由原核核酸結合蛋白介導的分子物質轉移法的製作方法

2023-09-10 14:52:40

專利名稱：由原核核酸結合蛋白介導的分子物質轉移法的製作方法
技術領域：
和現有技術狀況轉染是指，為了實現基因在細胞中的表達，引入核酸，如核苷酸、反義RNA、核酶、尤其是以質粒、染色體或染色體片段形式存在的DNA的過程。在此所用，術語轉移是與之類似的，而在通常語言慣用法中，術語轉染專門用於描述基因轉移。除了核酸轉移以外，附加活性物質如蛋白、肽、治療藥物和其他分子物質的定向有效轉化也很重要。轉移過程在生物醫學基礎研究和生物技術製藥工業領域均具有重要意義。一些蛋白，其中含有治療相關蛋白，只有在真核細胞中生產時，才能正確加工，因為甚至在翻譯後也能對蛋白進行修飾的修飾機器在原核生物中多半不存在或者顯著不同。相反，其它蛋白則利於在原核宿主細胞中生產，因為在原核宿主細胞中，可以經濟方便地生產大量蛋白。此外，特定基因的轉染和定向表達是一種在細胞和分子生物學中對生物過程進行定性描述和分析的重要手段。談及產生具有新特性和含有新成分的植物(轉基因植物)或抗除草劑植物，細胞轉染是植物技術中一種重要方法。最後，在生物醫學研究領域，定時用單鏈核酸(單鏈DNA或單鏈RNA)，或核酸衍生物[例如，肽核酸(peptide nucleic acids，PNAs)]轉染細胞，這些物質作為效應子發生細胞內效應，例如通過所謂反義核酸技術專一性抑制蛋白合成。對於所有這些過程和方法中，相關核酸的特定轉移是重要工序。
同樣地，可以直接地將蛋白或肽運輸進細胞的方法也是有關聯的；此方法最重要的應用在治療領域。例如，細胞內的抗體可被用來識別細胞內特定病原體並抑制它們。實現這一目的的一種方法是大分子物質進入靶細胞的電穿孔法；但是這種方法只能在體內應用，效率低並對細胞存在相對高的浪費(參見E.J.Verspohl，I.Kaiserling-Buddemeier，A.Wienecke，將特異抗體導入電滲透細胞是一種去除細胞特定功能的重要方法，Cell.Biochem.Funct.Vol.15，127-134，1997)。
根據目前技術水平，對於將核酸轉移進細胞而言，已有幾種方法。其中有，如同前面提及的蛋白轉移方法一樣的物理方法，例如電穿孔法，其中通過與電場接觸，細胞膜被穿孔，從而使大分子物質可以透過。然而，對於敏感細胞而言，電穿孔法常常存在困難，並且伴隨低的細胞存活率。就真核細胞來說，根據現有技術水平，最常使用化學法，例如磷酸鈣與DNA共沉澱法、高分子複合物形成法，如從DEAE-(二乙氨乙基-)葡聚糖法和DNA(參見Y.W.Yang J.C.Yang，DEAE-葡聚糖介導的基因轉移研究，Biotechnol.Appl.Biochem.1997，Vol.25，47-51)或帶有DNA的樹狀體形成法(參見J.F.Kukowska-Latallo，A.U.Bielinska，J.Johnson，R.Spindler，D.A.Tomalia， J.R.BakerJr.，利用Starburst聚醯胺型胺類樹狀體法將遺傳物質高效轉移進哺乳動物細胞，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，Vol.93，4897-4902)。這些轉染試劑的作用機制是首先，將長的具有一定機械強度的線狀核酸分子進行壓縮；在多數情況下，這種壓縮是核酸成功吸收進入細胞的重要先決條件。偶爾，可以利用多聚陽離子例如純的或修飾的多聚賴氨酸介導轉移(例如，參見專利WO 98/06869)。
在醫藥應用中，優選以陽離子脂類物質為基礎的脂質體系統進行轉移；該系統具有高效的優點。於是，出現了用不同來源和成分的的陽離子脂質體包合核酸的包合物(參見商業產品，如Invitrogen公司的PerFect，Roche公司的FuGene，Life Technologies公司的Lipofectamine，Biontex公司的PolyFectin，及Stratagene公司的LipoTaxi)。有關此方面的全面、最新的綜述可以參見文獻R.J.LeeL.Huang，進行基因轉移的脂類載體系統，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1997，Vol.14，173-206。相當大量國際專利主要區別就在於所用脂質體的配方不同。
然而，這些所述的技術和試劑分別具有不同的缺點。一方面，現存系統(除了基於脂質體的系統)效率相當低，產量只佔被轉染細胞的幾個百分點。另一方面，有效試劑(基於脂質體的)往往會增加毒性，尤其對敏感真核細胞。其他的不良特點也已被描述；例如用DEAE-葡聚糖法轉染依附的真核細胞時，微弱附著的細胞會從細胞培養皿的底部產生脫落。而且，沒有立即表現細胞毒性的轉染試劑可能具有影響轉染後細胞的特性。另外，現有的新一代轉染試劑如樹狀體(Superfect產品，Qiagen公司生產)雖然在一定的應用中僅具有微弱的毒性，但是製作相當複雜，所以很昂貴。最後，迄今為止，很多轉染方法要求使用者進行大量操作，所以使用中表現出複雜和繁瑣的特點；這也可能對轉染分析的再現性負面影響。為達到最大轉染量，必須分別針對每種細胞類型對製造商要求的轉染標準方法進行修改，並且每次進行最優化實驗。這些試劑大多僅適於雙鏈DNA的運輸，極少適用於單鏈核酸的運輸，特別不適用於其他分子物質如蛋白或肽。最後一點但不是最不重要的，目前常用的轉染試劑各自的組成僅為一種或少數幾種分子，因而，它們的應用範圍受到局限。
發明的任務就在於消除或減少上面列舉的根據現有技術水平所存在的的缺點。因此，根據本發明，提供了一種如權利要求1所述的用於將核酸和/或核酸類似物、和/或多種核酸和/或多種核酸類似物和/或含胺基酸物質轉移進原核或真核細胞的方法，其中●用於轉移的核酸或核酸類似物，或多種核酸或多種核酸類似物，或含胺基酸物質與原核核酸結合蛋白接觸，從而產生核酸、核酸類似物或多種核酸或多種核酸類似物或含胺基酸物質與此種原核核酸結合蛋白的複合物。和●隨之，通過這種核酸、核酸類似物和/或多種核酸或多種核酸類似物及含胺基酸物質與原核核酸結合蛋白形成的複合物與原核或真核靶細胞接觸，以便實現將複合物轉移進細胞。
本發明的有利應用形式來自於本發明說明部分的次要權利要求。
發明概述本發明涉及一種用於將核酸、核酸類似物、和/或多種核酸和/或核酸類似物、和/或含胺基酸物質，尤其是核酸例如以質粒形式存在的DNA，轉移進入原核或真核細胞的方法。
為了達到這一目的，通過一種原核核酸結合蛋白，在適宜的溫育條件下與被轉移物質的共價結合，或與被轉移核酸的非共價締合形成複合物，然後將複合體加入靶細胞中。這種原核核酸結合蛋白所具有的濃縮DNA的特性在這裡特別有利於以DNA為基礎活性物質的轉移。對於控制吸收和增加效率而言，原核核酸結合蛋白能表現出另外的特點，例如，附加融合的形式。細胞可分別吸收蛋白和活性物質的複合體，蛋白和核酸的複合體。不同形試圖示於

圖1中。
本轉移方法中用到了原核核酸結合蛋白，優選地來自耐熱生物，更優選地來自極端嗜熱生物。當核酸用作轉移物質時，原核核酸結合蛋白與核酸形成可逆複合體；原核核酸結合蛋白濃縮並壓縮核酸。這樣，複合物可以被保護不會受到令人不快的效應的作用，例如，核酸酶的降解效應。在分別溫育之後，用這種方法濃縮的核酸分子可以通過真核細胞膜或原核細胞壁被吸收進入細胞，不論是被動還是主動過程。如果一個編碼基因以相應的DNA(例如，質粒)形式被用作轉移核酸，這個基因則可以隨後在靶細胞中表達。另一方面，如果一種蛋白或肽用作被運輸的分子物質，則被轉移蛋白或肽在基因技術水平上與轉移蛋白之間的融合是有利的。為了提高轉移效率，核酸結合蛋白可以與基於蛋白或肽的基礎上的效應物結合(融合)。此外，使用在其序列中存在核酸易位的典型信號的蛋白質也是有益的。
此外，就轉移效率提高和複合體生物性質而言，利用脂類物質、聚乙二醇、或其他分子來包裹複合體也是有益的。
核酸轉移的一個重要要素是其濃縮程度。這種核酸分子通常具有長的不可彎曲結構，其在溶液中柔韌性很小。因為基因的總編碼長度，DNA分子可以很長，就會表現出不利於轉染的物理特性。本發明中，濃縮是指通過DNA線或環狀質粒凝聚成緻密結構，即，體積變小，以便降低DNA分子的不利的長徑比。最佳的濃縮情況通過發展出幾乎球形的結構而將其顯現出來。核酸濃縮預示了濃縮劑的存在；在這裡，濃縮劑的一個通常功能就是補償DNA和其他核酸分子的多磷酸骨架上的負電荷。
根據本發明的條件，有利的原核核酸結合蛋白源於一種極端嗜熱生物，該生物存在於75℃以上的環境中。源於此種生物的蛋白質的優點之一在於以下事實中，即，由於其特殊的穩定性特性，它們可以被方便地予以處理，例如在純化和保存中對試劑無需冷卻。而且，來源於這些生物的蛋白質易於生產和純化，並且重組在大腸桿菌中具有高表達量。因而，這些蛋白質對抗變性的高穩定性可被用於在頗嚴謹的條件下進行純化，這樣就可避免製備中的可能存在的汙染，例如，也包括將來自細菌脂多糖(內毒素)、脫氧核糖核酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶等的汙染限制在低於常用檢測方法的檢出限以下的最小量。在這一點上，優選用於本發明的TmHU蛋白(海棲熱袍菌HU-蛋白)在260至300納米波長範圍內具有光譜透明特性也是有用的；這就可以很容易地從核酸和其他蛋白中快速而靈敏的分光分析汙染物。根據本發明，轉移試劑的純化製劑是優選使用，以利於核酸、核酸類似物和含胺基酸物質的再現率和高效轉移率，因為汙染物，特別是來自細菌內毒素但也來自蛋白酶、脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶可以損害轉移結果。本發明方法尤其適合應用於各種敏感細胞，其他方法轉化效率較低。
組蛋白是一種存在於真核細胞細胞核內的蛋白，它與核酸主要結合或完全地非專一性的結合，其目的主要在於壓縮(濃縮)DNA，例如，源於蛋白質的電荷中和及疏水效應。通過這種作用，就可以降低DNA在細胞核內的有效空間需求。根據現有知識，在結構更加簡單(沒有細胞核)的原核生物中，組蛋白類似蛋白行使了類似的功能。例如，源於極端嗜熱生物海棲熱袍菌的DNA結合蛋白(組蛋白類似蛋白)，不僅在結構穩定性上優於源於真核細胞的組蛋白，而且更易於控制且結構較為簡單。舉例而言，真核細胞的組蛋白是由多達8個的不同蛋白亞基組成的締合體，其中所有亞基必須分別合成，且與DNA裝配形成一個複合體；此過程在體外是複雜而微妙的。在本發明中所使用的原核組蛋白類似蛋白，優選自來源於極端嗜熱生物海棲熱袍菌的HU蛋白。
發明者所做的試驗另人驚奇的表明，這種源自極端嗜熱真細菌海棲熱孢菌(thermotogales種)的、具有DNA結合作用的原核組蛋白類似蛋白HU，後面稱之為TmHU，不僅具有結合、保護、濃縮核酸的作用，而且還能夠非常有效的將核酸運輸不同的細胞類型中。此外，隨後的基因表達水平高於沒有任何可辨別的細胞毒性跡象的可比較的常規試劑這種轉移方法簡單、高效、而且在轉移過程中節省時間。
以一種相同的方式，還可以將融合在TmHU上的含有胺基酸的物質，例如蛋白或肽，尤其是將蛋白，經由TmHU吸收效應被吸收進靶細胞。
另外，事實已經證明這種組蛋白類似蛋白可以在細菌，即大腸桿菌中高產重組表達，並以分光純化方式簡單、經濟地分離。例如，因為源於極端嗜熱生物，所以無需在冷卻條件下製備和儲存該蛋白。並且，最初的清洗步驟，即從大腸桿菌宿主蛋白混合物中進行HU蛋白的分離，僅為一個簡單的熱沉澱步驟，其中幾乎只有熱穩定TmHU蛋白留在溶液中。
TmHU蛋白在細胞轉染上顯示傑出的性能。該蛋白將核酸壓縮(濃縮)為穩定的複合物，這樣就能很好地保護核酸不被核酸酶降解。所形成的複合物能夠有效地被吸收進細胞。
除此之外，還可以通過基因技術方式將肽或蛋白結構域與TmHU蛋白融合，這種做法可以使複合物具有修飾的特性。所以，修飾的TmHU蛋白可以增加吸收效率或增加細胞的定向吸收。對於修飾，舉例而言，考慮到肽與細胞表面結構的結合；現在已知帶有基序精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD序列)的肽優選地與細胞表面經常出現的αvβ3或αvβ5型整連蛋白結合。對於另外一些肽基序，已知由於它們的兩性分子結構特性，它們插入到真核細胞的細胞膜中，使細胞對分子的吸收成為可能。最後，通過使用作為效應物與細胞表面受體結合的蛋白或蛋白結構域，也可以達到提高吸收效率和增加細胞類型專一性的目的。與此有關一個例子就是表皮生長因子(EGF)，其可以高度特異性地結合在表皮生長因子(EGF)受體上(在一些腫瘤細胞類型上過量表達)。這樣，TmHU/EGF-DNA複合物就可以被專一性地吸收進入這類腫瘤細胞中。但是甚至在複合物被吸收進入細胞之後，粘附的功能結構域可以有助於轉染效率的提高。例如，影響核內體釋放的蛋白及通過核定位信號序列(NLS序列)將肽靶向吸收進入真核細胞細胞核內可被列舉出來如果可行，為了提高轉染效率，可將蛋白/核酸複合物進行包裹以使其與外部環境進一步分離，該包裹過程可以通過脂質體膜實現。基於現有技術水平，脂質體很容易生產；因而，可以將蛋白/核酸複合物被動包裹於脂質體中。這樣的結構在使用於生物體內時具有變低的免疫原活性。另外，通過脂質體外鞘與細胞膜的融合過程，會發生細胞吸收的增加。蛋白/核酸複合物的衣殼化也可以通過其他分子物質來實現，如分子量為2000道爾頓的聚乙二醇(PEG2000)。根據現有技術水平，已經證明聚乙二醇包裹導致體內應用中免疫反應的明顯降低(參見綜述，M.D.Scott K.L.Murad，細胞偽裝使用聚合物蒙蔽免疫系統，Curr.Pharm.Des.1998，Vol.4，423-438)。
將核酸、核酸類似物和(或)含有胺基酸的物質轉移進細胞是以轉移用於轉染的報告基因的編碼DNA序列和轉移蛋白質(GFP)進入靶細胞表現在下面每個實施例中。這裡採用了已被證明適用於所述方法的原核蛋白，即源於海棲熱孢菌的HU蛋白。與根據文獻Robbins，Dilworth，Laskey和Dingwall，細胞雜誌(Cell)，第64卷，615-623所述的轉運序列RPAATKKAGQAKKK比較，此蛋白含有兩個用於將蛋白轉移進真核細胞的典型的核轉運信號；這樣，蛋白質和與之締合的分子物質(DNA、蛋白質)的核轉運被確保具有超過95％的可能性(結果由據現有技術使用的計算機軟體PSORTII分析確證)。核轉運對於本方法的巨大效率具有意義，尤其對於將DNA轉移進細胞。但是，隨後的實施例8明確顯示這種蛋白不僅具有將DNA轉移進細胞的能力，而且還能轉移附著在TmHU上的蛋白。因而，這種蛋白也具有能夠透過真核細胞膜的優點。
通過附加受體結合分子如EGF(參見，後面的實施例6)，也可以實現定向吸收進入細胞。
TmHU蛋白的一個特有優點是，在下面列舉的實施例中缺乏毒性以及在轉染過程中，附著細胞不會從細胞培養容器上脫落下來。這一特性使該蛋白和其他轉染試劑如脂質體、合成化合物(樹狀聚合體)顯著區分開來。同時，TmHU作為一種源自極端嗜熱生物的蛋白，構成本系統使用中的特殊優點。於是，重組生產非常簡單，可以確保蛋白製劑的高純度。蛋白所具有的極高熱穩定性使得即使在非常不利的環境下的長期穩定保存成為可能。尤其是，這使得形成高溫轉染所需的蛋白/核酸複合物成為可能。如果把DNA與TmHU蛋白以適當質量比進行混合，然後放到高溫(90℃左右)環境中經過約0.5至10分鐘短時間處理後會形成優良的DNA與TmHU沉澱物，該沉澱物尤其適用於高效率的轉染。只有採用極度耐熱的核酸結合蛋白，才使得這種處理方法成為可能。核酸與TmHU蛋白可以在通常的室溫下溫育0.5至180分鐘，其中60分鐘的溫育時間往往就足夠了。對於利用TmHU進行的核酸轉移，已經證明在形成複合體的過程中，向TmHU/DNA混合物中加入鈣是有利的，鈣可以加速複合物的形成。室溫下或高溫下形成的沉澱物與靶細胞的溫育時間取決於細胞類型和應用情形，其範圍從30秒到幾天。
特別適用於本發明的是源自嗜熱生物，特別是極端嗜熱生物的核酸結合蛋白及其衍生蛋白物。好的候選生物來自古細菌領域，尤其是以Crenarchaeota(極端嗜熱古細菌)為代表，其它還有分類群Pyrodictiales、硫化葉菌目(Sulfolobales)、熱變形菌目，以及還沒有分類的Crenarchaeota例如Aeropyrum、Caldococcus、Cenarchaeum、Igneococcus、Pyrolobus、Sulfophobococcs、熱盤菌屬和Thermosphaera中的代表。在euryarchaeota中特別來自分類級熱球菌目和熱原體目(Thermoplasmales)的蛋白是相關的。但是，嗜熱和極端嗜熱的真細菌中也天然存在可在本發明所述應用框架中使用的核酸結合蛋白；例如，這些包括分類級thermosulfo-bacteria的代表、Aquificales、棲熱袍菌目(Thermotogales)或屬棲熱菌屬/異常球菌屬的菌類。
除了源於極端嗜熱生物和嗜熱生物的蛋白以外，源於其他原核生物的蛋白也可用於進行成功的轉染，如下面實施例8(使用源於大腸桿菌的HU蛋白)所表明的情況。在此，發生了核酸轉染必須的原核蛋白複合物的有效形成，優選地通過在混合物中加入適當數量的鈣；在此，產生良好沉澱物的加熱步驟必須去除。所以，這些蛋白可以從嗜溫生物中分離或形成天然蛋白的修飾結構，其中嗜溫生物來自古細菌或真細菌界。作為古細菌的代表，可以指出分類群Corarcheota和Euryarchaeota。後者包括古生球菌目、鹽桿菌屬、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷微菌目、Methanopyrales、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、熱球菌目和熱原體屬。對真細菌分類群，主要包括非嗜熱和非極端嗜熱生物，下述群特別適合此處Aquificales、衣原體目/疣微菌屬、糞熱桿菌屬、藍細菌屬、噬纖維菌目/綠硫桿菌(green sulfur bacteria)、絲狀桿菌/酸桿菌屬、厚壁菌門、Flexitipesk、梭桿菌、全噬菌屬、硝化螺菌屬、浮黴狀菌目(Planctomycetales)、變形桿菌(Proteobacteria)、螺旋體目(Spirochaetales)、互養菌屬。
當在所述技術技術中使用原核生物作為靶細胞時，如果採用一種源自嗜熱生物或極端嗜熱生物的蛋白，則通過短時間加熱TmHU/DNA混合物形成良好的沉澱物提供轉染效率的提高。不同於簡單地將TmHU/DNA複合物與原核細胞一起溫育的轉染方式，根據目前的技術水平，藉助TmHU/DNA複合物成功進行電穿孔。所以，DNA受到了TmHU的保護並在結構上得以穩定。通過後面實施例1，證實了即使在很高的濃度下，TmHU也不會對大腸桿菌造成毒性。相似地，可以成功地將蛋白或其他分子物質轉移進原核細胞。
同時，TmHU蛋白在體內可以起到保護核酸不被酶所降解的作用。在細菌細胞內重組產生的蛋白會與其中存在的核酸結合，例如質粒。以此為基礎，可以生產一種系統，該系統可以在經濟的條件下生產大量高純度的核酸，並且不存在被核酸酶降解的危險。
對分子物質轉移進細胞來說，特別重要的一個應用領域是使用植物細胞作為靶細胞。由於植物細胞具有的重要特點就是堅固的幾乎不能透過的細胞壁，因而，當前幾乎沒有任何已知手段將分子物質諸如DNA或蛋白質運輸進植物細胞。但是，極其穩定的TmHU/DNA複合物則可以做到這一點，使用現有技術的常規方法，例如化學轉染法、電穿孔法或者甚至僅需要將TmHU/DNA複合物與之進行簡單的溫育就可以完轉移進植物細胞的過程。所以，再次強調，TmHU中存在的核轉運序列在本發明所述方法可達到的高效率方面扮演了一個重要的角色。
例如，植物的基因技術修飾可以通過培育具有較好形狀的高產品種對保證世界糧食供應做出了根本性的貢獻。由於植物疾病、害蟲和雜草，西歐的糧食損失至少達20％。所以，本發明的一個重要應用也是植物細胞的轉染。但是，迄今為止已知用於植物細胞轉染的基因轉移方法只有很少幾種，而且都很複雜、轉移不夠充分且很昂貴。就這一方面而言，最常用的方法是使用一種叫做根癌土壤桿菌的能在根頸形成腫瘤的細菌，以便將DNA帶入細胞。但是，這種細菌只攻擊雙子葉植物；而單子葉植物(其中含有重要的作物)則不受感染。其它迄今為止仍不十分有效並且特別複雜的基因轉移可能方式是電穿孔和顯微注射另外，還用粒子轟擊(魔術子彈)法，往往可以成功但卻相當昂貴。在效率和費用方面，TmHU及某種分子物質的使用可以顯著優於這些轉染方法。所以，特別使用了蛋白質修飾法，其中，舉例來說，通過與TmHU融合的酶，在局部限制水平降解植物細胞的不易穿透的細胞壁，從而為TmHU/DNA複合物提供了適合的吸收途徑。一個應用方面特別存在於產量增加領域，如通過開發較高產量和從營養生理學的角度來說更有價值的品種的(改變或增加成份含量諸如蛋白、脂肪酸、香料和澱粉)；通過避免蟲害襲擊(引入抗蟲基因，其基因產物對相應害蟲有毒性)；通過避免植物疾病和抑制雜草生長(使用抗除草劑基因)和通過引入外源基因在植物體內表達活性成份。這種應用可以通過應用本發明所述的原核核酸結合蛋白來實現，該蛋白可以將質粒DNA引入植物體中。
對於醫療應用中要進行運輸的分子物質(有治療作用的)，例如，DNA可被用來編碼細胞內或細胞外作用蛋白。因而，這種具有治療作用的DNA是以單鏈或雙鏈形式導入細胞的。同樣地，參考原核蛋白與具有治療作用的單鏈DNA分子雜交形成特異複合物的過程，也可以想到序列特異性寡核苷酸與原核蛋白進行偶聯；這將用特異性結合代替上述非特異性核酸結合。用於治療活性物質轉移的另一個出發點是與核酶形成複合物，核酶具有用於病理條件相關RNA的特異識別序列。通過與核酶結合，RNA被酶解失活。
作為一種不用核酸的另一方案，治療也可通過將蛋白或肽類分子導入細胞進行。例如，一種免疫缺陷性病毒(HIV)的治療方法是基於根據本發明導入的轉顯性(修飾的)蛋白，該蛋白然後將與細胞中的天然HIV蛋白競爭，從而抑制其功能。同樣地，肽或人工合成的修飾肽可以抑制某種HIV蛋白的作用，例如，HIV蛋白酶的作用。另外，蛋白或肽可以與原核蛋白以這種方式直接融合，以致HIV蛋白酶的序列或細胞內蛋白酶的識別序列位於治療活性物質和原核轉運蛋白之間，從而在細胞內(如果可能，在感染細胞中也有特異性)將此蛋白或肽予以釋放。這就可以起到特異(治療)作用確定的施加於某種細胞類型，其中所用的原核蛋白將僅僅表現為穿過細胞的運輸工具。
本發明的另一種應用是在惡性腫瘤疾病中使用抗腫瘤活性物質。要實現這一作用，形成的複合物中必須有保證活性物質進入腫瘤組織的成分。根據不同的腫瘤類型，舉例來說，可以利用構建在活性物質/蛋白複合物中的抗體來實現，該抗體能與只在腫瘤細胞上存在或儘可能只在腫瘤細胞上存在的腫瘤抗原結合。實體瘤需要充足的血液供應，因而分泌具有促進腫瘤組織中新血管形成作用的生長因子。新生血管上皮細胞不斷增強質膜結合整連蛋白的表達。這些受體專一性識別RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列，引起對含有RGD序列配體的受體介導胞吞作用。這種特性可以通過利用含有暴露RGD序列的肽與原核轉運蛋白的融合用於定位腫瘤細胞和與其聯繫的上皮組織，從而引起治療物質被吸收進入腫瘤組織。其他腫瘤在細胞表面顯示出明顯較高的自然EGF受體。在這樣情況下，提議本身表明通過如後面實施例6所述那樣將EGF結構域與原核轉運蛋白融合，就可以實現對本發明所述的複合體的專一性吸收。不同受體結合特性的結合，除了提高組織專一性以外，還實現了一種治療方案，該方案同時襲擊腫瘤的幾個方面並且降低了腫瘤細胞對活性物質的耐受性的形成。對於活性物質，可以使用包括單鏈和雙鏈DNA或RNA的核酸。例如，它們所編碼的蛋白可以通過參與細胞信號傳導級聯的個別時間點從而誘發細胞調亡。為擴大腫瘤專一性因而產生更大的確定性，可以使用優先在在腫瘤細胞中具有活性的轉錄起動子。使用同樣方法，抑制基質金屬蛋白酶活性的肽可被用作欲運輸的分子物質。一些短肽序列對於MMP-2和MMO-9的抑制作用尤為明顯。
原則上，此處所述發明還可應用於矯正先天性遺傳缺陷，例如腺苷脫氨酶-缺陷症，血友病，假肥大型肌營養不良和囊腫性纖維化。這些疾病是單因性疾病，即，由單個基因缺陷造成。通常，導入該基因的正確形式足以消除或減輕這種疾病的症狀。對於這些應用，必須通過穩定的染色體外載體或者通過整合到細胞內染色體上的治療性DNA實現穩定的基因表達。對於這種情況，被轉移核酸可以包含有利於整合作用的核酸序列。例如，可以使用其尾部帶有腺病毒末端反向重複序列(ITR)的單鏈DNA，該序列在染色體整合中起作用。並且，除了治療性的DNA或RNA以外，還可以將蛋白一起運輸進細胞該蛋白可以積極地作為整合的催化劑發揮作用，例如HIV整合酶或腺病毒的Rep78和Rep68。
理想狀態下，修正基因的表達是在自然啟動子的控制下發生，以便同時確保合適的調控。所以，DNA和原核核酸結合蛋白複合物的細胞類型專一性靶向指向在大多情況下是不必要的。例如，對於血友病患者而言，血液凝固級聯中缺乏的因子可以在肌肉組織中合成，其中這些因子是與合適的信號序列融合的，從而引起它們從細胞中被分泌出來，併到達它們的活性部位，即血流。
除了上述實施例中討論的核酸以外，激發調亡或壞死的蛋白質或肽也可以被轉移例如，細菌毒素(如，白喉毒素、霍亂毒素、肉毒桿菌毒素等)的催化活性結構域是合適的，該結構域具有高效抑制細胞內蛋白生物合成的作用，因而會激發壞死過程。所以，這種方法具有隻需很少幾種分子就可以殺死細胞的優勢。另一種治療性的出發點是將單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶轉運進腫瘤細胞。此酶可以將核苷酸模塊磷酸化，因而表現出對細胞激酶的降低的底物專一性，也使人工核苷酸例如9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌啉被磷酸化。在DNA複製出新合成的DNA鏈的過程中，磷酸化9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌啉也會整合進去，從而導致DNA複製終止，而複製終止反過來阻止了細胞分裂。
在實際應用的多種情形中，轉運物質在細胞內的有效釋放是必須的，即，物質必須成功地通過內體膜。在下面列舉的實施例中，，內體釋放是非限制因素，因為基因表達或蛋白轉運(參見實施例7，採用綠色螢光蛋白(GFP)作為標誌蛋白)是高效進行的。如果經由被吸收複合物的內體包含物則會發生限制，那麼這一功能可以通過導入被轉移複合體的溶血素，特別是巰基激活溶細胞素，細菌毒素的轉運結構域，或某種病毒蛋白例如如腺病毒亞單位蛋白來實現。此外，這種功能也可以通過在複合物上結合的化學物質，如多聚陽離子或樹狀體來承擔。
通常，在體內應用中，有必要儘可能地降低被吸收複合物的免疫原性。複合物本身的體液免疫源性及巨噬細胞的識別和消除作用可以通過如下面的實施例9所示的聚乙二醇掩蔽或脂雙層包裝來實現。例如，聚乙烯可以被化學修飾使其與特定巰基共價結合。通過與含有35至40個GA(甘氨酸-丙氨酸)的重複序列的融合，可以降低治療性活性物質的免疫源性，即直接導入的蛋白或轉錄和/或翻譯的蛋白。富GA序列自然存在於人埃-巴二氏病毒(EB病毒)的EBNA1蛋白中，保護該病毒蛋白不被細胞細胞蛋白酶體降解和不在主要組織相容性複合物受體上呈遞。這種保護機制適用於本發明涉及的多種蛋白質和肽。
除了核酸、蛋白質和肽以外，其他分子種類也適用於本發明所述的將分子物質轉移進細胞的方法。所以，肽衍生物，肽類抗生素，具有修飾側鏈的蛋白如進行了螢光標記、脂環基化、乙醯化的蛋白，與糖、核酸或脂類成分偶聯的肽或蛋白和類似變體均可以用同樣方式整合進複合物。同樣地，除了通常使用的編碼(雙鏈)質粒以外，單鏈DNA、單鏈或雙鏈RNA、染色體DNA或染色體片段、反意RNA、核酶、催化活性RNA、核苷酸、人工合成核酸，如肽核酸(PNA)或其雜交分子也可以與原核轉運蛋白結合，該結合是通過與該蛋白的核酸結合部位的相互作用或或化學方式實現。它們均適合於高效地被吸收進入。同樣地，欲運輸的非核酸樣物質，特別是蛋白質，例如抗體、抗體類似物、蛋白結構域、糖蛋白、酶、肽、肽激素、基於胺基酸的藥物活性成分、脂蛋白以及結構蛋白均在本發明的應用領域內。
被轉運物質與原核轉運蛋白的化合物可以看作具有不同的物理相互作用。因而，疏水作用是形成複合物的主要作用力。但是其他形式的相互作用對化合物的形成也均有貢獻，例如離子相互作用、離子偶極相互作用、偶極-偶極相互作用、氫鍵、範德華力、色散力。最後，除了列舉的非共價化合物的實施例以外，被轉運物質和原核轉化蛋白的共價化合物也可被產生。由此，或者進行基因水平的融合或者在作用成分的兩個原子間形成化學性質上穩定的原子鍵。
總之，本發明所述的轉移方法與目前的技術水平相比表現出如下優點●與現有方法相比具有明顯更高的效率；●沒有或僅有極微弱毒性；●體內應用時，沒有或僅有很小的免疫原性；●生產和保存都有成本效益；●使用方法不複雜且快速；●可以轉移任意化學形式的核酸；●可以轉移其他通過共價或非共價結合的含胺基酸的物質，如蛋白質或肽；●很大程度上對靶細胞沒有限制(例如，本方法同樣適用於真核動物細胞、真核植物細胞和原核細胞)
●存在採用多種組成成份和另外粘附(融合)效應物的可能性或者存在整合更多便於細胞吸收的有益特性的包裝及輔助可能性。
下面的實施例用於說明本發明的應用，但是，它們並非局限本發明的保護範圍。
說明書和實施例均參考以下附圖。
圖1、是本發明，即核酸轉運，的可能應用方法的概要圖示。TmHU-蛋白(Y)指引了線性或環狀核酸的濃縮。形成的蛋白/核酸複合物隨後被細胞吸收(左圖)。對於另外形式，例如，由受體指引的吸收(中圖)或包裝蛋白/核酸複合物可以發生(右圖)。圖2、顯示用SDS-PAGE對在大腸桿菌中重組生產的TmHU蛋白的純化分析結果。泳道1上樣為大腸桿菌的細胞提取物中的可溶性部分。泳道2上樣為熱沉澱後的上清。泳道3上樣為分子量標準(分子大小在圖左側標出)；泳道4上樣為經陽離子交換柱純化後的洗脫物。本蛋白經過不是很複雜的少數幾個純化步驟即可達到很高的純度。圖3、顯示結果為天然及純化後TmHU蛋白的分光特性。蛋白(濃度為0.5mg/ml)在280或260納米處沒有紫外吸收說明沒有異源蛋白或核酸的汙染；因而說明製劑非常純淨。該蛋白沒有酪氨酸和色氨酸殘基，因而在特定的紫外區是透光的。和預測一致，該蛋白亞基中的3個苯丙氨酸殘基在257納米處有弱吸收。圖4、顯示用表面等離子共振法檢測TmHU蛋白與不同大小的DNA片段的結合。(●)，56bp雙鏈DNA片段，(一)當解離常數KD為73nM，希爾(Hill)係數為7.6時，希爾方程的計算值。(○)，23bp雙鏈DNA片段，(---)當解離常數KD為73nM，希爾係數為1.3時，希爾方程的計算值。蛋白與DNA的結合相當地強烈，對於通常大小的DNA片段(＞＞23bp)表現出高度的協作性。圖5、顯示典型DNA分子在受到核酸酶降解前的保護情況。使用了多種濃度的不同濃縮劑。泳道1，分子量標準；泳道2-4，TmHU(0.3，3，和15μg)；泳道5-7，組蛋白(0.3，3，30μg)；泳道8，分子量標準；泳道9-11，CTAB(5，10，100μM)；泳道12-14，亞精胺(10，100，2000μM)。在非常嚴格的條件下，未保護的DNA完全被降解，CTAB和亞精胺因此幾乎沒有提供防止降解的任何保護作用。組蛋白提供了略好的保護作用，而TmHU在本比較中提供了防止降解的最佳保護效果。圖6、顯示TmHU法與標準方法(DEAE-葡聚糖轉染法)對比在不同細胞系中的轉染效率。左側，TmHU法轉染人293T細胞；轉染效率約50％。中間，TmHU法轉染鼠NIH3T3細胞；轉染效率約30％。右側，用DEAE-葡聚糖法轉染鼠NIH3T3細胞，轉染效率達到約10％。圖7、顯示採用實施例5所述方法，TmHU對NIH3T3細胞的轉染效率。據此形成的一個細胞培養孔的兩個不同部分顯示於此；顯微鏡的放大倍數為20。轉染事件的產量經計算約為每微克所用DNA產生2500個陽性細胞。圖8、顯示證明將TmHU-EGF融合蛋白吸收進細胞表面表達作為腫瘤標誌的EGF受體的人A431細胞的蛋白質印跡實驗(Western Blot)結果。左圖溫育並吸收了TmHU-EGF融合蛋白的細胞裂解產物中的蛋白質Western Blot檢測結果。泳道1，用TmHU-EGF進行轉染；泳道2，用TmHU-EGF/DNA複合物轉染；泳道3，作為抗EGF抗體的專一性的檢測對照的未轉染A431細胞的裂解產物；泳道4，TmHU-EGF融合蛋白(標準品)；泳道5，分子量標準的記號。右圖在轉染過程中，細胞上清液中TmHU-EGF消失的時間進程；用Western Blot證明。泳道1-7轉染中加入DNA保溫；泳道A至G轉染中不加入DNA保溫。泳道1，TmHU-EGF對比標準；泳道2，，0分鐘；泳道3，，30分鐘；泳道4，，60分鐘；泳道5，，90分鐘；泳道6，，120分鐘；泳道7，，七小時，泳道A，，0分鐘；泳道B，30分鐘；泳道C，60分鐘；泳道D，90分鐘；泳道E，120分鐘；泳道F，七小時。可以很清楚的觀察到TmHU被吸收進入細胞，其中通過形成TmHU-EGF/DNA複合物產生比沒有形成此複合物更加有效的吸收過程。圖9、顯示NIT 3T3細胞的轉染培養皿的一部分的相差圖象(上)和螢光條件下的顯微圖形(下)。細胞在培養基中溫育五小時後用PBS洗滌。發出綠色螢光的細胞包含通過TmHU吸收機制已經吸收進細胞的TmHU-GFP融合蛋白。圖10、用實施例的方式顯示已用脂質體包裹的TmHU/DNA複合物轉染的NIT 3T3細胞的兩種細胞培養物。在兩種沉積物中，可記錄到大量的陽性轉化細胞，該細胞表達報告基因，從而在檢測實驗中表現藍色。
實施例1、源於海棲熱袍菌的HU蛋白的克隆、在大腸桿菌中重組表達和純化根據現有技術水平，已知克隆化DNA序列可以在原核宿主細胞中異源表達。採用標準技術(參見，Sambrook等，分子克隆實驗指南(Molecular CloningALaboratory Manual)，1989，冷泉港實驗室出版社)，使用寡核苷酸引物TmHU-N 5』-GGG GGT CAT ATG AAC AAA AAA GAA CTG ATC GAC AGG GTGG-3』TmHU-C 5』-TTC CGG ATC CCT ATC ACT TGA CCT TCT CTT TGA GGG C-3』以來自生物海棲熱袍菌的基因組DNA為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增得到300bp的片段並克隆進原核表達載體pETlla(Novagen公司產品)。用質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene公司產品)並用抗青黴素LB瓊脂平板篩選後，用單菌落接種預備的、含氨苄青黴素100μg/ml的LB培養基，於37℃搖床培養過夜。搖好的菌液按比例1∶100稀釋接種於含有同樣基質類型的主培養基中。主培養物在37℃搖床中繼續培養，直到細菌懸濁液的光吸收值在600nm達到1.0。然後向培養液中加入終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導海棲熱袍菌的HU基因(TmHU)的表達。隨後繼續培養90分鐘，離心(6000g，15分鐘，4℃)收集菌體後用重懸緩衝液(配方組成50mM磷酸鈉；pH7.5；300mM氯化納；5mM EDTA；1mM PMSF)重懸細胞，然後高壓均漿破碎細胞。TmHU蛋白完全存在於細胞裂解液的可溶相中。加入Benzonase(Merk公司產品)後，於室溫將此細胞裂解液溫育1小時，使源於宿主生物的令人厭惡的核酸(DNA和RNA)被酶解除去。
離心(50000g，1小時，4℃)將可溶相從不溶成分中分離出來，上清80℃加熱20分鐘。這樣處理後，宿主蛋白大部分將會熱變性並在隨後冷卻過程中形成不溶性沉澱被去除。再次經50 000g離心，熱穩定的TmHU蛋白被進一步富集、純化於上清(圖2)。
在最後一次離心之後，上清通過Poros HS型號(Perseptive Biosystems產品)的陽離子交換色譜柱進一步純化。在重懸緩衝液條件下，TmHU蛋白可以和陽離子交換柱牢固結合。通過改變氯化納鹽離子濃度從300mM至2000mM進行線性梯度洗脫，TmHU蛋白可從色譜柱上被單獨洗脫下來，而雜質仍然保留在交換柱上。圖2通過18％SDS-聚丙烯醯胺凝膠分析顯示了各步驟的純化效果。採用如上所述方法，可以得到在天然狀態下保持二聚體的TmHU蛋白的光譜分析純形式(純度高於95％，如圖3)，收率為大約(簡單培養法)每升大腸桿菌培養液20mg。實施例2、TmHU蛋白的核酸結合特性的證據通過兩對偶聯生物素的引物，用PCR擴增出兩長度分別為56bp和23bp的DNA片段，並將獲得的雙鏈DNA固定在鏈黴親和素晶片上。使用BIACore設備(Amersham Pharmacia Biotech公司產品)確定的表面等離子共振值(SPR)，可以直接檢測TmHU蛋白與各自固定化DNA的結合(圖4)。
因而，不同濃度的、存在於包含50mM磷酸鈉，pH7.5和100mM氯化納的緩衝液中的TmHU蛋白加至DNA晶片的流動池中，記錄SPR信號。信號的平穩值正比於與TmHU蛋白結合的數量。根據希爾方程，將SPR信號對所用TmHU蛋白的濃度作圖，就可以得到一個S形曲線(圖4)，其中，在使用56bp片段的情形中，表現出相對較高的相互結合作用。所以，兩條曲線的轉變中點，定義為解離常數KD，在兩種情況下均在TmHU蛋白濃度為73nM處。實施例3、保護核酸不被核酸酶降解將1μg的環狀質粒DNA(pEGFP-N1，Clontech公司產品)溶於120μl樣品緩衝液(20mM HEPES，pH7.2，100mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2)，再與TmHU蛋白、人組蛋白(Sigma公司產品)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，Amresco公司產品)及亞精胺(Sigma公司產品)混合，其中每種物質均有三種不同濃度。在室溫中溫育1小時隨，隨後加入5單位Benzonase(Merk公司產品)。在室溫中溫育30分鐘後，樣品中再加入終濃度為0.5％的SDS、20mM的EDTA，然後用酚/氯仿抽提核酸，再用乙醇從水相中沉澱核酸。隨後，在用1％瓊脂糖凝膠介導將DNA用敏感染料SYBR Gold(Molecular Probes公司產品)標記後，對核酸不被核酸酶降解的保護情況進行分析(圖5)。在本實施例中，TmHU保護DNA不被核酸酶酶解的能力相當明顯。而低分子物質(CTAB和亞精胺)僅對核酸酶降解起到微弱的保護作用；如果使用了真核組蛋白，這種保護作用會明顯提高(圖5)。然而，在其他實驗條件相同的情況下，只有使用原核TmHU蛋白時，才實現了防止核酸不被核酸酶降解的明顯保護。沒有保護的DNA將會在實驗條件下被完全降解。
保護核酸不被核酸酶降解對於最優化轉移效率至關重要，因為在含有血清的培養基以及部分地在靶細胞中，核酸會招致核酸酶的降解。本實施例進一步解釋這種原核蛋白比真核組蛋白在這一方面具有明顯的優點，其原因大概是真核生物的特點，即核酸組蛋白缺少重複結構所致，因為這有利於結合部位的裂解。這種防止降解的保護機制是本發明所述方法的一個非常有利的特性。因而，這種保護也可以用於體內質粒生產，以便達到較高產量，例如，在細菌體內。實施例4、真核細胞的轉染將300μl的TmHU蛋白溶液(0.5mg/ml)和6μl質粒DNA(24μg編碼標記蛋白β-半乳糖苷酶的pCMV-β)一起於室溫下溫育1小時。隨後，將混合物加入具有半匯合鼠NIH 3T3細胞或人293T細胞的培養基中(60mm的細胞培養皿內)。將培養皿在37℃含5％CO2的培養箱中微搖培養兩天，這段時間不補入新的培養基。這樣，蛋白與核酸在附著細胞上就會形成沉澱。並且，在這段時間裡，蛋白/核酸複合物被細胞吸收。48小時後，使用β-半乳糖苷酶的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)來標記轉化細胞，確定標記細胞(轉染細胞)對未標記細胞(未轉染細胞)的比例。通過二者的比例，可以計算出轉染效率。
並且，為了達到效果，進行了對照轉染，其中在轉染混合物中，依次或是缺乏核酸或是TmHU蛋白(陰性對照)。為了對比決定有效性，按照廠商的使用說明，使用DEAE-葡聚糖(Stratagene公司的哺乳動物轉染試劑盒)平行地進行最適條件轉染(陽性對照)。與預期一致，每種情況下，陰性對照顯示沒有標記細胞，所以，沒有發生轉染。對於陽性對照(DEAE-葡聚糖轉染)，培養皿中最多有10％的細胞被標記(參見圖6)；這在文獻報導的、本方法轉染效率的大小範圍之內。用DEAE-葡聚糖法進行人293T細胞轉染沒有成功，因為這種方法使僅僅只有弱附著的細胞會脫落。與此相反，用TmHU蛋白對兩種細胞系的轉染均沒有遇到問題；沒有觀察到293T細胞的脫落。在基於TmHU的轉染中，每種情況的轉染效率分別達到30％(鼠NIH 3T3細胞)，50％(人293T細胞)。因而，與標準系統相比，可觀察到細胞轉染效率的明顯提高(參見圖6)。通過最優化，似乎可能進一步提高轉染產量。直到固定細胞(致死的)進行X-Gal標記為止，也沒有觀察到TmHU轉染對細胞存活和生長的負面影響；；因而，TmHU不具有細胞毒性。實施例5、另一種真核細胞轉染方法將100μl用pH7.0的磷酸鹽緩衝液溶解的TmHU溶液(0.5mg/ml)和1μl質粒DNA(4μg編碼標記蛋白β-半乳糖苷酶的pCMV-β)溶液及10μl 20mM的CaCl2溶液混合，於95℃保溫40分鐘。冷卻至室溫後溫育20分鐘，隨後加入350μl含10％FBS的DMEM培養液，然後加入12孔板的小孔中。每個孔提前16小時接種50000個NIH 3T3細胞，並在加入上述培養基之前去除細胞。輕輕搖晃之後，培養皿於37℃含50％CO2的培養箱中培養12小時。然後，用1ml新鮮的完全培養液(含有10％FBS的DMEM)改換培養基，細胞繼續培養36小時。此時如實施例4所述進行β-半乳糖苷酶的表達測試，並藉助目鏡網格計數細胞。典型情況下，使用這種方法每孔可以獲得10000個陽性細胞(參見，圖7中的實施例)。如果不在轉染混合物中加入TmHU蛋白而進行所述方法(作為標準磷酸鈣轉染方法的效率對照組參與比較)，產量大概是10個轉化細胞，產量降低因子是103。本實施例轉染事件的產量為每微克DNA約得到2500個陽性細胞，其效率大概比DEAE-葡聚糖轉染法約(每微克DNA產生約300至400個轉染事件)高5至10倍。實施例6、用TmHU-EGF說明修飾蛋白的應用TmHU-EGF是一種來自TmHU和人表皮生長因子(EGF)的融合蛋白，其中人表皮生長因子(EGF)將有利於複合物被表面帶有EGF受體的靶細胞的吸收，如這裡所用的人A431細胞(參見，E.J.Meuillet等，在表皮樣癌細胞系A431中，通過轉染唾液酸酶基因提高表皮生長因子受體的活性，癌症研究(Cancer Res.)1999，Vol.59，234-240)。依照實施例1所述的標準方法，融合蛋白是通過SacI限制位點克隆進實施例1指定的表達載體pETlla中後產生的。100μl的TmHU-EGF蛋白溶液(0.5mg/ml)和8μgpCMV-β質粒溫育1小時，根據實施例4中的說明，將形成的TmHU-EGF/DNA複合物加入半匯合鼠NIH 3T3細胞的培養基中。作為對照，將100μl未加DNA的TmHU-EGF溶液直接加入同樣處理的細胞中。並且，在陰性對照中，準備未加TmHU-EGF的半匯合細胞培養皿。
將每種細胞在冰上培養2小時，用預冷的磷酸緩衝鹽溶液(PBS緩衝液)洗滌後，在37℃培養45分鐘。將細胞上的培養液去除，加入用於分離未內部化的複合體和附著細胞的胰蛋白酶/EDTA溶液。胰蛋白酶的消化作用通過加入含有牛胎兒血清(FCS)的培養液而終止，重懸細胞用預冷的PBS緩衝液洗滌三次。最後一次洗滌後，以100μl的PBS緩衝液重懸細胞，再與100μl的4％SDS和2mM PMSF混合，劇烈混勻後立即於95℃保溫10分鐘。這樣獲得的細胞裂解液可上樣於15％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠上及並用蛋白印跡電泳分析(第一抗體兔抗EGF多克隆抗體，Santa Cruz公司產品；第二抗體偶聯辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG抗體，BioRad公司產品)。
在特異性的蛋白印跡中(圖8，左圖)，該蛋白作為裂解液組中特異帶而被證實，其中該裂解液已同TmHU-EGF嵌合體蛋白溫育過；在未與TmHU-EGF溫育的細胞裂解液組中則檢測不到這些帶。這表明TmHU-EGF蛋白可以進入A431細胞，並且這一吸收過程可以通過特異的蛋白印跡予以證實。在本實驗中，這種吸收與是否存在DNA無關，但是存在DNA時，可使這種吸收更為有效；這一結論受到了與上述轉染實驗類似的第二個實驗的支持(圖8，右圖)。這裡，TmHU-EGF嵌合體蛋白進入A431靶細胞的吸收量是通過檢測細胞上的培養基中TmHU數量降低來進行的。這裡同樣明確表明，含有DNA的TmHU-EGF比不含DNA的對照實驗組從細胞殘餘物中減少的更快。實施例7、用TmHU-GFP說明修飾蛋白的應用TmHU-GFP是一種由TmHU與深海水母Aequorea victoria的綠色螢光蛋白(GFP)形成的融合蛋白，這種螢光蛋白具有不要輔助因子就可發出螢光的顯著特性，即，，僅憑自身的三級結構就可發出螢光。帶有GFP的融合結構常常保持該天然蛋白的螢光。本實施例中，GFP通過接頭肽與TmHU的C末端融合。這種融合是在DNA水平進行的；採用基因技術的標準方法，從Clontech公司pEGFP-N1載體上切下GFP基因及相接的接頭，把它插入TmHU基因的3』端。TmHU-GFP蛋白的純化與實施例1中的TmHU的純化類似，通過陽離子交換色譜法進行。融合蛋白可以溶液形式高效純化。
TmHU-GFP蛋白可發出帶綠色的螢光，僅是GFP部分本身發出的。同樣地，DNA與此融合蛋白結合後仍然具有此完整功能，若將高分子DNA加入該蛋白溶液，隨後離心，TmHU-GFP蛋白與DNA就會共沉澱，表現為帶綠色的螢光複合物。因而，可以知道融合結構的兩個部在功能上完整無缺。這再次確證了這樣的事實，即，本系統可以很容易在基因水平上進行修改，且TmHU的結構是一種適合以融合結構的形式形成多種變體的穩定結構。對於本變體TmHU-GFP，現在就可以在真核細胞內進行吸收研究了，而不需固定細胞。為達到效果，用PBS緩衝液洗滌培養NIH 3T3細胞的2cm培養皿，然後加入50μl用PBS緩衝液配製的TmHU-GFP溶液(0.1mg/ml)。短時搖動後，將培養皿於37℃、5％CO2的培養箱中培養5小時。隨後，經PBS緩衝液洗滌3次後，用螢光顯微鏡和數位相機照相拍攝GFP螢光照片。在圖9中，人們可以清楚的看到螢光條件下細胞的輪廓(下圖)和作為對比的同一部分的相差曝光照片(上圖)。這些結果表明了這一事實，即這種融合結構可以被高效地吸收進細胞，以至於沒有出現個體小泡如溶酶體的聚集和積累，而是這種融合蛋白充滿了整個胞質溶膠。
由文獻已知，這種細胞吸收作用不是由GFP引起的；因而，這種作用歸功於融合結構中的TmHU部分。
所以，這個實施例說明了原核生物的組蛋白類似蛋白，如TmHU蛋白，可以高效地被吸收進細胞，因而並不在溶酶體中積累而是分散於胞質溶膠中。這種吸收特性可以解釋TmHU蛋白的高基因轉移率。因而，細胞的有效吸收和從內體和其他細胞區室中釋放的潛能能促成較高轉染效率。另外，本實施例還說明吸附或融合了TmHU的蛋白質(例如，也是治療相關蛋白)將會通過TmHU被高效導入真核細胞。所以，TmHU蛋白作為融合蛋白穿過細胞膜的運輸工具而起作用。實施例8、利用源於大腸桿菌的HU蛋白(EcoHU)進行轉染100μl的EcoHU蛋白(源於大腸桿菌的HU蛋白)溶液，0.5mg/ml和1μl質粒溶液(4mg/ml，編碼β-半乳糖苷酶)混合，於95℃保溫40分鐘，然後在室溫溫育20分鐘。混合物用350μl含10％FBS及1％PS的DMEM培養液淘洗後用於NIH 3T3細胞(12孔板的每個孔含有50000個細胞)。培養兩天後，檢測細胞培養物的β-半乳糖苷酶的表達。在此條件下，104個細胞顯示表達了β-半乳糖苷酶。這是一個比類似條件下使用TmHU蛋白(約600個陽性轉化細胞)顯著要底的產量。此實施例說明對本發明所設定條件下的轉染原則上也可以使用其他細菌的組蛋白類似蛋白，本例中使用了嗜常溫細菌。實施例9、用脂質體包裹TmHU-DNA複合物並用這種脂質體-TmHU-DNA複合物進行轉染一種比較新的真核細胞基因轉移方法包括將DNA包裹入陽離子脂質體泡囊的過程，該結構然後與細胞膜融合，並以這種方式將DNA導入細胞。然而，這種方法導致了比最初設想較低的產量，因為在有效吸收進細胞後，這些脂質體泡囊通常積累在內體中，而不能產生把DNA轉移進細胞質以及進一步運輸進細胞核。在本實施例中，研究了是否可將脂質體指引轉染與TmHU指引轉染可被結合起來產生協同作用。
首先，按照廠商使用說明，使用Tfx-50試劑(Promega公司產品)作轉染。這裡，陽性電荷(脂質體)與陰性電荷(DNA)的電荷比為2∶1時，效率最高(按照廠商說明書進行最優化)。利用這種方法，將80％的匯合接種NIH 3T3細胞用1μg質粒DNA(pCMV-β)，3μl的Tfx-50試劑和200μl的DMEM進行轉染。在溫育1小時後加入1ml完全培養基(含10％FBS的DMEM)。每微克DNA平均可獲得3 300個陽性(轉化)細胞。這樣的轉染效率與最優化的TmHU轉染法處於同一數量級(參見實施例5)。
然後，將不同量的TmHU蛋白與不同量的脂質體配合進行轉染實驗。得到最佳轉染結果的條件如下，1μg DNA與12.5μl的TmHU蛋白溶液(0.5mg/ml)溫育1小時，電荷比為4∶1(為脂質體DNA)，(4.5μl的脂質體懸液、12.5μl的TmHU蛋白溶液和1μg DNA，轉染溶液體系為200μl)。每微克所用DNA產生的陽性細胞數兩增加到平均16000個轉化細胞的水平。所以，，利用TmHU-脂質體結合方法的產量大約比脂質體或TmHU蛋白各自單獨使用的最適方法均高出了5至6倍。這種形式轉化細胞的兩個實施例顯示在圖10中。
雖然在本實驗中不能排除TmHU指引的轉染與脂質體指引的轉染相互平行發生，但是，在每個情形中，可以觀察到明顯的協同效應，因為以此達到的效果顯著高於各自作用單獨相加(尤其是，從脂質體轉染法和TmHU轉染法的角度來看，對所做實驗而言，存在的條件比最適工作條件低)。因而，對高的轉染效率的最可能解釋在於，形成的TmHU-DNA複合物被包入利用脂質轉染試劑形成的脂質體中，或至少部分地被包入。用脂質體膜對TmHU-DNA複合物進行包裹的方法同樣與標準方法諸如DEAE-葡聚糖轉染比較具有明顯更高的效率。
P12603序列序列列表110ACGT前基因組公司(ACGT ProGenomics AG)120由原核核酸結合蛋白介導的分子物質轉移法130P12603140由原核核酸結合蛋白介導的分子物質轉移法1412000-11-03150PCT/EP00/108751512000-11-03150DE 199 52 983.31511999-11-031607170PatentIn version 3.12101211270212DNA213海棲熱袍菌220221CDS222(1)..(270)2234001atg aac aaa aaa gaa ctg atc gac agg gtg gcg aag aaa gca ggt gcg48Met Asn Lys Lys Glu Leu Ile Asp Arg Val Ala Lys Lys Ala Gly Ala1 5 10 15aag aaa aag gat gta aaa ttg att ctc gac acc atc ctt gaa acg atc96Lys Lys Lys Asp Val Lys Leu Ile Leu Asp Thr Ile Leu Glu Thr Ile20 25 30aca gaa gct ctc gca aag ggt gaa aag gtt cag atc gtt gga ttc gga144Thr Glu Ala Leu Ala Lys Gly Glu Lys Val Gln Ile Val Gly Phe Gly35 40 45agc ttc gaa gtg agg aag gcc gct gca aga aaa ggc gtg aat cct cag192Ser Phe Glu Val Arg Lys Ala Ala Ala Arg Lys Gly Val Asn Pro Gln50 55 60aca aga aaa ccc atc acc att ccc gaa aga aag gtc ccg aag ttc aaa240Thr Arg Lys Pro Ile Thr Ile Pro Glu Arg Lys Val Pro Lys Phe Lys65 70 75 80ccc gga aaa gcc ctc aaa gag aag gtc aag270Pro Gly Lys Ala Leu Lys Glu Lys Val Lys85 90210221190212PRT213海棲熱袍菌4002Met Asn Lys Lys Glu Leu Ile Asp Arg Val Ala Lys Lys Ala Gly Ala1 5 10 15Lys Lys Lys Asp Val Lys Leu Ile Leu Asp Thr Ile Leu Glu Thr Ile20 25 30Thr Glu Ala Leu Ala Lys Gly Glu Lys Val Gln Ile Val Gly Phe Gly35 40 45Ser Phe Glu Val Arg Lys Ala Ala Ala Arg Lys Gly Val Asn Pro Gln50 55 60Thr Arg Lys Pro Ile Thr Ile Pro Glu Arg Lys Val Pro Lys Phe Lys65 70 75 80Pro Gly Lys Ala Leu Lys Glu Lys Val Lys85 902103211468212DNA213人工序列220223表皮生長因子(EGF)與TmHU的融合蛋白220221CDS222(1)..(468)223220221misc_feature222(1)..(267)223融合蛋白的TmHU部分220221misc_feature222(289)..(468)223融合蛋白的EGF部分4003atg aac aaa aaa gaa ctg atc gac agg gtg gcg aag aaa gca ggt gcg48Met Asn Lys Lys Glu Leu Ile Asp Arg Val Ala Lys Lys Ala Gly Ala1 5 10 15aag aaa aag gat gta aaa ttg att ctc gac acc atc ctt gaa acg atc96Lys Lys Lys Asp Val Lys Leu Ile Leu Asp Thr Ile Leu Glu Thr Ile20 25 30aca gaa gct ctc gca aag ggt gaa aag gtt cag atc gtt gga ttc gga144Thr Glu Ala Leu Ala Lys Gly Glu 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15521052111014212DNA213人工序列220223TmHU與增強型綠色螢光蛋白(eGFP)的融合蛋白220221CDS222(1)..(1014)223220221misc_feature222(1)..(267)223融合蛋白的TmHU部分220221misc_feature222(297)..(1014)223融合蛋白的增強綠色螢光蛋白(eGFP)部分4005atg aac aaa aaa gaa ctg atc gac agg gtg gcg aag aaa gca ggt gcg48Met Asn Lys Lys Glu Leu Ile Asp Arg Val Ala Lys Lys Ala Gly Ala1 5 10 15aag aaa aag gat gta aaa ttg att ctc gac acc atc ctt gaa acg atc96Lys Lys Lys Asp Val Lys Leu Ile Leu Asp Thr Ile Leu Glu Thr Ile20 25 30aca gaa gct ctc gca aag ggt gaa aag gtt cag atc gtt gga ttc gga144Thr Glu Ala Leu Ala Lys Gly Glu Lys Val Gln Ile Val Gly Phe Gly35 40 45agc ttc gaa gtg agg aag gcc gct gca aga aaa ggc gtg aat cct cag192Ser Phe Glu Val Arg Lys Ala Ala Ala Arg Lys Gly Val Asn Pro Gln50 55 60aca aga aaa ccc atc acc att ccc gaa aga aag gtc ccg aag ttc aaa240Thr Arg Lys Pro Ile Thr Ile Pro Glu Arg Lys Val Pro Lys Phe Lys65 70 75 80ccc gga aaa gcc ctc aaa gag aag gtc ccg cgg gcc cgg gat cca ccg288Pro Gly Lys Ala Leu Lys Glu Lys Val Pro Arg Ala Arg Asp 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205cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag672Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu210 215 220ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag720Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys225 230 235 240ctg gag tac aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag768Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys245 250 255cag aag aac ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag816Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu260 265 270gac ggc agc gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc864Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile275 280 285ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag912Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln290 295 300tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg960Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu305 310 315 320ctg gag 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Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu145 150 155 160Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp165 170 175His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr180 185 190Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr195 200 205Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu210 215 220Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys225 230 235 240Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys245 250 255Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu260 265 270Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile275 280 285Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln290 295 300Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu305 310 315 320Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu325 330 335Tyr Lys210721190212PRT213大腸桿菌220221肽222(1)..(90)223大腸桿菌HU蛋白，α亞單位，基因庫編號1182564007Met Asn Lys Thr Gln Leu Ile Asp Val Ile Ala Glu Lys Ala Glu Leu1 5 10 15Ser Lys Thr Gln Ala Lys Ala Ala Leu Glu Ser Thr Leu Ala Ala Ile
20 25 30Thr Glu Ser Leu Lys Glu Gly Asp Ala Val Gln Leu Val Gly Phe Gly35 40 45Thr Phe Lys Val Asn His Arg Ala Glu Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln50 55 60Thr Gly Lys Glu Ile Lys Ile Ala Ala Ala Asn Val Pro Ala Phe Val65 70 75 80Ser Gly Lys Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys85 90
權利要求
1.一種用於將核酸和/或核酸類似物，和/或多種核酸和/或多種核酸類似物和/或含胺基酸物質轉移進入原核或真核細胞的方法，其中●被轉移的核酸或核酸類似物，或多種核酸或多種核酸類似物，或含胺基酸物質與原核核酸結合蛋白接觸，以便形成核酸，核酸類似物或多種核酸，多種核酸類似物及含胺基酸物質與此種原核核酸結合蛋白的複合物，和●隨後，這種由核酸、核酸類似物和/或多種核酸或多種核酸類似物及含胺基酸物質與原核核酸結合蛋白形成的複合物與原核或真核靶細胞接觸，以便實現該複合物轉移進細胞的過程。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於單鏈或雙鏈DNA、單鏈或雙鏈RNA、質粒形式的DNA、染色體片段、反義RNA、核酶、具有催化功能的RNA、核苷酸、染色體DNA或編碼的mRNA作為核酸被轉移。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於使用帶有一個編碼序列的DNA作為轉移核酸，其在靶細胞中進行表達。
4.根據前述權利要求中的一項或幾項所述的方法，其特徵在於用於轉移的核酸通過與這種原核核酸結合蛋白接觸從而被壓縮並受保護而不被降解。
5.根據權利要求1中所述的方法，其特徵在於核酸類似物PNA(肽核酸，PeptideNucleic Acid)被用於轉移。
6.根據權利要求1至5一項或幾項所述的方法，其特徵在於這種由核酸、核酸類似物與核酸結合蛋白所形成的複合物是可逆的。
7.根據權利要求1至5一項或幾項所述的方法，用於將DNA轉移進植物細胞或動物細胞或人細胞。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於蛋白質、肽、肽類激素、酶、蛋白結構域、糖蛋白、基於胺基酸的藥物活性化合物或脂蛋白作為含胺基酸物質，用以轉移。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於含胺基酸物質與核酸結合蛋白間的複合物形成是通過共價鍵或非共價鍵發生的。
10.根據權利要求8或9中所述的方法，其特徵在於綠色螢光蛋白(GFP)作為含胺基酸物質用於轉移。
11.根據前述權利要求中的一項或幾項所述的方法，其特徵在於原核核酸結合蛋白源於嗜冷，嗜溫，嗜熱和極端嗜熱生物。
12.根據前述權利要求中的一項或幾項所述的方法，其特徵在於作為原核核酸結合蛋白使用的蛋白有TmHU(海棲熱袍菌HU-蛋白)，Sso7d(源自硫磺礦硫化葉菌和嗜酸熱硫化葉菌)，Ssh7(源自希氏硫化葉菌)，Sac7d(源自硫磺礦硫化葉菌和嗜酸熱硫化葉菌)，BstHU(源自嗜熱脂肪芽孢桿菌)，冷休克蛋白(CSP-cold shock protein)(源自海棲熱袍菌)，HU(源自大腸桿菌)，IHF(源自大腸桿菌)，DNA結合蛋白I和II(源自大腸桿菌)，BsuHU(源自枯草芽孢桿菌)，SaHU(源自嗜酸熱硫化葉菌)，BbuHU(源自布氏疏螺旋體)，BgaHU(源自嘎氏疏螺旋體)，BafHU(源自阿氏疏螺旋體)，Hcl(源自沙眼衣原體)，AlgP(源自銅綠假單胞菌)，IHF(源自銅綠假單胞菌)，DNA-結合蛋白(衣原體亞種)，nifA，ntrC(源自肺炎克雷氏菌)，Hsa(源自金黃色葡萄球菌)，ORF99(源自雞敗血枝原體)，R1HU(源自豌豆根瘤菌)，HSl(源自淺青紫鏈黴菌)，HCj(源自空腸彎曲感菌)，HU(源自熱溶芽孢桿菌)，HU(源自熱堅芽孢感菌)，HU(源自枯草芽孢桿菌)，HCc(源自新月柄桿菌)，DNA-結合蛋白(源自耐放射性異常球菌)，HSa(源自嗜酸熱硫化葉菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自格氏鏈球菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自變異鏈球菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自釀膿鏈球菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自唾液鏈球菌嗜熱亞種)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自流感嗜血菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自單核細胞增生利斯特氏菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自粘質沙雷氏菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自鼠傷寒沙門氏菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自水生棲熱菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自苜蓿中華根瘤菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自惡臭假單胞菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自結核桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自麻風桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自運動發酵單胞菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自假結核耶爾森氏菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自牛分枝桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自豬肺炎枝原體)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自恥垢分枝桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自幽門螺桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自aeolicus產液菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自根癌土壤桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自銅綠假單胞菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自幽門螺桿菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自野油菜黃單胞菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自解蛋白弧菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自淺青紫鏈黴菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自普氏立克次氏體)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自天藍色鏈球菌)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自山羊枝原體)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自布氏疏螺旋體)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自日本疏螺旋體)，組蛋白類似的DNA結合蛋白(源自andersonii疏螺旋體)，oder HTa(源自嗜酸熱原體)
13.根據前述權利要求中的一項或幾項所述的方法，其特徵在於原核核酸結合蛋白被以某種方法修飾，以致產生了靶細胞吸收效率的提高或改善。
14.根據前述權利要求中的一項或幾項所述的方法，其特徵在於通過某種方法將原核核酸結合蛋白進行修飾，以致達到了增加轉移核酸，核酸類似物或多種核酸，多種核酸類似物及含胺基酸物質從靶細胞的內體中釋放的效果。
15.根據前述權利要求中的一項或幾項所述的方法，其特徵在於通過某種方法將原核核酸結合蛋白進行修飾，以致核酸，核酸類似物或多種核酸，多種核酸類似物或含胺基酸物質與核酸結合蛋白形成的複合物能夠與靶細胞表面的受體分子結合。
16.根據前述權利要求的一項或幾項所述的方法，其特徵在於在將核酸，核酸類似物或多種核酸，多種核酸類似物或含胺基酸物質與核酸結合蛋白的複合物與靶細胞溫育之前，發生了使用脂質體膜或聚乙二醇對複合物的包裹過程。
全文摘要
本發明涉及一種將分子物質諸如蛋白質或核酸轉移進細胞的方法,假設使用的DNA與可能基因表達相關。本發明採用了一種用於轉移的原核核酸結合蛋白,此蛋白優選來源為嗜熱生物。當被轉移物質是核酸時,該蛋白與核酸形成一種可逆複合物。這種原核蛋白可濃縮和壓縮核酸分子。通過適當的溫育作用後所述核酸可以被吸收進靶細胞中。
文檔編號A61P21/04GK1387575SQ00815315
公開日2002年12月25日 申請日期2000年11月3日 優先權日1999年11月3日
發明者G·伯姆, D·埃塞爾 申請人:Acgt前基因組公司