用於寡核苷酸合成的亞磷醯胺活化劑的製作方法

2023-09-11 04:40:20 1

專利名稱：：用於寡核苷酸合成的亞磷醯胺活化劑的製作方法用於寡核苷酸合成的亞磷醯胺活化劑發明領域本發明涉及用於寡核苷酸合成的改進的組合物。更明確地，本發明涉及用於寡核苷酸合成的改進的亞磷醯胺活化劑和相關使用方法。背景已發現寡核苷酸合成在製造用於多聚酶鏈式反應(PCR)複製過程的引物中非常有效。特別地，寡核苷酸可與互補DNA的特定區域結合，從而擴增DNA的特異性片段。寡核苷酸的該方面在用寡核苷酸進行治療和診斷應用方面很有意義，特別是可用於以序列特異性的方式影響表達基因和蛋白功能。在這些和其它的應用中，可大量產生高純度的寡核苷酸。DNA和RNA寡核苦酸合成包括多個串聯核苷的結合。該過程通常需要以下步驟(1)第一核苷、核苷酸或寡核苷酸上5'-羥基的去封閉；(2)亞磷醯胺單體鹼的活化；(3)將第一活化的核苷與活化的亞磷醯胺通過亞磷酸鍵(phosphitelinkage)結合；和(4)氧化亞磷酸鍵形成更穩定的磷酸鍵(phosphatelinkage)。可重複這四個步驟直至產生所需寡核苷酸。因此，亞磷醯胺為寡核香酸合成中的重要構件。用於各種核苷的亞磷醯胺可從許多供應商那裡購買得到。3'-0-亞磷醯胺為應用最廣泛的亞磷醯胺(amidites),但是寡核苷酸的合成還可包括5'-0-和2'-CM呆護的亞石粦醯胺(Wagneretal.,nucleosides&Nucleotides,1997,17,1657-1660;Bhanetal.,nucleosides&Nucleotides,1997,17,1195-1199)。還有許多不是核苷的亞磷醯胺可以使用(CruachemInc.,Dulles,Va.;Clontech,PaloAlto,Calif.)。如上所述，寡核苷酸合成通常涉及3'-0-亞磷醯胺與核苷、核普酸或寡核苷酸的5'-OH的偶聯。該合成過程的一個步驟為亞磷醯胺的活化，其可通過裂解保護亞磷鍵(phosphorouslinkage)的其中一個基團來完成。然後，所得的活化亞磷可與核苷基(皿cleosidebase)上的活性5'-羥基結合。下面的方案顯示了該反應的實例，其中亞磷醯胺(I)與連接在引物載體上的寡核苷(II)在亞磷醯胺活化劑存在下反應，形成核苦間的鍵(internucleosidelinkage)(IH):在該實例中，R為如下部分二甲氧基三苯曱基(DMT)、2'-0-(叔丁基)-二曱基甲矽烷基(TBDMS)、2'-0-[(三異丙基-曱矽烷基)氧基]曱基(TOM)、寡核苷酸及其類似物或類似的基團；Pg為亞磷(phosphorous)保護基團如烷基、-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3、CH2CH2N(CH3)COCF3等；X和X'獨立為氫、氟、烷氧基、-O-叔丁基二曱基曱矽烷基(OTBDMS)、-O-甲氧基曱基(OMOM)、2'-0-曱氧基乙基(2'-0-MOE)或類似的基團；B和B'獨立為衍生自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧咬的部分。通過上述方案形成的寡核苷酸為本領域已知的，如RiidigerWdzandSabineMiiller，"5-千基硫醇基-lH-四唑作為RNA合成中2'0-TBDMS亞石粦醯胺構4牛的活4匕劑(5-benzylmercapto-1H-tetrazoleasactivatorfor2'0-TBDMSphosphoramiditebuildingblocksinRNAsynthesis)",TetrahedronLetters43,2002,p.795-97。為了滿足對這些寡核苷酸的不斷增長的需要，需要在商業規模上改良寡核苷酸的合成(Noe,Kaufhold,NewTrendsinSyntheticMedicinalChemistry,Wiley-VChWeinheim,2000，261)。為了該目的，已在開發亞磷醯胺活化劑方面做了很多努力。最先被描述的亞磷醯胺化學活化劑為1H-四唑。後來，開發了更多的有效的活化劑，包括5-甲硫基-lH-四唑、5-硝基苯基-lH-四唑、5-乙硫基-lH-四唑和4,5-二氰基咪唑。最近，5-千基硫醇基四唑(BMT)(也被稱為千基硫基四唑(BTT)或千基-1H-四唑)被認為是某些RNA合成技術如TOM-保護的和TBDMS-保護的RNA亞磷醯胺的活4匕的理想活^匕劑。參見如X,Wu禾口S.Pitsch,NucleicAcitdsResearch,1998,26,4315-23);S.Pitsch,etal.,Helv.Chvn.Acta,2001，84,3773-3795;和R.Welz和S.Muller,"5-千基硫醇基-lH-四唑作為RNA合成中2'0-TBDMS亞磷醯胺構件的活化劑(5-benzylmercapto-lH-tetrazoleasactivatorfor2O-TBDMSphosphoramiditebuildingblocksinRNAsynthesis)",TetrahedronLetters43,2002,p.795-97。單體比採用1H-四唑的方法所需的TBDMS或TOM減少50%。另外，BMT在較低的溫度下比lH-四唑具有更高的溶解度，且BMT在19EC以下不結晶也不堵塞管道。但是，據報導BMT在乙腈中的最大；容解度為約0.33M(參見http:〃www.eurogentec.be/code/EN/what.asppk—id—what=85)，且BMT的疏水性質將其商業應用限制在低於或等於0."M的乙腈溶液。在此濃度以上，BMT的乙腈溶液變得不太穩定，在商業操作中易於堵塞溶劑管道。因此，儘管大於0.3M以上的溶液可能具有更有效和快速活化以及更少的亞磷醯胺消耗的優勢，但是BMT的乙腈溶液的商業用途被限制在低於或等於0.25M的濃度。另外大於0.3M的BMT的乙腈溶液更安全，不易爆炸，因此可大量生產並可在金屬容器中如200L的不鏽鋼壓力配藥系統中貯存和裝運。申請者用本發明克服了先有技術中的這些和其它缺點。發明說明書以及優選的實施方案本發明描述了用於寡核苷酸合成的改良亞磷醯胺活化劑溶液。更明確地，申請者發現通過加入某些極性共溶劑如N-烷基咪唑(N-alklimidazole)、四氬p夫。南(tetrahydrofan)和二氧六環，可增力口5-千基硫醇基四唑(BMT)(也被稱為千基硫基四唑(BTT)或千基-lH-四唑)在乙腈中的濃度。可用於本發明的共溶劑必須能溶解亞磷醯胺，且它們的官能性必須不能阻礙常規DNA和RNA合成技術。優選的共溶劑為N-烷基咪唑。已發現BMT的乙腈和N-烷基咪唑溶液的濃度穩定在0.25M以上。當用作亞磷醯胺活化劑時，超過0.25M的BMT溶液可增大亞磷醯胺的活化作用，從而導致更有效和快速的寡核苷酸合成和更少的亞磷醯胺損耗。本發明的亞磷醯胺為式I的化合物formulaseeoriginaldocumentpage8(式I)其中Pg為亞磷保護基團如烷基、-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、畫CH2CH2Si(C6H5)2CH3、-CH2CH2N(CH3)COCF3;W為核苷或寡核苷；和R2為嗎啉代、二烷基氨基(dialklamino)或-N(R3)2,其中R3獨立為具有最多3個選自氮、硫和氧的雜原子的C廣C6烷基或4-7元雜環烷基或雜環烯基環。本發明的核苷化合物(Nucleosidiccompounds)包括單體和連接的DNA或RNA核苷。術語"核苦"包括天然或非天然存在的核苷和具有修飾的鹼基(nucleobases)和/或修飾的糖部分的核苷，包括連接的核酸(LinkedNucleicAcid)(LNA)衍生物和#1其它基團如卣素(halogene)取代基取代的核香，檢測器-包含的核苷包括生物素-或營光素-連接的化合物；具有配體增強反義作用的效應器-包含的化合物；以及衍生自兩個或更多這些化合物的寡聚結構。合適的DNA和RNA核苷的實例包括受保護的核苦，如5'-0-保護的核苷(有或沒有另外的N-保護，如通過苯曱醯基、異丁醯基、叔丁基苯氧基乙醯基"TAC"等的保護)，包括腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷、去氧腺苷、去氧胞苷和去氧鳥苦的5'-0-保護的核香；5'-0-保護的-2'-保護的核苷(有或沒有另外的N-保護)，包括腺苷、胞苷、烏苷和尿苷的5'-0-保護的-2'-保護的核苷(其中優選的2'-保護基團包括叔丁基二曱基曱矽烷基、甲氧基曱基(MOM)、曱氧基乙基(MOE)和烷氧基如甲氧基)，以及腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胞苷和脫氧鳥香的3'-0-保護的核苷(有或沒有另外的N-保護)和衍生自這些化合物的寡聚結構。連接核苷的核苷間的鍵包括天然磷酸二酯鍵和修飾的鍵如好u代磷酸酯鍵(phosphoro-thioate)。其它本領域中已知的核苷間的鍵也適用於本發明。糖的修飾在先有技術中為已知的，包括如2'取代基如F和2'-0-取代基如取代或未取代c廣c,。烷基、cvq。烯基、CVC,。炔基、醚和聚醚，其中所述取代基選自一個或幾個氨基、咪唑、囟素、氰基、羧基、羥基、硝基和巰基。優選的聚醚為直鏈和環狀聚乙二醇(PEGs)和包含(PEG)的基團如冠醚和Ouchi,etal.,DrugDesignandDiscovery1992,9,93,Ravasio,etal.,J.Org.Chem.1991,56,4329和Delgardoet.al.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1992,9,249中公開的化合物，每個文獻都通過引用併入本文。另外在Cook,P.D.,supra.中也公開了糖的修飾。在1995年3月6日提交的申請號為08/398,901標題為"含2'和5'有取代的嘧啶核苷酸的寡聚物(01igomericCompoundshavingPyrimidineNucleotide(s)with2'and5'Substitutions)"的美國專利申請中描述了氟、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基咪唑、O-烷基氨基烷基和烷基氨基取代，其通過引用併入本文。在核糖基環上具有O-取代的糖也適用於本發明。環O上的代表性取代基包括S、CH2、CHF和CF2,參見如Secrist,etal.,"Abstract21，Program&Abstracts",TenthInternationalRoundtable,nucleosides,NucleotidesandtheirBiologicalApplications,ParkCity,Utah,Sep.16-20,1992,通過引用併入本文。本文所用術語"烷基"包括但不限於直鏈、支鏈和脂環烴基。本發明的烷基可為被取代的。美國專利No.5,212,295第12欄41-50行中公開了代表性的烷基取代基，通過引用併入本文。"芳基"基團為芳香性環狀化合物，包括但不限於苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基和二曱苯基。通常，術語"雜"表示不為碳的原子，優選但不僅為N、O或S。因此，術語"雜環烷基"表示具有一個或多個雜原子(即非碳原子)的烷基環系。優選的雜環烷基包括如嗎啉代。本文所用術語"雜環烯基"表示具有一個或多個雙鍵和一個或多個雜原子的環系。優選的雜環烯基包括如通過N連接的吡咯烷基(pyrrolidino)。在本發明的一些優選的實施方案中，氨基連在烷基或其它基團，如2'-烷氧基(如其中R1為烷氧基)上。這樣的氨基通常還存在於天然和非天然存在的鹼基上。在本發明的寡聚化合物合成過程中，這些氨基通常優選以受保護的形式存在。在GreeneandWuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,Chapter7,2ded,JohnWiley&Sons,NewYork,1991中討論了適用於這些目的的代表性的氨基保護基團。通常，當與分子部分如"石成基"一起應用時，本文所用術語"受保護的"是指分子部分包含一個或多個被保護基團保護的官能團。在本發明申請中所用術語"石威基"包括天然存在的鹼基如腺嘌吟、鳥噪呤、胞嘧咬、尿嘧p定(uridine)和胸腺嘧咬，以及外皮修飾的石成基如黃噤呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-曱基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶；6-氮雜尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧咬；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-囟代、氨基、巰基、烷硫基、羥基和其它8-取代的腺噪呤和鳥噤呤；5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧咬和胞嘧啶；7-曱基鳥嘌呤。還包括美國專利No.3,687,808以及ConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859頁，Kroschwitz,J.L,edJohnWiley&Sons,1990和Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition1991,30,613,Limbach,A.,etal.,NucleicAcidsResearch,1994,22,2183-2196中公開的其它嘌呤和嘧啶。術語"核苷鹼基(nucleosidicbase)"還包括可用作類似核苷鹼基的雜環化合物，包括某些不是最經典意義上的核苷鹼基但可充當核苷鹼基的"廣義鹼基"。特別要提到的廣義鹼基為3-硝基吡咯。在先有技術中已知的修飾核苷間鍵，包括如曱基磷酸酯(methylphosphates)、單石克代磷酸酉旨(monothiophosphates)、二硫代磷酸酯(dithiophosphates)、氨基石粦酸酯(phosphoramidates)、石壽酸酯(phosphateesters)、橋氨基磷酸酯(bridgedphosphoroamidates)、橋硫代磷酸酯(bridgedphosphorothioates)、橋亞曱基膦酸酯(bridgedmethylenephosphonates)、脫石奔酸一亥香間類似物與石圭氧烷橋(dephosphointernucleotideanalogswithsiloxanebridges)、碳酸酉旨橋(carbonatebridges)、羧曱基酯橋(carboxymethylesterbridges)、乙醯胺橋(acetamidebridges)、氨基曱酸酯橋(carbamatebridges)、硫醚、碌u醯氧基(sulfoxy)、磺醯氧基橋(sulfonobridges)、各種"可塑性"DNA、V-端基異構橋(anomericbridges)和硼烷衍生物。寡核苷酸合成中亞磷醯胺活化的效率直接關係到終產物的產率。可通過提供具高濃度BMT的亞磷醯胺活化劑溶液來提高該效率。申請者發現可通過加入N-烷基咪唑作為共溶劑來增加BMT在乙腈中的溶解度。因此，本發明的一個方面提供了包含BMT在乙腈和約0.1%-約10%N-烷基咪唑中的溶液的亞磷醯胺活化劑組合物。在優選的實施方案中，本發明的活化劑組合物包含約0.1%-約1.5%N-烷基咪唑，更優選包含約0.5%-約1.5%N-烷基咪唑，甚至更優選包含約1.0%-約1.5%N-烷基咪唑。N-烷基咪唑的濃度大於10%會干擾DNA或RNA的合成過程。優選地，所述N-烷基咪哇為N-甲基咪哇。在另一優選的實施方案中，亞磷醯胺活化劑組合物包含摩爾濃度為約0.25-約1.0的BMT在合成級乙腈中的溶液。更優選地，所述組合物包含摩爾濃度為約0.30-約0.40的BMT溶液，而甚至更優選的組合物包含摩爾濃度為約0.35-約0.40的BMT溶液。優選地，將所述組合物保持在約-lEC以上的溫度，更優選在約4EC以上。延長所述組合物暴露在-4EC以下的溫度的時間會在溶液中產生沉澱，這會對商業寡核苷酸合成過程產生不良影響。本發明的另一方面提供了亞磷醯胺活化的新型方法。不想被理論束縛，據信BMT活化亞磷醯胺的機理首先涉及亞磷醯胺的三價磷的質子化，然後與嗎啉代、二烷基氨基(dialkamino)或胺離去基團連接形成中間產物。接著，脫去離去基團，使亞磷與核苷或寡核苷酸的有效5'-0位點結合，從而在寡核苷酸內產生糖間共價鍵。該反應機理的實例如下面的方案所示formulaseeoriginaldocumentpage13亞磷醯胺和羥基在亞磷醯胺活化劑存在下的反應可在溶劑如乙腈存在下進行。因此，在一些優選的實施方案中，本發明涉及製備糖間共價鍵的方法，包括以具式n化合物為代表的化合物formulaseeoriginaldocumentpage13(式II)其中Pg和R'如上述定義；和R"為核苷或寡核苷。所述方法包括以下步驟(a)提供式I的亞磷醯胺；和(b)將所述亞磷醯胺與核苷或寡核苷的糖部分的羥基在亞磷醯胺活化劑存在下反應；其中所述亞磷醯胺活化劑包含大於0.25M的BMT在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液。在某些優選的實施方案中，V與固相載體相連，如在標準固相寡核苷酸合成方案中。本發明的固相載體包括本領域中眾所周知的適用於固相方法的固相載體，包括如可控多孔玻璃(CPG)、乙二醯基-可控多孔玻璃(參見如Alul,etal.,NucleicAcidsResearch1991,19,1527,通過引用以其整體併入本文)；TentaGel載體，氨基聚乙二醇衍生的載體(參見如Wright,etal.,TetrahedronLetters1993,34,3373,通過引用以其整體併入本文)和Poros，聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。本發明還提供了製備寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供3'-單核苷亞磷醯胺或3'-寡核苷亞磷醯胺；和(b)將所述3'-單核苷亞磷醯胺或3'-寡核苷亞磷醯胺與核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'羥基在亞磷醯胺活化劑存在下反應；所述亞磷醯胺活化劑包含大於0.25M的BMT在乙腈和N-烷基咪峻中的溶液。本文所用術語"寡核苷酸"包括天然存在或非天然存在(即"合成的")的寡核苷酸。天然存在的寡核苷酸為自然界存在的寡核苷酸；如具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶^成基的核糖和去氧核糖磷酸二酯寡核苷酸。本文所用非天然存在的寡核苷酸為包含修飾的糖、核苷間鍵和/或鹼基部分的寡核苷酸。這些寡核苷酸類似物通常與天然存在的或合成的野生型寡核苷酸結構上有差別，但功能可互換。因此，非天然存在的寡核苷酸包括可有效模擬(例如，通過與靶雜交)所需RNA或DNA鏈的結構和/或功能的所有結構。在一些優選的實施方案中，3'-單核苷亞磷醯胺或3'-寡核苷亞磷醯胺與固相載體結合的核苷、核苦酸或寡核苷酸的5'羥基反應。在更優選的實施方案中，重複進行上述每種方法，以得到具有預定核苷酸^喊基序列的寡核香酸或其類似物。通常，在合成方案的最後除去被稱為"Pg"的亞磷保護基團，優選在完成寡核苷酸或其類似物從固相載體上裂解之後進行。本領域熟練技術人員應了解，可根據本發明的方法合成寡核香酸，不僅可通過批量和/或連續法，還可採用自動寡核苷酸合成技術，如AppliedBioSystemsUser'sManualforModels392and394DNA/KNASynthesizers;Section6ChemistryforAutomatedDNA/RNASynthesis(March1994)和MlGait,"寡核苷酸合成，APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress(1984,ISBN0-904147-74-6)中所描述，這些文獻都通過引用併入本文。在這些實施方案中，核苷和/或寡核苷酸含羥基化合物為固定在固相載體上，在自動DNA合成儀中與核苷亞磷醯化劑(phosphitylatingagent)在亞磷醯化活化劑(phosphitylationactivator)存在下反應，生成寡核苷酸。可進行特定數目和序列的亞磷醯化反應(phosphitylationreactions)以得到本發明的包含不同長度和序列的核苷的寡核苷酸。任何合適的固相載體材料都可適用於本發明。合適的固相載體材料的實例包括可控多孔玻璃(controlled-poreglass)("CPG")、聚苯乙烯、二氧化矽、纖維素紙和它們中兩個或多個的組合。優選的固相載體材料包括可控多孔玻璃、聚苯乙烯及其組合。用於本發明的固相載體可具有任何適合孔徑的孔。本領域熟練技術人員應了解孔徑的選擇至少部分取決於要生產的寡聚物的大小和所用的核香酸合成方法。在本文中，本領域熟練技術人員可容易地選擇用於各種應用的適當孔徑的固相載體材料。許多固相載體固定的核苷都可購買得到。如，固定在CPG上(包括在1000埃CPG的0.2樣麼摩爾的苯甲醯基保護的去氧胞嘧啶)許多N-保護的去氧核苷可得自AppliedBiosystems(ABI)。任何自動DNA/RNA合成儀者卩可適用於本發明。合適的DNA合成儀的實例包括AppliedBiosystems的ModelNos.3900、3948、3400、380、380B、392和394,Expedite8800、8卯5、8909;得自Amersham/GEHealthcare的GeneAssembler、OligoPilotII、AKTAoligopilot10和AKTAoligopilot100;和BeckmannOligo1000和IOOOM，MWGBiotechOligo2000,PolyPlexGeneMachme,IlluminaOligator、MerMadeI、II和V,IntelligentBiolnstrumentsPrimerStation960,ProligoPolygen,Syntower等。優選的合成儀包括ModelABA-394等。下面的實施例提供了本發明的其它特徵，其不應被理解為是對權利要求的限制。實施例實施例1-12:下面的實施例表明了加入共溶劑N-曱基咪唑(imidiazoles)(NMI)後BMT在乙腈中的溶解度增加。tableseeoriginaldocumentpage17*在室溫下，濃度大於0.25M的BMT在乙腈中的混合物不易形成穩定溶液如上述實施例所顯示，可通過加入共溶劑NMI來增加BMT在乙腈中的濃度。實施例13-37:聯產率和全長產物。每個實施例的平均值採用rU20序列或RNA2-mer序列由總共3次實驗的平均值計算。實施例13的實驗方法如下將包含用r-DMT-U和Q-接頭衍生的LCAA-CPG載體(15.4mg)的合成柱裝在ABI394DNA合成儀上。該合成4義配有0.1M2'-0一又丁基二曱基甲矽烷基保護的RNA亞磷醯胺溶液(Transgenomics)和常用的去封閉、加帽和氧化溶液。所用的活化劑溶液為0.3MBMT+2.5%NMI。進行標準0.2nmol規模的RNA合成循環(300秒偶聯時間)(Tr-off/手工終止)。合成後，留下的粗產物吸附在載體上。打開合成柱，移出一部分CPG(5.2mg)置於氬氧化銨中(48h,RT)。將該溶液輕輕倒出，蒸發除去NH4OH,所得殘留物溶於水。在260nm的UV定量分析顯示回收率為27.3A，單位(或52,5A26。單位/10mgCPG))。移出等分部分的2'-0-甲矽烷基化的粗物質(5A，單位)，溶於3:1DMSO/TEA-3HF(10pi),加熱(3h@65°)以脫去2'-OH的保護基團。加入正丁醇(1.5ml)以沉澱出完全脫保護的產物。離心後，收集片狀沉澱物，然後用如上所述的毛細管凝膠電泳分析，只不過用手套和無菌DEPC水以避免RNA酶汙染。在實施例14-16中重複該方法，只不過用標明的組合物代替0.45M四唑活化劑。tableseeoriginaldocumentpage19**5次試驗均值tableseeoriginaldocumentpage203**6次試驗均值。***儘管在實驗室操作中可成功地使用無NMI的0.25M-0.3M的BMT溶液，但這些濃溶液無法用於工業應用，因為BMT會迅速從溶液中沉澱出來，導致轉運管道堵塞。如上述實施例所示，0.3MBMT的亞磷醯胺活化劑可得到的偶聯產率和全長寡核苷酸產物等於或高於其它特定活化劑。但是，高濃度的NMI會降低合成過程的效率。實施例38-43:聯產率和全長產物。每個實施例的平均值採用標明的DNA序列由總共3次實驗的平均值計算。實施例38的實驗方法如下將包含用d-DMT-G(iBu)和Q-接頭衍生的LCAA-CPG載體的合成柱裝在ABI394DNA合成儀上。該合成儀配有0.1M亞磷醯胺溶液(Tmnsgenomics)和常用的去封閉、加帽和氧化溶液。所用活化劑溶液為0.3MBMT+0.5%NMI。進行標準0.2pmol規模的DNA合成循環(Tr-off/自動終止)。合成後，用氬氧化銨(5min,RT)使粗產物自動從載體上分裂。然後將所得物質加熱(55。，16h)以除去保護基團。蒸發除去NH40H，所得殘留物溶於水，在260nm用UV定量(產量為59八26。單位)。移出粗物質的等分部分(0.5A，單位)，重新溶於水(50pl)，用正丁醇(1.5ml)沉澱以脫鹽。將該樣品離心(2min),除去液層，真空乾燥片狀沉澱物。將該樣品重新溶於7:3甲醯胺/水(100pl)，變性(95°,2min),在冰上冷卻(2min),然後用毛細管凝膠電泳分析。用Agilent儀器在PEG溶液和AgilentPVA塗漬的毛細管(總長100x33cm)中按照Agilent條件進行CGE(publication#5988-4303EN)。對樣品進行一式三份分^t,用最大峰的平均積分峰面積(進行流動性校正)作為全長產物的總產率。在實施例20和21中重複該方法，只不過用標明的組合物代替0.5METT活化劑。tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage22***儘管在實驗室操作中可成功地使用無NMI的0.25M-0.3M的BMT溶液，但這些濃溶液無法用於工業應用，因為BMT會迅速從溶液中沉澱出來，導致轉運管道堵塞。如上述實施例所示，與其它活化劑相比，0.3MBMT的亞^粦醯胺活化劑溶液可得到較高的偶聯產率和全長DNA寡核苦酸產物。2權利要求1.一種亞磷醯胺活化劑，所述活化劑包含5-苄基硫醇基四唑在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液。2.權利要求1的活化劑，包舍至少約0.5%重量的N-烷基咪唑。3.權利要求2的活化劑，包含至少約1.0%重量的N-烷基咪唑。4.權利要求3的活化劑，包含至少約1.5%重量的N-烷基咪唑。5.權利要求l的活化劑，其中所述N-烷基咪唑為N-曱基咪唑。6.權利要求1的活化劑，包含至少約0.25M的苄基硫醇基四唑溶液。7.權利要求1的活化劑，包含至少約0.30M的千基硫醇基四唑溶液。8.權利要求1的活化劑，包含至少約0.35M的苄基硫醇基四唑溶液。9.權利要求1的活化劑，包含至少約0.40M的苄基硫醇基四唑溶液。10.—種活化亞磷醯胺的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供亞磷醯胺；和(b)將步驟(a)的亞磷醯胺與權利要求1的亞磷醯胺活化劑反應，得到可與核苷或寡核苷酸的5'-0位反應的中間產物。11.權利要求10的方法，其中所述亞磷醯胺具下式formulaseeoriginaldocumentpage2其中Pg為選自下列的亞磷保護基團-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2—5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3和CH2CH2N(CH3)COCF3;W為核苷或寡核苷；和R"為嗎啉代、二烷基氨基或-N(R3)2,其中R獨立為C廣C6烷基或具有最多3個選自氮、硫和氧的雜原子的4-7元雜環烷基或雜環烯基環。12.—種製備寡核普酸的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供3'-核苷亞磷醯胺或3'-寡核苷酸亞磷醯胺；和(b)在亞磷醯胺活化劑存在下，將所述3'-核苷亞磷醯胺或3'-寡核苷酸亞磷醯胺與核苷或寡核苷酸的5'-羥基反應；其中所述亞磷醯胺活化劑包含5-千基硫醇基四唑的乙腈和N-烷基咪唑溶液，所述溶液的5-千基硫醇基四唑濃度大於約0.25M。13.權利要求12的方法，其中所述核苷或寡核苷酸結合在固相載體上。14.一種製備糖間共價鍵的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供亞磷醯胺；和(b)在亞磷醯胺活化劑存在下，將所述亞磷醯胺與核苷或寡核苷的糖部分的羥基反應，得到具下式的化合物formulaseeoriginaldocumentpage3其中Pg為選自下列的亞磷保護基團-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2.5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3和CH2CH2N(CH3)COCF3;R"為核苷或寡核苷；和W為核苷或寡核苷；所述亞磷醯胺活化劑包含至少0.2SM的5_千基硫醇基四唑的乙腈和N-烷基咪唑溶液。15.權利要求14的方法，其中所述亞磷醯胺具下式formulaseeoriginaldocumentpage4其中Pg為選自下列的亞磷保護基團-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2.5N(H)COCF3、陽CH2CH2Si(C6H5)2CH3和CH2CH2N(CH3)COCF3;W為核普或寡核苷；和W為嗎啉代、二烷基氨基或-N(R3)2,其中R"蟲立為C,-Q烷基或具有最多3個選自氮、硫和氧的雜原子的4-7元雜環烷基或雜環烯基環。16.權利要求14的方法，其中反覆進行步驟(a)和(b)得到按照預定核苦酸;成基序列的寡核苷酸。全文摘要本發明提供了改進的亞磷醯胺活化劑，該活化劑包含(5)-苄基硫醇基四唑在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液。進一步提供了改進的合成寡核苷酸的方法，其中包含(5)-苯甲基硫醇基四唑在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液的亞磷醯胺活化劑用於製備核苷間的鍵。文檔編號C07H21/00GK101155821SQ200680011228公開日2008年4月2日申請日期2006年2月1日優先權日2005年2月8日發明者K·S·雷迪申請人:霍尼韋爾國際公司