具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的製備方法
2023-09-21 11:34:00 1
專利名稱：具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種新型溫敏納米藥物載體的製備方法，尤其是一種 具有磁性和葉酸雙重耙向的溫敏納米藥物載體的製備方法，以及通過 該製備方法獲得的溫敏納米藥物載體及其用途。
背景技術：
根據大量的研究表明，葉酸受體是一種在多種癌細胞中廣泛過量 存在並且能和葉酸分子發生特殊相互作用的物質。利用葉酸與葉酸受 體特有的相互作用，人們通常將葉酸作為特殊的靶向分子來修飾各種 納米尺寸的抗癌藥物載體，起到對癌細胞的靶向識別作用，從而提高 藥物的傳遞效率，同時可以降低藥物的副作用。
在各種載體中，具有空腔結構的載體因其特有的性質，例如較大
的內部空間尺寸和殼層可調節的滲透性，在裝載DNA，蛋白質以及各 種藥物分子的領域中得到了廣泛的研究和應用。在實際應用中，控制 調節載體對於外來分子的滲透能力一直是人們研究的一個熱點，因為 載體對外來分子的滲透能力關係到外來分子的裝載以及釋放，是非常 重要的。為了進一步改善載體的滲透性， 一種比較可行的方法就是設 計製備一種能對外界的刺激，例如溫度，pH值和磁場，做出特殊響應 的載體。從而通過外界刺激的調節來控制載體對於外來分子的滲透能 力。
基於四氧化三鐵納米粒子的磁性，其功能微球材料在細胞分離， 固定化酶，磁靶向載藥，磁共振成像等生物領域都有著廣泛的應用。並且四氧化三鐵納米粒子被證明就有很好的生物相容性。聚N-異丙 基丙烯醯胺(PNIPAM)是一種具有溫度響應性的聚合物，它在32°C 左右有一個最低臨界溶解溫度(LCST)。當溫度小於32'C的時候， PNIPAM表現出親水性；當溫度大於32"C的時候，它表現出憎水性。 並且PNIPAM的LCST在較大範圍內是可調節的，加入親水性共聚單體 會升高LCST，反之加入憎水性共聚單體會降低LCST。 PNIPAM的這種 特殊的溫敏性質使它在藥物傳遞以及藥物的可控釋放領域都得到了 廣泛的研究報導。
基於以上信息，設計製備一種兼具磁靶向和葉酸靶向，同時具有 溫敏特性的具有空腔結構的納米藥物載體將會是對藥物傳遞領域的 一次很好探索。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種具有磁性和葉酸雙重 耙向的溫敏納米藥物載體的製備方法。
本發明所要解決的另一技術問題在於提供一種上述製備方法獲 得的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體。
本發明所要解決的再一技術問題在於提供一種上述溫敏納米藥 物載體的用途。
本發明解決上述技術問題所採取的技術方案是 一種具有磁性和
葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的製備方法，包括下述步驟 第一步將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性；
第二步在四氧化三鐵納米粒子表面通過細乳液聚合方法包覆聚N-
異丙基丙烯醯胺(PNIPAM)，製成具空腔結構的複合種子微 球；第三步在複合種子微球表面通過沉澱聚合方法包覆N-異丙基丙烯 醯胺(NIPAM)和甲基丙烯酸脫水甘油酯(GMA)的共聚物， 製得納米複合微球；
第四步將納米複合微球表面帶上氨基；
第五步將帶氨基的納米複合微球與葉酸結合，得到溫敏納米藥物載 體。
本發明首先用經油酸等改性的四氧化三鐵納米粒子作為磁性材 料，通過改進的細乳液聚合方法得到內部具有空腔結構的，以四氧化 三鐵納米粒子為核，以PNIPAM為殼層的複合種子微球；再通過沉澱 聚合方法在種子微球外包覆NIPAM和GMA的共聚物，進一步以NIPAM 和GMA的共聚物為殼，得到表面帶有環氧基團的複合微球；然後，微 球表面的環氧基團可以在常溫下用過量的氨基試劑開環，得到表面帶 有氨基的納米複合微球；最後，用葉酸和複合微球表面的氨基反應， 葉酸分子上的羧基和氨基反應生成醯胺鍵，從而將葉酸分子接到微球 表面，最終得到具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體。
所述的四氧化三鐵納米粒子為超順磁性的四氧化三鐵納米粒子， 通過化學共沉澱法製得。
在上述方案的基礎上，第一步中，採用超順磁性的四氧化三鐵納 米粒子，親油改性為將四氧化三鐵納米粒子表面通過親油劑改性得到 磁流體，所述的親油劑為油酸、油胺或三正辛基氧磷(T0P0)等。
在上述方案的基礎上，第二步中，所述的複合種子微球中四氧化 三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)單體的質量比為1: 5 15，獲得的複合種子微球的粒徑在80 120mn。
其中，四氧化三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯醯胺單體的質量比 可以具體為l: 5， 6, 8， 10， 12， 13或15;粒徑分布可以在80， 90,100， 110， 120nm。
複合種子微球的細乳液聚合製備方法具體可以為
將第一步四氧化三鐵納米粒子改性中獲得的磁流體洗滌後，加入 溶劑乙酸丁酯和偶氮二異丁腈(AIBN)，分散均勻後，和十二垸基苯 磺酸鈉(SDBS)溶液混合，超聲形成穩定乳液；
再將N-異丙基丙烯醯胺單體(NIP顏)和N， N，-亞甲基雙丙烯醯 胺(MBA)溶解，與所述穩定溶液混合，進行四氧化三鐵納米粒子與 NIPAM單體的聚合；
反應過程條件為先通氮氣20 50分鐘，再在反應溫度70 80 'C下反應3 6小時。
具體的，通氮氣的時間可以為20， 30， 40或50分鐘；反應溫度 可以為70， 72， 75， 78或8(TC，反應時間可以為3， 4， 5或6小時。
在上述方案的基礎上，第三步中，所述的納米複合微球的粒徑在 180 220nm。具體的粒徑分布可以在180， 190， 200， 210， 220nm。
通過沉澱聚合方法在種子微球外包覆N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM) 和甲基丙烯酸脫水甘油酯(GMA)的共聚物獲得納米複合微球的具體 可以為
在第二步中獲得的複合種子微球分散液中加入N-異丙基丙烯醯 胺單體(NIPAM),甲基丙烯酸脫水甘油酯(GMA)， N，N，-亞甲基雙丙 烯醯胺(MBA)交聯劑，先通氮氣20 50分鐘，加入過硫酸鉀引發劑， 再在反應溫度70 8(TC下反應3 6小時。
通氮氣的時間具體可以為20， 30， 40或50分鐘；反應溫度可以 為70， 72， 75， 78或8(TC，反應時間可以為3， 4， 5或6小時。
在上述方案的基礎上，第四步中，使納米複合微球表面帶上氨基
的方法為納米複合微球與氨基試劑反應，所述的氨基試劑為己二胺、乙二胺、丁二胺或巰基乙胺等。加入氨基試劑後常溫下攪拌過夜，產 物用磁分離，並用水洗滌多次後待用。
在上述方案的基礎上，第五步中，先將葉酸、l-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)、 N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) 在溶劑中混合，如二甲基亞碸(DMS0)中混合進行活化反應，再與帶 氨基的納米複合微球上的反應。
將葉酸與EDC. HC1和NHS混合攪拌活化0. 5 2小時， 一般情況 下，葉酸與EDC. HC1、 NHS的混合摩爾比為1: 1.5 2. 5: 1. 5 2. 5， 具體可以為l: 1.5， 1.8， 2， 2.2或2. 5: 1.5， 1.8， 2， 2.2或2. 5， 優選l: 2: 2。事先對葉酸進行活化更有利於之後葉酸分子上的羧基
與納米複合微球上的氨基反應生成醯胺鍵，從而將葉酸分子接到微球表面。
針對上述的製備方法獲得的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納 米藥物載體，所述的溫敏納米藥物載體具有空腔結構，以四氧化三鐵
為核，以聚N-異丙基丙烯醯胺、聚N-異丙基丙烯醯胺與甲基丙烯酸 脫水甘油酯的共聚物為殼，表面修飾有葉酸靶向分子，粒徑在180 220nm。具體的粒徑分布可以在180， 190， 200， 210， 220nm。這種 納米藥物載體具有較快的磁響應速度，在一定溫度下會發生體積相轉 變，並且在水中可以穩定分散。
在上述方案的基礎上，溫敏納米藥物載體的磁飽和強度範圍為 5emu/g 40emu/g;相轉變溫度為32 42°C 。
具體的，溫敏納米藥物載體的磁飽和強度範圍可以為5， 10， 15， 20， 25， 30， 35或40emu/g;相轉變溫度可以為32， 35， 38， 40或 42°C。
針對上述的溫敏納米藥物載體的用途，用於裝載抗癌藥物阿黴素。溫敏納米藥物載體可以在水溶液中通過氫鍵作用或者物理吸附作 用，裝載阿黴素藥物分子，其包封率以及載藥率可以方便地用pH值
加以控制。阿黴素的釋放過程可以通過調節環境的溫度和pH值加以 控制，在高溫和低pH值條件下展現出較快的釋放速度。通過將載有 藥物的上述納米藥物載體和帶有葉酸受體的癌細胞一起培養進行細 胞實驗，納米藥物載體體現出了很好的靶向特性。
在上述方案的基礎上，所述抗癌藥物阿黴素的載藥率的重量百分 比為3 60%。具體的，載藥率可以為3， 5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40, 45， 50， 55或60%。
本發明的優異效果是-
本發明製備工藝清晰全面，得到的納米藥物載體具有磁靶向性， 葉酸耙向性，溫度敏感性以及空腔結構等多種功能。載體的磁靶向性 使得載體能在磁場的控制下在特定的部位聚集；葉酸靶向性使得載體 對癌細胞具有特異的目標識別功能；載體的溫度敏感性可以用來實現 所裝載的藥物的可控釋放，能通過溫度刺激對於藥物分子的釋放加以 控制；而載體的空腔結構則使載體能夠裝載更多的藥物分子從而提高 藥物傳遞的效率和降低副作用；本發明在細胞實驗中表現出了很好的 應用效果，是一種較為理想的藥物載體。
以上設計思路基本覆蓋了藥物傳遞領域所關心的一些基本問題， 因此產品具有較好的全面性。
具體實施方法
一下通過實施例對本發明作進一步的說明，但這些實施實例不限 制本文的保護範圍。
一種具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的製備方法，包括下述步驟
第一步將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性-
將一定量的氯化鐵和氯化亞鐵(摩爾比2: 1)溶解在水中，通 氮氣半小時，升溫到60°C，加入適量的氫氧化鈉溶液，製成四氧化 三鐵納米粒子；
然後緩慢的向反應體系中滴加適量油酸，所得到的反應體系穩定 IO分鐘之後，加熱到9(TC反應半個小時，反應自然冷卻到常溫後，
用lmol/L的鹽酸溶液調節反應體系pH到4。然後用磁鐵吸引分離， 產物用水洗滌5次，接著再分別用無水乙醇和丙酮各洗滌三次，最終 得到的產物用環己垸分散保存，得到穩定的磁流體。 第二步在四氧化三鐵納米粒子表面包覆聚N-異丙基丙烯醯胺，制 成具空腔結構的複合種子微球-
四氧化三鐵納米粒子和NIPAM單體投料質量比為1: 10。
將0.625g磁流體(固含量5.6%)經丙酮和無水乙醇洗滌後，加 入0.5g溶劑乙酸丁酯和10mg AIBN，分散均勻後，和SDBS溶液 (75mg/30ml)混合，超聲形成穩定乳液；
取0. 35g NIPAM， 0. 047g MBA溶解在30ml水中，和上述乳液混 合均勻，放入100ml四頸瓶，通氮30min後，在76。C下反應4小時 停止，產物複合種子微球用水洗滌後再次分散保存。 第三步在Fe3OJPNIPAM複合種子微球表面包覆N-異丙基丙烯醯胺 和甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物，製得納米複合微球
將25g複合種子微球分散液中加入0.064g NIPAM， 0.02 GMA， 0. Olg MBA，通氮30min後，加入4mg過硫酸鉀引發劑，在76。C下反 應4個小時，產物用磁分離，用水洗滌後待用。 第四步使納米複合微球表面帶上氨基製備好的Fe3OJPNIPAM-co-PGMA納米複合微球分散液中，加入過 量的己二胺常溫下攪拌過夜，產物用磁分離，並用水洗滌多次後待用； 第五步將帶氨基的納米複合微球與葉酸結合，得到溫敏納米藥物載 體
摩爾比為1: 2: 2的葉酸，NHS， EDC溶於一定量的二甲基亞碸 (DMS0)中，攪拌活化l小時，然後將上述溶液加入到事先準備好的 微球分散液中，加入三乙胺催化劑，避光反應過夜，產物用磁分離， 用水洗滌後，並透析除去未反應的分子。 應用例
取實施例中製得的溫敏納米藥物載體5mg，加入5mg的阿黴素， 配成10ml的溶液，將溶液調節到一定pH5 10後，常溫下攪拌過夜， 產物用離心分離，冷凍乾燥，製成裝載有抗癌阿黴素的溫敏納米藥物 載體，抗癌藥物阿黴素的載藥率的重量百分比為5 50%。
權利要求
1、一種具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的製備方法，其特徵在於包括下述步驟第一步將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性；第二步在四氧化三鐵納米粒子表面包覆聚N-異丙基丙烯醯胺，製成具空腔結構的複合種子微球；第三步在複合種子微球表面包覆N-異丙基丙烯醯胺和甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物，製得納米複合微球；第四步使納米複合微球表面帶上氨基；第五步將帶氨基的納米複合微球與葉酸結合，得到溫敏納米藥物載體。
2、 根據權利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的製備方法，其特徵在於第一步中，採用超順磁性的四氧化三 鐵納米粒子，親油改性為將四氧化三鐵納米粒子表面通過親油劑改 性，所述的親油劑為油酸、油胺、三正辛基氧磷中的一種。
3、 根據權利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的製備方法，其特徵在於第二步中，所述的複合種子微球中四 氧化三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯醯胺單體的質量比為1: 5 15，粒徑在80 120nm。
4、 根據權利要求1或3所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米 藥物載體的製備方法，其特徵在於第二步中，複合種子微球的製備 方法為將第一步四氧化三鐵納米粒子改性中獲得的磁流體洗滌後，加入 溶劑和偶氮二異丁腈，分散均勻後，和十二烷基苯磺酸鈉溶液混合， 超聲形成穩定乳液；再將N-異丙基丙烯醯胺單體和N, N'-亞甲基雙丙烯醯胺溶解， 與所述穩定溶液混合，進行四氧化三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯醯 胺單體的聚合；反應過程條件為先通氮氣20 50分鐘，再在反應溫度70 80 'C下反應3 6小時。
5、 根據權利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的製備方法，其特徵在於第三步中，所述的納米複合微球的粒 徑在180 220nm。
6、 根據權利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的製備方法，其特徵在於第四步中，使得納米複合微球表面帶上氨基的方法為納米複合微球與氨基試劑反應，所述的氨基試劑為己二胺、乙二胺、丁二胺、巰基乙胺中的一種。
7、 根據權利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的製備方法，其特徵在於第五步中，先將葉酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀醯亞胺在溶劑中混合進行活化反應，再與帶氨基的納米複合微球反應。
8、 針對權利要求1 7之一所述的製備方法獲得的具有磁性和葉酸雙 重耙向的溫敏納米藥物載體，以四氧化三鐵為核，以N-異丙基丙烯 醯胺與甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物為殼的空腔結構，表面修飾有 葉酸靶向分子，粒徑在180 220nm。
9、 根據權利要求8所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體，其特徵在於溫敏納米藥物載體的磁飽和強度範圍為5emu/g 40emu/g;相轉變溫度為32 42°C 。
10、 針對權利要求8或9所述的溫敏納米藥物載體的用途，用於裝載 抗癌藥物阿黴素，抗癌藥物阿黴素的載藥率的重量百分比為3 60%。
全文摘要
本發明涉及一種具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的製備方法，包括下述步驟將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性；在四氧化三鐵納米粒子表面包覆聚N-異丙基丙烯醯胺，製成具空腔結構的複合種子微球；在複合種子微球表面包覆N-異丙基丙烯醯胺和甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物，製得納米複合微球；使納米複合微球表面帶上氨基；將帶氨基的納米複合微球與葉酸結合，得到溫敏納米藥物載體。產品相轉變溫度為32～42℃，用於裝載抗癌藥物阿黴素。優點是製備工藝清晰全面，得到的納米藥物載體具有磁靶向性，葉酸靶向性，溫度敏感性以及空腔結構等多種功能，並且在細胞實驗中表現出了很好的應用效果，是一種較為理想的藥物載體。
文檔編號A61K47/34GK101411877SQ20081020278
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月14日 優先權日2008年11月14日
發明者汪長春, 陳立波 申請人:復旦大學