腸道微生物群和GVHD的製作方法
2023-09-21 17:28:40 1
關於聯邦政府資助的研究或開發的聲明
本發明是在美國政府支持下根據國家衛生研究院(nationalinstitutesofhealth)的基金號r01hl069929、r01-ai080455、r01-ai100288、r01-ai101406、p01-ca023766和p01-ca023766以及美國國家過敏和感染性疾病研究所(u.s.nationalin-stituteofallergyandinfectiousdisease)的合同hhsn272200900059c作出的。政府享有本發明的某些權利。
本發明大體上涉及移植物抗宿主病(gvhd)。更具體地說，本發明涉及腸道菌種作為gvhd嚴重程度/死亡率的預測因子的作用並且告知了用於降低gvhd相關發病率的策略。
背景技術：
儘管接受同種異體骨髓移植(allobmt)的患者的結果得到持續改善，但是gvhd仍然是這一群體中死亡的主要原因1。現代的免疫抑制策略在預防gvhd方面只是部分有效的並且同時增加了感染和疾病復發的風險。減少gvhd，但是保持免疫功能完整的策略因此可以潛在地改善結果。一種這樣的策略是以存在於我們的腸道內的複雜微生物群落為靶標，該群落被統稱為腸道微生物群。
微生物群與gvhd之間的關係長期以來一直被懷疑，但是仍未得到充分了解。在無菌條件下接受移植2或接受腸道去汙抗生素3的小鼠產生不太嚴重的gvhd。臨床研究最初提出了來自接近總細菌去汙的益處4,5，但是後來沒有顯示出明顯的益處6-8，並且這種方法在20世紀90年代早期中止9。部分腸道去汙繼續被實施，但是關於最佳抗生素知之甚少。一項研究發現將甲硝唑(metronidazole)添加到環丙沙星(ciprofloxacin)中使得急性gvhd顯著減少，這表明厭氧細菌可能促進gvhd發病10。
然而，最近的研究表明這種方法可能不是理想的。在allobmt期間施用甲硝唑與腸道內萬古黴素(vancomycin)抗性的腸球菌屬(enterococcus)的增加有關，這在一些患者中在腸球菌菌血症之前發生11。其它研究已經發現腸內的專性厭氧菌、特別是梭菌屬菌種，其是腸道穩態的重要介質並且通過上調腸道調節性t細胞來預防炎症12。
最近，據報導，在植入時細菌多樣性增加與allobmt後總體存活率改善以及移植相關死亡率降低有關13。然而，所研究的群體是異質性的，並且特別是包括45％的接受t細胞去除性同種異體移植的患者。這種類型的移植的接受者有低得多的產生gvhd的風險。可能由於患者數目不足以及異質性，因此不可能確定與低多樣性相關的非復發死亡的亞類，包括gvhd、感染以及器官衰竭。
因此，對利用腸道微生物群與gvhd之間的關係的治療存在需要。
技術實現要素：
本公開是基於以下觀測結果，即移植物抗宿主病與骨髓和/或造血幹細胞移植期間出現的腸道微生物群的主要變化相關，這表明共生細菌可以是gvhd風險和嚴重程度的預測因子和調節劑。
本公開因此涉及用於在骨髓或造血幹細胞移植期間預防受試者的哺乳動物細菌胃腸道微生物群的喪失或使其恢復，以預防gvhd、降低gvhd的嚴重程度或治療gvhd的方法和組合物。本公開涵蓋了用於首先預防相關細菌的喪失、用於恢復已經持續喪失保護性細菌的受試者的細菌以及支持內源性種群或重新入駐的細菌的幾種方法或其組合。所述方法包括：
(1)選擇對專性厭氧細菌具有較低的活性的抗生素作為保護內源性保護性細菌和防止其喪失的途徑；
(2)提供支持內源性種群或重新入駐的有益細菌生長的益生元；以及
(3)在有益細菌已經喪失的情況下，提供益生菌，也就是說，向所述受試者施用治療有效量的包含一種或多種有益細菌的治療性組合物以重新入駐胃腸道。
在一個方面，本公開涉及一種用於恢復例如由於暴露於對厭氧菌具有高活性的抗生素而已經喪失的胃腸道細菌的方法，所述方法包括向需要這樣的治療的受試者施用有效量的來自梭菌目(clostridiales)的至少一種細菌或其組合。在一個實施方案中，口服施用所述細菌。或者，可以經直腸，例如通過灌腸來施用細菌。
在一個相關方面，本公開涉及用於減少移植物抗宿主病(gvhd)和gvhd相關死亡率的組合物。它是基於以下觀測結果，即腸道微生物群存在與gvhd相關死亡率相關的變化。具體來說，包括使木糖、棉子糖、纖維二糖或松三糖發酵的一些生物體的某些細菌菌種的存在在減少gvhd相關死亡率方面是特別有效的。
在一個方面，本公開涉及一種在接受骨髓移植或造血幹細胞移植的受試者中降低產生移植物抗宿主病(gvhd)的風險和/或治療gvhd的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含來自梭菌目的一種或多種細菌的治療性組合物，其中所述組合物
(i)刺激在移植之前或在移植之後在所述受試者的微生物群中表現不足的一種或多種細菌類群的生長或活性；或
(ii)抑制在所述受試者的微生物群中過度表現的一種或多種細菌類群的生長或活性。
在另一個方面，本發明涉及一種用於降低受試者的gvhd的可能性、發生率或嚴重程度的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含梭菌目的至少一種菌種的組合物。在一些實施方案中，所述生物體包含16srdna，所述16srdna具有基因庫x94966的核苷酸序列，即選自seqidno:1、3、4、5、7、8、9、12以及15的核苷酸序列或與所述序列中的任一個具有約98％至100％同一性的序列；在一些實施方案中，是與之具有約99％-100％同一性的序列；在其它實施方案中，是與之具有約99.5％-100％同一性的序列。在一些實施方案中，所述治療性組合物包含選自以下屬的細菌：布勞特氏菌屬(blautia)、瘤胃球菌屬(ruminococcus)、真桿菌屬(eubacterium)、霍爾德曼氏菌屬(holdemania)、以及梭菌屬(clostridium)。在一些實施方案中，所述細菌為選自以下者：卵形瘤胃球菌(ruminococcusobeum)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、eubacteriumdesmolans、dorealongicatena、乳酸瘤胃球菌(ruminococcuslactaris)(blautiaproducta)、異型桿菌(eubacteriumcontorum)、糞瘤胃球菌(ruminococcusfaecis)、絲狀霍爾德曼氏菌(holdemaniafiliformis)、索氏梭菌(clostridiumsordelli)以及其組合或混合物。
在一些實施方案中，所述布勞特氏菌屬菌種是blautiaproducta。
在一個相關方面，因此，本發明涉及一種治療性組合物，所述治療性組合物包含梭菌目菌種。在一些實施方案中，所述生物體包含16srdna，所述16srdna具有基因庫x94966的核苷酸序列、即選自seqidno:1、3、4、5、7、8、9、12以及15的核苷酸序列或與所述序列中的任一個具有約98％至100％同一性的序列；在一些實施方案中，是與之具有約99％-100％同一性的序列；在其它實施方案中，是與之具有約99.5％-100％同一性的序列。在一些實施方案中，所述治療性組合物包含選自以下屬的細菌：布勞特氏菌屬、瘤胃球菌屬、真桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬、以及梭菌屬。在一些實施方案中，所述細菌為選自以下者：卵形瘤胃球菌、哈氏梭菌、eubacteriumdesmolans、dorealongicatena、乳酸瘤胃球菌(blautiaproducta)、異型桿菌、糞瘤胃球菌、絲狀霍爾德曼氏菌、索氏梭菌以及其組合或混合物。
在另一個相關方面，本發明涉及一種用於降低gvhd的可能性或預防gvhd的方法，其中在allobmt之前約1周至約2周，在一些實施方案中，在allbmt之前約1天至約2周，以及在一些實施方案中，在allobmt之前約7天-10天，向所述受試者施用包含梭菌目的至少一種菌種的組合物。
一種用於降低接受骨髓移植(bmt)或造血幹細胞移植(hsct)的受試者的移植物抗宿主病(gvhd)的風險、發生率或嚴重程度的方法，所述方法包括當所述受試者已經因為中性粒細胞減少性發熱而受到選自甲硝唑、哌拉西林(piperacillin)-他唑巴坦(tazobactam)(pip-tazo)、亞胺培南(imipenem)的靜脈內抗生素治療時，向所述受試者施用治療有效量的口服萬古黴素或氨苄西林(ampicillin)。
一種用於降低受試者在骨髓移植(bmt)或造血幹細胞移植(hsct)後產生移植物抗宿主病(gvhd)的風險的方法，所述方法包括：確定來自所述受試者的糞便材料樣品中嗜粘蛋白阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的豐度；以及當嗜粘蛋白阿克曼氏菌的豐度高於1％至10％時，向所述受試者施用治療有效量的選自氨苄西林和口服萬古黴素的抗生素，其中所述抗生素的施用降低嗜粘蛋白阿克曼氏菌的豐度並且降低或消除gvhd的風險。在一些實施方案中，所述樣品中嗜粘蛋白阿克曼氏菌的豐度高於2％則指示有產生gvhd的風險。在移植之前、在針對移植相關中性粒細胞減少性發熱進行抗生素治療之後或在這兩個時間確定嗜粘蛋白阿克曼氏菌的豐度。
附圖說明
圖1示出了腸道菌群的變化與gvhd相關死亡率的差異有關。a)通過16s基因測序對來自初始菌群群組中64名患者的糞便樣品的細菌組成進行分析並且使用香農指數(shannonindex)定量細菌多樣性。通過中值香農指數值(2.6)將患者分層並且分析gvhd相關死亡的累積發生率。下半部分指示香農指數低於中值的患者，而上半部分指示香農指數高於中值的患者。b)通過lefse分析來定量細菌屬與gvhd相關死亡率結果的關聯性。c)將來自初始菌群群組和後續菌群群組的患者通過中值布勞特氏菌屬豐度(這兩者均是0.05％)分層並且分析gvhd相關死亡的發生率。
圖2示出了布勞特氏菌屬豐度與allobmt之後結果的關聯性。將來自這兩個菌群群組的患者組合併且通過低於或高於0.05％的布勞特氏菌屬豐度分層，並且評價所示的結果；對於每一個單獨的群組看到類似的結果。
圖3示出了布勞特氏菌屬豐度與臨床急性gvhd的關聯性。a)將患者通過低於或高於0.05％的布勞特氏菌屬豐度分層，並且評價急性gvhd所示嚴重程度等級的進展以及需要用皮質類固醇進行全身治療的急性gvhd的進展。b)針對典型的靶器官中急性gvhd的產生來對患者進行評價。
圖4確認了allobmt患者的布勞特氏菌屬豐度的潛在決定因素。a)評價來自這兩個菌群群組的所有可用的糞便樣品中布勞特氏菌屬的豐度並且進行繪圖。使用移動平均濾波構建豐度趨勢(藍色實線；95％置信區間以灰色示出)。b)通過將患者在樣品採集之前暴露於覆蓋厭氧菌的抗生素、以及通過tpn治療的持續時間來分成子組，並且評價布勞特氏菌屬豐度。c)將在樣品採集之前沒有暴露於覆蓋厭氧菌的抗生素的患者子組進一步通過tpn治療的時間長短來分成子組，並且與在第12天相比，評價在第12天之前糞便樣品中布勞特氏菌屬的豐度。
圖5評價了對在患者群體中沒有強預測性的與gvhd相關死亡率潛在相關的其它因素。將來自組合群組的患者通過所示細菌屬的中值豐度分層(乳桿菌屬(lactobacillus)：0.2％；擬桿菌屬(bacteroides)：0.02％；veillnoella：0.03％；腸球菌屬(enterococcus)：1.3％)並且評價gvhd相關死亡的發生率。
圖6通過分類學分類等級以及與gvhd相關死亡率的關聯性來評價布勞特氏菌屬和相關細菌。將來自組合菌群群組的患者通過所示細菌分類群的中值豐度分層(厚壁菌門(firmicutes)：95％；梭菌屬(clostridia)：3.5％；梭菌目：2.9％；毛螺旋菌科(lachnospiraceae)：0.2％；布勞特氏菌屬：0.05％)並且評價gvhd相關死亡的發生率。在菌種等級上，所有三種分類群的中值豐度是0％，從而造成在分層後患者的數目不相等。卵形瘤胃球菌由於16srrna基因相似性而被認為是布勞特氏菌屬的成員，但是尚未根據《細菌學法規(bacteriologicalcode)》正式重新命名，這是因為已經不可能將這種菌種保藏在第二個國家的第二個培養物保藏中心中。
圖7在調理強度和移植物來源子組中評價布勞特氏菌屬豐度與gvhd相關死亡率的關聯性。a)將患者通過調理強度分成子組，通過低於或高於0.05％的布勞特氏菌屬豐度分層，並且評價gvhd相關死亡的發生率。b)將患者通過移植物來源分成子組，通過低於或高於0.05％的布勞特氏菌屬豐度分層，並且評價gvhd相關死亡的發生率。
圖8在抗生素和tpn治療子組中評價布勞特氏菌屬豐度與gvhd相關死亡率的關聯性。a)將患者通過暴露於具有厭氧菌活性的抗生素分組，通過低於或高於0.05％的布勞特氏菌屬豐度分層，並且評價gvhd相關死亡的發生率。b)將患者通過tpn治療的持續時間分成子組，通過低於或高於0.05％的布勞特氏菌屬豐度分層，並且評價gvhd相關死亡的發生率。
圖9示出了布勞特氏菌屬的靶向營養支持使得在gvhd環境下豐度增加並且使gvhd嚴重程度降低。在bmt前1周開始，將c57bl/6小鼠的飲用水用木糖(10g/l)處理，木糖是通常由布勞特氏菌屬發酵的一種糖。左側：在bmt之後第14天評價布勞特氏菌屬的腸道豐度，單次實驗的結果。右側：針對臨床gvhd的進展跟蹤小鼠(2次實驗的結果組合)。
圖10示出了用棉子糖進行的靶向營養支持降低了gvhd嚴重程度。在bmt前1周開始，將c57bl/6小鼠的飲用水用棉子糖(10g/l)處理，棉子糖是通常由布勞特氏菌屬發酵的一種糖。針對臨床gvhd的進展跟蹤小鼠(3次實驗的結果組合)。
圖11示出了布勞特氏菌屬在體外的生長受到在飢餓條件下約氏乳桿菌(lactobacillusjohnsonii)所釋放的因子抑制。a)將鼠類布勞特氏菌屬單獨或與鼠類約氏乳桿菌一起在有限的培養基或充足的培養基的條件下在蛋白腖酵母葡萄糖肉湯中生長，並且對活菌落進行定量。b)使約氏乳桿菌在培養基中生長到平臺期，然後無菌過濾以產生乳桿菌條件培養基。當以1:1比率與新鮮培養基混合時，評價乳桿菌條件培養基對約氏乳桿菌和鼠類布勞特氏菌屬的活力的影響。還評價了添加所示的3種還原劑的影響。
圖12示出了腸道布勞特氏菌屬豐度預測了人類的gvhd。a)評價通過布勞特氏菌屬的豐度分層的105名患者群組的腸道gvhd的發生率。b)評價通過布勞特氏菌屬豐度分層的同一群組的gvhd相關死亡率。
圖13示出了向小鼠施用布勞特氏菌屬減輕了gvhd嚴重程度。小鼠經口服用2天療程萬古黴素、2天療程的氨苄西林進行治療，然後在5天和7天後用鼠源性布勞特氏菌屬或腸球菌屬接種，然後在2周後輻照並且用b10.br骨髓和t細胞移植。a)總體存活率，來自2次實驗的組合結果。b)對t細胞種群的流式細胞術評價，單次實驗的結果，在bmt第14天對小鼠進行收集，n＝4/組。c)將小鼠如a中用抗生素和細菌處理，但是不進行bmt，並且在細菌引入之後的兩周通過hplc評價糞便的短鏈脂肪酸含量。
圖14示出了營養攝入減少似乎驅使allobmt接受者的布勞特氏菌屬喪失。a)在移植住院期間每周評價九十四名allobmt患者的腸道微生物群的變化。布勞特氏菌屬豐度由使用移動平均濾波構建的黑色實線描繪，其中95％置信帶以灰色示出。b)在從沒有接受或接受全胃腸外營養(tpn)的allobmt患者採集的糞便樣品中測定布勞特氏菌屬的豐度，所述tpn是口服攝入不足的替代標誌物。c)在移植住院期間在5名allobmt患者中收集每日營養和微生物群分析，並且分析通過kcal消耗分層的糞便樣品的布勞特氏菌屬的豐度。d)在食物消耗減少25％的一周之前和之後在小鼠中測定梭菌目(布勞特氏菌屬所屬的目)的糞便豐度。
圖15(來自shono論文中的1個)示出了用於中性粒細胞減少性發熱的厭氧菌活性抗生素的臨床使用與gvhd相關死亡率增加有關。(a)確定了從1994年到2013年在我們中心接受非t細胞去除性allo-hsct並且針對中性粒細胞減少性發熱接受抗生素的283名成人患者的回顧性群組。通過暴露於對厭氧菌具有顯著活性的抗生素將患者分層。所示的結果通過卡普蘭-邁耶圖(kaplan-meierplot)描繪並且通過對數秩次檢驗來比較曲線。(b至g)六個代表性臨床病例，其中描繪了在allo-hsct的過程期間糞便微生物群組成和抗生素治療的施用的時間過程。對於氨曲南(aztreonam)(b和c)、亞胺培南(d)、pip/tazo(e和f)、甲硝唑(b)、以及最小菌群幹擾性抗生素(g)示出了在治療環境中發生的菌群組成的動力學。(h)在用所示的抗生素治療之前和之後從接受allo-hsct的患者採集的配對糞便樣品中梭菌目的豐度變化。
圖16.與氨曲南治療相比，亞胺培南治療在小鼠中抑制厭氧共生物並且提高gvhd嚴重程度。(a)在健康的c57bl/6小鼠中用所示的抗生素處理之前和之後使用16srrna測序進行的菌群組成分析。將小鼠通過每天兩次皮下(sc)注射每一種抗生素兩天(pip/tazo：500mg/kg，其它：100mg/kg)進行治療並在後一天採集糞便樣品。值表示平均值±sem(n＝3-4)。*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.0001。數據代表了兩次獨立實驗。(b至j)將經過致死劑量輻照的129s1接受者用mhc匹配的c57bl/6t細胞去除性骨髓(tcd-bm)細胞和1×106個c57bl/6t細胞進行移植。對照小鼠僅接受tcd-bm。將接受者用亞胺培南或氨曲南進行治療(100mg/kg，sc，在allo-hsct後第10天至第24天每周3次)。(b)總體存活率的比較，來自三次獨立實驗的組合數據(n＝15-43)。****，p<0.0001。(c)將接受抗生素治療的患有gvhd的小鼠在第21天處死並且通過不知情的病理學家對靶器官中的gvhd組織學分數進行定量。數據是從三次獨立實驗組合的(n＝5-20)。*，p<0.05。(d)在第21天採集從類似於b中的那些接受亞胺培南或氨曲南治療的小鼠獲得的糞便樣品並且通過16srrna基因測序分析，繼而對加權和歸一化的unifrac距離進行主坐標分析。(e和f)通過(e)線性判別分析聯同效應量測量(lefse)以及(f)通過投影為分支圖的lefse來分析在接受氨曲南治療的接受者與接受亞胺培南治療的接受者之間的有差異的分類學豐度。數據代表了d至f中超過五次獨立實驗。(g和h)示出了在(g)目和(h)屬的系統發育等級上細菌豐度的比較。數據是從6次獨立實驗組合的(n＝32-36)。***，p<0.001。(i)在第21天採集從接受抗生素治療的患有gvhd的小鼠採集的糞便樣品，並且通過宏基因組鳥槍法序列分析、通過分類學確定的細菌菌種豐度的比較來評價。沿著x軸的數字1至6代表單個受試者。(j)比較來自接受氨曲南和亞胺培南治療的小鼠的樣品的對來自kegg基因直系同源物的序列讀段的定量的主成分分析。
圖17示出了在allo-hsct之後亞胺培南治療的結果導致結腸炎症和屏障變化。(a至g)將經過致死劑量輻照的129s1接受者用c57bl/6tcd-bm細胞和1×106個c57bl/6t細胞移植。將接受者用亞胺培南或氨曲南治療，如圖2中所述。(a)在第21天通過流式細胞術分析來自接受者的結腸固有層浸潤性白細胞。數據是從兩次獨立實驗組合的。值表示平均值±sem(n＝10-14)。*，p<0.05；**，p<0.01。(b)示出了il-23的血清、全小腸勻漿、以及全結腸勻漿水平。數據是從兩次獨立實驗組合的。值表示平均值±sem(n＝10-12)。*，p<0.05。(c)使用磁性珠粒的混合物同時針對cd11b和cd11c富集在第21天來自結腸的固有層浸潤性白細胞，並且通過實時pcr定量il-23轉錄物。數據代表了兩次獨立實驗。值表示平均值±sem(n＝3)。*，p<0.05。(d)使用免疫螢光染色來定量在第21天採集的結腸組織中的pstat3、cd3、以及dapi陽性細胞。(e)在allo-hsct之後第16天對遠端結腸的rna測序分析。前50種調節基因示於熱圖中。(f)使用免疫螢光染色來定量在第天採集的結腸組織中的cd11b、b220、以及dapi陽性細胞。數據代表了兩次獨立實驗。值表示平均值±sem(n＝7-8)。在d和f中，**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。(g)對在第21天採集的糞便樣品通過同源性對基因序列進行定量。amuc_0953(硫酸酯酶)和amuc_2164(糖基水解酶)是在從人類糞便中分離的嗜粘蛋白阿克曼氏菌atccbaa-835的基因組中發現的兩種預測的分泌的粘液溶解基因。**，p<0.01。(h至j)在第21天將來自接受者的結腸組織通過無水甲醇-卡諾依氏固定劑(carnoy'sfixative)固定，用pas染色並且通過光學顯微鏡術可視化。h中的黃色三角形指示內粘液層的位置。杯狀細胞的數目示於j中。數據代表了兩次獨立實驗。值表示平均值±sem(n＝10)。**，p<0.01。(k)以hoechst(藍色)復染的使用一般細菌16srrna基因fish探針eub338(紅色)的結腸切片的muc2(綠色)的免疫染色。數據代表了兩次獨立實驗(n＝10)。箭頭；黃色，內粘液層；紅色，穿透過粘液層和結腸上皮的細菌。
圖18接受亞胺培南治療的接受者在第21天表現出組織學gvhd。將經過致死劑量輻照的129s1接受者用c57bl/6tcd-bm細胞和1×106個c57bl/6t細胞移植。將接受者用亞胺培南或氨曲南治療(100mg/kg，sc，在第10天至第24天每周3次)。在第21天收集結腸組織。示出了蘇木精和伊紅染色的樣品(放大倍率，×200)。(左側)接受氨曲南治療的接受者；(右側)接受亞胺培南治療的接受者。這兩者均顯示出gvhd的證據。接受亞胺培南治療的組表現出更多的炎性細胞浸潤(包括中性粒細胞和淋巴細胞)、穩固的細胞凋亡以及隱窩破壞。示出了來自三次獨立實驗的代表性組織學圖像。
具體實施方式
本文所引用的所有專利、公開、申請以及其它參考文獻在此整體併入本申請中。
在實施本發明中，使用分子生物學、微生物學以及細菌學中的許多常規技術，所述技術在本領域的技術範圍內。含有本領域技術人員公知的和所依靠的標準方案的參考文獻的內容(包括製造商的說明書在內)在此以引用的方式併入本文作為本公開的一部分。
對於術語，本文所用的術語意圖根據如相關領域的技術人員已知的標準含義來解釋。為了方便起見，在此給出了一些術語的定義。
如本文所用的「患者」或「受試者」指的是哺乳動物並且包括人類和獸醫學動物。
術語「腸道微生物群」、「腸道菌群」以及「胃腸道微生物群」可互換用於指消化道中的細菌。
術語「益生菌」指的是基本上純的細菌(即單一分離株)、或所期望的細菌的混合物，並且還可以包括可以向哺乳動物施用以恢復微生物群的任何另外的組分。這樣的組合物在本文也被稱為「細菌接種劑」。
術語「益生元」指的是提高一種或多種所期望的細菌的數目和/或活性的藥劑。可用於本發明的方法中的益生元的非限制性實例包括糖類，如木糖、棉子糖、纖維二糖以及松三糖。
「治療有效量」意指細菌接種劑或化合物(例如窄譜抗生素或抗細菌劑)的量，當以此量向受試者施用以治療病症或病況時足以產生這樣的治療效果。
「布勞特氏菌屬」、「布勞特氏菌屬相關」或「布勞特氏菌屬樣菌種」是革蘭氏染色陽性的非能動菌，它們是在人類和其它哺乳動物的糞便中發現的專性厭氧菌(liu等,2008)。布勞特氏菌屬菌種包括例如producta布勞特氏菌(atccr27340-dsm2950，維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心(americantypeculturecollection,manassas,va))。布勞特氏菌屬樣菌種包括具有與producta布勞特氏菌的16srdna(基因庫x94966)具有98％至100％序列同一性(在一些實施方案中，是99.5％-100％同一性)的16srdna序列的那些菌種。許多布勞特氏菌屬相關菌種在下表1中以包括各自的16srdna序列的名稱(ncbi名稱)示出。
儘管不是梭菌目的成員，但是絲狀霍爾德曼氏菌是與更少的gvhd相關的細菌並且因此意圖作為潛在的治療劑由本公開所涵蓋。
抗生素在它們針對厭氧共生生物的活性強度方面有相當大的差異，並且在本文被指定為對厭氧菌具有高活性或低活性。對厭氧菌具有高活性的抗生素包括甲硝唑、哌拉西林-他唑巴坦(pip-taxo或p/t)以及亞胺培南。對厭氧菌具有低活性的抗生素包括氨曲南、頭孢他啶(ceftazidime)/頭孢吡肟(cefepime)、靜脈內萬古黴素、左氧氟沙星(levofloxacin)、環丙沙星、頭孢唑啉(cefazolin)、阿託伐醌(atovaquone)以及tmp-smx。
除了本領域中用於細菌鑑定的其它常規方法之外，生物體相關菌株的相關分類學特徵還可以使用從16srdna序列分析和分析特徵指數(analyticalprofileindex)細菌鑑定系統獲得的結果來確認。
對於患有血液惡性腫瘤，如白血病、淋巴瘤以及其它相關癌症的患者，同種異體血液骨髓移植(allobmt)或造血幹細胞移植(hsct)是一種至關重要的療法，在單獨的化療不能治癒時，其可以產生治癒。在全世界，每年有超過25,000名患者接受allbmt。骨髓/造血幹細胞移植的主要風險仍然是移植物抗宿主病(gvhd)，它是由供體免疫系統將移植物接受者的器官識別為外來的，從而導致危急生命的炎症所引起。開發減少gvhd，但是保持整體免疫功能完整的策略應當對患者產生重大益處。
在過去，在allo-hsct接受者中使用廣譜抗生素被認為具有對抗gvhd的保護性。以完全腸道去汙為目標施用廣譜組合，並且這在小鼠模型(36)以及在一些(37,38)、但並非所有的臨床研究(39-41)中與gvhd減少有關。類似地，將甲硝唑添加到環丙沙星中在小型隨機化研究(42)中引起gvhd減少，從而為腸道細菌促成gvhd病理生理學的假設提供了支持。
然而，最近的一系列研究已經描述了不同的關聯性，其中持續存在更嚴重的微生物群損傷的allo-hsct接受者更易於發展成嚴重的gvhd(12,14,16,43)。微生物群損傷已經以幾種方式被觀測到，包括共生腸球菌屬菌種的增加(12)、總體多樣性的喪失(14)、來自布勞特氏菌屬(梭菌目的成員)的共生生物的減少(16)、以及最近的低吲哚水平，所述吲哚由腸道細菌產生的色氨酸代謝副產物，其可以在尿液中以3-吲哚氧基硫酸鹽的形式定量(43)。與這些報導相一致，在當前研究中，我們證實了使用具有更廣活性譜的抗生素，如亞胺培南，會導致微生物群損傷增加(特別是梭菌目的喪失)以及gvhd嚴重程度增加。
對早期研究與最近的研究之間似乎不一致的充分解釋尚有待被揭示，但是一個可能的促成作用可以是包括抗性腸球菌在內的抗生素抗性細菌的升高，這可以使得難以實現成功的腸道去汙。隨時間推移已經在allo-hsct接受者中觀測到抗性生物體的定殖頻率的增加(44)。最近的研究發現，腸道去汙在嘗試其的幾乎一半的患者中是不成功的。有趣的是，與未成功去汙的患者相比，成功去汙的患者具有低得多的急性gvhd的發生率(38)。
在這項研究中，我們證實了用於治療中性粒細胞減少性發熱的不同抗生素對患者和小鼠模型二者的腸道微生物群組成有不同的影響。我們還確認了在患有gvhd的小鼠中由亞胺培南治療所產生的幾種重要的變化，包括結腸gvhd的嚴重程度、炎症性變化、以及保護性結腸粘液屏障的破壞。
一種降低gvhd的風險、發生率以及嚴重程度的有前途的方法是以存在於人類腸道內的複雜的微生物群落為靶標，該群落被統稱為腸道微生物群。雖然微生物群與gvhd之間的關係多年來一直被懷疑，但是它仍然未被完善地了解。在一些，但不是所有的中心實施用抗生素進行的腸道去汙，並且關於抗生素作用範圍的理想選擇沒有達成共識。
本文公開了如下結果，所述結果表明屬於包括布勞特氏菌屬在內的分類群梭菌目的細菌(通常存在於人類腸道中的共生生物)的豐度在所有移植患者中預示了防止危急生命的gvhd的保護作用。此外，在鼠類模型中，引入鼠源性布勞特氏菌屬菌種降低了gvhd嚴重程度。不希望受理論所束縛，它似乎是通過誘導調節性t細胞而產生短鏈脂肪酸代謝副產物(scfa)來做到這樣的。
對allbmt/hsct接受者的梭菌目和布勞特氏菌屬豐度的自然史進行表徵的另外的研究表明，絕大多數的患者開始有大量這些生物體的內源性群體，但是許多患者在移植期間以顯著的方式喪失它們。有趣的是，布勞特氏菌屬的喪失與人類和小鼠這兩者的口服營養攝入的減少強烈相關。
在一個實施方案中，在allbmt/hsct之後支持梭菌目/布勞特氏菌屬豐度的營養幹預策略提供了一種減輕gvhd的方法。在鼠類模型中已經證實這些營養方法可以成功地防止梭菌目/布勞特氏菌屬的喪失以及降低gvhd的嚴重程度。這些結果將微生物群確定為可以被募集以顯著減少gvhd的一種強效的治療靶標。
腸道微生物群組成與allobmt或hsct之後的移植物抗宿主病(gvhd)之間的關係沒有被完全了解。腸道細菌在傳統上被認為會導致gvhd，但是最近在非移植環境中進行的動物研究已經確認了具有抗炎特性的專性厭氧腸道共生生物群體。
在一項研究中，從bmt之後的第12天評價64名患者的糞便細菌組成。細菌多樣性增加與gvhd相關死亡率降低有關。此外，擁有增加量的屬於布勞特氏菌屬的細菌與這一群組中gvhd致死率降低有關，並且在另一個有51名患者的獨立群組中被確認。布勞特氏菌屬豐度還與總體存活率改善相關。評價了就臨床因素而言布勞特氏菌屬的豐度，發現布勞特氏菌屬的喪失與兩個臨床因素有關：1)用抑制厭氧細菌的抗生素治療；以及2)在更長的持續時間內接受全胃腸外營養(tpn)。屬於布勞特氏菌屬的共生細菌的豐度增加與致死性gvhd減少以及總體存活率改善有關。
在另一項研究中，回顧性地檢查283名患者在同種異體造血幹細胞移植(allo-hsct)之後的中性粒細胞減少性發熱。發現與施用對厭氧菌具有降低的活性的抗生素(如氨曲南或頭孢吡肟)相比，施用對厭氧菌具有增加的活性的抗生素(包括哌拉西林-他唑巴坦(pip/tazo)或亞胺培南-西司他丁(cilastatin)(亞胺培南))，與gvhd相關死亡率增加有關。糞便微生物群組成分析證實pip/tazo和亞胺培南的施用與細菌梭菌目的成員的更嚴重的喪失有關。在小鼠模型中進行的實驗表明在使用這些抗生素的情況下發生類似的菌群變化。此外，，在患有gvhd的小鼠中對抗生素治療進行建模，與氨曲南相比在亞胺培南的情況下再現了加重的死亡率。
本公開描述了降低gvhd的可能性、發生率或嚴重程度、預防或以其它方式治療gvhd的方法，所述方法是通過防止腸道中某些梭菌目群體的喪失或重建這些梭菌目群體來實現的。
在第一個實施方案中，本公開涵蓋了一種用於降低接受骨髓移植(bmt)或造血幹細胞移植(hsct)的受試者的移植物抗宿主病(gvhd)的風險、發生率或嚴重程度的方法，所述方法是通過採取措施來防止有益活性的喪失，例如通過在可能時避免使用對厭氧菌造成損傷的抗生素來實現的。在這個實施方案中，所述方法包括選擇/向有需要的受試者施用對厭氧細菌具有降低的活性的抗生素，所述抗生素為選自以下者：靜脈內萬古黴素、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、甲氧苄啶(trimethoprim)-磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、環丙沙星、左氧氟沙星以及阿託伐醌。
在一些實施方案中，微生物群的恢復是通過向有需要的受試者施用治療有效量的益生菌組合物來實現的，所述益生菌組合物包含有效量的來自梭菌目類群的至少一種細菌菌株、或幾種菌株的組合，其中所述組合物(i)刺激具有對抗gvhd的保護性的細菌的生長和/或活性；和/或(ii)抑制在gvhd中過度表現的細菌的生長和/或活性。對保護性細菌的支持可以營養補充劑或益生元的形式，在一些情況下，由有益細菌發酵的糖類的形式提供。本公開還考慮了抑制過度表現的細菌，例如阿克曼氏菌屬，這是通過施用將消除那些生物體並且防止有益的梭菌屬菌種被「排擠出」的抗生素來實現的。
在一個實施方案中，降低gvhd的可能性或嚴重程度的方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含來自梭菌目類群的一種或多種細菌菌種，例如已經被證實減少gvhd的布勞特氏菌屬菌種/分離株。
根據本公開的方法所施用的細菌菌株可以包含活細菌。可以同時或依次施用(包括在不同的時間施用)一種或幾種不同的細菌接種劑。這樣的細菌可以從微生物群中分離並且使用已知的技術在培養物中培養。
可以通過本領域已知的可能將生物體引入到所期望的部位的任何方法來實現細菌組合物的施用。在一個實施方案中，口服施用所述細菌。或者，可以經直腸，例如通過灌腸來施用細菌。
本發明的細菌接種劑或化合物的劑量對本領域技術人員來說將是顯而易見的。經考量多種劑量將有效實現所期望的細菌接種劑對胃腸道的定殖，例如可以通過單次劑量施用例如106、107、108、109、以及1010cfu。更低的劑量也可以是有效的，例如104和105cfu。設想了在必要時進行後續接種。
被考慮用於施用以恢復胃腸道微生物群的生物體包括下表1中所示的那些。
有益菌種的確定
用於本文所述的方法中的菌種可以包括blautiaproducta(atccr27340-dsm2950，維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)或下表1中由星號指示的那些。每年都會確定出新的布勞特氏菌屬分離株；在一些情況下，其它屬的分離株正在被重新分類為布勞特氏菌屬。因此，例如，布勞特氏菌屬樣或布勞特氏菌屬相關菌種可以包括卵形瘤胃球菌、糞瘤胃球菌；乳酸瘤胃球菌等(參見下表1)。
為了評估與gvhd相關死亡率(或任何其它結果)的關聯性，利用腳本，即使用考克斯比例風險檢驗(coxproportionalha-zardstest)計算每一種細菌的對數變換的豐度與所關注的結果的時間事件的關聯性。這具有將每一名患者在該事件之前經過的時間考慮在內的優勢。另一個主要優勢在於考克斯比例風險檢驗結果可以容易地被調整以說明可能混淆的其它潛在臨床因素的影響。在這種情況下，我們進行單變量分析以及調整移植類型(臍帶血對比外周血對比骨髓)和調理強度的多變量分析。
在操作分類單位(otu)水平上分析數據。將每一種特異性16srrna的核苷酸序列信息相對於ncbi16s資料庫進行blast以給出名稱。
一般來說，布勞特氏菌屬和布勞特氏菌屬相關菌種(包括來自瘤胃球菌屬、乳球菌屬(lactococcus)、厭氧柄菌屬(anaerostipes)、霍爾德曼氏菌屬的菌種)是革蘭氏染色陽性的非能動性細菌，它們是在人類和其它哺乳動物的糞便中發現的專性厭氧菌(liu等,2008)。被證實與gvhd具有關聯性的細菌(無論是有益的還是有害的)示於表1中，其中與更低的gvhd風險或發生率相關的那些以*指示。
表1
*與更低的gvhd風險或發生率相關
布勞特氏菌屬和布勞特氏菌屬樣菌種，特別是具有與blautiaproducta的16srrna序列(基因庫x94966)或seqidno:1、3、4、5、7、8、9、12以及15中的任一個緊密匹配(例如具有98％至100％序列同一性或在一些實施方案中，99.5％-100％同一性)的16srrna序列的那些菌株適用於所公開的方法中。
來自包括布勞特氏菌屬在內的分類群梭菌目的細菌的豐度也已經被證實在一些患者中預測了降低的gvhd相關死亡率。有趣的是，所測試的17種梭菌屬分離株中的幾種(關於表徵，參見narushima等,《誘導調節性t細胞的人源性梭菌綱的17種菌株的表徵(characterizationofthe17strainsofregulatorytcell-inducinghu-man-derivedclostridia)》,gutmicrobes5:3,333-3392014，該文獻以引用的方式併入本文)是非常近的親緣，因此可用於實施本發明的方法。
在一些實施方案中，用於確定布勞特氏菌屬或布勞特氏菌屬樣菌種或分離株是否適用於本發明的方法包括確定菌種/分離株的16srrna與producta布勞特氏菌的16srrna序列(基因庫x94966)或seqidno:1-16中的任一個的同一性百分比；用於這樣做的方法是本領域公知的。
在一些實施方案中，用於本發明中的布勞特氏菌屬菌種包括發酵某些糖，例如木糖、棉子糖、纖維二糖以及松三糖的那些布勞特氏菌屬和布勞特氏菌屬樣菌種。提供包含這些糖的營養補充劑可以適用於作為益生元策略向受試者施用以減少gvhd。
施用布勞特氏菌屬/布勞特氏菌屬相關菌種
可以同時或依次施用(包括在不同的時間施用)一種或多種不同的細菌接種劑。根據本發明的方法所施用的細菌菌株可以包含活細菌、冷凍的細菌、細菌芽孢或其組合。這樣的細菌可以從適當的微生物群來源分離或從細胞儲存庫(如美國典型培養物保藏中心/atcc)獲得並且使用已知的技術在培養物中培養。
在實施本發明的方法中，向受試者遞送布勞特氏菌屬菌種以降低gvhd的可能性、發生率、嚴重程度或者預防或治療gvhd可以使用適用於向有需要的個體施用活微生物的任何口服遞送系統來實現，例如如美國公開申請號20140112985中所述。這樣的遞送系統可以包括益生菌劑，所述益生菌劑包含已經被證實與減少的gvhd相關的活布勞特氏菌屬微生物的至少一種菌種；任選的至少一種另外的藥劑，例如腸蠕動劑；以及遞送載體，其中所述口服遞送載體將益生菌劑釋放到個體的遠端小腸。在一個實施方案中，將布勞特氏菌屬分離株與它已知要發酵的糖組合施用。
在其它實施方案中，口服遞送是經由選自丸劑、片劑、囊片、膠囊、軟凝膠劑、以及包衣益生菌顆粒的載體實現的，它們將在遠端小腸中釋放益生菌劑。本發明還提供了其中存在益生菌劑的口服遞送，其是立即釋放、延遲釋放、在遠端小腸中釋放的延長釋放、以及被靶向以在遠端小腸中釋放的靶向釋放的劑型。
實施例
患者的選擇和標本採集的方法
在一項研究中，用於回顧性分析抗生素對臨床結果的影響的受試者由在1994年至2013年在紀念斯隆凱特琳癌症中心(memorialsloanketteringcancercenter，mskcc)接受all-hsct的283名成人患者組成。接受常規移植物(非t細胞去除)的患者被包括在這項研究中；接受離體t細胞去除性移植物或圍移植期阿侖單抗(alemtuzumab)的患者被排除在外。在移植住院的過程中，每周一次採集糞便標本並且儲存。所述研究是由mskcc的機構審查委員會批准的。所有研究患者均提供關於生物標本採集和分析的書面知情同意書。
gvhd在臨床上被診斷，在可能時通過活檢在病理學上確認，並且根據如先前所述的歷史共同標準進行分類(參見rowlingspa,przepiorkad,kleinjp等,《用於將急性移植物抗宿主病分級的ibmtr嚴重程度指數：與glucksberg等級進行回顧性比較(ibmtrseverityindexforgradingacutegraft-versushostdisease:re-trospectivecomparisonwithglucksberggrade)》,brjhaematol.1997)。這些標準適用於在第100天之後發生的具有純急性特徵的gvhd。通過使用或沒有使用全身性類固醇(潑尼松(prednisone)或甲潑尼龍(methylprednisolone)，每天0.5mg/kg或更高)進行治療將gvhd的病例進一步分類。使用標準算法確定死亡原因，其中結果按以下順序被優先考慮：1)原發性疾病復發；2)移植失敗；3)gvhd；4)感染；以及5)器官衰竭；因此，在沒有疾病復發或移植失敗的患者中，在死亡時正針對gvhd接受治療的那些患者被認為是死於gvhd相關死亡，包括死於感染的那些。根據asbmtrfi2014疾病分類來確定疾病風險。基於先前確定的工作規定來指定調理強度。
樣品儲存和dna提取
將來自患者的糞便樣品在4℃儲存<24小時，之後冷凍在-80℃。將來自小鼠的迴腸和大腸樣品冷凍在-80℃。使用兩種方法之一提取dna，這兩種方法給出類似的結果。
對於每一個糞便標本，使用苯酚-氯仿提取技術(參見ubeda,c.,y.taur,r.r.jenq,m.j.equinda,t.son,m.samstein,a.viale,n.d.socci,m.r.m.vandenbrink,m.kamboj以及e.g.pamer.2010,《在人類中萬古黴素抗性腸球菌在腸道中佔優勢先於血流入侵(intestinaldominationbyvancomycin-resistantenterococcusprecedesbloodstreaminvasioninhumans)》,j.clin.invest.)或使用powersoildna分離試劑盒(mobio實驗室公司(mobiolaboratories))來提取dna。
標本的16s分析
對於每一個糞便標本，提取並且純化dna。將樣品使用454gsflx鈦平臺分析以對細菌16srrna基因的v1-v3區進行測序，或可替代地使用illuminamiseq平臺分析以對16srrna基因的v4-v5區進行測序。將序列數據使用mothur1.34版和qiime1.8.0版編譯和處理，為了質量進行篩選和過濾。使用greengenes參考資料庫的修改形式將操作分類單位(otu)分類到菌種等級。在r軟體中對out豐度的加權和歸一化的unifrac距離矩陣上進行主成分分析。來自這項研究的數據已經被存儲在ncbi序列讀段檔案庫(sequencereadarchive)(url：ncbi.nlm.nih.bov/sra)中。
使用2.0的對數lda截止值、使用線性判別分析(lda)效應量(lefse)分析27來進行系統發育豐度比較以，確認gvhd相關死亡率的生物標誌物。
抗體和流式細胞術
所有抗體均是從bdbiosciences-pharmingen公司獲得的。對於表面標誌物的細胞分析，在fc封閉之後，將細胞在4℃在含有0.5％bsa的pbs(pbs/bsa)中染色20分鐘，洗滌，並且重懸在pbs/bsa中的dapi中。在細胞表面染色之後，用ebioscience試劑盒，根據製造商的說明書進行細胞內染色。使用live/dead可固定死細胞染色試劑盒(英傑公司(invitrogen))排除死細胞。所有的流式細胞術是在lsrii(碧迪生物科技公司(bdbiosciences))上進行的並且使用flowjo(treestar軟體公司)分析。
抗生素類別
在移植住院期間使用的抗生素被分成包括顯著的對抗厭氧細菌活性的那些(pip/tazo、替卡西林(ticarcillin)/克拉維酸鹽(clavulanate)、亞胺培南、美羅培南(meropenem)、甲硝唑、口服萬古黴素以及克林黴素(clindamycin))、以及具有降低的活性的那些(靜脈內萬古黴素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、環丙沙星、左氧氟沙星、阿託伐醌)(19)。
移植實踐
根據我們的機構實踐，患者接受環丙沙星預防，並且接受比非清髓方案更強烈的調理的那些患者從第-2天開始直到第7天還接受靜脈內萬古黴素預防(59)。由移植醫師酌情決定給予針對耶氏肺孢子蟲(pneumocystisjiroveci)的抗生素預防(甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、氣溶膠化的噴他脒(pentamadine)、或阿託伐醌)。
標本的分析
對於每一個糞便標本，基於先前所述的方案(60)，使用苯酚-氯仿提取技術，通過機械破壞(珠粒攪打)來純化dna。將樣品使用454gsflx鈦平臺分析以對細菌16srrna基因的v1-v3區進行測序，或可替代地使用illuminamiseq平臺分析以對16srrna基因的v4-v5區進行測序。將序列數據使用mothur1.34版(61)編譯和處理，為了質量進行篩選和過濾(62)。使用greengenes參考資料庫的修改形式(64)將操作分類單位(otu)分類到菌種等級(63)。在r軟體中對otu豐度的加權和歸一化的unifrac(65)距離矩陣進行主成分分析。來自這項研究的數據已經被存儲在ncbi序列讀段檔案庫(參見url：www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)中。
rna測序和分析
在接受總共三次抗生素處理之後，在第16天將小鼠處死。取出遠端結腸並且匯集(n＝4；對於氨曲南處理組和亞胺培南處理組)，繼而使用trizolls分離rna。使用ribominus(生命科技公司(lifetechnologies))製備rna。使用ionproton系統(生命科技公司)對文庫進行測序。分析比對的rna的倍數變化。評估接受亞胺培南處理的小鼠與接受氨曲南處理的小鼠的差異基因表達。
宏基因組鳥槍法測序和分析
使用trimmomatic0.32(69)，使用2的最大錯配、30的最小末端基本分數，以及illuminatruseq接頭序列來修剪來自鳥槍法測序的配對末端原始讀段。使用kraken對剩餘的修剪讀段進行分類學指定(70)。簡單地說，通過與由ncbi基因組和染色體集合(2014年11月12日訪問)產生的細菌、病毒以及真菌k聚體(k-mer)譜的k聚體相似性來對修剪和過濾的讀段進行分類學分類。使用blast(nt資料庫，2015年3月24日)進一步查詢未分類的讀段並且棄去非微生物讀段。使用humannv0.99(71)對質量過濾的讀段進行功能分析，這確定了給定的宏基因組群落中基因和通路的豐度。為了確認在接受氨曲南治療的受試者樣本與接受亞胺培南治療的受試者樣本之間差異表現的那些功能類別，我們使用lefse(21)；即確認微生物群落之間差異豐富的生物標誌物，如基因、通路或生物體的經過驗證的工具。
將接受者在第21天處死並且小心地採集10mm長的結腸段以及糞便內容物，並且在無水甲醇-卡諾依氏固定劑(60％無水甲醇、30％氯仿以及10％乙酸)(72)中浸泡過夜。然後將組織在甲醇中洗滌，包埋於石蠟中，然後將5μm切片放置在載玻片上。將載玻片脫石蠟，並且用標準高碘酸-席夫法(schiffmethod)染色，並且通過光學顯微鏡評估(73)。
結腸組織的免疫染色和螢光原位雜交(fish)
將來自接受者的福馬林固定的結腸用抗小鼠cd3抗體a0452(達科公司(dako))、pstat3抗體9135(cellsignal-ing)、cd11b抗體ab133357(艾博抗公司(abcam))、b220抗體550286(bdpharmingen公司)、或同種型對照進行染色。用af488針對pstat3和b220以及用af594針對cd3和cd11b進行免疫螢光二級染色。將帶有糞便材料的結腸塊在卡諾依氏固定劑中固定並且用muc2c3抗血清和dna，通過hoechst34580(生命技術公司(lifetechnologies))進行細菌fish(eub338)(35)和免疫染色，如先前所述(74,75)。
小鼠和骨髓移植以及移植物抗宿主病的評估
雌性c57bl/6、c57bl/6/ly5.1、以及129s1/svlmj小鼠是從傑克遜實驗室(jacksonlaboratory，美國緬因州巴爾港(barharbor,maine,usa))獲得的。用於實驗的小鼠是6周-9周大的。將小鼠用腸道去汙抗生素混合物(氨苄西林和萬古黴素)處理以模擬在allobmt患者中發生的微生物群損傷。然後使小鼠暴露於清髓劑量的全身輻照(tbi，來自137cs源的11gy，以分次劑量，在劑量之間有3小時的時間間隔)，然後通過靜脈內注射來自完全mhc不匹配的b10.br小鼠的骨髓和純化的脾臟t細胞來進行移植(h2k進入h2b)。使用二氧化碳通過窒息使供體小鼠安樂死，並且在無菌條件下取出脾臟、股骨、以及脛骨。通過用冷組織培養基衝洗脛骨和股骨獲得供體bm。通過在4℃與每106個bm細胞2.5μg的抗thy-1.2一起孵育30分鐘，繼而在37℃與每106個bm細胞10μl的低tox-m兔補體一起孵育40分鐘將供體bm去除t細胞(tcd)，以使得可以在實驗小鼠中通過同時注射t細胞去除性bm和供體脾臟t細胞來可再現地誘發gvhd。用抗cd5macs珠粒(美天旎公司(miltenyi))純化脾臟t細胞。通過尾靜脈注射來移植bm細胞(每個接受者5×106個)和脾臟t細胞(每個接受者1×106個)。
從小鼠或人類糞便分離布勞特氏菌屬分離株
採集整個糞便標本並且在1倍-3倍體積的0.05％蛋白腖中，使用無菌不鏽鋼共混器與1倍-3倍體積的蛋白腖一起勻漿。將約1克的標本在預還原的厭氧滅菌(pras)稀釋空白對照(anaerobesystems公司)中連續稀釋(10倍)。稱取單獨約1克的等分試樣，在真空中乾燥過夜，並且重新稱重以計算基於乾重的計數。為了選擇梭菌目細菌，包括布勞特氏菌屬菌種，將100μl勻漿的糞便樣品稀釋系列平板接種在補充有4μg/ml甲氧苄啶(sigmachemical)和1μg/ml磺胺甲噁唑(sigma)的腦心浸液血瓊脂(sba，bectondickinson)、布魯氏菌血瓊脂(bap，anaeobesystems)、cdcana血瓊脂(bblmicrobiologysystems)以及蛋黃瓊脂(eya，anaerobesystems)上(finegoldsm,molitorisd,songy,liuc,vaisanenml,boltee,mcteaguem,sandlerr,wexlerh,marloweem,collinsmd,lawsonpa,summanenp,baysallarm,tomzynskitj,reade,johnsone,rolfer,nasirp,shahh,haakeda,manningp,kaula,2002.《晚髮型自閉症中的胃腸道微生物群落研究(gastrointestinalmicroflorastudiesinlate-onsetautism)》,clininfectdis1:35)。為了選擇孢子形成菌，可以將稀釋液在70℃-80℃加熱10分鐘-20分鐘並且以與未加熱的勻漿糞便樣品相同的方式進行平板接種。在厭氧室中在37℃培養5天之後，選擇單一菌落。通過重新劃線接種所選的單一菌落，如上所述進行生長，並且再次選擇單一菌落來重複菌落純化過程。將單一菌落在15％-25％甘油中冷凍在1ml冷凍管中並且儲存在-80℃。
施用布勞特氏菌屬/群體以減輕實驗性gvhd
將購自傑克遜實驗室(jacksonlaboratory，緬因州的巴爾港)的c57bl/6小鼠用口服萬古黴素和氨苄西林處理。在去汙之後，將小鼠飼養在熱壓處理的條件下(籠具、褥草、水以及食物)以消除小鼠的菌群內存在的幾乎所有的內源性梭菌綱。然後通過灌胃將小鼠用作為對照的培養的糞腸球菌的液體懸浮液或布勞特氏菌屬分離株進行處理。然後使小鼠暴露於清髓劑量的全身輻照(tbi，11gy)，然後通過靜脈內注射來自完全mhc不匹配的b10.br小鼠的骨髓和純化的t細胞來移植(h2k進入h2b)。如所述來評價對腸道病理學和總體存活率的影響。與攜帶腸球菌屬的那些小鼠相比，由布勞特氏菌屬定殖的小鼠受到保護而免受gvhd，具有改善的存活率(圖9)。
gvhd臨床和組織學評分
每天監測小鼠的存活率並且每周監測小鼠的gvhd臨床分數(參見cooke,k.r.,l.kobzik,t.r.martin,j.brewer,j.delmontejr.,j.m.crawford以及j.l.ferrara.1996.《骨髓移植之後特發性肺炎症候群的實驗模型：i.次要h抗原和內毒素的作用(anexperimentalmodelofidiopathicpneumoniasyndromeafterbonemar-rowtransplantation:i.therolesofminorhantigensandendotoxin)》,blood.88:3230-3239)。如先前所述來對小腸、大腸、以及肝臟樣品的gvhd證據進行組織學評價和評分(參見hill,g.r.,j.m.craw-ford,k.r.cooke,y.s.brinson,l.pan以及j.l.ferrara.1997.《全身輻照和急性移植物抗宿主病：胃腸道損傷和炎性細胞因子的作用(totalbodyirradiationandacutegraft-versus-hostdisease:theroleofgastrointestinaldamageandinflammatorycytokines)》,blood.90:3204-3213)。
潘氏細胞數和功能的測量
將成年小鼠的小腸腔用冰冷的水衝洗並且分段。通過首先將節段從內向外翻出，然後將它們在含有30mmedta並且不含ca2+和mg2+的pbs中振蕩來洗脫隱窩。在700×g下使洗脫的絨毛和隱窩成粒，重懸在pbs中，並且使用毛細管移液管轉移到矽化的微量離心管中。將隱窩重懸在ipipes緩衝液(10mmpipes(ph7.4)和137mmnacl)中以準備暴露於分泌刺激物。
在37℃將隱窩在含有每個隱窩1000個細菌(梭菌目)cfu的30μlipipes中孵育30分鐘。通過短暫離心使細胞組分沉澱，並且將上清液轉移到無菌微量離心管中並且儲存在-20℃。這種方法可以在2mlipipes(加上或減去梭菌目細菌)中使用最多約3000個隱窩來按比例放大。使隱窩成粒並且分析10μl的上清液對液體培養物中或瓊脂平板上的梭菌目細菌和腸球菌屬細菌的殺細菌活性。使用30％乙酸從上清液的其餘部分以及隱窩中提取蛋白質。將從每一個部分提取的總蛋白通過au-page來進行分解並且如下使用抗隱窩素-1進行蛋白質印跡分析。將來自au-page的蛋白質轉移到硝化纖維素膜。然後將膜用5％脫脂奶封閉，依次與抗兔小鼠隱窩素-1(1:500)、辣根過氧化物酶綴合的抗兔igg(1:20,000)以及化學發光底物(supersignal，伊利諾州羅克蘭的皮爾斯公司(pierce,rockland,il))一起孵育，並且可視化(ayabet,satchelldp,wilsoncl,parkswc,selstedme,ouelletteaj,2000.《腸道潘氏細胞響應於細菌而分泌殺微生物性α-防禦素(secretionofmicrobicidalα-defensinsbyintestinalpanethcellsinresponsetobacteria)》,natureimmunology1:113-118)。
用於測量遠端器官(肝臟、胸腺、肺、腎臟)中微生物的水平的方法
使用dynamosybrgreenqpcr試劑盒(finnzymes)和0.2μm的通用細菌引物8f(5'-agagtttgatcctggctcag-3'，seqidno:1)以及寬範圍的細菌引物338r(5'-tgctgcctcccgtaggagt-3'，seqidno:2)對組織樣品進行細菌16srrna基因的定量pcr(qpcr)。通過連續稀釋含有1個16srrna拷貝的pcr平端載體(invitrogen)來製備標準曲線。
用於測量微生物對細菌代謝產物，如scfa水平的影響的方法
短鏈脂肪酸(scfa)作為碳水化合物發酵的副產物由許多細菌產生。scfa已經被發現是免疫系統的重要調節因子。它們由布勞特氏菌屬和來自梭菌綱的相關細菌大量產生。為了評價布勞特氏菌屬和相關細菌如何介導對gvhd的抑制，採集糞粒以定量scfa水平，特別是乙酸鹽、丙酸鹽、或丁酸鹽。通過將糞便樣品鹼化，在brukeravance-600mhz光譜儀上使用1d1hnmr獲得樣品的代謝組成的指紋圖譜，並且使用chenomxnmrsuite軟體用監督的多變量統計方法分析來定量scfa、肌酸以及羥基-scfa。
施用scfa以減輕gvhd。
進行初步實驗以測試施用scfa對鼠類gvhd的影響。沒有觀測到經由飲用水給予的丙酸鹽(數據未示)、或經由飲用水或經由灌腸給予的丁酸鹽(數據未示)的顯著益處，而在經由飲用水施用乙酸鹽的情況下觀測到顯著的益處。在bmt之前2周開始經由小鼠的飲用水遞送乙酸鈉(150mm)。然後對小鼠進行輻照並且在繼續補充乙酸鈉的情況下進行移植。將在小鼠中評價的結果包括gvhd臨床分數、存活率、以及第14天和第28天組織病理學。卡普蘭-邁耶曲線將顯示這兩組的總體存活率。此外，曲線下面積(auc)將匯總每一隻小鼠從輸注到第13周的每周總gvhd分數。將使小鼠安樂死以評價gvhd的病理學證據，以及在第14天和第28天通過流式細胞術定量和表徵大腸treg和同種異體反應性效應t細胞。
用於測量微生物代謝產物(scfa)對腸隱窩再生的影響的方法
使用如先前所述的腸上皮隱窩培養系統(toshirosato,robertg.vries,hugoj.snippert,marcvandewetering,nickbarker,daniele.stange,johanh.vanes,arieabo,pekkakujala,peterj.peters以及hansclevers,2009)。(《單一lgr5幹細胞在體外在沒有間充質小生境的情況下構建隱窩-絨毛結構(singlelgr5stemcellsbuildcrypt-villusstructuresinvitrowithoutamesenchymalniche)》,nature,459:262-265)。在4℃將每孔400個隱窩懸浮在液化的生長因子減少型基質膠(corning)(25％高級dmem/f12培養基(gibco)；75％生長因子減少型基質膠)中。然後，將它們於用於小腸的50μl液滴、用於大腸的30μl液滴中接種到預熱的δ-表面nunc24孔板中，所述液滴各自含有約100個-500個隱窩。在基質膠液滴聚合之後，將500μl完全隱窩培養基添加到小腸隱窩培養物中(enr培養基：高級dmem/f12(sigma)、2mml-穀氨醯胺(sigma)、10mmhepes(sigma)、100u/ml的青黴素/100μg/ml的鏈黴素(sigma)、1mm的n-乙醯半胱氨酸(sigma)、1×b27補充劑(invitrogen)、1×n2補充劑(invitrogen)、50ng/ml的megf(peprotech)、100ng/ml的mnoggin(peprotech)以及hr-脊椎蛋白-1轉染的hek293t細胞的10％人類r-脊椎蛋白-1條件培養基。在評價出芽的一些實驗中，將hr-脊椎蛋白-1降低到1.25％-5％。將大腸隱窩培養在除了上述蛋白質和1％牛血清白蛋白(sigma)之外還含有50％的wnt3a條件培養基的wenr培養基中。對於大腸培養物，將10μm的sb202190(sigma，目錄號：s7067)和alk5抑制劑(a83-01，tocris)添加到wenr中。將所有板在37℃/5％co2下孵育並且每2天-3天更換培養基。對照孔保持未經過處理，並且在適用時，處理孔接受不同濃度的細菌代謝產物以及培養基的更換。在第7天通過用血清吸移管對隱窩進行機械破壞，通過將隱窩在過量的培養基中旋轉沉降來洗掉基質膠，並且在將沉澱物在液化的基質膠中復原之後將它們重新接種來將它們傳代。
選擇低聚糖來擴充布勞特氏菌屬
利用c57bl/6源性布勞特氏菌屬分離株以及c57bl/6源性約氏乳桿菌，使用ph值和光學密度以評價在沒有葡萄糖的培養基中的細菌生長來評價這些細菌發酵多種糖的能力。對約氏乳桿菌進行評價，這是因為這種細菌在熱量受到限制的環境中以梭菌綱作為代價擴增，並且因此可能是鼠類腸道中營養物質的直接競爭者。通過該分析確認了由布勞特氏菌屬發酵而不是由乳桿菌屬發酵的兩種糖：鼠李糖和木糖。
施用低聚糖以擴充布勞特氏菌屬並且減輕實驗性gvhd
將c57bl/6小鼠經口接種以已知發酵木糖的鼠類布勞特氏菌屬分離株。然後從用b10.brbm和t細胞進行bmt之前的7天開始在飲用水(10g/l)中向一些小鼠施用木糖。這些接受木糖的小鼠在腸道菌群中表現出布勞特氏菌屬的擴增，這是通過16s深度測序來測量的，儘管在bmt之後的第14天存在gvhd(圖9)。有趣的是，長期施用木糖還使得患有gvhd的小鼠的存活率改善。
另一研究顯示在添加有各種糖的不含葡萄糖的bhi培養基中，來自梭菌混合物的菌株生長。葡萄糖得到最好的結果並且能夠支持總共17種菌株中的10種生長。然而，葡萄糖將具有有限的益處，這是因為它可能不給予有益細菌以選擇性優勢。棉子糖能夠支持5種菌株，而纖維二糖似乎支持了不被棉子糖支持的4種菌株。因此，在一個實施方案中，可以向受試者施用棉子糖和纖維二糖的混合物以為有益細菌的至少一部分提供支持。
檢測由培養的布勞特氏菌屬產生的代謝產物。
通過在brukeravance-600mhz光譜儀上使用1d1hnmr獲得樣品的代謝組成的指紋圖譜，並且使用chenomxnmrsuite軟體用監督的多變量統計方法分析來定量包括scfa、肌酸以及羥基-scfa的細菌代謝產物。
證實佔優勢的有害性(dysbiotic)微生物由於產生自由基而抑制布勞特氏菌屬的體外測定
通過研究熱量限制對腸道微生物群組成的影響，觀測到專性厭氧菌(梭菌綱、擬桿菌門(bacteroidetes))的豐度降低，而兼性厭氧菌(乳桿菌目(lactobacillales)、變形菌門(proteobacteria))擴增。先前已經描述了在飢餓的環境中大腸桿菌產生自由基(sabys等,applenvironmicrobiol.1999；5600-5603)。設計實驗以在體外研究約氏乳桿菌是否在飢餓條件下可能抑制我們的鼠類布勞特氏菌屬分離株的生長，並且進一步研究自由基的產生是否可能是促成因素。確切地說，將布勞特氏菌屬單獨培養，或與約氏乳桿菌一起培養，並且觀測到約氏乳桿菌實際上抑制布勞特氏菌屬的生長，但是如果添加另外的培養基以防止飢餓，則無法做到這樣(圖11)。在無菌過濾後進一步研究支持約氏乳桿菌生長到平臺期的培養基的影響。在以1:1比率與新鮮培養基混合時，乳桿菌條件培養基對乳桿菌屬的生長沒有影響，但是可以抑制布勞特氏菌屬的生長，這表明在飢餓條件下，乳桿菌屬釋放抑制布勞特氏菌屬的生長，但不抑制其本身的物質。然後研究還原劑是否可以從乳桿菌條件培養基介導的抑制拯救布勞特氏菌屬。l-半胱氨酸、抗壞血酸、以及硫代乙醇酸鈉全部都被發現能夠在乳桿菌條件培養基存在下支持布勞特氏菌屬生長。總之，這些結果表明乳桿菌屬可能在有限營養物質的環境中由於產生自由基而對布勞特氏菌屬產生競爭優勢，由於缺乏包括穀胱甘肽轉移酶、過氧化氫酶、以及超氧化物歧化酶在內的保護性酶，因此所述自由基選擇性地損傷專性厭氧細菌。
布勞特氏菌屬+木糖的體外組合和對細菌代謝產物的影響
將布勞特氏菌屬在單獨的液體py培養基或補充有葡萄糖或木糖(10g/l)的液體py培養基中培養48小時。將培養基離心並且評價上清液的scfa水平。
抗生素類別
在移植住院期間使用的抗生素被分成包括對厭氧細菌有顯著活性的那些(哌拉西林-他唑巴坦、替卡西林-克拉維酸鹽、亞胺培南-西司他丁、美羅培南、甲硝唑、口服萬古黴素以及克林黴素)、以及具有降低的活性的那些(靜脈內萬古黴素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑)19。
移植實踐
根據機構實踐，患者接受環丙沙星預防，並且接受比非清髓方案更強烈的調理的那些患者從第-2天開始直到第7天還接受靜脈內萬古黴素預防20。由移植醫師酌情決定給予針對耶氏肺孢子蟲的抗生素預防(甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、氣溶膠化的噴他脒、或阿託伐醌)。
統計分析
使用累積發生率函數，將復發和與gvhd無關的死亡作為競爭事件來估計急性gvhd和gvhd相關死亡的發生率，並且使用格雷氏檢驗(gray'stest)在因素之間進行比較。使用卡普蘭-邁耶方法估計總體存活率概率並且使用對數秩次檢驗來比較。使用用於非配對檢驗的曼-惠特尼u(mann-whitneyu)對細菌豐度進行比較。對於小鼠實驗，數據呈現為平均值±sem。使用曼特爾-考克斯對數秩次檢驗(mantel-coxlog-ranktest)來分析存活率曲線。對於其它對照，使用非參數曼-惠特尼u檢驗。在所有分析中，基於雙側檢驗，統計顯著性被定義為p0.1(10％)(圖4a)。然而，在許多患者中，布勞特氏菌屬水平在住院過程期間快速下降。如所預期的那樣，我們發現沒有暴露於具有厭氧菌作用範圍的抗生素的患者更可能具有增加水平的布勞特氏菌屬(圖4b)。
由於在調理之後的噁心和黏膜炎，因此allobmt患者通常經歷長時間的顯著減少的口服攝入並且接受補充性tpn治療。我們使用tpn補充的持續時間作為口服營養的指標並且研究與布勞特氏菌屬豐度的關聯性。有趣的是，使用tpn不到10天持續時間的患者(這表明延遲、中斷或中止的tpn治療，這是因為tpn的開始被認為是在第2天並且平均在第12天採集糞便樣品)，具有增加的布勞特氏菌屬水平(圖4b)。tpn持續時間與布勞特氏菌屬的喪失有關，即使是在避免用厭氧菌活性抗生素治療的患者中(圖4c)。總之，這些結果表明厭氧菌抗生素治療和不良的口服營養攝入這兩者似乎介導了對腸道中布勞特氏菌屬的抑制。
在這項研究中，我們首先發現在allobmt接受者中，在兩個獨立的群組中與gvhd相關死亡率降低最相關的來自糞便樣品的細菌屬是布勞特氏菌屬。具有更多的布勞特氏菌屬的患者還顯示出需要用全身性皮質類固醇治療的急性gvhd的發生率的降低以及總體存活率的改善。為了證實這些關聯性，我們將患者按照他們的布勞特氏菌屬豐度排序並且通過中值分層，所述中值在這兩個群組中正好是0.05％。
驚人的是，儘管與gvhd相關死亡率具有關聯性，但是布勞特氏菌屬豐度並沒有區分3級-4級急性gvhd的發生率，所述3級-4級急性gvhd已知被確定不太可能對類固醇作出響應，從而導致不良的存活率34。然而，已知存在最初表現出2級急性gvhd，然而進展不良的患者亞群，所述亞群可以由新型gvhd分級系統34或由新型生物標誌物35所確定。在另外的患者群組中進行的進一步研究可以確定布勞特氏菌屬豐度是否可以類似地增加臨床急性gvhd分級的預後效用。
來自包括布勞特氏菌屬在內的梭菌綱的細菌的豐度也已經顯示可預測我們的患者中的gvhd相關死亡率降低。有趣的是，17種梭菌分離株中的幾種與布勞特氏菌屬的成員的親緣很近，包括具有與菌種producta布勞特氏菌(atccr27340-dsm2950，維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)的16s序列(基因庫x94966)最緊密匹配的16s序列的一種菌株，所述producta布勞特氏菌預測了我們的患者群組中的gvhd致死率降低。布勞特氏菌屬的有益抗炎關聯性也已經在其它臨床環境中被觀測到，包括結腸直腸癌36、迴腸儲袋-肛管吻合術後的炎症性儲袋炎36、以及肝硬化37。
用對厭氧菌具有增加的活性的抗生素進行治療在產生中性粒細胞減少性發熱的allo-hsct患者中與gvhd相關死亡率增加以及梭菌目減少有關
在第二項研究中，我們首先質疑用以厭氧細菌為靶標的抗生素進行治療是否與gvhd相關死亡率的臨床差異有關。allo-hsct患者在我們中心接受抗生素的預防方案，包括短期的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑以防止耶氏肺孢子蟲肺炎，以及在整個中性粒細胞減少症期間的靜脈內萬古黴素和環丙沙星。值得注意的是，我們已經發現這一方案通常僅對腸道微生物群的組成造成輕度的幹擾(14)。隨後在allo-hsct的過程中，用經驗性抗生素治療產生中性粒細胞減少性發熱的患者，所述抗生素的選擇可以由於藥物過敏史或患者特異性考慮因素而不同。產生持續發熱、腹部症狀、或有感染抗性細菌的微生物證據的一些患者可以接受往往對厭氧菌更具活性的第二線抗生素。最終，allo-hsct患者在allo-hsct住院期間還常被診斷為患有艱難梭菌(clostridiumdifficile)結腸炎並且針對其進行治療，這迅速導致厭氧腸道共生生物的喪失(17,18)。
我們回顧性地確認了538名成人患者的群組，他們是在1994年至2013年在我們中心連續接受移植的allo-hsct患者，符合我們的納入標準，即有標準gvhd風險(即沒有離體t細胞去除)並接受用於中性粒細胞減少性發熱的治療。接受第二線抗生素或接受治療艱難梭菌結腸炎的抗生素(甲硝唑(靜脈內或口服)或萬古黴素(口服))的患者被排除。將其餘283名患者分類為接受對厭氧菌更具活性的抗生素(主要是哌拉西林-他唑巴坦(pip/tazo)和亞胺培南-西司他丁(亞胺培南))、或接受對厭氧菌不太具活性的抗生素(主要是頭孢吡肟和氨曲南)的治療(19)；臨床特徵提供於表2中。我們發現接受具有厭氧菌活性的抗生素的225名患者在allo-hsct後的第一年具有顯著增加的gvhd相關死亡的發生率(圖1a，p＝0.04)。對先前鑑定的gvhd風險因素進行的單變量分析沒有顯示與該數據集中的gvhd相關死亡率的顯著關聯性(表3)，這表明抗生素暴露的類型可能是gvhd相關死亡率的新型預測因子。我們還進行多變量分析，所述分析使用p<0.1的顯著性標準，在調整與gvhd相關死亡率相關的gvhd風險因素的同時在我們的患者組中評價了抗生素暴露的類型與gvhd相關死亡率的關聯性。我們發現在調整供體/hla匹配之後抗生素暴露的類型仍具顯著性(p＝0.047)(表3)。這些結果支持了選擇保護厭氧共生生物的抗生素可以降低gvhd風險的可能性。替代性的假說將是有青黴素過敏史的患者(因此更可能接受頭孢菌素或氨曲南來代替青黴素和碳青黴烯類(carbapenems))可以受到保護以防止gvhd，儘管這樣的生物學合理性似乎較小。
hsct患者與腸道細菌組成有關。在2009年，我們中心開始前瞻性地每周從接受allo-hsct的患者採集糞便樣品。從這一標本庫中，我們確定出在allo-hsct的過程期間在開始特定的抗生素之前以及之後從患者採集的配對糞便樣品。針對中性粒細胞減少性發熱接受治療的患者以及不需要治療性抗生素(但確實接受預防性抗生素)的患者的代表性病例示於圖15b至g中。使用16srrna基因深度測序，我們評價這些抗生素對微生物組成的影響。我們側重於梭菌目豐度的變化，所述梭菌目是包括與腸道健康相關的許多菌種的厭氧革蘭氏陽性共生細菌的主要目(8,13,20)。
我們發現患者往往表現出梭菌目的喪失並且這在時間上與開始用亞胺培南、pip/tazo、或甲硝唑治療重合，而用氨曲南進行的治療常常使得梭菌目豐度得到相對的保持(圖15b至g)。定量在開始特定的抗生素之前和之後梭菌目豐度的變化，我們發現與接受氨曲南治療的那些患者相比，接受亞胺培南、pip/tazo以及甲硝唑治療的患者都具有顯著更低的梭菌目豐度(圖15h)。
在小鼠中用亞胺培南進行處理(與氨曲南相比)與腸道微生物群的破壞增加以及gvhd加重有關
為了進一步研究具有厭氧菌活性的抗生素對gvhd的影響的因果關係和機制，我們轉向了小鼠實驗。我們首先用對厭氧細菌具有增加的活性的抗生素(pip/tazo、亞胺培南、以及甲硝唑)或具有降低的活性的抗生素(氨曲南和頭孢吡肟)處理健康的c57bl/6小鼠。通過每天兩次皮下(sc)注射每一種抗生素兩天(pip/tazo：500mg/kg；和其它：100mg/kg)來處理小鼠並且採集糞便樣品，繼而進行16srrna基因擴增和序列分析。我們發現用亞胺培南或甲硝唑進行的全身處理顯著降低了梭菌目的豐度並且增加了腸球菌屬的豐度，而用氨曲南或頭孢吡肟進行的處理不傷害梭菌目(圖16a)。有趣的是，用pip/tazo進行的處理在處理兩天之後使得沒有可擴增的細菌dna，這表明在小鼠中幾乎完全的去汙(數據未示)。
我們隨後研究抗生素處理在臨床相關的mhc-匹配次要抗原-不匹配allo-hsct模型(c57bl/6進入129s1)中的影響。我們選擇不施用最低限度地幹擾腸道微生物群組成的預防性抗生素，如iv靜脈內萬古黴素或環丙沙星，而是側重於在類似於移植後發熱/中性粒細胞減少症的常見臨床情況在allo-hsct之後第一周內給予時，比較不傷害患者和小鼠這兩者的梭菌目的氨曲南，與去除患者和小鼠這兩者的梭菌目的亞胺培南的影響。將經過致死劑量輻照的129s1接受者用c57bl/6t細胞去除性骨髓(tcd-bm)細胞和1×106個c57bl/6脾臟t細胞進行移植。對照接受者僅接受tcd-bm。在allo-hsct之後第10天開始每周三次用氨曲南或亞胺培南皮下處理接受者。值得注意的是，我們觀測到在開始處理的2周內接受亞胺培南處理的接受者中死亡率顯著增加(圖16b)。沒有t細胞轉移的對照接受者(無gvhd對照)顯示100％的存活率，這表明抗生素處理本身對清髓性輻照之後的bm移植或存活率沒有不利影響。這些結果在三次連續的和獨立的實驗中是可再現的。在allo-hsct之後第21天(在開始抗生素治療之後的11天)對gvhd靶器官進行的組織學檢查揭示了在接受亞胺培南處理的小鼠中存在增加的gvhd病變。有趣的是，這局限於結腸(圖16c和圖18)，而包括皮膚、肝臟以及小腸在內的其它常見的gvhd靶器官在炎症和損傷程度方面沒有顯示出顯著性差異。對來自患有gvhd的小鼠的糞便樣品進行16srrna基因測序，繼而進行主成分分析，表明氨曲南和亞胺培南治療產生不同的微生物群組成模式(圖16d)。如通過效應量的線性判別分析(lefse)(21)所進行的評估最好地解釋了這些組之間的差異的分類群，示於圖16e和f中。接受亞胺培南處理的移植小鼠顯示梭菌目的喪失，這確證了我們在患者和未移植的小鼠中的結果。
嗜粘蛋白阿克曼氏菌的增加
有趣的是，在六次實驗中在這些動物中始終觀測到嗜粘蛋白阿克曼氏菌的擴增(圖16g和h)。我們評價了亞胺培南處理對患有gvhd的小鼠的結腸中t細胞浸潤和stat3磷酸化的影響並且通過流式細胞術和組織學這兩者發現浸潤結腸的t細胞數增加，通過螢光顯微鏡術觀測原位t細胞中磷酸化stat3的水平顯著更高，這支持了升高水平的il-23參與供體t細胞的募集和激活的觀點，這可能導致特異性地在結腸中加重的gvhd。在患有gvhd的小鼠中，亞胺培南處理使得嗜粘蛋白阿克曼氏菌擴增，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌是在人類、小鼠以及其它動物的腸道中發現的一種常見共生細菌。值得注意的是，這種細菌在它利用粘蛋白作為碳源和氮源的能力方面是不尋常的(33)。已經在用嗜粘蛋白阿克曼氏菌對無菌小鼠進行單一定殖之後觀測到結腸粘液層的破壞，這表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌可以在體內以及體外降解粘蛋白(51)。然而，嗜粘蛋白阿克曼氏菌對腸道穩態有哪些影響是不太清楚的並且可能具有環境依賴性。在鼠類肥胖症模型中，用嗜粘蛋白阿克曼氏菌進行的處理使得代謝紊亂改善以及全身內毒素水平降低，這表明在這種環境中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌改善了腸道屏障功能(52)。然而，鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)感染的悉生鼠類模型顯示嗜粘蛋白阿克曼氏菌的存在導致腸道炎症加重，這歸因於結腸粘液破壞(53)。我們對接受亞胺培南處理的動物的結腸進行的檢查顯示粘液層幾乎完全消失。在被破壞的粘液層之外我們還檢測到在結腸固有層中存在細菌，這與粘液層提供了抵禦腸黏膜入侵的關鍵的第一道防線相一致(54)。阿克曼氏菌屬在接受亞胺培南處理的移植小鼠的結腸中擴增的原因是不清楚的；據我們所知，阿克曼氏菌屬分離株沒有被指出對亞胺培南或其它相關抗生素具有抗性。阿克曼氏菌屬與梭菌目之間的競爭性相互作用據我們所知也沒有被描述，儘管研究已經觀測到在使用抑制梭菌目的其它抗生素，如克林黴素對小鼠進行處理之後阿克曼氏菌屬出現類似的擴增(55)。這些結果表明選擇具有更有限的活性譜(特別是針對厭氧菌)的抗生素可以防止微生物群損傷並且減少gvhd。
梭菌目已經特別被確定為短鏈脂肪酸(scfa)的主要產生菌(10,22)，所述短鏈脂肪酸是在維持結腸穩態和健康中起重要作用的細菌發酵產物(23,24)。驚人的是，儘管在梭菌目豐度方面有很大的差異，但是我們在來自接受氨曲南或亞胺培南處理的接受者的結腸比較樣品中在scfa的水平方面沒有觀測到顯著的變化(數據未示)。
為了在接受氨曲南處理的受試者樣本與接受亞胺培南處理的受試者樣本之間獲得更大的對細菌組成的分辨，我們使用在allo-hsct之後第21天採集的糞便進行宏基因組鳥槍法測序。我們的發現揭示與16s測序結果相一致，亞胺培南處理使得嗜粘蛋白阿克曼氏菌的豐度增加，但是氨曲南處理並非如此(圖16i)。然而，由於來自所述分析的最大百分比的讀段被確定為未分類的，因此有可能在這兩種抗生素處理類型之間存在細菌菌種組成的另外的顯著性差異。宏基因組鳥槍法測序分析還揭示了在來自接受氨曲南處理的小鼠與接受亞胺培南處理的小鼠的微生物群樣品之間基因含量的差異，這是由基因直系同源物的主成分分析所描繪的(圖16j)。對基因通路進行的lefse分析表明接受亞胺培南處理的小鼠的微生物群基因被富集用於包括脂多糖合成的過程，並且在包括d-丙氨酸代謝的幾個過程中相對被貧化(數據未示)。有趣的是，公知脂多糖在包括gvhd的許多疾病過程中誘導促炎性級聯(25)，而脂磷壁酸的d-丙氨酸含量的減少可以增強乳桿菌屬的抗炎特性(26,27)。
如上所述，我們使用16srrna深度測序檢測到接受亞胺培南處理的小鼠的菌群中嗜粘蛋白阿克曼氏菌的增加(圖16h)。這種細菌具有使粘液降解作為碳水化合物源的能力(33,34)。利用我們的宏基因組鳥槍法測序結果，我們質疑被預測編碼分泌型粘液溶解酶的基因是否在接受每一種抗生素處理的小鼠中差異化地存在。對細菌粘液溶解酶進行鑑定和表徵仍是一個不成熟的領域，但是最近的研究檢查了從人類糞便中分離的嗜粘蛋白阿克曼氏菌atccbaa-835的全基因組序列(34)。所述作者鑑定出粘液降解的兩種強有力的候選物：amuc_0953(硫酸酯酶)和amuc_2164(糖基水解酶)，它們這兩者均含有預測的分泌信號肽切割位點以及預測的粘蛋白結合結構域。我們定量了與這兩種基因具有同源性的序列的存在並且發現這兩者顯著富集於來自接受亞胺培南處理的小鼠的樣品中(圖17g)。我們然後試圖對接受抗生素處理的移植小鼠的結腸的粘液層進行表徵。使用高碘酸-席夫染色，我們觀測到與接受氨曲南處理的接受者相比，在第21天接受亞胺培南處理的接受者的粘液層的厚度顯著減少(圖17h和i)。沒有觀察到接受氨曲南處理的接受者與接受亞胺培南處理的接受者之間產生粘液的杯狀細胞的數目存在差異，這表明粘液產生沒有受損(圖17j)。此外，通過利用一般細菌16srrna探針(eub338)(35)聯同muc2染色，我們直接將接受抗生素處理的接受者的結腸中的內粘液層可視化並且確認接受亞胺培南處理的小鼠的粘液層顯著變薄。驚人的是，我們還通過組織學方式在接受亞胺培南處理的小鼠中觀測到細菌越過結腸上皮屏障播散(圖17k)，而這在接受氨曲南處理的小鼠中沒有被看到。綜上所述，這些結果表明亞胺培南處理可能經由因素的組合來加重gvhd，這些因素包括屏障功能受損伴有保護性粘液層變薄和結腸b細胞數減少、粒細胞浸潤增加、il-23水平升高、以及供體效應cd4+t細胞的數目和激活增加。
出現的一個問題是早在allobmt之後的第12天的布勞特氏菌屬和其它相關細菌的豐度如何可以在生物學上影響急性gvhd和gvhd相關死亡率，這可能在allobmt之後的數月發生，並且在死亡的情況下，在allobmt之後的數年發生。然而，存在先例；即使是基本上在第30天之後發生的急性gvhd的發病，在allobmt後的第一周內的血清環孢素濃度也預測了急性gvhd的發病38。類似地，生物標誌物st2的血清水平預測了類固醇難治性gvhd，並且早在第14天的水平與不伴有復發的6個月死亡率有關35。總之，這些研究表明bmt後早期的狀態可能影響gvhd的引發並且決定了gvhd過程的最終嚴重程度，儘管這可能需要數月才能完全表現，這或許是因為持續施用呈gvhd預防和治療形式的免疫抑制劑部分地遏制了炎症。
有趣的是，雖然我們的結果表明布勞特氏菌屬與gvhd減少有關，但布勞特氏菌屬豐度增加與復發相關死亡率增加無關。這表明布勞特氏菌屬可能與主要為局部的抗炎作用相關聯，這一可能性得到了我們的關於與皮膚gvhd沒有關聯性的發現的支持。總之，這些數據表明以微生物群為靶向可以允許減少gvhd，而不同時損害移植物抗腫瘤作用。實際上，我們發現布勞特氏菌屬豐度與復發相關死亡率降低的關聯性，儘管這一關聯性在調整疾病風險和移植物來源之後喪失。更充分探究微生物群對復發的影響將需要進一步研究。
對我們的患者在他們移植住院的過程中布勞特氏菌屬的豐度進行表徵，我們發現大部分的患者最初具有相對大量的布勞特氏菌屬，但是在許多患者中，布勞特氏菌屬菌種然後顯著喪失。我們鑑定出與布勞特氏菌屬喪失相關的兩個潛在的風險因素，包括接受具有厭氧菌作用範圍的抗生素以及需要更長的tpn治療持續時間。在施用抗生素的情況下布勞特氏菌屬減少的發現並不驚人，但是與長時間的tpn的關聯性是意外的。雖然調理強度和tpn必要的持續時間已知是相關的39，但是我們發現調理強度與布勞特氏菌屬豐度之間沒有顯著的關聯性(數據未示)。這表明不良的口服營養可能是比更強的調理更有可能的造成布勞特氏菌屬喪失的促成因素。這種解釋得到了在小鼠模型中的發現的確證，即清髓性調理僅與菌群組成的輕度幹擾有關，相比之下，觀測到特徵在於在gvhd(厭食的強效誘發因素)發病的小鼠和人類這兩者中梭菌目喪失的更大的幹擾40。可以類似地在被安排高蛋白和低碳水化合物飲食41或完全源自於動物產品的飲食42的志願者中觀測到梭菌目的成員的喪失模式，所述成員包括羅斯氏菌屬(roseburia)、糞桿菌屬(faecalibacterium)、瘤胃球菌屬以及布勞特氏菌屬菌種。
根據本發明的具體實施方案的上述詳細說明，應當顯而易見的是，已經描述了一種在骨髓或造血幹細胞移植後利用梭菌目細菌來降低gvhd的風險和/或治療gvhd的獨特方法。儘管在本文已經詳細地公開了具體的實施方案，但是這是通過實施例的方式來進行的以實現說明的目的並且並不意圖對所附權利要求書的範圍構成限制。
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序列表
紀念斯隆-凱特琳癌症中心cpusl170890
m·萬登布林克
r·耶齊
e·g·帕默
y·陶勒
y·莊野
腸道微生物群和gvhd
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18
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1
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卵瘤胃球菌
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齒雙歧桿菌
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哈氏梭菌
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4
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6
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棉子糖乳球菌
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7
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糞瘤胃球菌
7
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8
331
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異型真桿菌
8
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9
331
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糞瘤胃球菌
9
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10
332
dna
帕氏乳桿菌
10
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11
332
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羅伊氏乳桿菌
11
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12
323
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絲狀霍爾德曼氏菌
12
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13
331
dna
腸胺基酸球菌
13
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14
327
dna
兩形真桿菌
14
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15
329
dna
索氏梭菌
15
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16
331
dna
居泉沙雷氏菌
16
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tgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggggaaat120
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gatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcg300
accgcctggggagtacggccgcaaggttaaa331
17
20
dna
人工序列
合成寡糖
17
agagtttgatcctggctcag20
18
19
dna
人工序列
合成核苷酸
18
tgctgcctcccgtaggagt19