一種人β珠蛋白基因及其重組腺相關病毒載體的製作方法
2023-09-21 08:03:35 1
專利名稱：一種人β珠蛋白基因及其重組腺相關病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，特別涉及一種含有人3珠蛋白基因啟動子的 人e珠蛋白基因及含有其的重組腺相關病毒載體，以及該重組載體的製備方 法和在e地中海貧血的基因治療中的應用。
背景技術：
P地中海貧血(海洋性貧血)是一組以血紅蛋白的P珠蛋白肽鏈合成減 少或缺失為特徵的遺傳性血液病。該病在地中海流域及東南亞發病率高達
10%。我國廣東、廣西地區檢出率可達3-4%。重型P-地中海貧血嚴重威脅 患兒生命，目前臨床治療主要依靠輸血，而長期輸血易引起體內鐵負荷過度， 過多吸收的鐵超出血清轉鐵蛋白的能力沉積臟器，引起多器官病變，且不能 達到根治的目的。造血幹細胞移植雖能醫治部分患者，但受供體來源及移植 後併發症等影響，難於廣泛應用。因此尋找有效治療手段是臨床醫生和患者 的急切願望。
將P-珠蛋白基因導入患者的造血幹細胞是最有希望的治療形式之一。 已有研究報導用逆轉錄病毒載體介導外源3珠蛋白基因轉入小鼠體內，可檢 測到外源P珠蛋白基因的低表達，相繼有報導，逆轉錄病毒載體整合具有隨 機性，可導致插入突變，激活原癌基因或抑癌基因失活引發惡性腫瘤 (屍rac.廳.y4cad 園，1995， 92: 6728~6732; Sc/e"ce，2003， 302:415-419)。 近年來，有研究報導用慢病毒載體能高效介導外源P珠蛋白基因在小鼠體內 穩定長期表達，但其生物安全性仍有待改進(iVa^w .2000,406:82-86)。
腺相關病毒(AAV)是細小病毒家族的一員，為無包膜的線性單鏈DNA 病毒。由於AAV具有長期潛伏於人體而不具有任何明顯致病性等優點，人
們對AAV作為一種理想的基因治療載體給予了很大期望。但是，近來發現，
這類載體在應用上有許多明顯的缺陷，包括某些細胞膜上病毒受體數量極
少，重組AAV載體位點特異性整合不足，AAV衣殼成分和轉基因產物引起 宿主的免疫反應，載體容量小(Cw^Tbp.M/cra6/o/./附mw"o/. 1996,218:1 -23; 屍rac.A^L4cad t/5^,1990,87:2211-2215)，裝載的目的基因片段大小受一 定的限制等等。因此，能否將P-珠蛋白基因導入腺相關病毒載體並獲得穩 定的表達還是個未知數。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種能在體內穩定長期表達，生物安全 性更高的重組腺相關病毒載體及其製備方法，以及適於該載體的含有人P珠 蛋白基因啟動子的人3珠蛋白基因。
由於用病毒載體介導外源正常的P -珠蛋白基因轉導造血幹/祖細胞，隨 造血幹/祖細胞在體內的增殖和分化使外源P-珠蛋白基因得到持久而穩定的 表達，以糾正血紅蛋白P珠蛋白肽鏈合成減少或缺失，是3地中海貧血基因 治療的策略。本發明人曾選用與人類疾病無相關性、生物安全性較好的腺相 關病毒作為載體，構建了包括腺相關病毒的反向末端重複序列ITR，人P-珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、 HS3和HS4片段(HS234)，以及含有 人e珠蛋白基因啟動子的人P珠蛋白基因序列(e-globin)的重組腺相關病 毒載體。將上述重組腺相關病毒載體轉染e地中海貧血小鼠的骨髓造血幹/ 祖細胞，並將其移植入受體小鼠，在該小鼠體內可檢測到外源人P-珠蛋白 基因並有表達，可持續12個月(參見Tan Mengqun, Qing Keyun， Zhou Shangzhen， et al. Adeno-associated virus 2-mediated transduction and erythroid lineage-restricted long-term expression of the human beta-globin gene in hematopoietic cells from homozygous beta-thalassemic mice. Mol Ther, 2001,3(6):940~946.)。然而，該重組載體中的P-globin序列，以及HS234核
苷酸序列均克隆自含有其的質粒，這些質粒並非商業質粒，公眾不能取得； 且由於帶有適於質粒的修飾片段，上述核苷酸序列，特別是e-globin序列較 長(>3kb)，表達效率低。
本發明人在上述試驗基礎上，直接從人0 -珠蛋白基因Genomic DNA中 分別克隆了 HS2、 HS3和HS4核苷酸序列，以及含有人P珠蛋白基因啟動 子的P-globin序列，將其導入腺相關病毒構建重組載體。本發明人驚奇地發 現，由於導入的P-globin序列〈3kb，為2472kb，更適合現有腺相關病毒載 體。將該重組載體轉染缺乏人3-珠蛋白基因表達的K562細胞株，可檢測到 外源人P -珠蛋白基因在該細胞的表達；用該重組腺相關病毒載體轉染P地 中海貧血小鼠的骨髓造血幹/祖細胞或流產3地中海貧血胎兒造血細胞，將其 移植入受體小鼠，在該小鼠體內可檢測到外源人P -珠蛋白基因並有表達， 且持續穩定表達一年以上。
因此，本發明提供的一種含有人e珠蛋白基因啟動子的人e珠蛋白基 因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。
而本發明的一種重組腺相關病毒載體，其在腺相關病毒的反向末端重複 序列ITR之間插入有人P -珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、 HS3和HS4 片段(HS234)，以及上述含有人P珠蛋白基因啟動子的人P珠蛋白基因的 核苷酸序列。
較佳地，所述HS2、 HS3和HS4片段也分別從人P -珠蛋白基因Genomic DNA中直接克隆得到，HS2的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示(386bp)， HS3片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示(225bp) ， HS4片段的核苷酸 序列如SEQIDN0.4所示(279bp)。
根據本發明，所述的腺相關病毒選用現常用的AAV2型。 而本發明一較佳實施例的重組腺相關病毒載體的製備方法，可以包括下 列步驟
①將人e-珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、 HS3和HS4片段依次插
入pCRlI-TOPO載體，構成載體pCRlI-HS234;
② 將含有人P珠蛋白基因啟動子的人P珠蛋白基因序列(e-globin)插 入經EcoRI酶切的質粒pBSII-SK，構建成載體pBSII-hP-globin;
③ 用EcoR V與Not I將P -globin從pBS II -h P -globin上切出，與用同 樣酶切的pCRlI-HS234連接，構建成載體pCRlI-HS234- P -globin;
④ 用Sac I與Not I將人P -珠蛋白基因簇增強子核心序列1 234片段及 e-globin序列(HS234-P-globin)從pCRlI-HS234-P畫globin上切出，與質 粒pAAV-IRES-hrGFP用Not I酶切後形成的片段連接，構建成質粒 pAAV-HS234-h P -globin，即重組腺相關病毒載體pAAV/ 3 -globin;
上述構建過程如圖1所示。
其中，步驟①、②中的載體還可以選擇其它適用的載體，可以是根據文 獻自行構建，也可以是商業化產品，主要考慮酶切位點，便於插入即可；而 步驟④中的腺相關病毒載體可以是現有任何含有反向末端重複序列ITR的 AAV載體，特別是AAV2，如pAAV-rGFP等。
同常規，本發明製備方法還包括包裝純化該重組腺相關病毒載體pAAV/ 3 -globin的步驟將pAAV/e -globin及輔助質粒pAAV-RC、 pHelper共三 種質粒共轉染至包裝細胞，經常規氯化銫超速離心純化方法製得純化病毒載 體rAAV/P-globin。
根據本發明，所述的包裝細胞可以是現有技術中常用的包裝細胞，例如 人胚腎細胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細胞BHK-21等，本發明以前者為 例。
而所述的轉染優選採用磷酸藥共沉澱法。
本發明重組腺相關病毒載體轉染缺乏人e-珠蛋白基因表達的K562細 胞株，可檢測到外源人e-珠蛋白基因在該細胞的表達；用該重組腺相關病 毒載體轉染P地中海貧血小鼠的骨髓造血幹/祖細胞或流產P地中海貧血胎 兒造血細胞，將其移植入受體小鼠，在該小鼠體內可檢測到外源人3-珠蛋
白基因並有表達，且持續穩定表達一年以上。
因此，本發明重組腺相關病毒載體可以用於製備基因療法治療P地中海 貧血的藥物。
另外，本發明還提供一種轉染有上述重組腺相關病毒載體的造血幹/祖細 胞。較佳地，造血幹/祖細胞在轉染前採用羥基脲預處理過，可明顯地提高表 達效率。所述的造血幹/祖細胞可移植入患體，用於治療e地中海貧血，故而 可用於製備治療P地中海貧血的藥物。
圖1為本發明重組腺相關病毒載體pAAV/P -globin的構建圖。
圖2顯示本發明重組AAV DNA拯救、複製的經0.8%瓊脂糖膠電泳印跡
雜交放射自顯影圖。
圖3顯示了用slot blot檢測純化重組病毒載體rAAV/P -globin的滴度。 圖4顯示了用PCR和RT-PCR檢測導入的外源P -globin基因在K562
細胞的表達。
圖5顯示了用PCR和RT-PCR檢測經ex vivo途徑轉入小鼠體內的人0 -globin基因。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。
下面實施例中所採用的分子生物學技術可參見J.薩母布魯克等編的《分 子克隆實驗指南》；所使用的工具酶均購自New England Biolab公司，具體 的反應條件和使用的方法均參考商品說明書；所使用的膠回收試劑盒購自博 大泰克生物基因公司，使用方法參考商品說明書。
實施例1 構建重組腺相關病毒載體pAAV-HS234-h P -globin
(1)HS234片段
根據現有HS2、HS3及HS4片段序歹u(Nucl Acid Res 1994. 22:1006-1011;
EMBO J 1993. 12:1077-1085; Nucl Acid Res 1990. 9:2159-2167; Nucl Acid
Res 1991. 19:1413-1419; PNAS 1995. 92:6728-6732)分別設計引物①、②和③。
弓i物①P5: 5，-ttaaataagcttcagtttttccttagttcc-3 ，(如SEQ ID NO.5所示)，
P3: 5，-tctagaatatgtcacattctgtct-3,(如SEQ ID NO.6所示)；
弓i物②P5: 5，-tggtgtgccagatgtgtctatcag-3，(如SEQ ID NO.7所示)，
P3: 5，-gatatcgctgctatgctgtgcctccccca畫3，(如SEQ ID NO.8所示)； EcoRV
弓i物③P5: 5，畫ggaccccagtacacaagaggggacgca-3 ，(如SEQ ID NO.9所示)，
P3: 5,-g§^ggaatgggagggagagtctctg-3，(如SEQ ID NO. 10所示)。 EcoRV
從來源於正常人外周血單個核細胞提取的人P -珠蛋白基因Genomic DNA[基因庫登錄號U01317,提取工藝來自Molecule Biology( the second edition): 9.16 Analysis and Cloning of Eukaryatic Genomic DNA]中，用弓i物①、 ②、③經PCR方法分別獲得相應產物HS2(386bp，如SEQ ID NO.2所示)、 HS3(去除3，端引物帶入的EcoRV酶切位點，225bp,如SEQ IDNO.3所示)、 HS4(去除3，端引物帶入的EcoRV酶切位點，279bp，如SEQIDN0.4所示) 片段。其中PCR體系和條件為模板DNA (100ng) l)il， 10XBuffer 5^1， dNTP 4(il， primerl l(xl， primer2 1jj!， H20 37|al， Tag enzyme 0.5-1 pi; 94°C 5min， (94。C 30s， 60°C 40s， 72°C 40s)30次，72°C 10min， 4。C。將HS2用T/A 克隆方法插入用EcoR I酶切的pCRlI-TOPO載體(購自Invitrogen)，構建 成載體pCRH-HS2;將在3'端帶有EcoRV酶切位點的HS3插入用EcoRV 酶切的pCRlI-HS2，構建成載體pCRlI-HS23，再將同樣3'端帶有EcoRV 酶切位點的HS4插入用EcoRV酶切的pCRlI-HS23，構建成載體pCRlI -HS234。
(2)含有P -globin啟動子的P -globin基因片段 用引物
上、遊:5 ，-ccaaatattacgtaaatacac-3 ，(如SEQ ID NO. 11所示)， 下遊:5,-tgaaagagtgatagttccggga-3 ，(如SEQ ID NO. 12所示)； 從人P -珠蛋白基因Genomic DNA經PCR擴增獲得含有人P珠蛋白基 因啟動子的人P珠蛋白基因序列(P-globin)產物(2472bp，如SEQIDNO.l 所示)。其中，PCR體系DNA (lOOng) 0.5-1 |il， 10X Advantage Genomic LA buffer 2.5(xl, dNTP ljil， primerl l(il， primer2 lpl， H2018.5(il， Advantage Genomic LA Polymerase Mix 0.25;條件94。C 3min，(94。C lmin、68。C 3min、 94°C lmin)30次，68°C 10min， 4°C。將P-globin引物在5，磷酸化後獲得 的產物直接插入經EcoR I酶切的pBSlI-SK載體質粒(購自Stratagene)，構 建成載體pBSlI-hP-globin。
(3)用EcoR V與Not I將P -globin從pBS II - P -globin上切出，與用同樣 EcoRV與Notl酶切的pCRlI-HS234連接，構建成載體pCRlI-HS234-P -globin 。
(4)用Sac I與Not I將HS234- P -globin從pCR II-HS234- P -globin上 切出，亞克隆至用Notl酶雙切的載體pAAV-IRES-hrGFP(購自Stratagene) 中，構建成重組腺相關病毒載體pAAV-HS234-hP-globin，簡稱pAAV/P -globin 。
上述構建過程如圖l所示。
採用人胚腎HEK293細胞(購自ATCC)2X 106/皿來驗證重組AAV DNA 的複製用磷酸鈣共沉澱法，同時轉染重組AAV載體質粒(pAAV-HS234-h P -globin 10嗎)和輔助質粒pAAV2-kC (購於Stratagene公司)、pHelper (購 於Stratagene公司)各10嗎，分別於24、 48、 72小時後收集細胞，用Hirt's 溶液提取小分子量DNA，經DpnI消化，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Southern 轉移至硝酸纖維素濾膜，然後與"P標記P-globin基因探針進行雜交，結果 如圖2所示，檢測到基因組的兩種複製形式(單體型M、 二倍體型D)，表 明pAAV-HS234-h P -globin結構完整，能夠在細胞內有效介導病毒基因組的
拯救、複製。
實施例2純化重組腺相關病毒載體rAAV/ P -globin的獲得 將HEK293細胞作為包裝細胞，用DMEM培養液、10%新生牛血清傳 代培養，細胞生長至80%-85%融合，採用磷酸鈣共沉澱法將實施例1製得的 pAAV-HS234-0-globin和輔助質粒pAAV2-RC、 pHelper共三質粒共轉染 HEK293細胞，各質粒10pg/皿(10cm)，取5 ml的1.5mol/L的CaCl2，加 水至20ml，混勻，逐滴加2x Buffer A (50mM Hepes， 1.5mM Na2HP04， 280rnM NaCl， pH7.05)25ml，混勻靜置5分鐘，出現白色雲霧狀，即開始轉染293 細胞，2ml/皿，繼續置二氧化碳培養箱5%C02、 37°C、飽和溼度培養65-70 小時，收集細胞放入-7(TC冰箱凍存。接下來進行純化，將凍存的細胞物從-70 "C取出置37t:水浴箱中30分鐘，反覆凍溶兩次，加氯化銫用超速離心(速 度35，000轉/分，15°C、 48小時)，分離出重組病毒，再經透析(透析袋型號 10000 MWCO)、濃縮離心管10000 MWCO (millipore.com)離心獲取純化 重組病毒rAAV/ 3 -globin。
用32P標記的P -globin為探針通過狹縫雜交(slot blotting)檢測rAAV/ 0-globin滴度(見圖3)。具體操作以AAV2標準質粒為對照，待測純化 重組病毒rAAV/ P -globin計微升數(pl)上樣，分別以1: 2對倍稀釋連續上樣 於硝酸纖維素膜上，用^P標記P-globin基因為探針進行雜交。圖中第l、 2 排為對照組，上樣濃度第1排按順序依次為10ng/^d、 5ng4d、 2.5ng年l……遞 減，第2排按順序依次為lng/W、 0.5ng/|al、 0.25ng一 遞減；第3、 4排
為本發明純化重組病毒rAAV/ P -globin樣品1 ，第3排上樣量按順序依次為 1(^1、 5^1、 2.5^1 遞減，第4排上樣量按順序依次為lpl、 0.5^1、 0.25^1……
遞減；第5、 6排為本發明純化重組病毒rAAV/e-globin樣品2，上樣順序同 樣品1，可見，樣品1和2滴度相差較大，樣品2未作進一步離心濃縮處理。 記算結果如圖可見本發明純化的重組腺相關病毒載體rAAV/e -globin滴度 第4排第1號相當於第一排第二號；5ng/l^ilX2X108particles4il =1.0 x10 particles./ml o
實施例3 用PCR和RT-PCR檢測導入的外源P -globin基因在K562細
胞中的表達
無菌條件下，取12X 106個懸浮於含10%新生牛血清的RPMI 1640培養 液中生長狀態良好的K562細胞，分為未經預處理對照組(8乂106細胞)與 用羥基脲預處理組(4X1S細胞)，未經預處理對照組加適量用於溶解羥基 脲的溶液1XPBS;預處理組加入終濃度為15mmol/L羥基脲，置二氧化碳培 養箱5%<:02、 37°C、飽和溼度培養4小時，分別收集細胞，用1XPBS洗細 胞一次，未預處理對照組又分為對照組與實驗組，分別用無血清RPMI1640 培養液150-200^1重懸細胞，對照組加16plRPMI 1640培養液、實驗組與預 處理組分別加16^1 (相當於50MOI)實施例2獲得的重組腺相關病毒載體 rAAV/P-globin，在上述條件下培養，每隔10-15分鐘搖勻一次，轉染2小 時後，用1XPBS洗細胞，再用含10。/。新生牛血清的RPM 11640培養液重懸 細胞，繼續在上述條件下培養72小時，收集細胞分別提取DNA和RNA， 完成PCR和RT-PCR檢測(具體步驟參見Tan Mengqun, Qing Keyun, Zhou Shangzhen, et al. Adeno-associated virus 2-mediated transduction and erythroid lineage-restricted long-term expression of the human beta-globin gene in hematopoietic cells from homozygous beta-thalassemic mice. Mol Ther， 2001，3(6):940~946.)。結果如圖4所示，圖中泳道1、 5號為對照K562細胞 組，2、 3、 4、 6、 7、 8號為K562細胞被rAAV/e-globin轉染組，其中4、 8 號為加羥基尿預處理再轉染組。結果提示K562細胞存在3 -globin但不表達， 轉染後的K562細胞，能檢測到外源3 -globin的表達，並且羥基尿預處理可 提高表達效率。
實施例4用PCR和RT-PCR檢測經ex vivo途徑導入的外源人P -globin 基因在受體小鼠中的表達
處死5隻P地中海貧血小鼠，衝取其四肢骨骨髓細胞，用淋巴細胞分離
液離心分離單個核細胞，用抗體標記(Sca-l+Lin-標記抗體B220、CD4、 CD8a Mac-l、 GR-1、 Fitc isotype 2a、 PE-Sca畫l、 PE-isotype 2b)，經流式細胞儀分 選造血幹/祖細胞(Pettersson et al祝o/. 2000 67 (3): 423,431)，將其 分為未預處理對照組與羥基脲預處理組，分別用50MOI rAAV/P -globin轉染 2小時，收集細胞洗後懸浮於RPMI 1640培養液中，調整細胞濃度至8X 104/ml。經尾靜脈注入受亞致死劑量(7.0Gy)照射的受體小鼠(與P地中海貧 血小鼠同品系)，用未預處理對照細胞與經羥基脲預處理細胞各5隻，每隻 注0.3ml含細胞2X 104，移植後3個月，取外周血來源的血細胞DNA，用 PCR擴增，人P-globin基因作探針，Southern blot分析其中5隻陽性，未預 處理對照組2隻，經羥基脲預處理組3隻。移植後6個月同上檢測，仍5隻 陽性。處死各組陽性小鼠l只，提取骨髓細胞來源的DNA和RNA，用PCR 和RT-PCR檢測示人P-globin基因存在，且有表達。移植後一年仍維持有3 只陽性小鼠，處死後檢測人P-globin基因存在且發現有紅系特異性表達，結 果如圖5所示。
序列表
譚孟群
—種人P珠蛋白基因及其重組腺相關病毒載體
<130〉 P4-071217C
12
Patentln version 3.3
1
2472
DNA
人(human)
1
ccaaatattacgta犯tac3cttgc犯aggsggatgttttt3gt3gC犯tttgtax:tgat60
ggtatggggcc犯gagatatatcttagsggg郷gctgagggtttg卿tccaactccta120
已gccagtgccaggac鄉tacggctgtcatcacttagacctcaccctgtg180
gagccacaccct鄉gttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggc240
agtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtg300
ttcactagcaacctcaaacagaC3CC3tggtgcacctgactcctg鄉sgaagtctgccg360
ttactgccctgtggggc犯ggtgaacgtgg3tg犯gttggtggtgaggccctgggcaggt420
tggtatc犯ggttacaagac鄉ttt卿gagaccaataga^3Ctgggcatgtgg卿ca480
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2
386
DNA
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2
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tgagacagaa tgtgacatat tctaga 386
3
225
DNA
人(human)
<400〉 3
tggtgtgcca gatgtgtcta tc卿ggttc caggg鄉gt ggggtggggt cagggctggc 60 caccagctat cagggcccag atgggttata ggctggcagg ctc卿tagg tggttaggtc 120
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4
279
DNA
人(human)
4
ggaccccagt acacaagagg
tgtgagaata agaatagcca
actcagcagc tatgagatgg
cagcaatggg cagggctctg
aaggggtgga ctcc卿gac
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30
DNA
人工序列(Artificial)
引物
5
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30
6
24
DNA
人工序列(Artificial)
引物
6
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24
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人工序列(Artificial)
引物
7
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8
29
DNA
人工序列(Artificial)
引物
8
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9
27
DNA
人工序列(Artificial)
引物
9
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10
28
DNA
人工序列(Artificial)
引物
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11
21
DNA
人工序列(Artificial)
引物
11
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12
22
DNA
人工序列(Artificial)
引物
12
tgaaagagtg atagttccgg ga 2權利要求
1、一種含有人β珠蛋白基因啟動子的人β珠蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 一種重組腺相關病毒載體，其在腺相關病毒的反向末端重複序列ITR 之間插入有人e-珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、 HS3和HS4片段，以 及如權利要求1所述的人P珠蛋白基因的核苷酸序列。
3、 如權利要求2所述的重組腺相關病毒載體，其特徵在於所述的HS2 片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，HS3片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，HS4片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
4、 如權利要求2或3所述的重組腺相關病毒載體，其特徵在於所述的 腺相關病毒為AAV2型。
5、 一種如權利要求4所述的重組腺相關病毒載體的製備方法，其包括 下列步驟-① 將人P-珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、 HS3和HS4片段依次插 入pCRlI-TOPO載體，構成載體pCRH-HS234;② 將含有人P珠蛋白基因啟動子的人P珠蛋白基因的核苷酸序列插入 經EcoRl酶切的質粒pBSII-SK，構建成載體pBSlI-he-globin;③ 用EcoRV與Notl將人e珠蛋白基因的核苷酸序列從pBSlI-he -globin上切出，與用同樣酶切的pCRlI-HS234連接，構建成載體pCRlI -HS234- P -globin;④ 用Sac I與Not I將人P -珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、 HS3和 HS4片段，以及人e珠蛋白基因的核苷酸序列從pCRlI-HS234-P -globin上 切出，與質粒pAAV-IRES-hrGFP用Notl酶切後形成的片段連接，構建成質 粒pAAV-HS234-h P -globin，即重組腺相關病毒載體pAAV/ e -globin;上述構建過程如圖1所示。
6、 如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其還包括包裝純化該重 組腺相關病毒載體pAAV/ 0 -globin的步驟將pAAV/ P -globin及輔助質粒 pAAV-RC、 pHelper共三種質粒共轉染至人胚腎細胞HEK293包裝，經常規 純化方法，製得純化病毒載體rAAV/ P -globin。
7、 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於所述的轉染採用磷酸,丐 共沉澱法。
8、 如權利要求2~4任一項所述的重組腺相關病毒載體在製備基因療法 治療P地中海貧血的藥物中的應用。
9、 一種轉染有權利要求2~4任一項所述的重組腺相關病毒載體的造血 幹/祖細胞。
10、 如權利要求9所述的造血幹/祖細胞，其特徵在於其在轉染前採用羥 基脲預處理過。
全文摘要
本發明公開了一種含有人β珠蛋白基因啟動子的人β珠蛋白基因及含有其的重組腺相關病毒載體，以及該重組載體的製備方法。該重組腺相關病毒載體在腺相關病毒的反向末端重複序列ITR之間插入有人β-珠蛋白基因簇增強子核心序列HS2、HS3和HS4片段，以及該含有人β珠蛋白基因啟動子的人β珠蛋白基因序列。該重組載體轉染效率高，介導的外源基因可在體內長期表達，且安全性好，可用於β地中海貧血的基因治療。
文檔編號C12N15/12GK101348786SQ200710044040
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月20日 優先權日2007年7月20日
發明者譚孟群 申請人:譚孟群