一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法
2023-09-10 22:17:50
一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法
【專利摘要】本發明主要涉及一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟：1）牡丹籽原料除雜、清洗、乾燥、脫殼，將牡丹籽皮乾燥、粉碎，置於超聲提取器內，加入乙醇進行超聲提取，過濾，重複向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作，收集的所有濾液，濃縮得提取浸膏，2）將提取浸膏用乙醇溶解，除去不溶物後加入到吸附劑中，吸附12-24h後得到吸附混合料，3）將吸附混合料裝入分離柱內，用不同質量濃度的乙醇溶液洗脫，收集芪類化合物含量大於85%的餾分段；4）將收集的芪類化合物的餾分段減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。該方法成本低，不使用有毒有機溶劑，且提取率高，製備得到的芪類化合物具有較好的抑制腫瘤細胞，抗氧化等活性。
【專利說明】一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法。
【背景技術】
[0002]芪類化合物(Stilbeniods)是指具有1，2_ 二苯乙烯骨架的單體及其聚合物的總稱。低聚芪類屬於酚酸類化合物。這類化合物具有廣泛的生物活性，如抗細菌和抗真菌活性，抗炎活性，抗氧化活性，抗腫瘤活性，抗愛滋病活性及保肝活性等。【李小妹，李娜，黃開勝，林茂.白藜蘆醇低聚體類似物的光譜特徵、生源與生物活性，藥學學報，2002，37(1):69-74 ;陳莉，陳堅波.芪類化合物的藥理研究綜述，廣東藥學，2005，15(3):84-86】
牡丹籽油含有多種不飽和脂肪酸，尤其是含有罕見的奇數脂肪酸，是一種具有重要開發價值的食用油脂來源。目前，我國油用牡丹籽的種植量在逐漸增多，油用牡丹籽的產量也逐年增加。目前，牡丹籽油的製備工藝是先將牡丹籽乾燥脫殼。按照目前的產量，油用牡丹籽產量為3萬噸，經過脫殼會產生大約3000-5000噸左右的牡丹籽皮，這些牡丹籽皮的開發利用將會是一個非常重要且任務艱巨的研究課題。
[0003]本課題組前期研究表明，牡丹籽餅中含有較多的低聚芪類化合物，進一步活性測試表明這些芪類化合物具有較好的活性。因此，從牡丹籽餅中分離芪類化合物，並研究其活性具有非常重要的意義。近年來，已有課題組對藥用植物牡丹籽中芪類化合物進行了研究:文獻【何春年.芍藥屬 藥用植物親緣學研究，中國協和醫科大學[D]，2010】報導了9中芪類化合物的分離過程，其所得到的芪類化合物收率非常低，從4公斤原料中所得到的單體芪類化合物最多100多毫克，難於產業化。另外，其所用的分離材料為牡丹種子，研究過程中還存在著有毒有機溶劑的應用問題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，該方法簡單，成本低，不使用有毒有機溶劑，安全環保，無汙染，且提取率高，可以規模化生產。
[0005]本發明實現上述目的採用的技術方案是:一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟:
O取牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗2-3遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在60-80°C條件下乾燥3-9h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量10-20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60-80%，在溫度為30-40 °C條件下超聲提取30-40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量10-20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60-80%，在溫度為30-40 °C條件下超聲提取30-40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作1-2次，將收集的所有濾液混合，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用； 2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量6-10倍的乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為20-40%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量100-200倍的吸附劑中，吸附12-24 h後得到吸附混合料，備用；
3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用；
4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
[0006]所述的牡丹籽原料為鳳丹牡丹籽或紫斑牡丹籽，也可以是芍藥科其它物種的籽皮。
所述的步驟3)中的吸附劑為聚醯胺樹脂、DlOl大孔吸附樹脂或AB-8大孔吸附樹脂中的一種。
[0007]所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。
[0008]本發明的有益效果:
其一、本發明的採用超聲提取，提取溫度低，具有提取效率高，有效成分不容易發生變化的特點；提取後得到的組分採用吸附劑吸附，然後採用不同濃度的乙醇洗脫，整個過程中用到的有機溶劑僅僅為乙醇，所以整個製備方法簡單，生產成本低，符合中藥產業現代化要求，該方法可以實現工業化生產，其純化工藝具有較強的實用價值。
[0009]其二、本發明的整個提取過程沒有使用有毒有機溶劑，所用到的乙醇可以回收再利用，安全、環保，既可以節約能源，又幾乎不產生對環境有害的廢棄物。
[0010]其三、本發明充分利用了牡丹籽榨油過程中的副產物一牡丹籽皮，降低了廢棄的排放，增加了牡丹深加工產品的附加值。
[0011]其四、通過本發明提供的方法提取的芪類化合物含量較高，大於90%，可以滿足進一步開發的要求，如開發成高品質的食品添加劑、藥物等。
[0012]其五、本發明製備得到的牡丹總芪類化合物，經過藥理學試驗證明，具有抗氧化和抗腫瘤活性，可以單獨或與適宜的賦形劑等結合，作為食品添加劑用於食品中，或用於製備抗腫瘤的藥物。因此具有重要的研究開發價值。
[0013]【具體實施方式】:
一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟:
O取牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗2-3遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在60-80°C條件下乾燥3-9h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量10-20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60-80%，在溫度為30-40 °C條件下超聲提取30-40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量10-20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60-80%，在溫度為30-40 °C條件下超聲提取30-40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作1-2次，將收集的所有濾液混合，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用；
2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量6-10倍的乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為20-40%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量100-200倍的吸附劑中，吸附12-24h後得到吸附混合料，備用；
3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用；
4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
[0014]所述的牡丹籽原料為鳳丹牡丹籽或紫斑牡丹籽，也可以是芍藥科其它物種的籽皮。
所述的步驟3)中的吸附劑為聚醯胺樹脂、DlOl大孔吸附樹脂或AB-8大孔吸附樹脂中的一種。
[0015]所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。
[0016]總芪類化合物含量的測定方法:
參考文獻【倪網東，滿瑞林，李志明，盧紅梅.紫外分光光度法同時測定虎杖中芪類和蒽醌類化合物，化學工程師，2006，125(2):35-36，39】的方法，進行改進。用在研究過程中分離得到的芪類化合物牡丹醇A作為標準對照品，利用紫外-可見分光光度法，在338 nm處測試:稱取10毫克牡丹醇A，調節PH=8，採用95%乙醇配置成100 μ g/mL的儲備液，再取一定量的儲備液稀釋成5.00,4.00,3.00,2.00、1.00,0.50 μ g/mL,在338 nm處測定紫外吸收，以吸光度A和濃度C進行線性回歸分析，得標準曲線。由測定的樣品吸光度A，按照下列公式計算出總芪類化合物的含量。
[0017]總芪類化合物(%)=(牡丹醇A質量X提取液稀釋倍數)/ (樣品粉末質量X IO6) 以下結合具體實施例對本發明做進一步說明:
實施例1:
一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟:
O取鳳丹牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗2遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在60°C條件下乾燥3h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，取出1kg粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量10倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60%，在溫度為30°C條件下超聲提取30min，提取結束後過濾，收集濾液，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量10倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60%，在溫度為30°C條件下超聲提取30min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作1次，收集所有濾液，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用；
2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量6倍乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為20%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量100倍的吸附劑聚醯胺樹脂中，吸附12h後得到吸附混合料，備用；
3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用；
4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。[0018]經檢測，本實施例提取得到的芪類化合物的總含量為93.2%。
[0019]實施例2:
一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟:
O取鳳丹牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗3遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在80°C條件下乾燥9h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，取出I kg粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為80%，在溫度為40°C條件下超聲提取40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為80%，在溫度為40°C條件下超聲提取40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作2次，將收集的所有濾液混合，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用；
2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量10倍乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為40%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量200倍的吸附劑DlOl大孔吸附樹脂中，吸附24h後得到吸附混合料，備用；
3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用；
4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。
[0020]經檢測，本實施例提取得到的芪類化合物的總含量為92.1%。
[0021]實施例3:
一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟:
O取鳳丹牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗2遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在70°C條件下乾燥6h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，取出I kg粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量15倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為70%，在溫度為35°C條件下超聲提取35min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量15倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為70%，在溫度為35°C條件下超聲提取35min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作2次，將收集的所有濾液混合，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用；
2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量8倍乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為30%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量150倍的吸附劑AB-8大孔吸附樹脂中，吸附20h後得到吸附混合料，備用；
3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用；
4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。
[0022]經檢測，本實施例提取得到的芪類化合物的總含量為91.0%。[0023]實施例4:
一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，包括以下步驟:
O取紫斑牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗3遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在60°C條件下乾燥3h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，取出I kg粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量10倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60%，在溫度為30°C條件下超聲提取30min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量10倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60%，在溫度為30°C條件下超聲提取30min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作2次，將收集的所有濾液混合，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用；
2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量6倍乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為20%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量100倍的吸附劑DlOl大孔吸附樹脂中，吸附12h後得到吸附混合料，備用；
3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用；
4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
[0024]所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。
[0025]經檢測，本實施例提取得到的芪類化合物的總含量為90.8%。
[0026]活性測試試驗:
1.抗腫瘤活性藥理研究 I)試驗材料
胎牛血清，96孔培養板，恆溫箱，RPM1640培養液。
[0027])方法
對上述實施例富集得到的芪類化合物進行細胞毒活性測試，採用的方法為MTT法。
[0028])試驗步驟
(I)取對數生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPM1640培養液，製成單細胞懸液5 X IO4個/mL,將該懸液加到96孔培養板中，每孔加入IX IO4個細胞。培養24 h後,加入受試藥物，化學單體濃度分別為30 μ g/mL>10 μ g/mL。
[0029](2)將平板在37 °C，含5%C02空氣及100%溼度的恆溫箱中孵育3天，去除培養液。
[0030](3) MTT用無血清的RPM1640培養液配成I mg/mL溶液，每孔加100 μ L，37°C溫育4 h，使MTT還原為甲臢。
[0031](4)吸出上層清液，加入150 yL DMSO使甲臢溶解，於ELISA儀570 nm處測OD值。
[0032])試驗結果
表1:分離化合物細胞毒活性實驗數據(n=6)
【權利要求】
1.一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，其特徵在於:包括以下步驟: O取牡丹籽原料，除去雜質，並用清水清洗2-3遍，然後置於恆溫乾燥箱中，在60-80°C條件下乾燥3-9h，烘乾後加入脫殼機中去皮，然後將得到的牡丹籽皮乾燥至含水量不超過10%，粉碎，置於超聲提取器內，然後加入其重量10-20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60-80%，在溫度為30-40 °C條件下超聲提取30-40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；向得到的濾渣中加入其重量10-20倍的乙醇溶液，乙醇的質量濃度為60-80%，在溫度為30-40 °C條件下超聲提取30-40min，提取結束後過濾，收集濾液，備用；重複上述向濾渣中加入乙醇、超聲提取和過濾操作1-2次，將收集的所有濾液混合，蒸發濃縮，得到提取浸膏，備用； 2)將步驟I)得到的提取浸膏用其重量6-10倍的乙醇溶液充分溶解，乙醇的質量濃度為20-40%，除去不溶物，得到樣品液，備用；將樣品液加入到其重量100-200倍的吸附劑中，吸附12-24h後得到吸附混合料，備用； 3)將步驟2)得到的吸附混合料裝入分離柱內，依次用以水為溶劑的不同質量濃度的乙醇溶液進行洗脫，其中各次洗脫用乙醇溶液的質量濃度依次為0%、20%、30%、40%、50%、70%、80%以及95%，洗脫過程中收集芪類化合物含量大於85%的餾分段，備用； 4)將步驟3)收集的芪類化合物的餾分段，在小於60°C條件下減壓濃縮至無溶劑，即得總芪類化合物。
2.如權利要求1所述的一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，其特徵在於:所述的牡丹籽原料為鳳丹牡丹籽或紫斑牡丹籽，也可以是芍藥科其它物種的籽皮。
3.如權利要求1所述的一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，其特徵在於:所述的步驟3)中的吸附劑為聚醯胺樹脂、DlOl大孔吸附樹脂或AB-8大孔吸附樹脂中的一種。
4.如權利要求1所述的一種從牡丹籽中提取總芪類化合物的方法，其特徵在於:所述的從牡丹籽中提取總芪類化合物的過程中應用到的乙醇均為食用酒精。
【文檔編號】A61P39/06GK103766913SQ201410011977
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月10日 優先權日:2014年1月10日
【發明者】劉普, 鄧瑞雪, 梁菊, 楊丹蕾, 劉欣, 尹衛平, 高嘉嶼, 段文錄, 柴元武, 時清亮 申請人:河南科技大學