一種高純度丹酚酸b的製備方法
2023-09-11 01:22:10 4
專利名稱：一種高純度丹酚酸b的製備方法
技術領域：
本發明涉及植物純化領域，尤其涉及一種從丹參中提取高純度丹酚酸B的方法。
已有的丹酚酸B的分離純化方法主要是通過大孔吸附樹脂分離或者高速逆流色譜分離。
大孔吸附樹脂分離的主要缺點是製備得到的丹酚酸B樣品純度較低。CN1247855A公開了丹參多酚酸鎂鹽的製備方法，其主要有效成分為丹酚酸B鎂鹽，但是其含量只能達到60%。 CN1240695C公開的丹酚酸B的提取工藝，採用矽膠柱層析分離純化丹酚酸B，得到的純度50%-96%的丹酚酸B，但是過程複雜，並且採用矽膠柱層析成本較高，操作過程煩瑣，難以擴大到生產。Xiao Wang等在J. S印.Sci. 30(2007)， 3214-3217描述了採用高速逆流色譜法分離純化丹酚酸B的工藝，顯示pH梯度逆流色譜可以將丹酚酸B純化到94. 1%，並可能應用於大批量生產。但是其工藝複雜，並且成本高。CN1876641A中將丹參採用微波處理，離心去除沉澱後上聚醯胺樹脂，採用乙醇梯度洗脫，得到純度達到95%的丹酚酸B，所述丹酚酸B的純度不是太高，同時文中也沒有提及其收率。
因此，本領域迫切需要提供一種製備高純度丹酚酸B的方法，該方法應當工藝簡單、成本低，而且收率高。
發明內容
本發明旨在提供一種高純度丹酚酸B的製備方法。
在本發明中，提供了一種高純度丹酚酸B的製備方法，所述的方法包括步驟
(1) 將丹參水提物和未谷鐮孢菌(/^ari》/^r柳i'/7朋r咖)靜息細胞接觸，在20 — 35'C生物轉化24—90小時，得到去除迷迭香酸的丹參水提物；和
(2) 去除迷迭香酸的丹參水提物經反相樹脂吸附，通過水或甲醇水溶液洗脫
背景技術：
得到高純度的丹酚酸B，所述的丹酚酸B的純度》97w/wy。。在另一優選例中，所述的丹酚酸B的純度》99w/wT。。
在另一優選例中，將以幹品計20 — 70g的丹參水提物和10LlOW個/ml未谷鐮孢菌(/^ar2'〃/Z7 ^a/w'/7earaz )靜息細胞混合。
在另一優選例中，將以幹品計40—50g的丹參水提物和5xl9—10'"個/ml禾穀鐮孢菌(屍脂,/"歷graw// ear"/z/)靜息細胞混合。
在另一優選例中，所述的禾穀鐮孢菌(,"^n'^^r柳^ear咖)靜息細胞是處於對數生長期後期的靜息細胞。
在另一優選例中，所述的丹參水提物以幹品為基準，其中的丹酚酸B含量為10—60w/w%。
在另一優選例中，所述的丹參水提物以幹品為基準，其中的丹酚酸B含量為20—60w/w%。
在另一優選例中，在步驟(1)的放置過程中通入空氣並攪拌或振蕩。在另一優選例中，步驟U)中，在22 — 32r放置30 — 80小時。在另一優選例中，步驟(2)中，所述的反相樹脂是以聚苯乙烯為基質的樹脂。
在另一優選例中，步驟(2)中，將步驟(1)得到的轉化液調節pHl-3，經反相樹脂吸附，通過甲醇水溶液洗脫得到高純度的丹酚酸B;或將步驟(1)得到的轉化液調節pH6-9，經反相樹脂吸附，通過水洗脫得到高純度的丹酚酸B。
在另一優選例中，通過甲醇水溶液梯度洗脫得到高純度的丹酚酸B，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量為35 — 70v/v%。
在另一優選例中，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量為40 — 60v/v%。在另一優選例中，所述的方法包括步驟
(a) 將丹參水提物和禾穀鐮孢菌(屍"5"ari'鄉《r柳/z7e3i"湖)靜息細胞混合，在20 — 35'C通入空氣，攪拌或振蕩24—90小時，得到去除迷迭香酸的丹參水提物；
(b) 將去除迷迭香酸的丹參水提物離心除去菌體，調節pH1-3過濾，除去沉澱得到濾液；和
(c) 濾液調節pHl-3，經反相樹脂吸附，通過甲醇水溶液洗脫得到高純度的丹酚酸B;或濾液調節PH6-9，經反相樹脂吸附，通過水洗脫得到高純度的丹酚酸B。據此，本發明提供了一種製備高純度丹酚酸B的方法，該方法工藝簡單、 成本低，而且收率高。
圖1顯示了丹參水提物的HPLC圖譜。
圖2顯示了丹參水提物在使用禾穀鐮孢菌(屍"sariwz; ^ray^'/7ear〃歷)生物 轉化前後的HPLC圖譜；其中
A為轉化前的，B為轉化後的。(因採用的色譜柱不同，主要化合物的保 留時間略有不同，但經過與標準品和其紫外圖譜的對比，確定了其主要的化合 物的吸收峰。)
圖3顯示了本發明提供的製備方法的流程。
圖4顯示了實施例2製備得到的丹酚酸B的HPLC圖譜。
具體實施例方式
為了從丹參水提物中獲得高純度和高回收率的丹酚酸B，發明人經過廣泛 而深入的研究，發現了一種製備方法，就是利用微生物細胞中的酶等生物活性 成分將在反相高效液相色i普(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)中保留時間與丹酚酸B很接近的迷迭香酸分解成小分子物質，然後將經 生物轉化的丹參水提物通過pH調節使成中性或弱鹼性或成酸性，由反相樹脂 吸附後，經水或甲醇水溶液洗脫，便能得到高純度的丹酚酸B，該製備方法的 丹酚酸B的回收率也很高。
定義
丹參(Radix Salviae Miltiorrhizae)，唇形科鼠尾草屬植物丹參的根。 丹酚酸B的化學結構如式I所示formula see original document page 6
迷迭香酸的化學結構如式II所示:formula see original document page 7II
如本文所用，"丹參水提物"是指丹參經水提取所獲得的物質，其中丹酚
酸B的含量，以幹品為基準，為10 —60w/w%，較佳地為20 — 60w/w%。它可以 通過本領域技術人員熟知的方法獲得，例如，將丹參和水混合，加熱(60—100 °C，優選80—IOCTC)提取1一5次(優選2 — 4次)，合併濾液而得。 一種優 選的方法是將丹參和水混合，加熱(60—100'C，優選80—10(TC)提取l一5 次(優選2 — 4次)，減壓濃縮後調節pHl-3，加乙酸乙酯萃取1一3次(優選 2次)，除去多糖得到的。
在本發明中，將禾穀鐮孢菌(,wari"歷grayw'/ ea/7/歷)靜息細胞和丹參水 提物接觸，使丹參水提物中的迷迭香酸分解成小分子物質。所述的接觸包括將 靜息細胞加入到丹參水提物中，將丹參水提物加入到靜息細胞中，和將靜息細 胞和丹參水提物加入到溶液中混合。在本發明中，將以幹品計20 — 70g的丹參 水提物和109—1(t個/ml禾穀鐮孢菌(/^s"^ry〃7z;^柳y/7ear鵬)靜息細胞接觸， 優選地，將以幹品計40 — 50g的丹參水提物和5xl09—l(t個/ml禾穀鐮孢菌 (F"sarj'M7 ^ra歷i/ ea/7y/z )靜息細胞接觸。所述的未谷鐮孢菌(屍"5"ari"/Z7 ^^^'/7ear"歷)可以通過本領域技術人員熟知的方法獲得，例如可購自中國農 業微生物菌種保藏中心，菌株保藏編號30068。
如本文所用，"靜息細胞"是指禾穀鐮孢菌(/^^ri柳^r柳/77ear卿)經 培養基培養至對數生長期後期的菌體。所述的培養基可以是本領域技術人員常 用的適合禾穀鐮孢菌(,^ari咖gr柳i"earw77)，例如但不限於，PDA培養基、 或其它一些真菌培養基。 一種優選的獲得靜息細胞的方法，是將禾穀鐮孢菌 (/^sari湖gra肌'/ earM7)菌株在PDA培養基中培養之對數生長期後期，離心 收集菌體，以無菌水洗滌菌體1一3次(優選1一2次)得到。
如本文所用，"生物轉化"是指利用靜息細胞中的酶等生物活性成分將在 反相HPLC中保留時間與丹酚酸B很接近的迷迭香酸分解成小分子物質的過程。
在本發明中所述的反相HPLC的方法，是進行丹酚酸B可以是本領域常用的藥典中規定的檢測丹酚酸B含量的方法， 一種優選的HPLC方法是色譜柱 C18， Hypersil 0DS2 ， 250mmX4. 6ram， 5u m，大連伊利特分析儀器有限公司出品， 流動相1.7%乙酸水溶液甲醇乙腈=67: 28: 5，流速0.8ml/min，檢測波 長281nm。
如本文所用，"反相樹脂"是指樹脂的基質為極性較低的化合物，待分離 的化合物被樹脂吸附後，採用極性較大的流動相進行洗脫，並逐漸降低流動相 的極性，在洗脫過程中可實現化合物的分離，直至待分離物質被洗脫。同本領 域熟知的大孔非極性吸附樹脂的性質和使用方法相同。其實大孔非極性吸附樹 脂就是一種反相樹脂。本發明優選採用苯乙烯為橋架材料製成的吸附層析擔 體，即聚苯乙烯作為基質的樹脂，樹脂粒徑40-100微米。更佳地本發明可以 採用amberlite XAD系列和三菱化成公司生產的HP系列及其類似的國產樹脂， 如XAD-2， HP-20和安徽三星樹脂科技有限公司的YPR-II樹脂等。
製備方法
技術領域：
本發明提供的高純度丹酚酸B的製備方法，包括步驟
(1) 將以幹品計20 — 70g的丹參水提物和1(f一l(T個/ml禾穀鐮孢菌 (屍Mar^y歷^ra/^/7ear"/Z7)靜息細胞接觸，在20—35。C放置24—90小時，得到去
除迷迭香酸的丹參水提物；和
(2) 去除迷迭香酸的丹參水提物經反相樹脂吸附，通過水或甲醇水溶液洗脫 得到高純度的丹酚酸B。
較佳地，將以幹品計40 — 50g的丹參水提物和5xl09—l(T個/ml 109靜息 細胞混合。
較佳地，在22 — 32'C通入空氣，攪拌或振蕩30 — 80小時，得到去除迷迭 香酸的丹參水提物；更佳地，在25 — 30。C通入空氣，攪拌或振蕩36-72小時， 得到去除迷迭香酸的丹參水提物。
在本發明的一個優選例中，將丹參水提物和靜息細胞混合，進行生物轉化 的過程是通過HPLC跟蹤的， 一般是待迷迭香酸峰恰好消失時，將去除迷迭香 酸的丹參水提物離心去除菌體，終止轉化。
在本發明的一個優選例中，去除迷迭香酸的丹參水提物在上反相樹脂前， 可以將其調節pHl-3，靜置15分鐘以上(優選20 — 40分鐘)，過濾除去不溶 性沉澱。去除迷迭香酸的丹參水提物在上反相樹脂前，根據隨後將採取的洗脫方 式，進行PH調節。
如果調節pH為酸性，那麼在上反相樹脂後，可以先用蒸餾水洗脫樹脂柱， 除去無機鹽和極性色素；再用低濃度的甲醇水溶液(35 — 55v/vy。甲醇，優選40 —50v/v%)洗脫HPLC中保留時間小於丹酚酸B的雜質，直至洗脫完畢；然後 再用高濃度的甲醇水溶液(45 — 70v/vy。甲醇，優選50 — 60v/vy。)，將丹酚酸B 洗脫下來。
如果調節pH為中性或偏鹼，可以是丹酚酸B成鹽，但同時又不破壞丹酚 酸B，那麼在上反相微球樹脂後，可以僅用水洗脫，得到高純度的丹酚酸B。 本發明提供的這種單純用水洗脫的方法，還可以應用於含有羧基、磺酸基等酸 性基團的物質的分離純化。
在本發明的一個優選例中，高純度丹酚酸B的製備方法包括步驟
(a) 配製pH7的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩衝液，將靜息細胞和丹參水提 物(已經除去多糖)加入到緩衝液中，通氣攪拌，轉化，HPLC檢測，待迷迭香 酸恰好被水解完畢後，離心或過濾除去菌體，中止轉化，得到去除迷迭香酸的 丹參水提物；
(b) 將去除迷迭香酸的丹參水提物調節pHl-3 (優選pH2)，靜置，過濾 除去不溶性沉澱；
(c) 將步驟(b)得到的濾液調節pHl-4 (優選pH3)，上反相樹脂柱，流 速，l倍柱體積/小時；
(d) 5倍柱體積的蒸餾水洗脫樹脂柱，流速，3倍柱體積/小時，除去無機
鹽和極性色素；
(e) 45%的甲醇洗脫樹脂柱，流速，2倍柱體積/小時，分步收集，HPLC檢 測，待保留時間小於丹酚酸B的雜質洗脫完畢後停止洗脫；
(f) 55。/。甲醇洗脫丹酚酸B，流速，2倍柱體積/小時，HPLC檢測，待丹酚 酸B洗脫基本完畢時中止洗脫；
(g) 將丹酚酸B濃縮，調節pH2後乙酸乙酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以 水溶解丹酚酸B，冷凍乾燥，得到丹酚酸B純度大於97y。的樣品。
在本發明的另一優選例中，高純度丹酚酸B的製備方法包括步驟 (i)配製pH7的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩衝液，將靜息細胞和丹參水提 物(已經除去多糖)加入到緩衝液中，通氣攪拌，轉化，HPLC檢測，待迷迭香
9酸恰好被水解完畢後，離心或過濾除去菌體，中止轉化，得到去除迷迭香酸的 丹參水提物；
(ii) 將去除迷迭香酸的丹參水提物調節pHl-3 (優選pH2)，靜置，過 濾除去不溶性沉澱；
(iii) 將步驟(b)得到的濾液調節pH6-9 (優選pH7)，使丹酚酸B成 為鈉鹽，上反相樹脂柱，流速5倍柱體積/小時；上柱後以去離子水洗脫樹脂 柱，流速5倍柱體積/小時，分布收集，HPLC檢測，合併純度達標的丹酚酸B 樣品；
(iv) 濃縮，調節pH2後乙酸乙酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹 酚酸B，冷凍乾燥，得到純度超過99y。的丹酚酸B樣品。
對於純度未達標的丹酚酸B洗脫液，可以收集後重複上述步驟進行分離。
本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所 揭示的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特 徵僅為均等或相似特徵的一般性例子。
本發明(釆用水洗脫的方法)的主要優點在於
1、 純化得到的丹酚酸B純度更高，可以有效去除甲醇洗脫不能夠有效分 離的雜質，可以將丹酚酸B純化到100% (高效液相純度)。
2、 分離過程中不用有機溶劑，降低了工作環境和產物的毒性。
3、 使用水做為洗脫劑，有效降低了分離的成本。
4、 節省了分離工作所需要的時間，提高了工作效率。
5、 對於純度未達到要求的洗脫液，可以重複分離，明顯提高了收率(該 步驟收率可以達到80%)。
6、 在分離過程中，先流出的有色物質基本不含丹酚酸B， HPLC亦不能檢 出。因此，該方法可以有效去除丹酚酸B中HPLC不能檢測的雜質，有效提高 丹酚酸B的毫克效價。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說 明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於 本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
實施例1
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(/^sari"歷^r柳iV ear柳)溼菌體10g，於28。C搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後上反相樹脂XAD-2，樹脂體積200ml。上 柱後1000ml水洗脫樹脂柱，後再以45%的甲醇洗脫樹脂柱至保留時間小於丹酚 酸B的雜質去除完全。以559i甲醇洗脫樹脂柱至丹酚酸B洗脫完全。合併純度 達標的丹酚酸B洗脫液，濃縮後調節至pH2後以乙酸乙酯萃取除鹽，回收乙酸 乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹，得到丹酚酸B高純度樣品純度97. 1%。
各部分丹酚酸B損失及總收率
1. 水提取，損失1(P/。丹酚酸B
2. 微生物轉化除迷迭香酸，損失1(F。丹酚酸B
3. 45y。甲醇除保留時間小於丹酚酸B的極性物質，損失30y。丹酚酸B 丹酚酸B (純度大於97%)。
總收率50%。
實施例2
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(屍"sari鵬gr柳"ear,)溼菌體10g，於28。C搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH7，上反相樹脂HP-20，水洗脫，收集純度達到99鬼的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸乙 酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗脫 液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.31g純度超過9將。
最終製得的丹酚酸B的HPLC圖譜如圖4。
各部分丹酚酸B損失及總收率
水提取、微生物轉化收率同甲醇洗脫法，水洗脫去純化丹酚酸B損失丹酚 酸B小於總量的20。/。；丹酚酸B (純度大於99%)。 總收率大於60%。
實施例3
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(,"^sri'M7 g/^w'/2ea/7/歷)溼菌體20g，於28。C搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH7，上反相樹脂，水 洗脫，收集純度達到99. 5y。的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸乙 酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗脫 液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.02g液相純度100%。
實施例4
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pHl，乙酸乙酯萃取兩次，合併兩次乙酸 乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝液溶解，加 入未谷鐮孢菌(/^5"ari"/ff《ra歷/77朋rM7)溼菌體7g，於28'C搖床上振蕩，轉 化72小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除菌，然後調 節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH7，上反相樹脂柱，水洗脫，收 集純度達到99.5%的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸乙酯萃取除 鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗脫液重複上 柱分離，共得到丹酚酸B 1.21g液相純度99.8呢。實施例5
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%),加入400ral水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(,"sari'"歷^ra77iV ear"歷)溼菌體20g,於28°〇搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH7，上反相樹脂柱， 水洗脫，收集純度達到99.5%的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸 乙酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗 脫液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.2 g液相純度99.2呢。
實施例6
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(,^ai-i'M7 gra/w'"ea/v/yz )溼菌體20g，於28'C搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH6，上反相樹脂，水 洗脫，收集純度達到99. 5y。的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸乙 酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗脫 液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.25 g液相純度100呢。
實施例7
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(/^sar/"/H gra歷i'/ ear"歷)溼菌體20g，於28。C搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH9，上反相樹脂柱， 水洗脫，收集純度達到99. 5y。的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸 乙酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗脫液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.22 g液相純度99. 1%。 實施例8
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2y。)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(/^Asar/咖gra/^"ear鵬)溼菌體20g，於25。C搖床 上振蕩，轉化50小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH7，上反相樹脂柱， 水洗脫，收集純度達到99. 5。/。的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸 乙酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗 脫液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.21 g液相純度99呢。
實施例9
稱取丹參幹藥材100g(丹酚酸B含量2%)，加入400ml水9(TC提取兩次，合 並兩次濾液，減壓濃縮至50ml，調節pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取兩次，合 並兩次乙酸乙酯液，濃縮回收乙酸乙酯。將濃縮殘渣以200mlpH7的磷酸緩衝 液溶解，加入禾穀鐮孢菌(/^sari'wz7 gra/w77ea/7/歷)溼菌體20g，於35"C搖床 上振蕩，轉化36小時，得到無迷迭香酸的丹酚酸粗提液。將該粗提液過濾除 菌，然後調節pH2，靜置沉澱雜質，過濾後將濾液調節pH7,上反相樹脂柱，水 洗脫，收集純度達到99.5y。的丹酚酸B洗脫液，合併，調節至pH2後以乙酸乙 酯萃取除鹽，回收乙酸乙酯後以水溶解丹酚酸B，凍幹。將純度不達標的洗脫 液重複上柱分離，共得到丹酚酸B 1.22 g液相純度iooy。。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後， 本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申 請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種高純度丹酚酸B的製備方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(1)將丹參水提物和禾穀鐮孢菌(Fusarium graminearum)靜息細胞接觸，在20-35℃生物轉化24-90小時，得到去除迷迭香酸的丹參水提物；和(2)去除迷迭香酸的丹參水提物經反相樹脂吸附，通過水或甲醇水溶液洗脫得到高純度的丹酚酸B，所述的丹酚酸B的純度≥97w/w％。
2. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的丹酚酸B的純度》 99w/w%。
3. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，將以幹品計20 — 70g的丹參 水提物和109—10'。個/ml禾穀鐮孢菌(/^s槓i"/z/^r柳i77朋r湖)靜息細胞混合。
4. 如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，將以幹品計40 — 50g的丹參 水提物和5xl(^—l(T個/ml禾穀鐮孢菌(化幼/v'咖^r柳iV e^咖)靜息細胞混合。
5. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的禾穀鐮孢菌(^/^r^加 ^s歷i'/7ear^)靜息細胞是處於對數生長期後期的靜息細胞。
6. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的丹參水提物以幹品為 基準，其中的丹酚酸B含量為10—60w/w0/。。
7. 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的丹參水提物以幹品為 基準，其中的丹酚酸B含量為20—60w/w%。
8. 如權利要求l所述的製備方法，其特徵在於，在步驟(1)的放置過程中 通入空氣並攪拌或振蕩。
9. 如權利要求1或8任一所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中，在22 一32。C放置30 — 80小時。
10. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的反 相樹脂是以聚苯乙烯為基質的樹脂。
11. 如權利要求l所述的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，將步驟(l) 得到的轉化液調節PHI-3，經反相樹脂吸附，通過甲醇水溶液洗脫得到高純度 的丹酚酸B;或將步驟(1)得到的轉化液調節pH6-9，經反相樹脂吸附，通過 水洗脫得到高純度的丹酚酸B。
12. 如權利要求11所述的製備方法，其特徵在於，通過甲醇水溶液梯度洗 脫得到高純度的丹酚酸B，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量為35 — 70v/v%。
13. 如權利要求12所述的製備方法，其特徵在於，所述的甲醇水溶液中的 甲醇含量為40 — 60v/v%。
14. 如權利要求l所述的製備方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(a) 將丹參水提物和禾穀鐮孢菌(,"sari'咖grayz7i77ear鵬)靜息細胞混合， 在20—35'C通入空氣，攪拌或振蕩24—90小時，得到去除迷迭香酸的丹參水提物；(b) 將去除迷迭香酸的丹參水提物離心除去菌體，調節pHl-3過濾，除去沉 澱得到濾液；和(c) 濾液調節pHl-3，經反相樹脂吸附，通過甲醇水溶液洗脫得到高純度的 丹酚酸B;或濾液調節p朋-9，經反相樹脂吸附，通過水洗脫得到高純度的丹酚酸 B。
全文摘要
本發明公開了一種高純度丹酚酸B的製備方法，所述的方法包括步驟(1)將丹參水提物和禾穀鐮孢菌(Fusarium graminearum)靜息細胞混合，在20-35℃生物轉化24-90小時，得到去除迷迭香酸的丹參水提物；和(2)去除迷迭香酸的丹參水提物經反相樹脂吸附，通過水或甲醇水溶液洗脫得到高純度的丹酚酸B。本發明提供的製備方法所得到的丹酚酸B純度≥99％，回收率＞60％，工藝簡單、成本低。
文檔編號C07D307/00GK101638401SQ20081004110
公開日2010年2月3日 申請日期2008年7月29日 優先權日2008年7月29日
發明者李繼安, 闞士東, 陳代傑 申請人:上海醫藥工業研究院