分子相互作用的檢測的製作方法

2023-09-10 22:41:35 1

專利名稱：分子相互作用的檢測的製作方法
相關申請本申請要求申請日為2003年12月4日的待批美國臨時申請流水號60/527,209的優先權，該文獻的全文被收作本文參考。
政府資助的聲明本發明是在位於Lawrence Berkeley National Laboratory、由美國能源部按照合同編號DE-AC03-76SF00098資助的研究中完成的。美國政府擁有本發明的某些權利。
背景技術：
發明領域本發明涉及用於分析感興趣的分析物和感興趣的配體之間的結合相互作用的組合物和方法，更具體地講，本發明涉及通過觀察溶液中膠體顆粒的總體行為的變化來檢測分析物和配體的相互作用。
相關技術的說明大部分生物分子與其他生物分子相互作用，以便完成它們的體內功能。例如，細胞過程通常涉及以多亞基複合物形式結合在一起的蛋白。另外，多種類型的生物分子之間的相互作用導致了細胞結構的多樣性，如細胞骨骼和細胞膜。另外，可以通過特定物質在生物樣品中的存在來診斷很多病原體、疾病和生理學上重要的狀態。因此，一般需要檢測分析物和感興趣的配體之間的結合的靈敏、低成本的方法。
某些配體天然存在於細胞膜中。由於這種原因，業已對細胞膜進行了充分研究，以便確定所述配體與它們的體內功能之間的聯繫。例如，很多已知的治療藥物靶定生物分子，如存在於細胞膜表面上的受體。研究細胞膜表面上的生物化學反應的重大挑戰是在體外分析中難於模仿天然流體膜環境。一種方法涉及用脂膜對固體基質如二氧化矽或某些聚合物進行包被，以便模仿體內細胞膜的結構(Sackmann，E.，Science 27143-48(1996)；Groves，J.T.，Curr.Op.Drug Disc. Dev.，5606-612(2002))。採用這種技術，將細胞膜牢固地俘獲在靠近固體界面的地方，不過，還保留了它們的天然流動性和生物學功能(Grakoui等，Science 285221-227(1999))。
漂浮在受到支撐的表面如二氧化矽上的脂膜業已被用於研究多種具有治療價值的膜蛋白，包括G蛋白偶聯受體(Fang等，J.Am.Chem.Soc.，1242394-2395(2002))。不過，對這種膜表面上的分子相互作用的檢測通常需要精細的技術，如表面等離子共振(surfaceplasmon resonance，SPR)(例如，Hoffinan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9711215-11220(2000))或全內反射(total internalreflection，TIR)顯微術(Yang等，Anal.Chem.，73165-169(2001))。以上技術通常必須使用螢光標記。
發明概述本發明的實施方案涉及用於檢測分析物和配體之間的結合事件的方法和組合物，包括觀察膠體顆粒群的總體行為。在各種實施方案中，本發明包括用於檢測並且表徵分析物和配體之間的結合的方法，可用於檢測所述結合的膠體顆粒和製備所述膠體顆粒的方法。其他實施方案包括用於檢測和表徵分子結合相互作用的試劑盒。
在一種實施方案中，感興趣的配體與膠體顆粒的表面直接或間接地結合，以便形成改性膠體群。所述改性膠體隨後在允許它們在水溶液中獲得平衡或接近平衡分布的條件下溫育。所述膠體優選表現出自由的側向擴散，並且，所述系統優選表現出遍歷性流體(ergodicfluid)的特徵。在某些實施方案中，所述改性的膠體在重力作用下沉降到下面的基質上，並且形成二維膠體。膠體顆粒的分布優選通過直接光學成像測定，並與計算機輔助的分析相結合。
為了檢測感興趣的分析物是否與所述改性膠體結合，將分析物添加到膠體溶液中。所述分析物能夠以它的游離形式添加，或者可以與其他材料或結構如活細胞結合。可以通過觀察在添加分析物時所述改性膠體顆粒在平衡或接近平衡時的分布的改變檢測結合。在某些實施方案中，結合誘導了顆粒從凝聚相(condensed phase)向分散相(dispersed phase)的相轉變。在其他實施方案中，添加分析物導致了從分散相到凝聚相的相轉變。在其他實施方案中，結合可以通過在沒有顆粒發生特定相轉變的條件下所述膠體顆粒分布的改變來測定。
所述膠體顆粒分布可以通過直接光學成像觀察。相轉變還可以通過肉眼或測定顆粒在溶液中的空間分布的裝置檢測。在某些實施方案中，相轉變是通過對顆粒配對分布函數的統計學分析進行測定的，使得能夠對有和沒有分析物的條件下改性膠體的分布進行定量比較。在其他實施方案中，將不同的統計分析用於表述膠體相行為的差異。
所述膠體顆粒可以具有任何大小和/或組成。在某些實施方案中，所述膠體顆粒是與有孔或無孔材料如二氧化矽製成的大體上為球形的膠體顆粒。在本發明的一個方面，所述膠體顆粒是用脂膜層衍生化的。所述脂層可以是雙層，單層，或其他結構。所述脂膜層可以用對分析物特異的配體摻雜或衍生化，以便製備改性的顆粒。一方面，使用衍生化的顆粒，其具有外部摻雜的脂膜層，並在摻雜的脂層和顆粒表面之間有水層。在一種實施方案中，所述脂膜是用細胞表面蛋白或膜結合配體摻雜的。在該實施方案中，分析物通過配體與所述膜的結合導致了顆粒發生從凝聚群體到分散群體的相轉變。
本發明的實施方案可用於鑑定和表徵配體和分析物之間的結合相互作用。例如，在一種實施方案中，膜衍生化的膠體顆粒被用於研究在脂雙層環境中分析物與細胞表面分子之間的相互作用。在另一種實施方案中，所述改性膠體群被用作診斷工具，以檢測與疾病、病原體、藥物或各種生理學狀態相關的分析物的存在情況。例如，可以通過檢測與它們的脂配體的結合來診斷靶向膜的細菌毒素(例如，肉毒桿菌毒素，霍亂毒素，炭疽毒素，破傷風毒素)和病毒。
通過結合附圖來閱讀以下詳細說明，可以更完整地理解本發明的上述和其他目的和特徵。
附圖的簡要說明

圖1a是膜衍生化的二氧化矽顆粒的示意圖。圖1b表示在光致退色之後螢光恢復(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)實驗的詳細情況的三張照片，所述實驗是對包被顆粒表面作為流體膜的脂膜進行的。所述照片表示在退色之前的完全照明(左)，在退色期間的曝光(中)，和在退色之後1分鐘的完全照明(右)。圖1c表示相同的螢光恢復，但是使用的是非流體膜。
圖2表示膜衍生化顆粒的流動性(mobility)。圖2a是表示膜衍生化顆粒的二維布朗軌道的照片，所述顆粒業已在重力作用下沉降到裝有水的培養皿的底部。圖2b是一組四張照片，這些照片表示膠體的凝聚相圖像的時序，表明單個顆粒流動進入和離開凝聚的微晶。所述時序選擇為t＝0，t＝90秒，t＝180秒，和t＝270秒。
圖3表示蛋白結合激發的膠體相轉變。圖3a是表示圖像時序的一組四張照片，示出了從凝聚膠體相向分散膠體相的轉變，這種轉變是通過添加蛋白啟動的。照片是在以下時間拍攝的t＝0，t＝30秒，t＝60秒和t＝240秒。圖3b是圖3a所示時序的三維照片g(r)。
圖4表示一系列三維曲線圖，圖解說明蛋白結合分析的結果。圖4a是在與20μg/ml抗-Texas Red兔單克隆IgG抗體培養之後針對顆粒分散體測定的g(r)函數的曲線圖(面積分數φ＝0.15)，所述顆粒是被流體膜(90％DMOPC，大約9％DMPS)衍生化的，所述流體膜含有Texas Red-DPPE配體(N-(Texas Red磺醯)-1，2-雙十六烷醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)的不同摩爾分數(x)。圖4b是直徑為6.8μm的顆粒(φ＝0.25)的一系列相同分散體的g(r)曲線圖，所述顆粒是用含有神經節苷脂GT1B(三唾液醯神經節苷脂)的膜衍生化的，該顆粒業已與各種濃度的破傷風毒素(TT)進行過培養。TT與膜表面GTIB的結合誘導了從凝聚相向分散相的轉變，正如通過g(r)曲線檢測到的，以及通過直接觀察膠體確定的(插入的圖像)。圖4c是表示與圖4b類似的一系列實驗結果的曲線圖，所不同的是用0.5％單唾液醯神經節苷脂(GM1)取代了GT1B。霍亂毒素B-亞基(CTB)與GMI膜表面的結合誘導了所述轉變。CTB與GT1B膠體或TT與GM1膠體一起培養未產生影響。
圖5是在平面受支撐膜上進行的平行系列實驗的線狀圖。所述圖示出了CTB-GM1(圖5a)和TT-GT1B(圖5b)結合的有效解離常數經測定分別為大約60和大約41nM。圖5c表示在將CTB添加到用不含GM1和GT1B的膜衍生化的珠中時缺乏結合。圖5d表示用含有GM1-的膜衍生化的珠能檢測到CTB——它的天然配體——的結合，但是檢測不到α-銀環蛇毒素(BT)或TT的結合。圖5e表示用含有GT1B-的膜衍生化的珠能檢測到TT——它的天然配體——的結合，但是檢測不到CTB或BT的結合。
圖6a是微球體在溶液中的照片。帶陰影的顆粒是覆蓋有流體脂雙層膜(組成96％ DMOPC，3％ DMPS，1％ Texas Red^DPPE)的直徑為6.8mm的二氧化矽微球體。白顏色的顆粒是無孔的由流體脂雙層膜(組成98％ DMOPC，2％ DOEPC，1％1，2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯並二唑-4-基，或NBD-PE)覆蓋的直徑為6.8mm的二氧化矽微球體。圖6b表示典型的異質配對相關函數的曲線圖，示出了樣品中陰影和白色顆粒對的相對密度。
圖7a是表示通過直接光學成像觀察到的衍生化膠體顆粒的示意圖。
圖7b是最近鄰相互作用的直觀圖，它對應於在均質膠體顆粒的g(r)圖上的不同峰。
圖8A是三個圖像的照片，表示在CTB與膜相關GM1結合時膜包被的二氧化矽微珠的各種聚集狀態，用1nM(左)，50nM(中)，和1000nM(右)CTB進行溫育。
圖8B是表示0.5mol％GM1膜-包被的珠與升高濃度的CTB溫育後徑向分布函數的一系列曲線圖。
圖8C是表示通過膠體分析(虛線)和常規螢光讀數(實線)獲得的平衡結合曲線之間比較的線性圖。
圖9A是表示針對用人類紅細胞膜衍生化的平均直徑為6.8μm的珠的分散體測定的g(r)曲線圖(面積分數φ＝0.15)(左)。相應的圖像表示代表性的分布(右)。
圖9B是表示針對用人類紅細胞膜衍生化的並且與過量的抗-BandIII小鼠單克隆抗體溫育的平均直徑為6.8μm的珠分散體測定的g(r)曲線圖(面積分數φ＝0.15)(左)。相應的圖像表示代表性的分布(右)。
詳細描述本發明的實施方案涉及對檢測配體和分析物之間的結合的分析法。正如下文所討論的，在所述分析法中，首先將膠體群與配體結合，以便形成改性膠體群。然後使所述改性膠體一起在接近或處在相轉變狀態的條件下一起溫育。在上述條件下，所述改性膠體大部分處在凝聚相，但是接近向分散相的轉變。膠體混合物狀態的相對微小的擾動可能導致所述改性膠體轉變成主要為分散相。
業已發現，添加能與結合配體結合的分析物能夠導致所述改性膠體從主要為凝聚相向主要為分散相的相轉變。利用這一發現，可以開發出通過在分析物處理之後測定改性膠體群的相而檢測任何分析物與配體的結合的靈敏分析方法。
應當指出的是，本發明的實施方案不局限於從凝聚相到分散相的相轉變。實際上，分析物與配體的結合可以通過測定從分散相到凝聚相的相轉變進行檢測。
膠體體系的行為是通過顆粒之間的配對相互作用勢能(pairinteraction potential)驅動的。對於膜衍生化的二氧化矽顆粒來說，所述配對勢能是由膜-膜相互作用決定的。脂膜衍生化的二氧化矽顆粒的二維分散體表現出膠體相轉變，這種轉變是通過所述膜表面相互作用的細節控制的。所述總體相行為起著協同倍增器的作用，它能夠由所述膜表面上的少量的分子事件產生便於檢測的反應。
應當理解的是，所述分析法不需要採用標記技術對膠體、分析物或配體進行標記。微球體的相轉變可以進行光學檢測，如使用顯微鏡。因此，本發明的實施方案能提供這樣的優點，即不需要對任何成分進行染色或標記來檢測分析物-配體結合事件。
不過，應當理解的是，所述分析法不局限於未標記過的成分。在某些場合下，對膠體、配體或分析物進行標記可能是有利的。例如，在一種實施方案中，對微球體的異質混合物進行標記，然後在用分析物處理之後通過測定標記的位置來檢測它們的分散形式。在另一種實施方案中，所述膠體顆粒的異質性可以通過單個顆粒大小的顯著差異進行分辨。
另外，所述相轉變優選是動態相轉變。在本文中，動態相轉變是這樣一種轉變，其中，實際上整個群體從一種相轉變成另一種相。另外，所述群體的組成部分還能夠動態移動。例如，膠體群體的動態相轉變是這樣一種轉變，其中，實際上整個膠體群的相發生改變，例如從凝膠相轉變成分散相。不過，所述群體中的膠體顆粒還與多種其他膠體顆粒動態結合。從宏觀上看，所述膠體群可能會或者不會從一種相轉變成另一種相。不過，所述膠體改變相的自由度確實存在。不過，在顆粒水平上，每一特定膠體顆粒與任意數量的其他顆粒配對和不配對任意次數。因此，所述顆粒決非是不可逆轉的彼此結合的。這一點與諸如凝集的檢測方法不同，它們並不是動態相轉變的代表。這是因為凝集物的組成部分在轉變狀態之後彼此不會發生動態相互作用；在凝集過程中，所述成分保持以固定的構象相互結合。
正如下面所討論的，本發明的實施方案還包括檢測分析物存在情況的方法，其中在與分析物接觸之後通過對顆粒群的總體行為進行統計學分析來實現檢測。通過直接光學成像，觀察到了多種接近平衡的相，並且發現，分析物以低至10-4單層的密度與顆粒表面結合即可引起相轉變。統計學分析使得能夠對不同的系統進行定量比較，並發現微小的轉變前效應和顯著的轉變後行為。在某些實施方案中，顆粒分布是通過計算顆粒配對分布函數測定的，不過，可以使用其他分析法，包括、但不局限於高次相關函數。已發現實現處在或接近平衡的相轉變的顆粒表面上的結合事件能對顆粒的隨機分布產生可識別的標記作用，這種作用可以通過統計學分析解釋和計算，正如在下文更詳細地披露的。
在整篇說明書和附圖中使用了以下縮略語FRAP-光致退色之後螢光恢復(fluorescence recovery afterphotobleaching)；g(r)-配對分布函數(pair distribution function)；DMOPC-1，2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼；DMPS-1，2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸]；DOEPC-1，2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼；NBD-PE-1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯並二唑-4-基；Texas Red-DPPE-N-(Texas Red磺醯基)-1，2-雙十六烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；GT1B-三唾液醯神經節苷脂；GM1-單唾液醯神經節苷脂；TT-破傷風毒素；CTB-霍亂毒素B-亞基；和BT-α-銀環蛇毒素顆粒組成正如所公知的，膠體顆粒能自我組裝成各種有序相。膠體顆粒的總體行為在很大程度上是由顆粒之間的配對相互作用勢能決定的，後者又是由顆粒的表面化學所控制。因此，所述膠體顆粒的特徵在決定所述分析法的靈敏度和其他方面是重要的。
術語″膠體″和″膠體顆粒″在這裡可以互換使用，並且被定義為表示小到足以在溶液中表現出總體行為的微型顆粒。所述膠體顆粒的直徑可以為大約10nm-50μm，優選大約1μm-6.8μm，更優選大約5μm-6.8μm。所述顆粒可以具有任何形狀，不過優選基本上是球形的。在一種實施方案中，所述膠體顆粒是微球體。
在某些實施方案中，膠體顆粒是惰性的，從而裸露的顆粒在分析法的條件下彼此之間不會顯著地相互影響。在其他實施方案中，所述裸露的顆粒彼此之間可能產生吸引力或排斥力。顆粒還可以由各種材料組成，包括有孔和無孔形式的材料，如二氧化矽和含有二氧化矽的化合物，聚合物，如聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯類，聚丙烯酸酯類，聯乙炔類，烯烴類，噻吩類，聚噻吩類，糖聚噻吩類，醯亞胺類，丙烯醯胺類，丙烯酸酯類，甲基丙烯醯胺類，甲基丙烯酸酯類，乙烯醚，蘋果酸酐，聚氨酯類，烯丙胺類，矽氧烷類，苯胺類，吡咯類，和乙烯吡啶和其他水凝膠聚合材料，微凝膠和水凝膠，金或其他金屬，Group II-VI材料，Group III-V材料，分支的和無分支的組合物(例如樹狀聚合物(demdrimer))，其他無機和有機金屬和乙炔材料。
膠體顆粒可以用多種物質衍生化，從而為調節它們的表面的化學和生物學組成、由此調節它們在溶液中的表現提供了精確方法。在一種實施方案中，用脂層對顆粒進行包被。所述脂層可以是雙層，單層或其他結構。可以對脂膜的化學組成進行調整，以便調節配對相互作用勢能，並因此調節顆粒處在相轉變狀態的點。在本文中，術語″相轉變狀態″表示膠體顆粒懸浮液的狀態，其中，膠體處在將從分散相轉變成凝聚相的狀態，或者相反。實際的″相轉變″表示膠體懸浮液從一種相轉變成另一種相。
在各種實施方案中，當所述脂層具有淨中性或淨負電荷時，所述脂包被的顆粒進入凝聚相。類似地，在其他實施方案中，當所述脂層具有淨正電荷時，所述脂包被的顆粒進入分散相。在優選實施方案中，所述脂層由帶中性和帶負電荷的脂類的混合物組成，其中有大約10％的脂類是帶負電荷的。不過，所述分析法可以用具有任何表面電荷組成的顆粒進行。
脂膜可以通過大體上與用於在單片基質上形成被支撐膜相同的囊泡融合方法裝配在二氧化矽顆粒上(Bayerl等，Biophys.J.，58357-362(1990)；Buranda等，Langmuir，191654-1663(2003))。還可以使用任何其他合適的方法，如由Tanaka等，J.Am.Chem.Soc.，126；3257-3260(2004)中披露的方法。所述脂層可以用純化的成分重建，以便在所述顆粒上形成薄膜，或者可以使用從活的細胞上剝離的膜。所述脂層優選是連續的，並且優選保持側向流動性。在一種實施方案中，所述脂層的擴散係數為大約1-5μm2/s。
圖1a是膜衍生化二氧化矽顆粒的示意圖。如圖所示，二氧化矽(SiO2)顆粒與大約1nm的水層和寬度為大約5nm的脂雙層結合。圖1b表示三張照片，詳細示出了在光致退色之後螢光恢復(FRAP)實驗，該實驗是在包被顆粒表面作為流體膜的脂質膜上進行的。所述照片表示在退色之前的完全照明(左)，在退色期間的曝光方式(中)，和在退色之後完全照明1分鐘(右)。圖1c表示相同的螢光恢復，但是使用的是非流體膜。
所述脂層通常可以包括生物學或合成膜的任何成分，包括，但不局限於，脂類，膽固醇，固醇，麥角固醇，聚乙二醇，蛋白，肽，或任何其他分子，如脂肪酸，三醯基甘油，甘油磷脂，鞘脂類(例如鞘磷脂，腦苷脂和神經節苷脂)，固醇，膽固醇，表面活性劑，聚山梨酸酯，辛苯聚糖(octoxynol)，十二烷基硫酸鈉，兩性離子型去汙劑，癸基葡糖苷，脫氧膽酸鹽(酯)，丁二炔衍生物，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯肌醇，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯膽鹼，磷脂醯甘油，磷脂酸，磷脂醯甲醇，心磷脂，神經醯胺，溶血磷脂醯膽鹼，D-erythrosphingosine，鞘磷脂，十二烷基磷脂醯膽鹼，N-生物素基磷脂醯乙醇胺，以及其他合成的或天然的細胞膜成分，這些成分能夠與膜或諸如脂質體和薄膜的膜裝配體結合。
在一種實施方案中，所述膜包括中性和帶負電荷的或帶正電荷的脂單體，更優選中性和帶負電荷的脂。合適的脂類包括，但不局限於，磷酸絲氨酸，二棕櫚醯磷脂酸，1，2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMOPC)，1，2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)，和1，2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)，二硬脂醯磷脂醯甘油，磷脂醯肌醇，1，2-二油醯基-3-二甲銨-丙烷，1，2-二油醯基-3-三甲銨-丙烷，二甲基雙十八烷基溴化銨，1，2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼，N-(7-硝基苯-2--1，3-重氮-4-基)-1，2-雙十六烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺銨鹽，和N-1，2-雙十六烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙銨鹽，L-a-磷脂醯膽鹼(卵PC)，膽固醇，N-二硝基苯基氨基己醯基磷脂醯乙醇胺(DNP-Cap PE)，神經醯胺(天然和合成製劑)，N-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並二唑-4-基)氨基]十二烷醯]-鞘氨醇-1-磷酸膽鹼(C12-NBD鞘磷脂)，1，2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素基)，1-棕櫚醯(D31)-2-油醯-sn-甘油-3-磷酸肌醇(和其他磷酸肌醇提取物)，以及各種長度的聚乙二醇。
在優選實施方案中，所述膠體顆粒是用脂膜衍生化的二氧化矽顆粒，所述脂膜包含1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMOPC)，1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)，和1，2-二油醯-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)，並且，所述膜被對分析物專一的配體所摻雜。在與分析物結合時，會發生聚合物主鏈的破壞，導致從凝聚相到分散相的可檢測相轉變。
在其他實施方案中，所述顆粒可以用非脂類聚合物衍生化或者完全由這種聚合物組成，所述聚合物例如是Discher等，Science 297967-973(2002)中公開的那些，或任何其他足以獲得需要的配對相互作用勢能的材料。
已發現懸浮液中的顆粒顯示自由的側向擴散，並且所述系統的表現如同遍歷流體(ergodic fluid)。在圖2a中示出了稀釋的顆粒混合物的布朗軌跡。顆粒擴散係數基本上與膜的組成無關；對於直徑5μm的顆粒來說，測定的結果為0.079-0.086μm2/s。
以上值為根據Stokes-Einstein關係預測的純粘滯曳力的大約80％，表明曳力在下層基質上的作用較小。根據顆粒表面上的膜之間的相互作用的強度，觀察到了膠體的分散(氣體)或凝聚(液體或晶體)相。顆粒移動性局限於凝聚相，而發現顆粒沒有不可逆轉的結合(圖2b)。單個顆粒在凝聚相和分散相中的移動性決定了系統平衡速度。如圖2b所示，顆粒凝聚在凝聚的微晶上並且從它上面蒸發出來的時間量程與我們的實驗相比是快速的(分別為幾分鐘和超過半小時)。另外，所述相的總體形態學和定量配對分布函數保持恆定，儘管單個顆粒發生了相互交換。以上發現表明，該系統是接近平衡的，至少在若干顆粒直徑的長度規模上是這樣。
對脂膜的化學組成進行調節，以便調控配對相互作用勢能，並且如下文所述。如圖2b所示，無論包被膜是淨中性的或帶負電荷的，都形成了凝聚相。相反，由帶淨正電荷的膜產生了分散相。多種相的出現表明了配對相互作用能量使得該系統接近相轉變。因此，膜表面上的微小擾動誘導了膠體宏觀組構的顯著變化。
配體在本文中，配體包括離子、分子或分子團，它們可與其他化學實體結合，形成較大的複合體。配體可以包括多種材料，包括下文披露為潛在分析物的那些。優選的是，配體對於要檢測的分析物具有特異親和力。合適的配體包括、但不局限於碳水化合物、核酸、生物素、鏈黴抗生物素蛋白、細胞因子、肽、蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶、受體、通道蛋白、抗體、小分子藥物、大的聚合藥物、生色團、抗原、螯合化合物、磷酸鹽和反應性基團、分子識別複合物、離子基團、可聚合的基團、二硝基苯酚、接頭基團、電子供體或受體基團、疏水基、親水基、有機或無機分子或者與受體結合的任何分子。另外，多個配體可以與單一膠體結合。可以使用的配體的多樣性使得能夠檢測並且表徵與多種分析物的結合。
配體能夠直接或間接地與所述膠體顆粒的表面結合。在本文中，當兩個分子以任何方式彼此結合時，這兩個分子就是″結合的″。例如，如果兩個分子是非共價連接的，它們就是結合的。在另一種實施方案中，如果兩個分子是共價連接的，它們就是結合的。在某些實施方案中，配體分散在膠體顆粒外表面上的脂層中。這種類型的脂膜摻雜(doping)可以參見Salafsky等，Biochemistry，3514773-14781(1996)，和Groves等，Biophys.J.，712716-2723(1996)，這兩篇文獻都以全文形式收作本文參考。在某些實施方案中，將配體直接摻入到所述膜上，而在其他實施方案中，它們與所述膜間接地結合，例如通過摻入到所述膜中的糖基磷脂醯肌醇(GPI)接頭連接，而在另一些實施方案中，是天然地出現在所述膜中的，天然膜提取物就是如此。所述配體能夠以大約10-2-10-6摩爾濃度，更優選大約10-2-10-4摩爾濃度的濃度插入所述脂層，或者以典型的體內濃度存在於天然脂膜中。在其他實施方案中，配體是與顆粒的表面直接共價偶聯的。例如，配體諸如抗體或抗體結合片段可以直接地與二氧化矽、苯乙烯、磁性或半導體納米晶體顆粒偶聯。抗體片段的非限定性例子包括Fab片段、Fab2片段和單鏈抗體。
分析物在本文中，分析物是接受分析的任何物質或化學成分。分析物可以包括無限種類的物質，它們優選與所述配體結合。分析物的例子包括毒素、激素、酶、凝集素、蛋白、信號分子、無機或有機分子、汙染物、抗體、病毒、細菌或其他病原生物、或者獨特位或其他細胞表面標記。
在某些實施方案中，所述分析物可以包括多種物質，這些物質的存在指示了致病有機體，包括、但不局限於唾液酸，其用於檢測HIV，衣原體，腦膜炎奈瑟氏球菌，豬鏈球菌，沙門氏菌屬，腮腺炎，新城疫(newcastle)，和各種病毒，包括呼腸孤病毒，仙臺病毒，和粘液病毒；9-OAC唾液酸，其用於檢測冠狀病毒，腦脊髓炎病毒，和輪狀病毒；非-唾液酸糖蛋白，其用於檢測巨細胞病毒和麻疹病毒；用於雜交和鑑定炭疽的存在的肽序列，CD4，血管活性腸肽，和肽T，其用於檢測HIV；表皮生長因子，其用於檢測牛痘；乙醯膽鹼受體，其用於檢測狂犬病；CD3補體受體，其用於檢測EB病毒；β-腎上腺素能受體，其用於檢測呼腸孤病毒；ICAM-1，N-CAM，和髓磷脂-相關糖蛋白MAb，其用於檢測鼻病毒；脊髓灰質炎病毒受體，其用於檢測脊髓灰質炎病毒；成纖維細胞生長因子受體，其用於檢測皰疹病毒；寡聚甘露糖，其用於檢測大腸桿菌；神經節苷脂GM1，其用於檢測腦膜炎奈瑟氏球菌；和抗體，其用於檢測多種病原體(例如，淋病奈瑟氏球菌，V.vulnificus，V.parahaeniolyticus，V cholerae，和V.alginolyticus)。
所述分析物還可以包括上文作為潛在配體披露的任何物質。
檢測分析法檢測分析法被用於確定分析物是否業已與配體結合。在某些實施方案中，所述分析包括以下步驟將具有感興趣的配體的顆粒添加到溶液中，以便形成膠體懸浮液。然後讓所述顆粒達到平衡或接近平衡分布，以便所述顆粒處在或接近相轉變狀態。然後在所述相檢測顆粒彼此之間的相互分布，以便可以與添加分析物之後的顆粒分布進行比較。然後將分析物添加到膠體懸浮液中，並且讓膠體顆粒重建平衡或接近平衡的分布。然後再次測定顆粒的彼此相對分布，以便確定分析物是否業已與配體結合。如果所述顆粒分布表明它們業已從一種相轉變成另一種相，例如從主要為凝聚相轉變為主要為分散相，就可以確定分析物業已與配體結合。
在其他實施方案中，所述分析法包括以下步驟將具有感興趣的配體的膠體顆粒添加到溶液中，以便形成膠體；讓所述述膠體顆粒達到平衡或接近平衡分布；檢測顆粒彼此的相對分布；分離所述膠體顆粒；將分離的顆粒添加到有可能含有與配體結合的分析物的第二種溶液中；讓所述膠體顆粒重建平衡或接近平衡的分布；並且檢測顆粒彼此的相對分布，以便確定分析物是否存在於所述樣品中。
所述分析法的其他實施方案可以包括以下步驟將具有感興趣的配體的膠體顆粒添加到溶液中，以便形成膠體；讓所述膠體顆粒達到[動態]平衡或接近平衡分布；檢測顆粒彼此的相對分布；分離所述膠體顆粒；將分離的膠體顆粒添加到有可能含有與配體結合的分析物的環境中；從所述環境中分離所述膠體顆粒；將所述膠體顆粒添加到溶液中；讓所述膠體顆粒重建平衡或接近平衡的分布；並且檢測顆粒彼此的相對分布，以便確定在所述樣品中是否存在分析物。總體相行為被用作協同倍增器，它由膜表面上的少量的分子事件產生便於檢測的反應。
在一種實施方案中，通過觀察從凝聚相到分散相的轉變檢測分析物結合。為了實現在結合時從凝聚相到分散相的轉變，分析條件如顆粒的大小和表面組成以及分析溶液的組成可使得在缺少分析物的條件下由於顆粒之間的引力(例如，範德華相互作用)由顆粒形成凝聚相。如果添加到溶液中的分析物與顆粒-相關的配體結合，則它與顆粒表面的相互作用可能增加兩個顆粒之間的最緊密的接近位置，並相應降低它們之間的引力的總強度(參見，Wong and Groves，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9914147(2002))。這樣，分析物的結合可能影響所述膠體顆粒的聚合、分布和行為，從而可以通過測定顆粒的分布來檢測結合。通過對顆粒配對分布函數的統計學分析，能夠對不同的系統進行定量比較，並且能夠揭示微小的分析物-配體相互作用。另外，結合事件能夠對顆粒的隨機分布產生可識別的標記效應，這種效應可以與顆粒相互作用關聯起來。
還應當理解的是，分析物的檢測不是二元事件。例如，與配體結合的強或弱可以通過本分析方法精確地確定(參見圖8A-8C)。通過測定膠體顆粒從凝聚狀態轉變到分散狀態的程度，人們能夠估算分析物和配體之間的結合量。從凝聚狀態到分散狀態轉變的膠體數量較大表明了較強的配體結合，而從凝聚狀態到分散狀態轉變的膠體數量較小則表明了所述配體與分析物的結合更弱。
圖8A-8C表示利用膜衍生化的膠體測定結合親和力。CTB與被膜包被的具有膜結合型GM1的二氧化矽微珠的結合在多種CTB濃度下測定。徑向分布函數的曲線使得能夠在所使用的蛋白濃度範圍內對膠體分布進行定量比較。將通過膠體分析法獲得的平衡結合曲線和用常規螢光方法獲得的結合曲線進行比較，發現來自通過膠體分析法獲得的膠體配對分布函數結果與通過螢光測定的結合蛋白濃度成比例。因此，膠體分析法提供了對結合親和力的無標記分析，可將這種方法用於精確地測定多種相互作用的平衡解離常數。
在一種實施方案中，在缺少分析物的條件下，顆粒之間的引力使系統接近相轉變。在某些實施方案中，可以對所述分析法進行校正，以便通過觀察響應於分析溶液的離子強度、溫度或其他影響顆粒-顆粒引力之間親和力的變量的改變而發生的相轉變來確認該系統接近相轉變閾值。當該系統接近相轉變狀態的閾值時，所述分析法通常更靈敏，使得配體和分析物之間的結合的微小擾動能夠啟動便於檢測的相轉變。不過，本發明的某些實施方案在有或沒有分析物的條件下檢測無顆粒群處於或接近相轉變時的結合。
為了觀察顆粒，通常由於重力作用使它們處在或接近平衡狀態。所述顆粒能夠沉降在大體上的平面上，以便形成″二維膠體″，它是一層膠體顆粒，通常位於基質的表面上(圖7a)。這種二維膠體有利於觀察顆粒並且進行成像，並且有利於對它們在所述表面上的分布進行統計學分析。優選將所述膠體顆粒以這樣的濃度使用，當所述顆粒排列在孔或平板的底部時，顆粒所佔的面積佔顆粒之間或周圍的空間面積的大約0.1-0.5，或更優選0.15-0.25。更多的顆粒傾向於使得所述分析法更靈敏。將顆粒運動性保持在和接近平衡相，並且顆粒運動程度決定了系統平衡的速度。在某些實施方案中，平衡的時間量程少於幾分鐘。在其他實施方案中，該量程少於大約30分鐘。
所述分析法通常不需要施加外部力，而僅僅依賴於膠體顆粒群體的熱力學行為。在有或沒有分析物的條件下，當該系統處在或接近平衡時，所述膠體溶液優選表現出遍歷流體的特徵。單個顆粒隨時間遷移進入群體，進入孤立的狀態，然後返回群體。所述膠體顆粒能夠在懸浮液中自由地四處移動並且改變相對位置。這一特性使得能夠檢測動力學，可逆轉的和/或′弱的′結合相互作用，因為所述分析法不需要形成靜態複合物。這一點與現有技術如共沉澱、親和層析、以及需要形成穩定的複合物以檢測結合的技術不同。單個顆粒的運動性不受蛋白結合的影響，因此接觸特定的感興趣的分析物，在合適的同源配體業已摻入到所述膠體膜上時能夠誘導相轉變。
其他實施方案可以利用顆粒的異質混合物以檢查複雜的相互作用。可以對顆粒進行標記，以便它們可以單獨地識別。所述標記包括、但不局限於摻雜到顆粒材料中的螢光分子、摻雜到脂層中的螢光分子、摻雜到顆粒材料中的半導體納米晶體等。還可以按照大小區分顆粒。例如，某些實施方案利用大小不均勻的顆粒，每一種顆粒具有不同的特性，例如通過對顆粒表面或材料進行改性，或通過修飾顆粒大小本身(例如改變可供相互作用的表面積)。可以將多種粒度用於該分析法中。在一種實施方案中，使用直徑為大約3-7μm的顆粒，並且，直徑的大約50％的波動能夠引起相行為方面的可檢測的差異。在該實施方案中，粒度的可檢測的差異為鑑定和追蹤特定顆粒行為提供了一條途徑。在各種實施方案中，追蹤具有特定特性的顆粒的行為可用於檢測複雜的分子間相互作用。例如，非均一組成和功能的強烈相互作用顆粒可用作構件，用於組裝成複雜的、多功能的納米級結構，用於分析更複雜的系統。膠體顆粒還可以利用諸如螢光標記、半導體納米晶體、納米級檢測裝置，或定製的納米晶體或分子之類的材料進行內在功能化。
在其他實施方案中，顆粒可以與活的細胞混合。在上述實施方案中，細胞表面蛋白或其他分子被用作分析物，它們在配體結合時可導致顆粒分布的可檢測的變化。這使得能夠檢測細胞激活和增殖事件(例如，紅細胞形成玫瑰花結)，細胞相互作用，細胞倍增，和其他生理學上相關的事件。
膠體顆粒可以分散到多種不同的環境中，用於檢測感興趣的分析物的存在，如人體，存在劇毒物或腐蝕性物質的區域。所述顆粒還可用於高真空環境。在這些實施方案中，使結合事件發生，並且隨後收集所述顆粒，使之處於可以進行該分析法的條件下。由於只有經歷了結合事件的有限數量的顆粒必須收集，故所述顆粒可以分散在諸如流動的水體中的環境中，例如河流或活的有機體。在某些實施方案中，接觸分析物樣品的「傳感器」顆粒可以通過多個沒有接觸分析物樣品的背景顆粒發生運動。這使得檢測步驟能夠以少量的接觸樣品的顆粒，通過觀察「傳感器」顆粒的相行為與背景顆粒的關係來進行。
膠體分析法的實施使得自動化液體處理和成像系統能促進高通量分析。例如，自動化流體處理系統可用於在一個或多個測試孔中實施分析法的各步驟。在優選實施方案中，所述分析是在Corning COSTAR3997聚苯乙烯平板或在相當的高通量平板上進行的。自動化流體處理使得能夠在多種條件下同時進行多種分析，實現樣品的均一的和可重複的處理。可以對流體處理裝置進行編程，以便控制分析條件，如溫度和培養時間，將樣品添加到測試孔中及從孔中取出，以及實施所述分析法的檢測步驟等。機械流體處理裝置可以通過商業渠道獲得，例如從Tecan AG購買。
在某些實施方案中，所述分析法的檢測步驟可以通過測定已知與相轉變相關的變量進行，優選的是所述變量比所述膠體顆粒的分布更易於測定。例如，可以將分光光度計、掃描平板讀數儀或成像或計算光散射的類似裝置用於測定添加分析物之前和之後的顆粒群體的光學密度，並且將特定的讀數與相轉變的發生或未發生相關聯。然後能夠以高通量方式進行其他分析，其中，分析物與配體的結合是通過對所述平板進行掃描以便確定是否獲得了表明存在或不存在相轉變的標誌性光密度讀數進行檢測的。
可以改變的本發明的其他方面包括用於本分析法的材料的水化、包被和電荷。
檢測顆粒群的分布可以用配對相關性表示，並且相轉變可以通過分析它們的函數進行作圖。最低群體數為2，優選至少10，更優選1000。
圖3表示通過在t＝0秒添加分析物蛋白誘導的從凝聚相到分散相的相轉變的時序(圖3a左上部圖片)。在將一滴含有分析物的溶液添加到孔頂部的數秒鐘內，凝聚相的一致性的破壞是可分辨的(圖3a右上部圖片)。大約經過1分鐘，所述膠體達到了可測定的分散的分布(圖3a下部圖片)。單個顆粒的運動性不受蛋白結合的影響，因此只有當合適的同源配體業已被摻入到膠體膜中時，對特定感興趣的分析物的接觸才誘導了相轉變。與膜表面結合的分析物的物理存在增加了兩個膜之間的最接近的位置，並因此減少了顆粒之間的範德華引力的累計強度，使得能夠發生相轉變。
膠體相的定量分析是通過對配對分布函數g(r)的提取進行的。顆粒位置是根據寬視野(～1mm)圖像測定的，通過目標定位算法達到大約16nm的精度。大顆粒群的寬視野圖像應當用高解析度照相機拍攝，如電荷耦合器件照相機，並且利用成像軟體如METAMORPH(Universal Imaging Corporation，Cranberry Township，PA)進行分析。採用這種軟體，利用強度可以非常精確地找到顆粒的中心，因為所述顆粒是球形的透明物體。針對每一個圖像計算每一顆粒中心的X，Y坐標，以便計算每一顆粒中心和它的最鄰近顆粒的中心之間的距離，與第二鄰近的和第三鄰近的顆粒之間的距離等(圖7b)。
對於空間尺寸X×Y的有限的矩形窗口來說，g(r)可以根據以下公式計算g(r)=(r)X2Y2N(N-1)r[XYr-2(X+Y)r2+r3]]]>(公式1)其中η(r)是間隔距離為r±δr/2的顆粒對的數量(對於本文所提供的數據來說，δr＝40nm)，r是所使用的顆粒的半徑，而N是顆粒的總數目。
進行有效分析的g(r)的迭代次數取決於N，即要分析的顆粒對的數目。如果N＝1，為了令人滿意地計算g(r)，需要很長的時間，以便獲得足夠的數據顯示該特定顆粒組成的具體g(r)曲線。因此，N優選為至少10，優選1000或更大，以便在幾秒鐘時間內獲得足夠的數據。
凝聚相g(r)在t＝0時的曲線上表徵為在一種顆粒直徑(r0)的最鄰近間隔距離處的大峰，以及在r＝√3r0和2r0處相當於六邊形微晶上次最近鄰的次級峰。g(r)的獨立測定值是高度一致的。用獨立的膠體製劑測定的r0峰幅度的標準誤差一般小於5％。包括隨機分布並且相當平直的g(r)函數的分散相可以通過肉眼與凝聚相區分。(參見30，60和240秒的時間的曲線)。g(r)的定量測定還能區分多種中間分布。儘管這種分布是暫時的，中等級別的程度同樣出現在接近平衡分布中，相當於結合在膜表面上的蛋白質的不同用量。
膠體相的定量分析還可以通過提取無限系列的分布進行。當膠體顆粒類型的數量大於1時使用這種方法。
為了對樣品進行定量比較，提取g(r)上的第一個峰，該峰出現在特定顆粒直徑下(5μm)。相應的有效相互作用能量為Ei。然後作為kBT能量的近似值計算Ei，並且通過利用g(r)曲線上第一個峰的高度的自然對數計算，將它代入具有已知函數或表達的曲線中，或者求曲線下面積的積分。這樣能夠精確地比較包括顆粒的等面積分數()的樣品，並且Ei在低的覆蓋密度下會合成純的配對相互作用能量。儘管Ei需要平衡，以便具有有單位的能量，但這不是進行有效比較所必須的。只要每一種膠體系統是在最初的不相關的狀態下形成的，以特定時間間隔進行的非-平衡分布測定還可用於定量比較。
儘管Ei的計算可能是有用的，對於在本文中的分析物的檢測來說它可能是不必要的。定量的g(r)曲線在檢測分析物並且與要分析的顆粒結合時，表現出第一個峰的非常獨特的缺失。
在平衡狀態下，g(r)與平均力的潛力w(r)物理相關g(r)=e-w(r)/kBT]]>(公式2)在稀釋系統中，w(r)相當於配對相互作用勢能，因此提供了對相互作用能量的直接度量。在更濃縮的系統中，w(f)由於相鄰的顆粒而起作用。可以展開w(r)，以便利用Ornstein-Zemike積分方程式和適當的截取近似值，如Percus-Yevick方程，獲得實際的配對勢能。
g(r)的獨立測定值是高度一致的。利用相同的原材料根據獨立的膠體製劑測定的Ei值的標準誤差一般小於0.1kBT。
g(r)的精確測定值為利用不同膜組成之間的相互作用的微小不同提供了一條途徑。隨著膜上的淨靜電荷逐漸從負調整到正，檢查從凝聚相到分散相的轉變。
有若干種力，包括範德華、空間水合和靜電影響了膜之間的相互作用勢能。業已利用表面力裝置(SFA)研究了支撐在分子平面雲母表面上的脂膜之間的力。在類似所述膠體實驗的條件下，雲母支撐的膜的黏性相互作用力在大約0.5-1nm的最小間距下為大約10-22J/nm2。這一結果總體上與在Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理論的預測吻合，只有最小間隔距離不同，該距離主要是由排斥性空間水合力決定的。利用線性化Derjaguin近似方法計算膜衍生化顆粒之間的DLVO相互作用勢能，以便計算兩個球體之間的靜電相互作用和非延遲範德華力，所使用的Hamaker常數＝7×10-21J。所述範德華引力較強(在1nm的最小間隔距離下為350kBT)，並且通過靜電排斥平衡，它在強度≥14mV的表面電位(1nm的最小間距)很快變得顯著。DLVO相互作用的大的總體幅度表明了範德華力之間的精確平衡是不可能的，並且靜電力可能導致在實驗中觀察到的一致性的較弱粘附力。
對所述實驗結果的一種解釋可以根據本發明的膠體顆粒不是分子平面這一事實進行解釋。在兩個顆粒彼此接近時，相對較大表面拓撲結構的區域經歷更短的相互作用距離。粗糙表面之間的接觸幾何學的細節對各種顆粒間的力產生了不同的影響，這取決於它們所起作用的特定長度規模。例如，預計納米長度範圍的表面拓撲結構對靜電相互作用具有很小的影響，因為在上述實驗中具有長的Debye長度(＞100nm)。相反，較短範圍範德華相互作用強烈受到納米級表面拓撲結構的調控大部分附著能量來自緊密接觸的表面的小部分面積。同樣短範圍的空間水合力將決定兩個顆粒之間的最小的間隔距離，這同樣取決於所述緊密接觸部位。因此，大的表面區域由於表面拓撲結構而被排除經歷短範圍的相互作用力。
與膜表面結合的分析物形成了拓撲結構，並且改變了有效的粗糙度。這表明了分析物結合誘導的膠體相轉變的可能機制，其中，少數蛋白在膜表面上的存在改變了兩個顆粒之間的最接近的位置，並因此調節了範德華引力的累計強度。這種通過調整膜組成控制相互作用能量的實驗能力對於基於這種類型的膠體相轉變的分析系統的設計和優化來說具有實用價值。
由於檢測的可量測性和低的成本，分析物的檢測分析法可以用高通量方式進行。編寫軟體程序，以便使g(r)的計算自動化。該程序輸入包括每一幅圖像中每一個顆粒的X，Y坐標位置的文本文件。該軟體還利用了這樣的參數，如每一幅圖像的像素分辨度，顆粒大小，圖像窗口大小，以及所需要的g(r)的分辨度。g(r)能夠以高的和低的分辨度分析，不過，優選以較高的分辨度分辨g(r)，如0.04的分辨度，因為這種分辨度具有可接受的信噪比。如果分辨度較低，如為0.01或更小的分辨度，就有可能存在太大的噪音。該程序計算並且輸出g(r)曲線。實驗通常在φ≈0.15-0.25的顆粒面積分數下進行，相當於每幅圖像大約7000個獨立的顆粒，其中，φ是由顆粒覆蓋的窗口的面積，與顆粒之間和周圍的空的空間相反。一般地，對大約5-10個獨立的圖像加以平均，以便由＞108的測定的配對距離得到g(r)。
可以自動化計算視野區域的成像，只要照片是一致性地拍攝的即可，唯一的限制是自動化照相機的速度，軟體和硬體。可以相當快地製造g(r)曲線，只要在足夠的時間內對足夠數量的顆粒進行成像即可。
還可以理解的是，所述分析法可以只使用諸如分光光度計或掃描平板讀數儀的裝置進行，這些儀器能夠成像或者計算所有波長和光譜的光散射，以便能夠進行高通量檢測。在相轉變之前和在每一相轉變時測定特定顆粒群的光學密度，以便獲得標誌性光學密度讀數。在添加並且使分析物與衍生化顆粒結合時，可以對所述平板進行掃描，以便確定是否業已誘導了相轉變。
影響檢測分析法的其他因素包括水合層，包被物，和進行分析的材料的電荷。目前可以理解的是，所述檢測分析法優選在ComingCOSTAR 96-孔3997聚苯乙烯平板或者相當的高處理量平板上進行。所述分析法還可以在96-，384-或1536-孔平板上進行。
所述技術的應用本文所披露的膠體顆粒提供了在任何特定溶液中檢測分析物的靈敏的低成本方法。在優選實施方案中，通過檢測與配體的結合事件來檢測病原生物、疾病、毒素、汙染物、激素、信號分子、抗體、癌症或醫學狀態的存在。在某些實施方案中，採用了多種配體以檢測多種病原生物，包括、但不局限於唾液酸，其用於檢測HIV，衣原體，腦膜炎奈瑟氏球菌，豬鏈球菌，沙門氏菌屬，腮腺炎，新城疫(newcastle)，和各種病毒，包括呼腸孤病毒，仙臺病毒，和粘液病毒；以及9-OAC唾液酸，其用於檢測冠狀病毒，腦脊髓炎病毒，和輪狀病毒；非-唾液酸糖蛋白，其用於檢測巨細胞病毒和麻疹病毒；能夠雜交並鑑定炭疽的存在的肽序列，CD4，血管活性腸肽，和肽T，其用於檢測HIV；表皮生長因子，其用於檢測牛痘；乙醯膽鹼受體，其用於檢測狂犬病；Cd3補體受體，其用於檢測EB病毒；β-腎上腺素能受體，其用於檢測呼腸孤病毒；ICAM-1，N-CAM，和髓磷脂-相關的糖蛋白MAb，其用於檢測鼻病毒；脊髓灰質炎病毒受體，其用於檢測脊髓灰質炎病毒；成纖維細胞生長因子受體，其用於檢測皰疹病毒；寡聚甘露糖，其用於檢測大腸桿菌；神經節苷脂GM1，其用於檢測腦膜炎奈瑟氏球菌；和抗體，其用於檢測多種病原體(例如，淋病奈瑟氏球菌，V.vulnificus，V.parahaemolyticus，V.cholerae，和V.alginolyticus)。
本文所披露的膜衍生化的膠體系統具有應用於與細胞膜表面上的化學事件相關的多種問題的潛力。這些應用包括利用多種細胞表面蛋白對配體相互作用進行作圖，用於檢測靶向膜的細菌毒素(例如肉毒毒素，霍亂毒素，炭疽毒素，破傷風毒素)和病毒。應當理解的是，利用天然生物學膜對膠體進行包衣，可以用於對多種分析物進行測定。通過利用天然膜，所述分析法可以檢測分析物與只存在於天然膜中的配體的結合。正如所公知的，多種類型的膜結合配體在體外是不容易表達的，因此，利用天然膜提供了很多優點。
膜衍生化顆粒可以組合成非均質混合物或者與活的細胞(例如形成玫瑰花結)組合，使得本文所披露的方法可用於分析膜間受體-配體相互作用。通過膠體分析法的實施可應用於自動化液體處理和成像系統。對空間分布函數的詳細分析，如本文所披露的配對分布研究，能夠表徵微弱的相互作用，包括不會產生質上可識別影響的作用。與此同時，在膠體顆粒上應用包被膜，提供了化學官能性的大量成分，它在非生物學環境下可顯示是有價值的。預計在本研究中用脂膜說明的一般原理可以擴展到其他材料，如最近開發的聚合物小泡。
顆粒的非均質混合物可用於檢查膜和/或膜結合配體之間的相互作用，或者作為倍增方式。在這種實施方式中，所述顆粒可以通過標記物分別識別。可以使用的標記包括、但不局限於摻雜到顆粒材料中的螢光分子，摻雜到膜中的螢光分子，摻雜到顆粒材料中的半導體納米晶體等。可以將非均質組成和官能性的強相互作用顆粒用作構件，用於組裝成複雜的、多功能的納米級結構，該結構可用於分析更複雜的系統。
顆粒能夠與活的細胞混合，通過產生便於觀察的、可控制的、保留了細胞樣特性的界面，從而定量觀察細胞激活和增殖(例如，細胞玫瑰花結形成)，或檢查細胞相互作用和倍增。
顆粒還可以用諸如螢光標記、半導體納米晶體、納米級檢測裝置，或定製的納米晶體或分子之類的材料進行內部官能化。
膠體顆粒可以分散到多種不同環境中，如人體內，存在劇毒物或腐蝕性物質的區域，或高真空環境，以便檢測例如汙染物的存在。使結合事件發生，然後收集顆粒，再使之處於能夠進行分析的條件之下。由於顆粒沉澱，並且只有業已經歷了結合事件的有限數量的顆粒必須收集，所述顆粒能夠均勻分散在諸如流動水體之類的環境中，例如河流中。例如，將顆粒在接觸河流之後的可觀察的行為和分布與注入河流之前的顆粒進行比較。
在檢測條件下接觸介質的「傳感器」顆粒可以通過沒有接觸所述介質的多個背景顆粒發生移動。有關所述顆粒行為的相數據可以通過觀察相對較少的「傳感器」顆粒的軌跡得出，而不用察看在有限部位觀察很多顆粒的整體空間數字。
實施例1利用被神經節苷脂摻雜的膜衍生化的二氧化矽顆粒進行檢測分析法的方法和材料材料脂類是從Avanti Polar Lipids獲得的。將1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMOPC)，1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)，和1，2-二油醯-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)放入氯仿中，並且在-20℃下保存長達兩周時間。單唾液醯神經節苷脂GM1，牛銨鹽(GMI)是以粉末形式從Matreya公司獲得的，將其溶解在2∶1氯仿/甲醇中達到1mg/mL的濃度，在-20℃下保存。三唾液醯神經節苷脂GT1B，牛腦(GT1B)是以粉末形式從Sigma獲得的，將其溶解在2∶1氯仿/甲醇中達到1mg/mL的濃度，在-20℃下保存。螢光探針N-(Texas Red磺醯)-1，2-雙十六烷醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(Texas RedDPPE)是以粉末形式從Molecular Probes公司獲得的，並且在使用之前溶解在氯仿中。FITC標記的霍亂毒素亞基B(CTB)是從Sigma公司購買的，溶解在0.2xPBS中，使濃度達到0.5mg/mL，並且在4℃下保存。未標記過的α-銀環蛇毒素(BT)是從Sigma公司購買的，溶解在0.2xPBS中，使濃度達到0.5mg/mL，並且在4℃下保存。螢光素標記的破傷風毒素c-片段(TT)是從Calbiochem購買的，用無菌水重溶，使濃度為0.1mg/mL TT和10mM磷酸鈉緩衝液，在4℃下保存。胎牛血清(FCS)是從Sigma公司購買的，用無菌水重溶，並且在4℃下保存。未標記過的兔IgG級份抗體抗-Texas Red是從Molecular Probes公司購買的，濃度為1mg/mL，並且在4℃下保存。平均直徑為5μm的二氧化矽玻璃微球體是從Bangs實驗室獲得的，並且在4℃下在DI H2O下保存。
受支撐的膜受支撐的雙層是通過將小的單層囊泡融合在(SUV)乾淨的玻璃微球體上形成的。將溶解在氯仿中的脂溶液蒸發到小的圓底燒瓶中，並且在4℃下在18.2MΩ-cm的水中水合1小時，達到大約3.3mg/mL。在冰水浴中對所述脂類進行探針-超聲波處理至澄清，並且在4℃下，以160,000g的速度超速離心2小時。將上清液在4℃下保存達一周。通過在250℃下在濃硝酸中煮沸，然後進行充分漂洗，製備玻璃表面用於沉積。通過使等量(100μL)的擴散溶液(1∶1SUV/PBS)和顆粒溶液一起在1.5mL離心管中混合，讓雙層在顆粒表面上進行自我組裝。通過脈衝離心使顆粒沉澱並且除去上清液，除去多餘的囊泡。然後將1mL的18.2MΩ-cm的水添加到沉澱的顆粒中，並且對整個混合物進行渦旋攪拌，使之再懸浮。
膠體形成膠體是通過將顆粒懸浮液稀釋到理想濃度，並且用吸液管將200-300μL的上清液轉移到Costar number 3997 96-孔平板上形成的。讓96-孔平板保持靜止15分鐘時間，以便使顆粒均勻沉降到每一個孔的底部。
成像將受支撐的雙層包被的顆粒稀釋到工作濃度，並且沉降到Corning 96-孔細胞培養族上進行觀察。在室溫下用Nikon TE-300倒置螢光顯微鏡(Nikon，Japan)觀察顆粒，該顯微鏡上裝有水銀弧光燈，用於發出螢光，和100W的滷素燈，用於亮視野照明。用RoperScientific CoolSnap HQ電荷耦合器件照相機(Roper ScientificCoolSnap HQ，USA)記錄圖像。用SIMPLE PCI(Compix Inc.，CranberryTownship，PA)獲取圖像，並且用METAMORPH(Universal ImagingCorporation，Cranberry Township，PA)進行分析。
數據分析為了獲得上面所述的公式(1)，將配對分布函數表示為g(r)＝n(r)/p(r)，其中n(r)＝2η(r)/(N(N-1)δr)是具有間隔距離r的顆粒對的實際相對密度，p(r)＝2(πXYr-2(X+Y)r2+r3)/(X2Y2)是在空間尺寸為X×Y的有限矩形窗口中發現具有間隔距離r的顆粒對的總體概率密度。為了獲得p(r)的這種表達，我們解除了線性積分p(r)＝∫Qp(rx)p(ry)dq，其中，p(rx)＝2(X-rx)/X2和p(ry)＝2(Y-ry)/Y2是發現具有間隔矢量r分別為rx和ry的絕對投射的顆粒對的概率密度，而Q是圓的全部正象限。
在平衡狀態下，g(r)與平均力w(r)的勢能在物理上相關g(r)=e-w(r)/kBT]]>。在稀釋系統中，w(r)與配對相互作用勢能等同，並因此提供了對相互作用能量的直接衡量。在更集中的系統中，w(r)包括了由於相鄰的顆粒而產生的影響。為了對樣品進行定量比較，我們提取了g(r)上的第一個峰，該峰出現在顆粒直徑上，並且計算相應的有效相互作用能量Ei。這樣可以精確地比較包括顆粒的相等面積分數(φ)的樣品，並且Ei與低覆蓋密度的純配對相互作用能量會合。儘管對於Ei來說需要平衡以便具有有意義的能量單位，但這對於有效比較來說並非必需。只要每一種膠體系統是以最初不相關的相形成的，在特定時間間隔的非平衡分布測定值也可用於定量比較。g(r)的獨立測定值是高度一致的。從用相同的原始材料獲得的獨立膠體製劑測定的Ei值中的標準誤差通常小於0.1kBT。
實施例2利用被神經節苷脂摻雜的膜衍生化的二氧化矽顆粒進行檢測分析對膜衍生化的二氧化矽顆粒進行分散，放置在水中，其中，它們在重力作用下沉降到底部的基質上，形成二維膠體。所述膠體表現出自由的側向擴散，並且該系統的表現如同遍歷流體。在圖2a中示出了稀釋顆粒集合的布朗軌跡。顆粒擴散係數大體上與膜的組成無關；對於直徑為5μm的顆粒來說，測量值為0.079-0.086μm2/s。以上值為通過Stokes-Einstein關係對純的粘滯曳力所預測值的大約80％，表明了所述曳力對下部基質的小的影響。根據顆粒表面上的膜之間的相互作用的強度，觀察到了膠體的分散(氣體)或凝聚(液體或晶體)相。顆粒運動性局限於凝聚相(圖2b)。在凝聚相和分散相中單個顆粒的運動性決定了系統平衡的速度。圖2b中所見的顆粒濃縮到凝聚的微晶上並且從它上面蒸發的時間量程與我們的實驗相比很快(分別為幾分鐘和超過半小時)。另外，所述相的總體形態和定量配對分布函數保持恆定，儘管單個的顆粒相互轉變。以上發現暗示了該系統是接近平衡的，至少在若干顆粒直徑的長度規模上是這樣的。
對脂膜的化學組成進行調節，以便調控配對相互作用勢能，如下文所述。如圖2b所示無論包被膜是淨中性或帶負電荷的，都形成了凝聚相。相反，由帶淨正電荷的膜產生了分散相。多種相的出現表明了配對相互作用能量使系統接近相轉變。這樣，預計膜表面上的小的擾動能夠誘導膠體宏觀組構的顯著改變。通過檢查與膜結合的配體相結合的蛋白的作用，我們觀察到了這一預測。
研究了若干蛋白系統抗體結合膜表面抗原和細菌毒素——霍亂毒素(CTB)和破傷風毒素(TT)與它們的相應配體——單唾液醯神經節苷脂GM1和三唾液醯神經節苷脂GT1B結合。被9％磷脂醯絲氨酸/91％DMOPC膜包被的顆粒是按實施例2所述方法製備的。
由此製備的顆粒形成了凝聚相，它是由短壽命的微晶組成的，將它用於所有的膜表面配體研究。在所有情形下，與膜表面的蛋白結合誘導了從凝聚相到分散相的轉變。圖3表示通過在t＝0秒時添加蛋白誘導的相轉變的時序。以上實驗是用大約300μl的溶液在96-孔平板的大約5mm圓形孔中進行的。在將一滴蛋白溶液添加到孔頂部的30秒內，可以觀察到凝聚相的均勻的破壞。在60秒內，所述膠體達到了分散的分布。單個顆粒的運動性不受蛋白結合的影響。只有在將合適的同源配體摻入到膠體膜中時，接觸感興趣的特定蛋白才誘導了從凝聚相到分散相的相轉變。與膜表面結合的蛋白的物理存在增加了兩種膜之間的最近的位置，並相應降低了顆粒之間的範德華引力累計強度。
實施例3利用衍生化的膠體顆粒檢測霍亂毒素和破傷風毒素在一定範圍的蛋白和配體濃度下進行接近平衡的膠體分布測定，以便探究相轉變作為膜表面上蛋白結合的讀數的用途。利用單克隆IgG抗體進行抗體研究，該抗體能結合螢光膜探針Texas Red-DPPE。
通過將20μg/mL的抗體溶液與1mL的顆粒溶液在黑暗條件下在室溫下培養45分鐘，每隔5分鐘進行輕柔的渦旋攪拌，將抗-TexasRed兔IgG級份抗體結合在含有Texas Red的膜上。還通過將抗體溶液直接添加到96-孔平板上的膠體中，將抗體結合在含有TexasRed的膜上。通過將各種濃度的毒素與顆粒溶液在黑暗條件下，在室溫下進行連續的柔和混合溫育50分鐘，將細菌毒素(CTB，TT，BT)結合在膜(包括GM1，GT1B，或不含神經節苷脂)的膜上。
對於配體表面濃度≥10-4單層來說，與20μg/ml抗-Texas Red抗體一起培養的樣品表現出從凝聚相到分散相的明確轉變(圖4a)。這相當於在接觸區內的每一個膜上有大約10個配體分子，其中，膜間距離＜10nm(5μm的顆粒)。為了進行細菌毒素結合研究，以恆定的0.5％濃度將神經節苷脂配體GT1B或GMI摻入膜內。與TT溫育在含有GTIB的膠體中誘導了分散相的形成，而在GM1膠體中沒有產生影響(圖4b)。類似地，接觸CTB在GM1膠體中誘導了分散相的轉變，而對GT1B膠體沒有產生任何影響(圖4c)。接觸銀環蛇毒素(1μM)在任何膠體中都沒有產生影響。在測定的g(r)中r0峰的幅度與結合蛋白的表面濃度一致。
圖4圖解說明了來自一組膜組合物的結果，其中完全離子化的電荷密度為每個膜小葉-1.43×104-7.15×104e/μm2；由於不完全的離子化，預計實際表面電荷密度略低。在用中性膜衍生化的顆粒中觀察到了最強的相互作用。這一結果與在中性表面之間預期的靜電排斥最小化吻合。遠離中性，對於帶正電荷的膜來說Ei迅速降低，而當膜帶負電荷時，只觀察到了微弱的、但是一致的降低。用於蛋白結合實驗中的DMPS膜(在完全離子化時為-1.43×105e/μm2)表現出的Ei類似於中性膜的Ei(大約2kBT，參見圖3)。
CTB-GM1和TT-GT1B結合是通過將平面受支撐膜(通過將SUV′s沉積在玻璃蓋玻片上形成)和各種濃度的CTB和TT一起溫育、並且監測來自FITC標記(來自CTB)或螢光素標記(來自TT)的螢光進行表徵的。結果表明，CTB能結合本文所研究的89％DMOPC/9％DMPS/1％GM1/1％Texas Red DPPE膜，有效解離常數為大約41nM(參見圖5a)。由於CTB-GM1結合不是一價的，這一結果只是結合親和力的近似值。結果表明，TT能結合本文所研究的89％DMOPC/9％DMPS/1％GTIB/1％Texas Red DPPE膜，有效解離常數為大約60nM(參見圖5B)。
通過將FCS(0.1％)和CTB(濃度為100nM)與含有4mg/mL的有機和無機成分的河水樣品混合，進行實際檢測實驗。用0.2μm的過濾器過濾混合物，並且與1mL的顆粒溶液在黑暗中在室溫下培養50分鐘，連續地柔和混合。在製備膠體之前通過用18.2MΩ-cm的水漂洗所述混合物除去多餘的可溶性成分。
支持性的表1和圖5b，5c，5d和5e包括設計成測試這種膠體檢測方法的選擇性的一系列實驗的結果。
表1若干實驗的Ei值 在表1中小於大約1(用黑體表示)的Ei值表示強的正信號(毒素檢測)。測試了用包含GM1(圖5d)，GT1B(圖5e)或無神經節苷脂(圖5c)的膜衍生化的顆粒對CTB，TT和BT的結合親和力。所得到的膠體分布是以有效相互作用能量Ei形式評估的。結果發現，在沒有任何類型的毒素的條件下，用三種類型的膜中任意一種衍生化的顆粒的Ei值超過大約2。該值表示凝聚相，並且被認為是負信號。在存在毒素和它的特異性靶(GM-CTB，GTIB-TT)的條件下，所述膠體的Ei值小於大約1。該值表示膠體處在分散相，並且被認為是正信號。另外，在存在不正確的或不存在的目標的條件下，明確表現出對毒素的特異性。針對以下系統獲得了負信號GMI-TT，GT1B-CTB，CTB和TT(沒有靶)，和BT(具有所有三種膜類型)。
在圖5c中提供了上述所有數據的g(r)圖。通過在存在含有GM的膜的條件下溫育0.1％胎牛血清(FCS)證實了對多種潛在目標的不敏感性。所得到的膠體分布的Ei值大於大約2，表示負信號。注意到當存在CTB並且與含有GM1的膜衍生化的顆粒結合時，發現g(r)圖上的第一個峰不存在。並且，當要檢測的毒素是破傷風毒素時，對於用含有GT1B-的膜衍生化的顆粒來說，明顯缺少g(r)曲線上的峰。因此，g(r)曲線能夠定量顯示業已檢測並且與衍生化的顆粒相結合的溶液中的毒素。
例4
用膠體顆粒的非均一混合物檢測按照實施例1製備兩種類型的膠體顆粒。一種類型看上去是暗色的，而另一種看上去是白色的。參見圖6，膠體具有以下組成暗色顆粒是直徑為6.8μm的二氧化矽微球體，它是用流體脂雙層膜(組成96％DMOPC，3％DMPS，1％Texas RedDPPE)覆蓋的。白色顆粒是直徑為6.8μm的無孔二氧化矽微球體，用流體脂雙層膜(組成98％DMOPC，2％DOEPC，1％1，2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯並二唑-4-基，或NBD-PE)覆蓋。顆粒定位分析與實施例2所進行的和披露的方法相同。
對膠體的非均一混合物的研究是通過將不同膠體的稀釋溶液按需要的比例混合在一起進行的。然後對所得到的非均一膠體溶液進行充分地渦旋攪拌，並且用吸液管轉移到96孔平板的孔中，以便形成膠體，正如上文所披露的。
測定膠體顆粒非均一混合物的g(r)的分析是按照下文所述方法進行的。對於圖6a所示的二元膠體來說，非均一顆粒的整個系統的φ＝0.2。圖6b中的曲線表示非均一g(r)曲線的特有特徵。
首先，評估四種′非均一顆粒′情形的n(r)，具有間隔距離r的顆粒配對實際相對密度所有顆粒的n(r)nALL(r)=2ALL(r)(NS+NW)(NS+NW-1)r]]>ηALL(r)是具有間隔距離為 的所有顆粒配對的數量，而NS和NW分別是暗色和白色顆粒的總數。由於NS+NW＝N，nALL(r)類似於原始的′均一顆粒′n(r)。
暗色顆粒的n(r)nS(r)=2S(r)NS(NS-1)r]]>ηS(r)是間隔距離為 的暗色-暗色顆粒配對的數量。如果不考慮白色顆粒，在這裡我們可以這樣做，則NS＝N，並且nS(r)同樣類似於原始′均勻顆粒′n(r)。
白色顆粒的n(r)通過S→W的取代，nW(r)類似於上述nS(r)。
暗色顆粒與白色顆粒(非均一配對相關函數)的n(r)nSW(r)=SW(r)NSNWr]]>ηSW(r)是間隔距離為 的非均一配對顆粒的數量。nSW(r)公式是唯一實際上不同於′均一顆粒′n(r)公式的。
四種情形的g(r)我們利用了原始的通用定義公式g(r)=n(r)p(r),]]>其中，p(r)是以間隔距離為r發現顆粒配對的可能的密度。而n(r)在四種討論過的′非均一顆粒′情形中是不同的，p(r)相對原始的′均一顆粒′p(r)而言保持不變，並且為p(r)=2X2Y2[XYr-2(X+Y)r2+r3].]]>綜合以上公式，我們得出了以下公式
gALL(r)=ALL(r)X2Y2(NS+NW)(NS+NW-1)r[XYr-2(X+Y)r2+r3]]]>gS(r)=S(r)X2Y2NS(NS-1)r[XYr-2(X+Y)r2+r3]]]>gw(r)=W(r)X2Y2NW(NW-1)r[XYr-2(X+Y)r2+r3]]]>gSW(r)=SW(r)X2Y22NSNWr[XYr-2(X+Y)r2+r3]]]>由於p(r)在所有情形下都相同，四種g(r)函數之間的關係直接來自它們相應的n(r)部分的比較。
在圖6A的照片中示出的暗色和白色顆粒配對的相對密度的曲線圖如圖6B所示。在非均一g(r)的這種特定示意圖中的第一個峰是非常陡而且高的，並且確切出現在一個珠直徑處，表明了存在彼此接觸的暗色和白色顆粒。隨後是函數值的急劇下降，表明了絕對沒有暗色和白色顆粒相互作用的不利能量區域。隨後是其他的峰，這些峰表示間隔距離為r的暗色和白色顆粒配對的相對密度。可以看出，改變膠體所在溶液的離子強度，能夠改變其中非均一g(r)顯示兩種顆粒相互作用的不利概率的區域寬度。這種效果可用於使膠體顆粒的非均一混合物更接近或者更遠離相轉變點，因此使得相行為的差異更靈敏。
實施例5利用膠體顆粒進行檢測通過將FCS(0.1％)和霍亂毒素(CTB)(濃度為100nM)混合在含有大約4mg/mL的有機和無機成分的河水樣品中，進行實際檢測實驗。用0.2μm的過濾器過濾混合物，並且與1mL的顆粒溶液在黑暗中在室溫下溫育50分鐘，連續進行柔和混合。在形成膠體之前通過用18.2MW-cm水漂洗所述混合物而除去多餘的可溶性成分。
在用實施例2所述統計分析方法進行分析時，觀察到了來自檢測霍亂毒素的系統的正信號。
另一種方法是將具有霍亂毒素配體的顆粒分散到河水中，溫育足夠的時間(例如大約50分鐘)，從河水中收集並且分離所述顆粒，然後進行上述分析。
實施例6用於計算配對分布函數的其他方法將計算g(r)的其他方法用於提高計算效率。當在視野中觀察典型的膠體分布時，很多顆粒配對間隔超過40μm。由於配對分布早在40μm之前就變得恆定，計算這種配對距離並且將它們整合到柱狀圖中是浪費的。由於要計算的配對距離的數量與圖像中顆粒的數量N2成比例(104-105)，沒有必要的配對距離將會顯著降低計算速度。由於所述顆粒在某種程度上是堅硬的球體，能確保特定珠的第n近的鄰居距離中心珠超過40μm。對於6.84μm的珠來說，第7近的鄰居太遠了，但是，第6近的鄰居仍然處在範圍內。因此，如果能夠找到只計算第6近以及更近鄰居配對的配對距離的方法的話，就可以使要計算的配對距離數量最小化，而與g(r)的最初40μm無關。
為了標記相關的配對，使用了N×N矩陣。如果珠i和珠j是第6近或更近的鄰居，就應當有1，表示應當計算它們的配對距離，並且將其整合到柱狀圖中。如果它們是更高級別的最近鄰居(較遠的近鄰)，就應當是0。上述方法等同於用1填充該矩陣。通常，少於8％的顆粒配對與40μm的g(r)相關。
為了獲得這種矩陣，計算了第一級最近鄰居配對的矩陣。為了方便起見，將第一級最近鄰居矩陣稱作G。該矩陣G是網絡的數學表達式，它是通過劃出連接最近鄰居珠的中心的線段獲得的。如果存在連接珠i和珠j的線段，則在G的小室(i，j)中的值為1。因此，G具有直接的幾何含義(它告訴你如何連接各點)。利用被稱作DelaunayTriangulation的方法可以很快地計算出最近鄰居網絡。對於應用計算幾何學來說該方法是很重要的。
在圖論中，矩陣G還具有其他含義。G可以在網絡上操作，以便提供包括高級最近鄰居配對的更複雜的網絡。因此，G2是第2和以下級別最近鄰居的網絡。G6是第6和以下級別最近鄰居的網絡。因此，計算方法如下提供描述每一珠的位置的一組(x，y)配對1)利用Delaunay triangularion計算G2)計算G63)對於G的上部三角部分中的每一個1來說a)計算配對距離b)將所述配對距離整合到柱狀圖中4)對柱狀圖進行標準化。
例7利用天然細胞膜進行蛋白檢測膜結合蛋白的檢測是利用″粗製″膜提取物進行的，該提取物是從天然細胞中直接獲得的，以便對顆粒進行包被。具體地講，用直接由人類紅細胞的天然細胞膜製備的囊泡對平均直徑為6.8mm的二氧化矽微珠進行包被。天然細胞膜是從活細胞中獲得的膜。隨後證實，抗體與存在於紅細胞膜中的天然膜結合型細胞內蛋白Band III的結合足以激發相轉變。
利用Kaufmann等(Kaufmann，S.Tanaka，M.Cell Adhesiononto Highly Curved SurfacesOne-Step Immobilization of HumanErythrocyte Membranes on silica Beads.Chem Phys Chem 4，699-704(2003))的方法製備紅細胞血影。將所得到的細胞隨後在冰水浴中在5mM Tris緩衝液，pH 8.0的條件下以25W的功率進行探頭超聲波處理90秒(進行5秒脈衝，間隔1秒鐘)，以便產生小的單層囊泡(SUV′s)。在4℃下以160,000g的速度對緩衝液中的SUV超速離心2小時。上清液在4℃下，在5mM Tris緩衝液，pH 8.0中保存長達48小時。通過將等量的(100mL)分散溶液(1∶1 SUV/1X Tris緩衝鹽溶液，pH 7.4)和微珠懸浮液(存在於去離子水中的10％固體)一起在1.5mL離心管中混合，在微珠表面上自我組裝雙層。通過脈衝離心並且取出上清液而除去多餘的囊泡。然後將1mL的5mM Tris緩衝液，pH 8.0添加到所述微珠中，並且對整體混合物進行渦旋攪拌，以便使微珠重新懸浮。
在進行抗體染色之前，在BSA(15mg/mL)中溫育微珠1小時，以便防止抗體的非專一性吸附。然後在生理學緩衝液中利用單克隆小鼠IgG抗體鑑定細胞內Band III結構域。然後通過Texas Red-標記的多克隆山羊抗-小鼠抗體檢測結合型小鼠IgG。每一種抗體的溫育時間是30分鐘。用18.2MΩ-cm水充分漂洗微珠，稀釋到可接受的工作濃度，澆鑄到96孔平板中，並且使之通過重力沉降。在室溫下用NikonTE-300倒置螢光顯微鏡觀察所述微珠，顯微鏡上裝有水銀弧光燈用於產生螢光，以及100W滷素燈用於亮場照明。用Roper ScientificCoolSnap HQ電荷耦合器件照相機記錄圖像。
該實驗的結果與上述實施例2中進行的抗體分析法的結果類似。在這裡，抗體的結合足以導致膠體發生從凝聚相到分散相的相轉變。
應當理解的是，可以對該實驗進行改進，以便進行蛋白組分析，這樣的分析方法與現有的方法(ELISA等)類似，但是更簡單，因為不需要二級抗體或複雜的光學檢測設備。諸如HEK和CHO細胞等在遺傳學上充分表徵過的模型細胞系可以用於轉化，以便展示任意數量的膜結合/相關分析物。另外，還可以使用表現出天然存在的分析物的天然細胞，並且在對模型細胞進行工程改造不可行或不合適的情況下，它可能更合適(難以進行工程表達的蛋白，發現以高濃度天然存在於天然細胞中的那些蛋白等)。
以上書面說明被認為足以使得本領域技術人員實施本發明。以上說明和實施例詳細說明了本發明的某些優選實施方案，並且說明了發明人所理解的最佳方式。不過，可以理解的是，無論在本文中上述說明看上去如何詳細，本發明能夠以多種方式實施，並且本發明應當按照所附權利要求書和任何等同方案進行理解。
權利要求
1.一種用於檢測樣品中的分析物的方法，包括提供膠體顆粒懸浮液，其中，所述顆粒與和所述分析物結合的配體相結合，並且其中所述膠體顆粒接近動態相轉變狀態；讓所述懸浮液與所述樣品接觸；和測定所述膠體顆粒是否從第一種相轉變成第二種相，其中，所述轉變是在所述樣品中存在所述分析物的指示。
2.權利要求1的方法，其中所述膠體顆粒包括脂層。
3.權利要求2的方法，其中所述脂層包括脂雙層。
4.權利要求3的方法，其中所述脂雙層包括天然細胞膜。
5.權利要求3的方法，其中所述脂雙層包含人工細胞膜。
6.權利要求1的方法，其中所述膠體顆粒是與所述配體共價連接的。
7.權利要求1的方法，其中所述配體是與所述膠體顆粒非共價連接的。
8.權利要求1的方法，其中所述配體散布在所述膠體顆粒上的脂層中。
9.權利要求1的方法，其中所述膠體顆粒具有淨負電荷或淨中性電荷。
10.權利要求1的方法，其中所述分析物選自下列組中蛋白質，核酸，抗體，抗原，受體，病毒，和細菌。
11.權利要求1的方法，其中，測定所述膠體顆粒是否從第一種相轉變成第二種相包括測定所述懸浮液中所述膠體顆粒中心之間的距離。
12.權利要求1的方法，其中所述膠體顆粒的大小為1μm-10μm。
13.權利要求1的方法，其中所述第一種相是凝聚相，而所述第二種相是分散相。
14.權利要求1的方法，其中所述第一種相是分散相，而所述第二種相是凝聚相。
15.權利要求1的方法，其中所述膠體顆粒懸浮液包含第一群體的膠體顆粒和第二群體的膠體顆粒。
16.權利要求15的方法，其中所述第一群體包含的膠體顆粒比所述第二群體中包含的膠體顆粒更大。
17.權利要求15的方法，其中所述第一群體包含的膠體顆粒的標記方式與所述第二群體中的膠體顆粒的標記方式不同。
18.一種用於檢測分析物與配體的結合的分析系統，其中包含膠體顆粒懸浮液，其中所述膠體顆粒接近動態相轉變狀態；與所述顆粒結合併且對所述分析物特異的配體；和被設計成用於測定在與所述分析物接觸時所述膠體顆粒是否從第一種相轉變成第二種相的設備，其中所述轉變是所述分析物與所述配體相結合的指示。
19.權利要求18的分析系統，其中所述膠體顆粒懸浮液包含第一群體的膠體顆粒和第二群體的膠體顆粒。
20.權利要求19的分析系統，其中所述第一群體包含的膠體顆粒比所述第二群體中的膠體顆粒更大。
21.權利要求19的分析系統，其中所述第一群體包含的膠體顆粒的標記方式與所述第二群體中所述膠體顆粒的標記方式不同。
22.權利要求18的分析系統，其中所述膠體顆粒包含脂層。
23.權利要求22的分析系統，其中所述脂層包含天然細胞膜。
24.權利要求18的分析系統，其中所述膠體顆粒是與所述配體共價連接的。
25.權利要求18的分析系統，其中所述配體是與所述膠體顆粒非共價連接的。
26.權利要求18的分析系統，其中所述第一種相是凝聚相，而所述第二種相是分散相。
27.權利要求18的分析系統，其中所述第一種相是分散相，而所述第二種相是凝聚相。
28.一種用於檢測分析物與配體的結合的分析系統，其中包含膠體顆粒懸浮液，其中所述顆粒被脂層所包被，並且其中所述顆粒接近動態相轉變狀態；與所述脂層結合的配體，其中所述配體特異於所述分析物；和用於測定當接觸所述分析物時所述膠體顆粒是否從第一種相轉變成第二種相的設備，其中所述轉變是所述分析物與所述配體相結合的指示。
29.權利要求28的分析系統，其中所述用於檢測的設備包括顯微鏡。
30.權利要求28的分析系統，其中，所述用於檢測的設備包括螢光檢測儀。
31.權利要求28的分析系統，其中所述脂層包含天然細胞膜。
32.權利要求28的分析系統，其中所述配體是與所述脂層非共價連接的。
全文摘要
本發明披露了用於測定配體和分析物之間的相互作用的方法和分析法。所述分析法可以包括與感興趣的配體結合的膠體顆粒懸浮液。所述膠體顆粒在所述懸浮液中維持在從凝聚相到分散相的相轉變狀態或接近相轉變狀態。然後將要檢測的分析物添加到所述懸浮液中。如果分析物與所述配體結合的話，就會發生表明所述結合成功的相轉變。
文檔編號G01N33/543GK101052695SQ200480040747
公開日2007年10月10日 申請日期2004年12月6日 優先權日2003年12月4日
發明者J·T·格羅夫斯, M·M·巴克施, M·亞洛斯 申請人:加利福尼亞大學董事會