEQ ID NO 2 禾穀鐮孢(Fusarium Graminearium)SEQ ID NO 3 叢赤殼屬(Nectria)脂肪酶 1SEQ ID NO 4 叢赤殼屬脂肪酶2SEQ ID NO 5 異孢鐮孢SEQ ID NO 6 半裸鐮孢(Fusarium semitectum)SEQ ID NO 7 腐皮鐮孢(Fusarium solani) LipCSEQ ID NO 8 腐皮鐮孢 LipD
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO 定義
磷脂酶活性
9:細毛嗜熱黴(Thermomyces lanuginosus)，TLL 10:鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)PLA2，FVPLA2 11 菌絲黴素(plectasin) 12莫尼糖蛋白
13 Protegrin
14芽孢桿菌RNA酶(Barnase)
15胱蛋白(Cystatins)
16載脂蛋白E
術語「磷脂酶活性」在本文中定義為磷脂分解(EC號3丄1.4)活 性，其將磷脂轉化為脂肪酸和其他親脂性物質。就本發明而言，磷脂酶活性根據在下文 段落「材料和方法」中描述的PHLU和平板測定法的步驟來確定。磷脂酶抑制活性術語「磷脂酶抑制活性」在本文中定義為抑制磷脂酶活性的 活性。本發明的肽具有SEQIDNO 1的成熟多肽的至少20%，至少40%，至少50%， 至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或100%的磷脂酶抑制活性。分離的肽/多肽術語「分離的肽」或「分離的多肽」在本文中分別指自源 (source)分離的肽或多肽。在某些方面，所述肽/多肽如通過SDS-PAGE或HPLC所確定 的為至少純，至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純， 至少80 %純或至少90 %純。肽純度通過HPLC確定。同一性兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數「同一 性」來描述。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS 程序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等， 2000，Trends in Genetics 16 276-277)(優選版本 3.0.0 或更新的版本)的 Needle 程 序中執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48 443-453)來確定的。使用的可選參數是缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和 EBLOSUM62CBLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的 Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性並且是如下計算的(相同的殘 基xl00)/(比對的長度-比對中的缺口總數)。就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序 列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000，見上)(優選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程 序中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上)確定。使用 的可選參數是缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL (NCBI NUC4.4 的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief 選項獲得)用作百分比同一性並且是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸xl00)/(比對 的長度-比對中的缺口總數)。
同源序列術語「同源序列」在本文中定義為在tfasty檢索(Pearson，W.R., 1999,於 Bioinformatics Methods and Protocols, S.Misener 禾口 S.A.Krawetz 編，185-219 頁)中給出小於0.001的E值(或預期分數)的預測蛋白質。同源性的程度可適當的通 過本領域已知的電腦程式來確定，如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual forthe Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B.和 Wunsch，C.D., (1970)， Journal of Molecular Biology, 48，443-45)。 在本發明中，禾穀鐮孢、叢赤殼屬脂肪
酶、腐皮鐮孢、半裸鐮孢、尖鐮孢、異孢鐮孢和細毛嗜熱黴(同物異名疏棉狀腐質黴 (Humicolalanuginose))的脂肪酶序列的相應(或同源)位置由圖1所示的比對定義。為 了尋找未顯示於比對中的脂肪酶序列的同源位置，將目標序列和圖1所示的序列進行比 對。將新序列與圖1的現有比對通過使用由所述GAP程序所找到的最具同源性序列的 GAP比對來進行比對。對於多肽序列比較使用下述設定GAP產生罰分(GAP creation penalty)為 3.0 而 GAP 延伸罰分(GAP extension penalty)為 0.1。分離的多核苷酸術語「分離的多核苷酸」用於本文中指從來源分離的多核苷 酸。在某些方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，至少5%純， 至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純或至少90%純。編碼序列當用於本文時術語「編碼序列」的意思是直接指定其蛋白產物的氨 基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起 始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子如TAA、TAG 和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。核酸構建體術語「核酸構建體」用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核 酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(not otherwise exist)自 然界中的方式修飾以含有核酸的區段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構建體含有 表達本發明的編碼序列所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。控制序列(control sequence)術語「控制序列」在本文定義為包括對編碼本發 明多肽的多核苷酸的表達是必需的所有組分。各個控制序列對於編碼所述多肽的核苷酸 序列可以是天然的或外源的，或各個控制序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些控 制序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉 錄終止子。最少的情況，控制序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。控制序列可以 和接頭一起提供，所述接頭目的為引入特異性限制位點的，所述特異性限制位點促進控 制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區連接。可操作地連接術語「可操作地連接」在本文表示這樣的構型，其中將控制序 列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得控制序列指導多肽編碼序列的 表達。表達術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉 錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語「表達載體」在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含 編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作 地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語「宿主細胞」包括任何細胞類型，所述細胞 類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易 感的(susceptible)。改變術語「改變」在本文的意思是，對由SEQIDNO: 1的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學改變，以及對編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述改 變可以是一個或多個(幾個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個) 胺基酸側鏈的置換。為了易於參考，在描述本發明的經修飾的胺基酸序列時，採用了以 下命名法原始胺基酸位置取代胺基酸。根據這種命名法，例如，在位置195中用 穀氨酸(E)取代甘氨酸(G)表示為G195E。在相同的位置中缺失甘氨酸表示為G195'， 而插入額外的胺基酸殘基例如賴氨酸(K)表示為G195GK。與其它脂肪酶相比，當特定 脂肪酶含有「缺失」並且在該位置進行插入的情況，就在位置36插入天冬氨酸(D)而 言，將這種情況表示為'36D。用加號分隔多個突變，即R170Y+G195E，分別表示在位 置170用酪氨酸(Y)取代精氨酸(R)，和在位置195用穀氨酸(E)取代甘氨酸(G)。當 應用所述比對方法時，X231表示在親本多肽中對應於位置231的胺基酸。X231R表示 用R置換所述胺基酸。就SEQ ID NO : 2而言，X是T，因此X231R表示用R取代位 置231的T。當某個位置(例如231)中的胺基酸可以由選自一組胺基酸(例如由R和P 和Y組成的組)的另一個胺基酸取代時，將這種情況表示為X231R/P/Y。在所有的情況 下，採用公認的IUPAC單字母或三字母的胺基酸縮寫。一個給定的胺基酸殘基是否在所述酶的表面可根據W.Kabsch和C.Sander (1983). Biopolymers 22, 2577-2637 頁.Dictionary of protein secondary structure pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features確定，例如當其溶劑可接近的表面用DSSP程 序計算超過30人2時。發明詳述本發明人發現了一種肽，其可自尖鐮孢或禾穀鐮孢(玉米赤黴(Gibberella zeae))的C-端分離，並能夠結合所述脂肪酶。他們另外還顯示了尖鐮孢的肽具有磷 脂酶抑制活性。因此表明自任何合適的磷脂酶，例如，叢赤殼屬脂肪酶、紅球叢赤殼 (Nectria haematococca)(真馬特鐮孢(Fusarium eumartii))、腐皮鐮孢、大刀鐮孢(Fusarium culmorum),半裸鐮孢和異孢鐮孢分離的類似的C_端肽，可用於抑制磷脂酶活性。在第一方面，本發明涉及具有磷脂酶抑制活性的分離的肽，選自(a)分離的 肽，包含與SEQ ID NO 1的289-310殘基或SEQ ID NO 9的154-175殘基具有至少 65%,至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97% 或100%同一性的胺基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的分離的肽，所述多核苷酸在中等嚴 格條件或高嚴格條件下與SEQ ID NO 1的肽編碼序列或所述SEQ ID NO 1的肽編碼 序列的互補鏈雜交；(c)由多核苷酸編碼的分離的肽，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:
1的289-310殘基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%,至少95%、至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)包含具有下列胺基酸 序列的基序的分離的肽Mi^DsXAsL^TXsIQI^NnUnVMXuXwD 17X18E19Y2OX21K22 其中X4、X5、X8、X12、X15、X16、X18和X21獨立地可為任何胺基酸，其中該肽的大小 小於60個胺基酸(aa)。在另一方面，本發明涉及具有長度少於55aa，少於50aa，少於45aa，少於 40aa,少於35aa或少於30aa的肽。在另一方面，本發明涉及具有長度至少15aa，至少20aa或至少25aa的肽。在另一方面，本發明涉及這樣的肽，其中所述肽具有a-螺旋的二級結構。
在另一方面，本發明涉及這樣的肽，其中在基序中存在的X4、X5、X8、X12、 X15、X16、&8和乂21位置中每一個處的胺基酸獨立選取，使得&為A或E;或 Q ； X8為K或A ； X12為S或N ； X15為E、Q或A ； X16為L或M ； X18為K或Q ；而 X21為I或V。尖鐮孢脂肪酶(FoL)的肽可經改變以改進或減少所述肽抑制所述脂肪酶的能 力。上述改變的實例示於表1。表1:在來源於尖鐮孢脂肪酶的，具有磷脂酶抑制活性的肽中，對應於SEQID NO 1的殘基317-346處的改變，以通過改變的肽獲得對野生型脂肪酶改進的或減少的 抑制。
權利要求
1.一種具有磷脂酶抑制活性的分離的肽，選自(a)分離的肽，其包含與SEQID NO 1的289-310殘基或SEQ ID NO 10的 154-175殘基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少97%或100%同一性的胺基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的分離的肽，所述多核苷酸在中等嚴格條件或高嚴格條件下與 SEQ IDNO 1的肽編碼序列或所述SEQ ID NO 1的肽編碼序列的互補鏈雜交；(C)由多核苷酸編碼的分離的肽，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO: 1的289-310 殘基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%,至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)分離的肽，其包含具有下列胺基酸序列的基序M1T2D3X4X5L6E7X8K9LltlN11X12Y1 I3V14X15X16D17X18E19Y20JC21IC22, X4> Χδ> Xs、Χ 2> X15、X16> X18和X21獨立地可為任 何胺基酸，其中該肽的大小小於60個胺基酸(aa)。
2.權利要求1的肽，其具有少於55aa，少於50aa，少於45aa，少於40aa，少於35aa， 或少於30aa的長度。
3.權利要求1或2的肽，其具有至少15aa，至少20aa或至少25aa的長度。
4.權利要求1的肽，其中所述肽具有α-螺旋的二級結構。
5.權利要求1的肽，其中在基序中存在的X4、X5>X8> X12> X15、X16> X18和X21位 置中每一個的胺基酸獨立地選取，使得X4SA或E ； X5 SE或Q ； X8SK或A ； X12為 S或N ； X15為E、Q或A ； X16為L或M ； X18為K或Q ；而X21為I或V。
6.權利要求1-4任一項所述的肽，其與SEQID NO: 1相比在對應於FoL殘基D291 ； L294 ； E295 ； K297 ； L298 ； N299 ； Y301 ； D305 ； K306 ； Y308 ；或 V309 的位置處包 含至少一個胺基酸取代。
7.權利要求5所述的肽，其與SEQID NO: 1相比在對應於FoL殘基D291E ； L294A ； E295T, S ； K297R ； L298A ； N299D, E ； Y301W ； D305A ； K306R ； Y308E, D ；或V309I，N，Q處包含至少一個胺基酸取代。
8.編碼權利要求1-7任一項所述的肽的分離多核苷酸。
9.一種核酸構建體，其包含權利要求8的多核苷酸，所述多核苷酸可操作連接於至少 一個控制序列，其在表達宿主中引導所述肽的產生。
10.包含權利要求9的核酸構建體的重組表達載體。
11.包含權利要求9的核酸構建體或權利要求10的重組表達載體的重組宿主細胞。
12.—種製備權利要求1-7任一項所述的分離的肽的方法，包括下列步驟(a)在有益於所述肽產生的條件下培養包含所述核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構 建體包含編碼所述肽至少一個拷貝的多核苷酸；和(b)回收所述肽。
13.權利要求1-7任一項所述的肽在將所述肽結合於脂肪酶時抑制所述脂肪酶酶活性 的用途。
14.包含權利要求1-7任一項所述的肽和脂肪酶的多肽，其中所述脂肪酶在平板測 定法中具有低於50PHLU/mg，低於45PHLU/mg，低於40PHLU/mg，低於35PHLU/mg，低於 30PHLU/mg，低於 25PHLU/mg，低於 20PHLU/mg，低於 15PHLU/mg，低於 lOPHLU/mg,低於5PHLU/mg或低於lPHLU/mg的磷脂酶活性，和/或不顯示磷脂酶活性。
15.權利要求14的包含脂肪酶的多肽，所述脂肪酶與細毛嗜熱黴(Thermomyces lanuginosus) (SEQ ID NO 9)具有至少 70%，至少 75%，至少 80%，至少 85%，至少 90%,至少95%，至少97%或100%的同一性。
16.權利要求14-15任一項所述的多肽，其中所述脂肪酶包含至少一個改變，其獨立 地為插入、缺失或取代。
17.權利要求16的多肽，其中所述脂肪酶的至少一個改變包含對應於細毛嗜熱黴 (SEQ ID NO 9)的殘基 E87R、I90L、G91T、I202P、R209L、E210I 或 T244L 的一個或 多個胺基酸取代。
18.權利要求15的多肽，其中所述脂肪酶包含用尖鐮孢(Fusariumoxysporum) (SEQ ID NO 1)的殘基246-254取代對應細毛嗜熱黴(SEQ ID NO 9)的248-255的殘基，或 用尖鐮孢(SEQ ID NO 1)的殘基247-252取代細毛嗜熱黴(SEQ ID NO 9)的248-253。
19.一種具有磷脂酶抑制活性的多肽，其中具有α-螺旋的至少三個溶劑可接近的殘 基位於其表面的蛋白質在該α-螺旋中對應於位置D3、L6、L10, Y13、V14, D17和X21的 至少一個所述溶劑可接近的殘基處和/或對應於權利要求1的基序的位置E7、K9、Nn、 X18和Y2tl的邊緣殘基處經修飾。
20.權利要求19的多肽，其中所述親本蛋白質具有與菌絲黴素(SEQID NO: 11)； 莫尼糖蛋白(SEQ IDNO 12) ； Protegrin (SEQ ID NO 13)；芽孢桿菌RNA酶(Bamase) (SEQ ID NO 14)；胱蛋白(SEQ ID NO 15)；或載脂蛋白 E (SEQ ID NO 16)具有至 少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或100% 同一性的胺基酸序列。
21.製備權利要求14-18任一項所述的多肽的方法，包括將權利要求1-7任一項所述 的肽附加於脂肪酶的步驟，其中所述脂肪酶具有在平板測定法中低於50PHLU/mg，低於 45PHLU/mg,低於 40PHLU/mg，低於 35PHLU/mg，低於 30PHLU/mg，低於 25PHLU/ mg,低於 20PHLU/mg，低於 15PHLU/mg，低於 10PHLU/mg，低於 5PHLU/mg 或低於 lPHLU/mg的磷脂酶活性，和/或不顯示任何磷脂酶活性。
22.—種製備多肽的方法，包括下述步驟(a)選擇在蛋白質表面具有α-螺旋的蛋白質，由此所述α-螺旋的至少三個，至少 四個，至少五個或至少六個殘基是溶劑可接近的；(b)將所述蛋白質的α-螺旋與權利要求1-7任一項所述的肽進行比對；(C)鑑定出所述蛋白質的α-螺旋上溶劑可接近的殘基，其對應於權利要求1的所述 基序的位置 D3、L6、L1q、Y13、V14、D17 和 X21 ；(d)在步驟(c)中鑑定出的蛋白質中改變至少一個，至少兩個，至少三個，至少四 個，至少五個，至少六個或至少七個胺基酸；(e)測試所述多肽的磷脂酶抑制活性；(f)選擇具有磷脂酶抑制活性的多肽；和(g)產生(f)中選出的多肽。
23.權利要求22的方法，其還在步驟(C)中鑑定所述蛋白質的α-螺旋中的殘基，其 潛在地為溶劑可接近的，對應於權利要求1的所述基序的位置E7、K9、N11 > X18和義。。
24.權利要求23的方法，其還包括在所述蛋白質中一個或多個位置進行至少一個改變 的步驟。
25.權利要求14-20任一項所述的多肽在將包含於所述多肽中的肽結合於脂肪酶時抑 制所述脂肪酶的酶活性的用途。
26.—種脂肪酶，其在平板測定法中具有低於50PHLU/mg，低於45PHLU/mg，低於 40PHLU/mg,低於 35PHLU/mg，低於 30PHLU/mg，低於 25PHLU/mg，低於 20PHLU/ mg，低於 15PHLU/mg，低於 10PHLU/mg，低於 5PHLU/mg 或低於 lPHLU/mg 的磷脂 酶活性，和/或不顯示任何磷脂酶活性，其能夠受權利要求1-7任一項所述的肽抑制，其 中所述脂肪酶包含至少一個改變，其獨立地為插入、缺失或取代，由此所述脂肪酶的活 性在結合(a)權利要求1-8任一項所述的具有磷脂酶抑制活性的分離的肽；或(b)權利要 求15-21任一項所述的包含於所述多肽中具有磷脂酶抑制活性的肽至少之一時受抑制。
27.權利要求26的脂肪酶，其中所述脂肪酶與細毛嗜熱黴(SEQID NO: 9)具有至少 70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或100%的同 一性。
28.權利要求27的脂肪酶，其中至少一個改變是對應於細毛嗜熱黴(SEQID NO: 9) 的殘基 L92 ； R96 ； L203 ； 1207 ； R211 ； L243 ； L250 ；或 L252 的取代。
29.權利要求28的脂肪酶，其中所述至少一個改變是對應於細毛嗜熱黴(SEQID NO: 9)的殘基 L92D，E, W ； R96E, D, A ； L203W, K, M ； I207D, E ； R211H ； L243W, KL250D, E, R 和 L252S，T 的取代。
全文摘要
本發明提供了來自具有磷脂酶抑制活性的脂肪酶的C-端肽，包含磷脂酶抑制活性的多肽和能夠受包含磷脂酶抑制活性的分離的肽和/或多肽抑制的脂肪酶。本發明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，以及產生並使用具有脂肪酶抑制活性的肽和多肽的方法。
文檔編號C07K14/37GK102016042SQ200980115692
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者倫納多·D·瑪利亞, 克裡斯琴·I·喬爾根森, 李明, 傑斯珀·文德, 湯姆·A·B·尼爾森, 金·博爾奇 申請人:諾維信公司