N-末端乙醯化蛋白或多肽的製備方法及其專用工程菌的製作方法

2023-09-21 07:00:25 3

專利名稱：N-末端乙醯化蛋白或多肽的製備方法及其專用工程菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備N-末端乙醯化的多肽，尤其是胸腺素的方法及其專用工程 菌。
背景技術：
乙醯化是一種廣泛存在的蛋白質修飾方式，存在於原核生物、古細菌和真核生物 中，大約80 90%的哺乳動物細胞質蛋白、50%的酵母蛋白、少量的原核或古細菌蛋白質 會發生乙酉先化(Polevoda B, Sherman F. The diversity of acetylated proteins. Genome Biology, 2002, 3 :1_6)。乙醯化修飾對一些蛋白質的活性和穩定性有影響，如酶活性、酶穩定性、DNA結合、 蛋白質-蛋白質相互作用、受體識別等等。在有些情況下，缺少乙醯化會導致蛋白質熱穩定 性的下降或其它動力參數的改變，或者複合體組裝效率下降。酵母細胞中蛋白質的乙醯化 修飾與細胞的生長、非發酵碳源的利用、芽胞生成等有關。在哺乳動物細胞中，乙醯化修飾 與組織發育、細胞增殖和腫瘤發生等有關。N-末端乙醯化修飾對原肌球蛋白(tropomyosin) 功能極其重要，無乙醯化修飾的原肌球蛋白不能與肌動蛋白(actin)結合，不能形成多 聚體(Urbancikova M，and Hitchcock-DeGregori SE. Requirement of amino-terminal modification for striated musclealpha-tropomyosin function. J. Biol. Chem.，1994， 269 :24310-24315.)。對肽類藥物而言，乙醯化修飾可以提高多肽在體內的半衰期，如乙 醯化修飾的促黑素細胞激素的半衰期是非乙醯化修飾的3倍(Rudman D, Hollins BM, Kutner MB,Moffitt SD,Lynn M1JThree types of α -melanocyte-stimulating hormone bioactivity andhalf-lives. Am J Physiol 1983，245 :E47_E54.)。一些天然多肽類藥物，如胸腺素α 1 (Τ α 1)和胸腺素β 4 (Τ β 4)都含有Ν_末端乙 醯化修飾。儘管體外研究表明非乙醯化修飾形式的胸腺素也具有生物活性，但是乙醯化修 飾會增加多肽的體內穩定性。胸腺素α 1 (Τ α 1)由28個胺基酸組成，具有N-末端乙醯化修飾，分子量3108kD， 等電點4. 2，結構保守，在各哺乳動物中結構一致，分布廣泛，存在於哺乳動物各組織器官 中，尤以胸腺中含量最高。Ta 1是一種生物反應調節因子，主要是T淋巴系統的免疫增強 劑，對NK細胞也有協同作用。Tal聯用幹擾素治療B型肝炎與C型肝炎、聯用化學療法或 放射療法或白介素_2(IL-2)治療非小細胞肺癌和惡性黑色素瘤、聯用疊氮胸苷和幹擾素 治療免疫缺陷症候群等等臨床試驗都顯示其有良好的治療效果(劉玉英.胸腺素a 1的研 究進展.上海醫藥，2003，24 (5) :211-216)。化學合成的Ta 1已在中國、美國、日本等在內的 多個國家批准臨床應用，以治療B型肝炎、C型肝炎和肺癌等發病率較高且嚴重危害人類 健康的疾病。如美國SciClone製藥公司生產的T a 1 (商品名ZADAXIN)，在2006年銷售額 達到3243萬美元(約合人民幣2. 5億元)，其中90%來自中國市場，比2005年增加16%。 在中國售價每支(1.6mg)近800元。如果能進一步降低生產成本，作為抗病毒、腫瘤治療的 輔助藥物，T a 1在國內外的市場將會進一步擴大。
胸腺素β 4 (Τ β 4)是一個具有N-末端乙醯化修飾的43肽。T β 4是主要的肌動 蛋白螯合肽，是真核細胞中肌動蛋白聚合的調節因子。肌動蛋白有許多重要功能，如細胞 運動，細胞骨架的構建，微管形成等。這些功能受肌動蛋白絲的聚集和解聚調節，而肌動蛋 白亞單位的聚合和解聚又受 Τβ 4 調節(Allan L. Goldstein, Ewald Hannappe, and Hynda K. Kleinman. Thymosin β 4 :actin_sequestering protein moonlights torepair injured tissues. TRENDS in Molecular Medicine，2005，11 (9) :421_429)。Τβ 4 存在於多數組織 和各種類型細胞中，但不存在於紅細胞中。在血小板、嗜中性粒細胞、巨噬細胞及其他淋巴 細胞中濃度很高。在血小板中濃度最高，是首先進入傷口的細胞。Τβ 4具有癒合傷口和抗 炎作用。在皮膚(真皮)傷口，Τβ4通過促進角化細胞和內皮細胞遷移，促進膠原蛋白沉 積，刺激血管生成等，引導傷口收縮和閉合。在小鼠角膜鹼損傷模型中，T β 4不僅促進表皮 再植，而且減少了基質水腫，很少的炎性細胞侵染。炎性細胞侵染減少與炎性因子(IL-Ιβ、 MIP-2、MIP-I、MCP-I、KC)基因轉錄水平降低直接相關。近來還發現，T β 4還能抑制轉錄因 子NF-κ B的激活和核遷移，NF-κ B是炎性反應的主要調節因子。這可能是T β 4的抗炎活性 的機制。雷根內克斯(RegeneRx)製藥有限公司正在進行T β 4的臨床研究。2005年雷根內 克斯公司被FDA批准開展一項皮膚II期臨床試驗，在此之前他們已經在成功完成了 I期臨 床試驗，結果顯示出較好的人體耐受性且沒有毒性。2007年他們又被FDA批准進行另外兩 項臨床試驗手術後糖尿病人角膜修復II期臨床試驗和急性心肌梗塞I期A臨床試驗。目 前該公司還有多項臨床試驗正在開展中，如壓力潰瘍II期臨床試驗，大皰性表皮鬆解症 II期臨床試驗，靜脈阻滯潰瘍II期臨床試驗，糖尿病患者角膜上皮細胞損傷II期臨床試 驗，靜脈給藥的單次劑量和多次劑量的I期臨床試驗(David Crockford,Nabila Turjman, Christian Allan,and Janet Angel. Thymosin β 4 !structure,function,and biological properties supporting current and future clinicalapplications. Ann N Y Acad Sci, 2010，1194 179-189)。由於胸腺素的分子量小，並具有N-末端乙醯化修飾，難以用基因工程技術生 產.目前國內外均採用化學合成方法生產N-末端乙醯化的Tal和Τβ4。但由於化學合成 成本高，用基因工程方法製備T α 1和T β 4更具吸引力。曾有多人嘗試利用基因工程技術表 達T α 1，無論採用融合表達或者串聯表達都不能獲得N-末端乙醯化的T α 1和T β 4 (Esipov RS, Gurevich Al, Stepanenko VN, Chupova LA, Chuvikovsky DV, andMiroshnikov Al. Recombinant Thymosin α 1. Russian Journal of BioorganicChemistry,2004, 30 :431-435. Xiankui Li, Lishu Zheng, Fuwang Peng, ChengyuQi, Xiaoguang Zhang, Anguang Zhou, Zhewei Liu, Shuhua ffu. Recombinant thymosinbeta 4 can promote full-thickness cutaneous wound healing. Protein Expressionand Purification, 2007,56 :229-236.)。非乙醯化重組產物可以通過化學方法進行乙醯化修飾，但無疑 會增力口生產成本(Roman S.Esipov, Vasily N. Stepanenko, Ksenia A. Beyrakhova, Tatjana I. Muravjeva and Anatoly I. Miroshnikov. Production of thymosin α 1 via non-enzymatic acetylation of the recombinantprecursor. Biotechnol Appl Biochem, 2010,56 17-25)。蛋白質的N-末端乙醯化修飾是由N-末端乙醯轉移酶 (N-terminalacetyltransferases,NATs)將乙醯輔酶A的乙醯基團轉移到蛋白質氨基末端的α-氨基上。NH2-Plotehi + Ac-CoA NAT, Ac-NH-Plotrin + CoASH細胞內存在多種N-末端乙醯轉移酶，分別負責不同類型胺基酸序列多肽的乙醯 化修飾。迄今酵母細胞的N-末端乙醯轉移酶研究較多。酵母有三類不同的N-末端乙醯轉移 酶NatA、NatB、NatC，分別催化不同的底物群體(Polevoda B and Sherman F. N-terminal Acetyltransferases and Sequence Requirements for N-terminalAcetyIation of Eukaryotic Proteins. J Mol Biol，2003，325 :595_622.)。NaU 催化 Ser、Ala、Gly 和 Thr 殘基為末端的蛋白質乙醯化修飾，NatB催化Met-Glu、Met-Asp以及部分Met-Asn、Met-Met 為末端殘基的蛋白質乙醯化修飾，NatC催化Met-Ile、Met-Leu、Met-Trp和Met-Phe為末 端殘基的乙醯化修飾。真核生物的NATs都由二個或以上不同亞基組成。NatA至少有兩個 亞基 Ardlp (27kDa)、Natlp (99kDa)，NatB 也有兩個亞基 Nat3p (23kDa)和 Mdm20p (92kDa)， NatC由三個亞基組成:Mak3p (20kDa) ,MaklOp (84kDa)和Mak31p (IOkDa)。高等真核生物中 也存在上述三種酶的催化亞基Ardlp、Nat3p和Mak3p的同源序列，但單個亞基沒有催化乙 醯轉移的活性。大腸桿菌中已知的N-末端乙醯轉移酶有RimI、RimJ和RimL，分別與核糖體蛋白 S18 (N-Ala)、S5 (N-Ala)和 L12 (N-Ser)的 N-末端的 Ala 或 Ser 殘基乙醯化有關(Yoshikawa A, Isono S, Sheback A, Isono K. Cloning and nucleotide sequencingof the genes riml and rimj which encode enzymes acetylating ribosomal proteinsS18 and S5 of Escherichia coli K12. Mol Gen Genet,1987,209 :481-488. TanakaS, Matsushita Y, Yoshikawa A, Isono K. Cloning and molecular characterizationof the gene rimL which encodes an enzyme acetylating ribosomal protein L12 ofEscherichia coli K12.Mol Gen Genet，1989，217，289-293·)。此外，根據生物信息學分析，大腸桿菌基因組 中一些未知功能基因可能也具有乙醯轉移酶活性。現有的研究表明，與真核細胞的NATs 不同，原核細胞的NATs可能只需要一種亞基蛋白組成。2005年Vetting等報導鼠傷寒沙 門氏菌的RimL具有二聚體結構，並可在體外對其底物進行乙醯化修飾反應(Vetting MW, de Carvalho LPS, Roderick SL, andBlanchard JS. A Novel Dimeric Structure of the RimL Na-acetyltransferase fromSalmonella typhimurium. J Biol Chem,2005,280(23) 22108-22114)。根據晶體結構及計算機模擬結果，顯示原核生物的NATs不同於真核生物 NATs，推測只能催化一種蛋白底物。最近文獻報導來自嗜鹽古細菌的乙醯化酶具有多種 底物(Dale Τ. Mackay, Catherine H. Botting, Garry L. Taylor and Malcolm F. White. An acetylasewith relaxed specificity catalyses protein N-terminal acetylation inSulfolobus solfataricus. Molecular Microbiology, 2007，64 :1540-1548)。我們最新 研究結果發現，RimJ可以催化T α 1的乙醯化，但不能使T β 4乙醯化(Fang，H.，Zhang, X.， Shen, L. , Si, X. , Ren, Y. , Dai, H. , Li, S. , Zhou, C. , Chen, H. , 2009. RimJ is responsible for Na-acetylation of thymosin α 1 in Escherichia coli. Appl.Microbiol. Biotechnol. 84,99-104) 從進化關係看，古細菌更接近於真核生物(圖1)，我們推測該細 菌的乙醯化酶可以催化來自真核生物的多肽的N-末端乙醯化修飾。將該酶基因與胸腺素 基因共表達，結果顯示T α 1和T β 4在工程菌體內獲得了乙醯化修飾。

發明內容
本發明的目的是提供一種能產生N-末端乙醯化的蛋白質或多肽的方法及其專用 工程菌。本發明所提供的產生N-末端乙醯化的蛋白質或多肽的專用重組工程菌，是將表 達來自古生菌的乙醯化酶的表達盒整合到宿主菌染色體上，得到在染色體上表達古生菌乙 醯化酶的重組菌。所述古生菌的乙醯化酶可來自Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus acidocaldarius, Metallosphaera sedula, Hyperthermus butylicus, Pyrobaculum arsenaticum, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum calidifontis, Caldivirga maquilingensis 等■生物。 /[尤 ife Jfe 自 Sulfolobus solfataricus, Sulfolobustokodaii, Sulfolobus acidocaldarius。 M it ife 自 Sulfolobus solfataricus。所述乙醯化酶胺基酸序列如序列表中序列2所示或與它具有80%以上的同源性， 並不影響其活性。所述表達乙醯化酶的表達盒包括啟動子和連接於啟動子下遊的編碼古生菌乙醯 化酶的結構基因以及終止子序列，其中編碼古生菌乙醯化酶的結構基因的序列為與序列表 中序列1自5'端第4-501位核苷酸序列具有80%以上的同源性的核苷酸序列，優選為序 列表中序列1自5'端第4-501位核苷酸序列所示的核苷酸序列。所述宿主菌為大腸桿菌，優選為大腸桿菌BL21 (DE3)。所述表達乙醯化酶的表達盒中，所述啟動子可以採用組成型啟動子、熱誘導型啟 動子、或化學誘導型啟動子，優選採用T7啟動子；T7啟動子可進行高效可控表達。所述表達乙醯化酶的表達盒中還可以包括篩選標記基因，如卡那黴素抗性基因， 便於篩選。本發明所提供的製備N-末端乙醯化多肽或蛋白的方法，是將表達目的多肽或蛋 白的載體轉入所述的重組工程菌中誘導表達，得到N-末端乙醯化多肽或蛋白。所述方法中，所述表達目的多肽或蛋白的載體中含有表達所述多肽或蛋白的表達 盒，所述表達盒中含有啟動子和所述多肽或蛋白的編碼基因，所述啟動子可以採用組成型 啟動子、熱誘導型啟動子、或化學誘導型啟動子，優選採用T7啟動子。上述方法適用於製備多種N-末端乙醯化多肽或蛋白，如製備N-末端乙醯化胸腺 素，是構建胸腺素的表達載體。可以將胸腺素與內含肽融合表達，即是將表達胸腺素融合蛋 白的載體轉入上述的重組工程菌中誘導表達，得到N-末端乙醯化胸腺素融合蛋白。N-末端 乙醯化胸腺素融合蛋白可以通過溫度誘導切割、DTT或巰基乙醇誘導切割、Cys誘導切割。 溫度誘導切割可以避免添加一些試劑增加成本。DTT或巰基乙醇誘導效率高，可以獲得具有 完整結構的N-末端乙醯化胸腺素(Ta 1和Τβ4，胺基酸序列為自序列表中序列7的氨基端 第2-44位胺基酸殘基序列或者自序列表中序列5的氨基端第2-29位胺基酸殘基序列)。 用Cys誘導切割，可以在T a 1和T β 4的C端增加一個Cys殘基，便於進行化學修飾，改善 Ta 1和Τβ 4的性質，如延長體內半衰期等。融合蛋白及胸腺素的純化可以通過親和層析、離子交換、疏水層析、反相層析等方 法。
本發明構建可以乙醯化修飾多種多肽的大腸桿菌宿主。人工合成了來自嗜鹽古細 菌Sulfolobus solfataricus的乙醯化酶基因，並通過質粒轉入大腸桿菌細胞內，或利用重 組技術將該基因整合到大腸桿菌的染色體上獲得了本發明的工程菌。該酶基因可以通過誘 導表達，或組成性表達，從而使目的多肽獲得乙醯化修飾。用本發明工程菌可以直接獲得完全N-末端乙醯化的蛋白或者多肽，如胸腺素α 1 和胸腺素β 4，克服了傳統基因工程技術中不能乙醯化或僅部分乙醯化的缺點，徹底實現了 通過基因工程技術獲得N-末端乙醯化胸腺素，具有很強的實際用途。實驗證明，用本發明工程菌製備得到的Τα 1和Τβ 4，全部是N-末端乙醯化的，克 服了傳統技術中不能N-末端乙醯化、部分N-末端乙醯化、乙醯化效率不高的缺點，徹底的 實現了通過基因工程技術獲得N-末端乙醯化胸腺素。因此，本發明工程菌及方法在製備 N-末端乙醯化胸腺素領域具有廣闊的應用前景，並有可能用於其他需要進行乙醯化修飾多 肽的表達和製備。


圖1生命系統的三界
圖2輔助質粒pKDS
圖3含有Spl Intein基因的質粒
圖4 Ardl在質粒上的表達
圖5一步法染色體整合過程示意圖
圖6染色體整合打靶質粒
圖7 Ardl染色體整合PCR鑑定
圖8 Ardl在染色體上整合表達
圖9融合蛋白AS的表達
圖10重組T α 1的純化
圖11重組Tdl的分子量測定
圖12化學合成T α 1 (日達仙)的分子量測定
圖13重組Ta 1的一級序列測定結果
圖14融合蛋白BS的表達
圖15重組Τβ 4的純化
圖16重組Τβ 4的分子量測定
圖17重組Τβ 4的N端序列測定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中的酶試劑均購自TaKaRa公司。實施例1、表達嗜鹽古細菌的乙醯化酶的大腸桿菌宿主構建1、嗜鹽古細菌的乙醯化酶ssArdl基因設計與合成根據文獻報導的胺基酸序列(DaleΤ. Mackay, Catherine H. Botting,Garry L.Taylor and Malcolm F. White. An acetylase with relaxed specificity catalysesprotein N—terminal acetylation in Sulfolobus solfataricus. MolecularMicrobiology, 2007,64 1540-1548)及大腸桿菌基因密碼子的偏嗜性，設計了 如下基因序列並送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。合成的ssArdl基因序列，在 兩側分別增加了 NdeI和HindIII酶切位點，具體序列如序列1所示(序列表中序列1的 5'端第4-501位核苷酸序列為編碼序列)，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列2所示。 該合成基因克隆在質粒PGH-X047G (上海生工生物工程技術服務有限公司)上(圖3)。2、表達載體構建及表達用NdeI和HindIII (購自寶生物工程(大連)有限公司)雙酶切將上述基因從載 體pGH-X047G上切下，然後連接到pET22b載體(購自Novagen公司，目錄號69337-3)的 NdeI和HindIII酶切位點之間，轉化大腸桿菌DH5 α，篩選得到陽性克隆，再進行測序鑑定， 得到表達ssArdl的載體pET-ssArdl。為了今後與目的多肽基因共表達，用NdeI和XhoI雙酶切(購自寶生物工程(大 連)有限公司)pET-ssArdl回收ssArdl片段，用NdeI和XhoI雙酶切載體pACYCDuet-1 (購 自Novagen公司，目錄號71147-3)，連接，轉化大腸桿菌DH5 α，篩選得到陽性克隆，再進行 測序鑑定，獲得表達ssArdl的載體pACYC-ssArdl (該質粒與pET系列載體可共存於細胞 內)，在此載體上ssArdl基因的表達也是由T7啟動子控制。將載體pACYC-ssArdl轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選，得到表達ssArdl 的工程菌。首先挑取單菌落接入含有25mg/L氯黴素的2ml LB培養基(酵母粉5g/L，蛋 白腖10g/L，氯化鈉10g/L ；pH 7. 0)中，30°C培養12小時(未誘導)。然後轉接到50ml的 含有25mg/L氯黴素的FML培養基中(酵母粉12g/L，蛋白腖15g/L，Na2HPO4 · 2H203g/L, KH2PO4 ·3Η20 7g/L, NaCl 2. 5g/L，0. 2% 葡萄糖，2mM 乳糖，0. 05% MgSO4 · 7H20)於 37°C振蕩 培養10小時(誘導)，取樣進行SDS-PAGE分析，有目的蛋白表達(圖4)。圖4中，M為分 子量Marker，LB為未誘導全菌蛋白電泳，FML為誘導表達後的全菌蛋白電泳。3、整合載體 pBRSS-LPLR-Kan-Ardl 的構建3. 1 構建 pBRS(1)以pBR322(寶生物工程(大連)有限公司)為模板，PBR5/PBR3為引物，PCR 擴增包含Tet基因和複製子的PBR322骨架，得PBR。(2)EcoRI/XhoI 雙酶切 PBR 回收 3000bp 左右片段 I，(3)合成的下列片段(上海生工生物工程有限公司合成)5 』 -gGAATTCATATGCCCTTTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCATGCAGGAGCGATCCTCCTGCAT AC-3'5 』 -ccgCTCGAGGATTGCCTTATTACCCTGTTATCCCTAACGCGTATGCAGGAGGATCG-3』將兩片段等摩爾混合，變性退火延伸，條件94°C，30s ；50°C, 30s ；72°C，延伸10s。 反應30循環；膠回收約IOObp處條帶。用EcoRI/XhoI雙酶切並回收IOObp片段II。(4)將⑵得到的片段I和(3)得到的片段II連接，轉化，挑選轉化子，直接通過 測序得到陽性克隆，命名為PBRS。3. 2 構建 pBRSS(1)以枯草芽孢桿菌基因組(1. 1391，中國普通微生物菌種保藏管理中心)為模板，SP5/SP3為引物，PCR擴增sacB基因。SP5和SP3弓丨物序列為SP5 :5』 -CCGGAATTCTAGTTCTTTAGGCCCGTA-3，SP3 5' -TGCTCTAGATATGGGATTCACCTTTATG-3'PCR反應體系為=IOXTransHiFi Buffer 5 μ l，dNTP 4μ 1,SP51 μ 1，SP3 1 μ 1，枯 草芽孢桿菌基因組 0. 5 μ 1，TransHiFi DNA polymerase 0· 5 μ 1，ddH20 38 μ 1。PCR 反應條件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 2min，反應 10 個循環每 個循環退火溫度降0. 5 °C，94°C，30s ;55 °C，30s。72 °C，延伸2min，反應20循環；72 V延伸 300s，4°C，10h。膠回收 2000bp 處條帶。(2)使用EcoRI/Xbal雙酶切載體pBRS和sacB基因，兩者連接後轉化大腸桿菌 DH5a感受態細胞。(3)以SP5/SP3為引物，PCR鑑定陽性重組；PCR鑑定正確後，使用含有5%蔗糖的 固體LB平板驗證sacB功能。在含有蔗糖固體LB平板上不長的菌落為所需菌落。成功構 建質粒pBRSS。3. 3 構建 pBRSS-LPLR(1)以大腸桿菌BL21(DE3)基因組為模板，以PL-1/PL-2為引物擴增L，以PL-3/ PL-4為引物擴增R ；以L，R為模板，以PL-1/PL-4為引物擴增得LR片段。引物序列如下PL-I :5』 -GGCCATGATTGGCGTAGATTACCTG-3，PL-2 :5』 -TACGAGAGCGGCCGCGTGTCTAGAAATCCAGCCGTATAAGCG-3，PL-3 :5』 -TAGACACGCGGCCGCTCTCGTAGCTTTTCCAGTTTCGGATAAGG-3』PL-4 :5』 -CGCGACACCTGGGAAGTGTCTCG-3』(2)用T4DNA聚合酶和dTTP處理LR片段，然後電泳回收。T4DNA聚合酶反應體系LR片段 10μ 1,10ΧΤ4 DNA polymerase buffer 2μ 1，BSA 2 μ 1，T4DNA polymerase 1 μ 1，IOOmMdATP 0. 5μ 1, ddH20 4. 5 μ 1, ,g、體禾只 20 μ 1。以上反應體系37°C反應30min後，直接純化回收DNA片段。(3)用Notl/Mlul雙酶切載體pBRSS，然後電泳回收。(4)連接pBRSS與LR並轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。用PBR+/PBR-為引物， 菌液PCR篩選陽性重組子，測序正確後得到pBRSS-LPLR。引物序列如下PBR+:5，-GTGGAACGAAAACTCACGT-3，PBR-:5，-GTTAGATTTCATACACGGTG-3，3. 4 構建 pBRSS-LPLR-Kan-Ardl(1)以pET-ssArdl為模板，以P5/P6為引物擴增得ssArdl表達盒片段。引物序列如下P5 :5』 -AGACACGCGGCCTCCCGCGAAATTAATACGAC-3，AR3 :5』 -CGGATATAGTTCCTCCTTTC-3』PCR反應體系如下10XTransHiFi Buffer 5 μ l,dNTP 4μ1，Ρ5 1 μ 1,AR3 1 μ 1, SSARDl 0. 5μ 1, TransHiFi DNA polymerase 0. 5μ 1, Ckffl2O 38 μ 1。
PCR 反應條件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 lmin，反應 10 個循環每 個循環退火溫度降0. 5°C，94°C，30s ；55°C，30s。72°C，延伸lmin，反應20循環；72°C延伸 300s，4°C，10h。膠回收 800bp 處條帶。(2)以pET_28a(購自北京欣經科生物技術有限公司)為模板，KN5/KN3為引物， PCR擴增Kan基因表達盒。PCR 反應體系如下10 X TransHiFi Buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，KN5 1 μ 1，ΚΝ3 1 μ 1，PET-28a 0. 5μ 1, TransHiFi DNA polymerase 0. 5μ 1, ddH20 38 μ 1。PCR 反應條件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 lmin，反應 10 個循環每 個循環退火溫度降0. 5°C，94°C，30s ；55°C，30s。72°C，延伸lmin，反應20循環；72°C延伸 300s，4°C，10h。膠回收 IOOObp 處條帶。引物序列如下KN5 :5』 -GAAAGGAGGAACTATATCCGCAGCAGATTACGCGCAG-3，KN3 :5』 -ACGAGAGCGGCCTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAG-3，(3)以(1)和⑵得到的片段為模板，P5/KN3為引物，PCR擴增得到融合片段 Kan-Ardl。PCR 反應體系10 X TransHiFi Buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，P51 μ 1，KN3 1 μ 1，Kan 0. 5μ 1, ssArdl 0. 5μ 1, TransHiFi DNA polymerase 0. 5μ 1, Ckffl2O 37. 5 μ 1。PCR 反應條件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 2min，反應 10 個循環每 個循環退火溫度降0. 5°C，94°C，30s ；55°C，30s。72°C，延伸2min，反應20循環；72°C延伸 300s，4°C，10h。膠回收 2000bp 處條帶。(4)用T4DNA聚合酶和dATP處理融合片段Kan-Ardl。T4DNA 聚合 Sl 反應體系=Kan-Ardl 10 μ 1,10ΧΤ4 DNA polymerase buffer 2μ 1, BSA 2 μ 1，Τ4 DNA polymerase 1 μ 1，IOOmMdATP 0· 5 μ 1，ddH20 4. 5 μ 1，總體積 20 μ 1。以上反應體系37°C反應30min後，直接純化回收DNA片段。(5)使用NotI單酶切pBRSS-LPLR膠回收後，再用T4DNA聚合酶和dTTP處理；酶切反應體系pBRSS-LPLR8μ 1, IOXH buffer 2 μ 1, BSA 2 μ 1, NotI 1 μ 1, ddH20 7 μ 1。以上體系在37°C下反應過夜，瓊脂糖凝膠電泳回收5000bp酶切片段。T4DNA 聚合酶反應體系pBRSS-LPLR (NotI 切)8 μ 1，10 X T4 DNA polymerasebuffer 2 μ 1，BSA 2μ 1，Τ4 DNA polymerase 1 μ 1,IOOmMdTTP 0·5 μ 1，ddH20 6. 5 μ 1，總體積20 μ 1。以上反應體系37°C反應30min後，直接純化回收。(6)將步驟(4)和(5)得到的片段連接，然後轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。直 接在含有25mg/L的卡那黴素固體LB平板上篩選陽性克隆，並以P5/KN3為引物進行PCR驗 證，然後用通用引物T7和T7t引物對陽性克隆進行測序，表明ssArdl基因序列及其表達控 制序列完全正確。至此，完成載體pBRSS-LPLR-Kan-Ardl (圖6)構建。4、ssArdl在染色體上整合表達應用本實驗室建立的一步法(圖5)將ssArdl基因及其表達調控元件整合到大腸 桿菌染色體上(周軍智等.大腸桿菌PtsHIcn 操縱子的快速敲除及敲除菌生長性能測定， 微生物學通報，2010，37 1146-1152)。具體方法如下所述首先，應用常規酶切連接方法按步驟3構建如圖6所示的染色體整合打靶質粒pBRSS-LPLR-KanArdl (圖 6)。低拷貝pKDS質粒(圖2)含有exo、bet、gam以及歸巢內切酶I-Sce I基因，均受 阿拉伯糖啟動子控制(見周軍智等.大腸桿菌PtsHIcn 操縱子的快速敲除及敲除菌生長 性能測定，微生物學通報，2010，37 1146-1152)(中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工 程研究所)。然後將打靶質粒PBRSS-LPLR-KanArdl和輔助質粒pKDS共同轉化到大腸桿菌 BL21 (DE3)中，將轉化子在25mg/L氯黴素和卡那黴素雙抗平板上培養，挑取單菌落，接種到 5ml氯黴素和卡那黴素雙抗液體LB培養基中，過夜培養。次日，取500 μ 1共轉菌菌液接種 到50ml含有25mg/L氯黴素的LB中，200rpm 30°C培養到OD600 ^ 0. 4。加入終濃度0. 2% L-阿拉伯糖誘導，誘導5h後，取菌液200 μ 1，塗布Kan/蔗糖平板(含有25mg/L卡那黴素 和5%蔗糖的固體LB平板)。37°C過夜培養。在Kan/蔗糖平板只長出1個單菌落。菌液PCR鑑定從Kan/蔗糖平板上挑取單菌落到LB無抗培養基中，培養4_5h 後，以菌液為模板，PL-7/PLlpxmR為引物，PCR鑑定。陽性重組菌應為4000bp，非重組 菌為3000bp。PCR驗證正確後(圖7，圖7中樣品是陽性重組菌，陽性對照是打靶質粒 pBRSS-LPLR-KanArdl,陰性對照是未重組的大腸桿菌BL21 (DE3))，進行測序，得到含有輔助 質粒的BL21 (DE3) IpxM: :Kan-Ardl。將該菌株塗布四環素抗性平板，不能生長，說明打靶質 粒已不存在。引物 PL-7 5，AGACATTAAGACTGCGGCGT 3，引物 PLlpxmR 5，ACTCTCCTGGACATTAACCG 3，輔助質粒剔除取50 μ 1含有輔助質粒的BL21 (DE3) IpxM: Kan-Ardl菌液接種到 5ml含有25mg/L卡那黴素液體LB培養基中，42°C過夜培養。次日將過夜菌稀釋到10_6，塗 布含有25mg/L卡那黴素的固體LB平板，37°C溫孵過夜。次日，挑取卡那黴素平板生長的單 菌落到卡那黴素液體LB培養基中，培養4-5h後，將菌液編號，對應點到含有25mg/L氯黴素 的固體LB平板，不能在氯黴素平板生長的菌株為輔助質粒pKDS丟失株，保存該菌種，得到 去除輔助質粒的菌株BL21 (DE3) IpxM: Kan-Ardl。誘導表達ssArdl 將去除輔助質粒的BL21 (DE3) IpxM: :Kan_Ardl在卡那黴素平 板上劃線，37°C溫孵12h，次日挑取單菌落到5ml液體LB培養基中，37°C震蕩培養過夜。取 50 μ 1過夜培養菌液分別接種到2隻試管中，每管含有5ml液體LB培養基。37°C震蕩培養 到OD6qq^ 0.4，一支試管加入終濃度0.5mmol IPTG誘導，另一支作為對照。誘導6h後，以 誘導前樣品為對照，進行SDS-PAGE分析，結果表明有ssArdl表達(圖8)。至此，我們獲得了在染色體上表達ssArdl的大腸桿菌BL21 (DE3) IpxM: Kan-Ardl，簡稱 BDArd。實施例2、重組N-末端乙醯化T α 1的製備Τα 1分子量較小，難以在細胞內直接表達，需要與其它蛋白基因融合表達。為獲得 完整結構的Ta 1，需要對融合蛋白進行切割。切割方法可採用酶裂解法、化學裂解法，以及 內含肽介導的切割方法。本實施例介紹利用內含肽切割獲得N-末端乙醯化修飾的胸腺素 Tal01、表達Ta 1與內含肽的融合蛋白工程菌I的構建編碼Spl DnaX內含肽的基因序列如序列表中序列3所示，由上海生工生物工程技
11術服務有限公司合成。用限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切上述編碼Spl DnaX內含肽的基因，再用 限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切pET22b載體(購自Novagen公司，目錄號69337-3) 回收載體片段，與切上述編碼Spl DnaX內含肽連接，獲得重組載體，將鑑定正確的含有Spl DnaX內含肽的編碼基因的重組載體命名為pET-S。設計兩條寡核苷酸片段TA和TAS，如下所示TA :5，-GM TTC CAT ATG TCA GAT GCA GCA GTA GAT ACT AGC TCT GM ATC ACTACC AAA GAC CTG AAG GAG AAG AAG-3'TAS 5' -GCT GCT ACT TAA GCA GTT CTC AGC CTC TTC GAC AAC TTC CTT CTT CTCCTT CAG GTC-3，將兩條片段通過自身退火延伸得到約IOObp的產物，將其用NdeI和Afl II雙酶 切後插入到PET-S的酶切位點之間，從而獲得表達T α 1與Spl內含肽融合蛋白AS (AS氨基 酸序列如序列表中序列5所示，編碼AS的基因序列如序列表中序列4所示)的載體，將鑑 定正確的載體命名為pET-AS。TA和TAS的自身退火延伸反應條件如下反應體系(總體積 50μ L) :10XPyrobest Buffer 5μ L ；dNTP 4 μ L ；PrimerTA 1 μ L ；Primer TAS 1 μ L ；Pyrobest DNA Polymerase 0. 3 μ L ；ddH20 38. 7 μ L0PCR反應條件先95°C預變性5min ；再94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸 lOsec，反應30個循環，最後72°C延伸lOmin。構建工程菌I 將表達載體pET-AS轉化到大腸桿菌BDArd中，在添加終濃度 100mg/L氨苄青黴素LB平板上篩選，並經過PCR檢測和測序鑑定，得到含有pET_AS的工程 菌I，即BDArd/pET-AS。這樣，在工程菌I內AS(位於質粒上)和ssArdl (位於染色體上) 的表達都由T7啟動子控制，可以用IPTG誘導同時表達。2、工程菌I發酵培養及重組T α 1的純化與鑑定搖瓶發酵將工程菌BDArd/pET-AS接入添加終濃度100mg/L氨苄青黴素的2mlLB 培養基(酵母粉5g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉10g/L;pH 7.0)中，30°C培養12小時。然後轉 接到50ml的相同培養基中，30°C振蕩培養10小時，作為種子。將種子接入1升FML培養基 中(酵母粉 12g/L，蛋白腖 15g/L，Na2HPO4 · 2H20 3g/L，KH2PO4 · 3H207g/L，NaCl 2. 5g/L，葡 萄糖2g/L，2mM乳糖，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，lOOmg/L氨苄青黴素)，37°C振蕩誘導培養10小 時(振蕩速度為250rpm/min)，離心，收集菌體。對全菌蛋白進行SDS-PAGE分析，以未誘導 培養的菌體為對照，結果表明，誘導培養後AS有表達(圖9中箭頭示)。分離純化1)鎳柱親和層析取IL誘導培養發酵液所得的BDArd/pET-AS菌體(溼重約IOg)，加入200ml鎳柱 親和層析A緩衝液(50mM磷酸鹽、0. 5M NaClUOOmM咪唑、ρΗ7. 0)，混勻後超聲破菌30min， 離心(12000r/min，4°C，30min)，收集上清，在上清中加入終濃度為1 %的曲拉通-100，將上 清液首先用0. 8 μ m的濾膜過濾，再用0. 45 μ m的濾膜過濾後上樣鎳柱(已經用A液平衡)， 上樣後，用鎳柱親和層析B緩衝液(50mM磷酸鹽、0. 5M NaCl、20mM咪唑、10%甘油、pH7. 0) 漂洗，最終用鎳柱親和層析的C緩衝液(50mM磷酸鹽、0. 5M NaCl、400mM咪唑、ρΗ7. 0)直接
12洗脫，收集洗脫峰。2)切割在經鎳柱親和層析後所得到的AS融合蛋白溶液中添加終濃度為300mM的β -巰 基乙醇，放置在42°C水浴中溫育切割24h。3)疏水層析在經過誘導切割的蛋白溶液中加入等量的初濃度為2M的(NH4)2SO4溶液，使溶液 中所含的(NH4)2SO4濃度為1M，用0. 22 μ m的濾膜過濾後上樣Phenyl Sepharose 6FastFlow column (high sub) (GE Healthcare)柱進行疏水層析，該柱子已經用疏水層析平衡液 D(50mM磷酸鹽，lM(NH4)2S04，pH7. 0)平衡，進行疏水層析，根據先前預實驗結果，目的蛋白在 穿過峰中，收集穿過液。4)反相層析經過疏水層析的蛋白溶液再進行反相層析，上樣反相柱S0RCE30 RPC column (GEHealthcare)後用E液平衡(0. 1 %磷酸)，再用F液(0. 1 %磷酸，25 %乙腈)進 行梯度洗脫，洗脫條件為4ml/min，0 100% F，100ml，分管收集，每管10ml，將收集到的目 的蛋白管混合。5)離子交換層析將反相層析所得到的含有目的蛋白的樣品管混合後，調節PH至7.0，上樣 QSepharose Fast Flow column (GE Healthcare)柱，進行陰離子交換層析，平衡液 G (50mM 磷酸酸鹽，PH7.0)，洗脫液為H(G+1M NaCl, pH7.0)，洗脫條件為:4ml/min，0 100 % G, 100ml，分管收集。每管10ml，將收集到的目的蛋白管混合。各步驟樣品SDS-PAGE分析結果如圖10所示，表明通過上述步驟後可以獲得比較 純的重組T α 1。6)反相-高效液相色譜(RP-HPLC)分析目的蛋白T α 1得率與純度反相-高效液相系統大連依利特分析儀器有限公司柱填料=Hypersil300Α C18 5 μ m在分析了系統適應性及重複性的基礎上利用該系統及柱填料對本研究所得到的 Tal進行得率及純度分析洗脫程序為
權利要求
重組工程菌，是將表達古生菌的乙醯化酶的表達盒整合到宿主菌染色體上，得到在染色體上表達古生菌的乙醯化酶的重組菌。
2.根據權利要求1所述的重組工程菌，其特徵在於所述宿主菌為大腸桿菌。
3.根據權利要求1或2所述的重組工程菌，其特徵在於所述古生菌為 Sulfolobussolfataricus, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus acidocaldarius, Metallosphaerasedula, Hyperthermus butylicus， Pyrobaculum arsenaticum， Pyrobaculum islandicum,Pyrobaculum calidifontis，或aldivirga maquilingensis ；優 選為 Sulfolobussolfataricus, Sulfolobus tokodaii 或 Sulfolobus acidocaldarius, ^ 優選為 Sulfolobussolfataricus。
4.根據權利要求3所述的重組工程菌，其特徵在於所述古生菌的乙醯化酶的胺基酸 序列為與序列表中序列2具有80%以上的同源性的胺基酸序列；優選為序列表中序列2所 示的胺基酸序列。
5.根據權利要求4所述的重組工程菌，其特徵在於所述編碼古生菌乙醯化酶的結構 基因的序列為與序列表中序列1的5'端第4-501位核苷酸序列具有80%以上的同源性的 核苷酸序列，優選為序列表中序列1的5'端第4-501位核苷酸序列所示的核苷酸序列。
6.一種製備N-末端乙醯化多肽或蛋白的方法，是將表達目的多肽或蛋白的載體轉入 權利要求1-5中任意一項所述的重組工程菌中誘導表達，得到N-末端乙醯化多肽或蛋白。
7.一種製備N-末端乙醯化胸腺素的方法，是將表達胸腺素融合蛋白的載體轉入權利 要求1-5中任意一項所述的重組工程菌中誘導表達，得到N-末端乙醯化胸腺素融合蛋白。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述胸腺素融合蛋白的胺基酸序列為序 列表中序列5或者序列表中序列7。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述胸腺素融合蛋白的編碼基因的核苷 酸序列為序列表中序列4或者序列表中序列6。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述方法中還包括將誘導表達獲得的 N-末端乙醯化胸腺素融合蛋白進行切割獲得N-末端乙醯化胸腺素；所述N-末端乙醯化胸 腺素的胺基酸序列為自序列表中序列7的氨基端第2-44位胺基酸殘基序列或者自序列表 中序列5的氨基端第2-29位胺基酸殘基序列。
全文摘要
本發明公開了一種能產生N-末端乙醯化的蛋白質或多肽的方法及其專用工程菌。該重組工程菌，是將表達來自古細菌的乙醯化酶的表達盒整合到宿主菌染色體上，得到在染色體上表達古細菌乙醯化酶的重組菌；所述表達古細菌乙醯化酶的表達盒包括啟動子和連接於啟動子下遊的古細菌乙醯化酶基因；所述古細菌乙醯化酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其胺基酸序列如序列表中序列2所示。用本發明工程菌可以直接獲得完全N-末端乙醯化的蛋白或者多肽，如胸腺素α1和胸腺素β4，克服了傳統基因工程技術中不能乙醯化或僅部分乙醯化的缺點，徹底實現了通過基因工程技術獲得N-末端乙醯化胸腺素，具有很強的實際用途。
文檔編號C12N15/70GK101979505SQ20101052184
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者任元濤, 司信喜, 周長林, 孫旭, 戴紅梅, 方宏清, 李樹龍, 陳惠鵬 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所