魔芋凝集素蛋白編碼序列及其應用的製作方法

2023-09-10 22:51:05 2

專利名稱：魔芋凝集素蛋白編碼序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、酶學、生理學以及基因工程等領域。具體地，本發明涉及一種在魔芋中表達的a-Lectin蛋白(魔芋凝集素蛋白，Amorphophalluskonjacagglutinin，AKA)及其核酸序列。本發明還涉及該蛋白和核酸序列的製備方法和用途。
本發明中，我們在天南星科(Araceae)植物魔芋(Amorphophallus konjac)中克隆到雪花蓮g-Lectin凝集素(GNA)基因的同源基因a-Lectin。
在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過本專利申請中提及的魔芋a-Lectin蛋白序列及其核酸序列。
本發明的第二目的是提供一種新的魔芋蛋白a-Lectin。
本發明的第三目的是提供一種利用重組技術生產上述新的魔芋a-Lectin蛋白和核酸序列的方法。
本發明還提供了這種魔芋a-Lectin蛋白多肽和編碼序列在利用轉基因技術控制植物病蟲害上的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有魔芋a-Lectin蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離出的魔芋a-Lectin蛋白質多肽，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是BL21和菸草。
在本發明的另一方面，還提供了一種產生具有魔芋a-Lectin蛋白質活性的多肽的方法，其步驟如下(1)將編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成魔芋a-Lectin蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入原核宿主細胞，形成魔芋a-Lectin蛋白的重組細胞；(3)在適合表達魔芋a-Lectin蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有魔芋a-Lectin蛋白活性的基本純的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第17-493位的序列。
在本發明的另一方面，還提供了一種利用轉基因技術將編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性多肽的核苷酸序列轉化入植物以提高植物對病蟲害抗性的方法，其步驟如下(1)將編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連於植物表達調控序列，形成含魔芋a-Lectin蛋白的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含表達載體的農桿菌同真核宿主細胞共培養，在22-28℃條件下，暗培養1-2天後，通過篩選如抗生素篩選，獲得含有魔芋a-Lectin蛋白基因的轉化細胞並最終再生轉基因植株及其後代，包括植物種子及植物組織。含有魔芋a-Lectin蛋白基因的轉基因植株對植物病蟲害具有增強的抗性作用。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第17-493位的序列。
本發明還提供了與a-Lectin蛋白多肽特異性結合的抗體，它包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「魔芋a-Lectin蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第17-493位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.3序列的編碼框第17-493位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.3中第17-493位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的魔芋a-Lectin相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「魔芋a-Lectin蛋白或多肽」指具有魔芋a-Lectin蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術語還包括具有與天然魔芋a-Lectin相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括魔芋a-Lectin蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的魔芋a-Lectin多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與魔芋a-Lectin DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗魔芋a-Lectin多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含魔芋a-Lectin多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括魔芋a-Lectin多肽的可溶性片段。通常，改片段具有魔芋a-Lectin多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
在本發明中，「魔芋a-Lectin保守性變異多肽」指與SEQ ID NO.4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
表1

發明還包括魔芋a-Lectin蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然魔芋a-Lectin多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的魔芋a-Lectin多肽時，可以將魔芋a-Lectin編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成魔芋a-Lectin蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」為原核或真核細胞。常用的原核宿主細胞包括BL21，常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、菸草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法技術分析魔芋a-Lectin基因產物的表達，即分析魔芋a-Lectin的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
魔芋a-Lectin RNA的Northern印跡分析和魔芋a-Lectin特異抗體的Western印跡分析可以聯合使用，以證實魔芋a-Lectin在生物樣本中的表達。
此外，本發明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有魔芋a-Lectin核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼魔芋a-Lectin的核酸分子。
本發明還提供了檢測樣品中是否存在魔芋a-Lectin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於魔芋a-Lectin核苷酸編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據本發明的魔芋a-Lectin核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選魔芋a-Lectin同源基因或同源蛋白。
為了得到與魔芋a-Lectin基因相關的魔芋cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選魔芋cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對魔芋a-Lectin的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合於篩選的cDNA文庫是來自魔芋的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與魔芋a-Lectin相關的基因家族的核苷酸序列。
本發明的魔芋a-Lectin核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然後再進行連接而獲得編碼本發明魔芋a-Lectin蛋白的核酸序列。然後，可將該核酸序列引入本領域中各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。
利用本發明的魔芋a-Lectin蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與魔芋a-Lectin發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
表2為本發明的魔芋凝集素(AKA)蛋白與石蒜科植物雪花蓮凝集素(GNA)蛋白的核苷酸序列(GenBank Accession No.M55559)的同源比較(GAP)表。
表3為本發明的魔芋a-Lectin蛋白與石蒜科植物雪花蓮g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的胺基酸序列(GenPept Accession No.AAA33349.1)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用胺基酸單字符標出，相似的胺基酸用「+」標出。
實施例1魔芋a-Lectin基因的克隆1.組織分離(isolation)魔芋球莖來源於上海中醫藥大學，採取材料後，立即置於液氮中冷凍保存。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50mL管，充分振蕩後，再移入玻璃勻漿器內。勻漿後移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據雪花蓮和其它天南星科凝集素胺基酸保守序列，設計簡併引物，利用同源性基因克隆原理，採用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)3』-RACEPCR(AP+TNX001)得到2001MY3』(0.6kb)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟體包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知石蒜科植物如雪花蓮(Galanthus nivalis)和天南星科植物如芋頭(Colocasia esculenta)、疆南星(Arum maculatum)的凝集素基因的同源性很高，故初步認為它是一個凝集素基因。
(2).5』-RACE第一輪PCR (AAP+MYR02)第二輪PCR (AUAP+MYR03)得到2001MY 5』(0.3kb) (過程同(1))(3).PCR擴增2001MY編碼區(MYF01+R1)得到2001MY編碼區(0.5kb)(過程同(1))。
BLAST的結果證明從魔芋中新得到的基因確為一個植物凝集素基因。由於已知的同源凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)基因具有較強的抗同翅目類昆蟲包括蚜蟲和飛蝨功能(Hilder等，1994；Powell等，1993，1995)，故推測此基因具有相同的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的魔芋a-Lectin蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物R15』-ACCAATCACATACACAATGG-3』(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸R25』-AAGCACAGATGATGGAGAGC-3』(SEQ ID NO.2)為反向引物，以魔芋總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃ 5分鐘，隨之以94℃45秒、58℃45秒和72℃1分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為668 bp。然後按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
實施例2魔芋a-Lectin基因的序列信息與同源性分析本發明新的魔芋a-Lectin全長cDNA的長度為668 bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於17-493位核苷酸。根據全長cDNA推導出魔芋a-Lectin的胺基酸序列，共158個胺基酸殘基，分子量17112.73，pI為11.07。詳細序列見SEQ ID NO.4。
將a-Lectin的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與雪花蓮凝集素(GNA)基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與雪花蓮凝集素基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.M55559)有62.3％的相同性(附表2)，在胺基酸水平上，它與雪花蓮g-Lectin蛋白(GenPept Accession No.AAA33349.1)的第1-158位胺基酸殘基有52％的相同性和59％的相似性(附表3)。由上可見，a-Lectin基因與雪花蓮g-Lectin(GNA)基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認為兩者在功能上也有很高相似性。
實施例3魔芋a-Lectin蛋白的結構和功能研究1.魔芋a-Lectin蛋白的胺基酸序列blocks分析。將魔芋a-Lectin蛋白的胺基酸序列在blocks資料庫(網址為http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結構域，得到以下結果 (1)在胺基酸序列中，存在以下結構域區加框區(26-50，65-99，103-122)Lectin蛋白功能模塊(Lectin)。
(2)功能分析在該基因胺基酸序列中存在Lectin蛋白功能模塊，因而可預見其的確具有相應功能。
2.魔芋凝集素蛋白胺基酸序列的前體蛋白和成熟蛋白分析。通過對魔芋凝集素蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和胺基酸序列的比較分析，發現魔芋凝集素蛋白基因編碼一前體蛋白含有信號肽序列、成熟蛋白序列和C-末端肽序列，按van Hei jine(1986)等預測凝集素蛋白信號肽的規則和對魔芋凝集素蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比較，鑑定出魔芋凝集素蛋白的信號肽剪切位點在第25胺基酸(A)和第26胺基酸(Q)之間，該位置也符合目前已知的大多數甘露糖專一結合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子蘭凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的信號肽剪切位點。通過比較大多數甘露糖專一結合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子蘭凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的C-末端肽序列的剪切位置，推測出魔芋凝集素蛋白的C-末端肽的剪切位置在第135位的A和第136位的L之間。因此，魔芋凝集素蛋白的凝集素成熟蛋白序列為QALYAPGALFSGQSLTVGNYRFTMQADCNLVLYDRGRAIWASGTARRGINCVLRMQRDGNLVVYTPGGRAIWASGTNRGAGNYYLTLQSDRNVVIYGPDGRAIWATNTKA3.魔芋a-Lectin蛋白的專一結合糖基化分析。通過對魔芋a-Lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等的專一結合糖基化分析，發現魔芋a-Lectin蛋白同大多數甘露糖專一結合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等一樣，具有3個典型的甘露糖專一結合位點盒(QDNY)，見下圖(圖中甘露糖專一結合位點盒QDNY用方框框住)。因此證明魔芋a-Lectin蛋白也同雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素等一樣，為甘露糖專一結合的凝集素蛋白。 實施例4魔芋a-Lectin多肽的製備和提純在該實施例中，將魔芋a-Lectin編碼成熟蛋白的序列或片段構建入原核表達載體之中，以表達和提純目的蛋白。
原核表達載體的構建以及轉化原核表達宿主菌感受態細胞根據魔芋a-Lectin的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)，設計擴增出完整成熟蛋白編碼閱讀框的引物(分別對應於完整成熟蛋白編碼序列5』和3』端的約20個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的原核表達質粒pET-32a而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將魔芋a-Lectin基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至原核表達質粒pET-32a(Novagen)。轉化大腸桿菌DH5α菌株，經PCR鑑定後測序確認，然後在抽提質粒，轉化到原核表達宿主菌BL21的感受態細胞中，塗LB+Amp(100mg/L)的平板，37℃培養1d。
魔芋a-Lectin蛋白的表達隨機挑取長出的單菌落，LB+Amp(100mg/L)的液體培養基37℃培養過夜，吸取50μl然後煮沸5min。12 000rpm/min離心1min，取上清為模板。使用魔芋a-Lectin的引物進行PCR擴增反應。同時以未轉化的宿主菌作對照。觀察重組子中能否擴增出魔芋a-Lectin的基因片段。將PCR陽性的重組菌接種於5ml的LB+Amp(100mg/L)培養基中，37℃振蕩培養(250rpm/min)3h至OD600＝0.6，取1ml菌液做為對照(誘導前)，在剩下的4ml菌液中加入IPTG使終濃度為1mM，繼續37℃振蕩培養(250rpm/min)3h，吸取1ml菌液，兩次吸取的菌液12000rpm/min離心5min。沉澱用100μl 1×PBS培養基懸浮，取10μl進行SDS-PAGE檢測表達產物(見

圖1)。
圖1.魔芋凝集素(AKA)的原核表達圖。1蛋白大小標準(從上到下依次為97kD、66kD、43kD、31kD、20kD、14kD)；2BL21大腸桿菌菌株在IPTG誘導表達前；3BL21大腸桿菌菌株在IPTG誘導表達後；4pET-32a轉化到BL21中在IPTG誘導表達前；5pET-32a轉化到BL21中在IPTG誘導表達後；6pET-32a-AKA轉化到BL21中在IPTG誘導表達前；7pET-32a-AKA轉化到BL21中在IPTG誘導表達後。
魔芋a-Lectin融合蛋白的提取純化按上述方法大量表達魔芋a-Lectin蛋白，對離心管稱重後加入菌液，10000g離心10min，棄上清，再次稱重，計算細菌的溼重。按5ml/g細菌的比例加入BugBuster reagent(Novagen)，在每毫升BugBuster reagent中加入1μlBenzonase(Novagen)，重懸細菌沉澱。室溫緩慢搖動溫育20min，4度16000g離心20min，將上清液(含可溶的蛋白)移入一乾淨管中。用等體積的BugBuster Reagent重懸沉澱，加入lysozyme至終濃度為200mg/L，混勻，室溫放置5min，10000g離心10min，棄上清。加6倍體積的稀釋了10倍的BugBuste reagent，混勻，4度5000g離心15min，收集包涵體，棄上清。用1/2原培養基體積的稀釋了10倍的BugBuste reagent重懸包涵體，混勻，4度5000g離心15min。再用1/2原培養基體積的稀釋了10倍的BugBuste reagent洗滌一次，同上一步驟。再次洗滌，4度16000g離心15min，棄上清，稱量包涵體的溼重。用1*IB Solubilization Buffer/0.3％N-lauroylsarcosine(Novagen)重懸包涵體，使終濃度達到10-20mg/ml，混勻，反覆吹打以破碎包涵體。室溫，溫育15min。室溫，10000g離心10min，將上清(含有可溶的包涵體蛋白)轉入一新管子中，小心不要吸入沉澱。用至少是樣品體積50倍的dialysis buffer(Novagen)透析，中間更換dialysis buffer，至少透析兩次。如果透析後看到有不溶物，4度10000g離心10min，將上清吸入一新管中。用rEK酶(Novagen)切除融化蛋白後進行SDS-PAGE變性蛋白電泳，檢測提取的魔芋a-Lectin蛋白的純度。在12kDa處的蛋白質條帶即為魔芋a-Lectin成熟蛋白。
實施例5魔芋a-Lectin蛋白或多肽在菸草細胞中進行真核細胞表達及轉基因植株的抗蟲性鑑定含目的基因(魔芋a-Lectin基因)表達載體的構建根據魔芋a-Lectin的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將魔芋a-Lectin cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121)，在保證閱讀框架的前提下鑑定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，利用葉盤法技術轉化模式植物菸草。利用葉盤法轉化菸草1.用無菌牙籤挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種於2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長兩周左右的菸草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方釐米見方的小葉片；5.將葉片放入製備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸乾菌液；6.把經侵染的葉片放於MS培養基上，28℃暗培養48小時；7.將葉片轉到愈傷培養基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天後可見分化芽長出，待芽長大後，切下，置於生根培養基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan25mg/L)上進行生根培養，2-7天左右生根；9.等根系發達後，將植株取出，用無菌水洗淨附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯後再取下玻璃罩，溫室中培養。利用western blot檢測AKA蛋白在轉基因菸草植株中的表達1.蛋白的提取a)取50mg葉片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)於1.5ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過程於冰上進行。2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻後，分光光度計測OD595；蛋白含量計算1 OD595＝28.57μg。3.SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的製備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加樣前，將樣品置於含50mmol/L DTT的加樣緩衝液(2*加樣緩衝液甘油2.4g，1M Tris-HClpH6.8 1ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；b)室溫100V電壓下聚丙烯醯胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達到凝膠底部。4.蛋白質向硝酸纖維膜上轉移a)轉移之前，用轉移緩衝液(39mmol甘氨酸，48mmol TrisBase，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)室溫下用半乾式電轉儀轉移1h，凝膠兩側各墊3層Whatman濾紙；5.膜上蛋白的檢測a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶於100ml 1*PBS(含0.5g疊氮鈉)；b)再將濾膜浸泡在洗滌緩衝液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；c)加入第一抗體(抗魔芋a-Lectin的抗體或抗雪花蓮g-Lectin的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌三次；d)加入第二抗體(親和素-鹼性磷酸酶複合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌兩次；e)加入底物顯色觀察蛋白條帶。含魔芋凝集素基因(aka)的轉基因植株的抗蟲性鑑定鑑於編碼甘露糖專一結合的植物凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)的基因已被證明對病蟲害如刺吸式口器類昆蟲如蚜蟲(Hilder等，Transgenic Res，1995，418～25)、飛蝨(Tang等，Plant Breeding，2002，12193～95)及咀嚼式口器類昆蟲如番茄蛾Lacanohia olerucea(Gatehouse等，Molecular Breeding，1997，349～63)都具有抗性，而魔芋凝集素(AKA)也為甘露糖專一結合的凝集素且與雪花蓮凝集素(GNA)具有較高的同源性，由此推測魔芋凝集素基因(aka)同雪花蓮凝集素基因(gna)相似，也應具有抗蟲功能，因此我們對含魔芋凝集素基因(aka)的轉基因植株進行抗蟲性鑑定。按Hilder等(Transgenic Res，1995，418～25)的方法對含魔芋凝集素基因(aka)的轉基因菸草植株(20-30釐米高)進行蚜蟲(桃蚜)抗性鑑定，研究其對蚜蟲存活率和發育進度的影響。對蚜蟲存活率的研究中，在每株植株上接種10頭蚜蟲一齡若蟲後每2天測定蚜蟲存活數(共測定14天)。對蚜蟲發育進度的研究中，在每株植株上接種5頭蚜蟲一齡若蟲，13天後測定存活的蚜蟲成蟲數和若蟲數。結果表明，在含魔芋凝集素基因(aka)的轉基因菸草植株上存活的蚜蟲數量同非轉基因對照上的相比顯著減少(P＜0.05)，同時，在含魔芋凝集素基因(aka)的轉基因菸草植株上存活的蚜蟲其發育進度同非轉基因對照上的相比也被顯著減緩(P＜0.05)，其13天後發育成成蟲的數量也顯著減少(P＜0.05)。因此抗蟲性結果證明，魔芋凝集素基因(aka)對昆蟲(如蚜蟲)確有抗性，魔芋凝集素基因(aka)將可用於利用轉基因技術控制植物蟲害的研究和產業化中。
表262.3％identity in 321 nt overlap8090 100 110 120 130GNATGTACTCTGGCGAGACTCTCTCTACTGGCGAATTTCTCAACTACGGCAGTTATGTTTTTA::::: : :: : :::: : :::: : : :::: : ::::: :::: :AKATGTACGCGCCCGGCGCCCTCTTTTCTGGGCAGTCCCTCACCGTCGGCAACTACAGGTTCA100 110 120 130 140 150140 150 160170 180 190GNATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGAC-GTTGACAAGCCTATCTGGGCAACA:::::::: :::::::: ::::: : :::::: : : : ::: :: ::::: :AKACCATGCAAGCAGACTGCAACCTGGTTCTCTACGACCGAGGCCGCGCC-ATATGGGCCTCC160 170 180 190 200210200 210 220 230 240 250GNAAACACAGGTGGCCTCTCCCGTAGCTGCTATCTCAACATGCAGACCGACGGGAACCTCGTC::: : :::: : :::: :: : ::::::: ::::: :::::::::AKAGGCACCGCCCGCCGGGGCATCAACTGCGTGCTGAGGATGCAGAGGGACGGCAACCTCGTC220 230 240 250 260 270260 270 280 290 300GNAGTGTACAA-CCCGTCGAACAAACCGATTTGGGCAA---GCAACACTGGAGGCCAGAATGG:: :::: :::: :: : :: :: :::::::: :: : ::: ::AKAGTCTACACTCCCGGCGGCCGCGCC-ATCTGGGCCTCCGGCACCAACAGGGGCGCC---GG280 290 300310 320 330310320 330 340 350 360GNATAATTA-TGTGTGCATCCTTCAGAAGGATCGGAACGTTGTGATCTACGGACCTGCTCGTT:: :: : :: : ::: :::: :: :::::::: :: ::::: :: :: : :AKACAACTACTACCTG-ACCCTGCAGAGTGACCGGAACGTCGTCATCTATGGCCCGGACGGCA340350 360 370 380 390370 380GNAGGGCTA-CTGGA--ACCAATA:::: : :::: ::::: :AKAGGGCCATCTGGGCGACCAACA400 410上列雪花蓮凝集素(GNA)蛋白的核酸序列(GenBank Accession No.M55559)下列魔芋凝集素(AKA)蛋白的核酸序列表352％identity in 113 aa overlap，59％similarity in 113 aa overlapa.pep28 LYAPGALFSGQSLTVGNYRFTMQADCNLVLYDRGRAIWASGTARRGINCVLRMQRDGNLV 87+Y+ L +G+ L G+Y F MQ DCNLVLYD + IWA+ T +CL MQ DGNLVg.pep24 MYSGETLSTGEFLNYGSYVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCYLNMQTDGNLV 83a.pep88 VYTPGGRAIWASGTNRGAGNYYLTLQSDRNVVIYGPDGRAIWATNTKALSKGI 140VY P + IWAS TGNY LQ DRNVVIYGP A WAT T GIg.pep84 VYNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGP---ARWATGTNIHGAGI 133a.pep魔芋a-Lectin蛋白胺基酸序列g.pep雪花蓮g-Lectin蛋白胺基酸序列(GenBank Accession No.AAA33349.1)
序列表110復旦大學120魔芋凝集素蛋白編碼序列及其應用130121604170PatentIn version 3.1210121120212核苷酸213魔芋4001accaatcaca tacacaatgg20210221120212核苷酸213魔芋4002aagcacagat gatggagagc202103211668212核苷酸213魔芋220221編碼序列222(17)..(493)2234003accaatcaca tacaca atg gcg gcc aaa cct gcc agc ctt gcc ttc ctc ctc 52Met Ala Ala Lys Pro Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu1 5 10ctc ctc ctc ggc gtg gta ttg cgg cct tcc gaa gca gcc caa gcc ctg 100Leu Leu Leu Gly Val Val Leu Arg Pro Ser Glu Ala Ala Gln Ala Leu15 20 25tac gcg ccc ggc gcc ctc ttt tct ggg cag tcc ctc acc gtc ggc aac 148Tyr Ala Pro Gly Ala Leu Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Val Gly Asn30 35 40tac agg ttc acc atg caa gca gac tgc aac ctg gtt ctc tac gac cga 196Tyr Arg Phe Thr Met Gln Ala Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Arg45 50 55 60ggc cgc gcc ata tgg gcc tcc ggc acc gcc cgc cgg ggc atc aac tgc 244Gly Arg Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Ala Arg Arg Gly Ile Asn Cys65 70 75gtg ctg agg atg cag agg gac ggc aac ctc gtc gtc tac act ccc ggc 292Val Leu Arg Met Gln Arg Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Pro Gly80 85 90ggc cgc gcc atc tgg gcc tcc ggc acc aac agg ggc gcc ggc aac tac 340Gly Arg Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn Arg Gly Ala Gly Asn Tyr95 100 105tac ctg acc ctg cag agt gac cgg aac gtc gtc atc tat ggc ccg gac 388Tyr Leu Thr Leu Gln Ser Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro Asp110 115 120ggc agg gcc atc tgg gcg acc aac acc aag gca ttg tct aag gga atc 436Gly Arg Ala Ile Trp Ala Thr Asn Thr Lys Ala Leu Ser Lys Gly Ile125 130 135 140cgg cga tgg gtg ggc ggc gtc atg cga cgc aca acc cgg tcc acc cct 484Arg Arg Trp Val Gly Gly Val Met Arg Arg Thr Thr Arg Ser Thr Pro145 150 155acc agc tga tccatcacac gcaatctcca accatgcatc tgtgcatgct 533Thr Sertgcttactct tgtaataagc aggctggacg gccggtgatc gaaagctttt acatgtttat593gtatagcaag tgctcaactg tatgcgttat gacgcgcgtg tctgccggag aaggagctct653ccatcatctg tgctt 6682104211158212胺基酸213魔芋4004Met Ala Ala Lys Pro Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu Gly1 5 10 15Val Val Leu Arg Pro Ser Glu Ala Ala Gln Ala Leu Tyr Ala Pro Gly20 25 30Ala Leu Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Val Gly Asn Tyr Arg Phe Thr35 40 45Met Gln Ala Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Arg Gly Arg Ala Ile50 55 60Trp Ala Ser Gly Thr Ala Arg Arg Gly Ile Asn Cys Val Leu Arg Met65 70 75 80Gln Arg Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Pro Gly Gly Arg Ala Ile85 90 95Trp Ala Ser Gly Thr Asn Arg Gly Ala Gly Asn Tyr Tyr Leu Thr Leu100 105 110Gln Ser Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro Asp Gly Arg Ala Ile115 120 125Trp Ala Thr Asn Thr Lys Ala Leu Ser Lys Gly Ile Arg Arg Trp Val130 135 140Gly Gly Val Met Arg Arg Thr Thr Arg Ser Thr Pro Thr Ser145 15015權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有魔芋a-Lectin蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列的多肽。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列。
4.一種分離出的魔芋a-Lectin蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ IDNO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它包含權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞，其特徵在於它是原核或真核細胞。
8.一種產生具有魔芋a-Lectin蛋白質活性的多肽的方法，特徵在於其步驟如下(1)將編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成魔芋a-Lectin蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成魔芋a-Lectin蛋白的重組細胞；(3)在適合表達魔芋a-Lectin蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有魔芋a-Lectin蛋白活性的基本純的多肽。
9.一種利用轉基因技術將編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性多肽的核苷酸序列轉化入植物以提高植物對病蟲害抗性的方法，以及魔芋a-Lectin蛋白基因在改良植物病蟲害抗性上的應用，特徵在於其步驟如下(1)將編碼具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連於植物表達調控序列，形成含魔芋a-Lectin蛋白的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入植物細胞；(3)通過篩選如抗生素篩選，獲得轉化細胞並最終再生轉基因植株及其後代，包括植物種子及植物組織。轉基因植物及其後代對植物病蟲害具有增強的抗性。
10.一種能與權利要求7所述的魔芋a-Lectin蛋白多肽特異性結合的抗體，其特徵在於它包括多克隆抗體和單克隆抗體。
11.一種核酸分子，其特徵在於，它包含權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
12.一種用於檢測樣品中是否存在魔芋a-Lectin核苷酸序列的方法，其特徵在於它包括用權利要求10所述探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於魔芋a-Lectin核苷酸編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間，引物長度為15～50個核苷酸。
全文摘要
本發明提供了一種在魔芋中表達的新的a－Lectin蛋白、編碼序列及其在改良植物對病蟲害抗性上的應用。本發明涉及包含所說基因的融合基因構建體,攜帶該構建體的新的重組表達載體。還涉及被所說的表達載體轉化植物細胞,以及由轉化細胞產生的所說基因的轉基因植物及其後代,包括植物種子及植物組織。本發明將所說基因在植物中表達,所獲得的轉基因植物對植物病蟲害具有增強的抗性。
文檔編號C07K14/415GK1384196SQ0211194
公開日2002年12月11日 申請日期2002年6月4日 優先權日2002年6月4日
發明者唐克軒, 費炯, 孫小芬, 遊學軍 申請人:上海復旦迪恩生物技術有限公司