一種納米組合物及其製備方法和應用的製作方法
2023-09-11 02:01:35 1
專利名稱::一種納米組合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域:
:本發明為一種新型給藥系統載體材料小麥醇溶蛋白與水飛薊賓製成的肝耙向納米組合物。涉及生物材料,生物醫學工程與新藥研究領域。技術背景水飛薊賓(Silybin,SN)是由菊科植物水飛薊SilybumMarian咖L.果實中提取得到的水難溶性黃酮類化合物。藥理實-驗證明,水飛薊賓對多種肝臟毒物引起的肝臟損傷有明顯的保護作用。其靶器官為肝臟,進入體內後主要與血漿蛋白結合,以結合型水飛薊賓的形式存在於血漿、膽汁及尿液中(史向國,鍾大放,張逸凡,等.反相高效液相色譜法測定大鼠血漿中水飛薊賓的濃度[J].瀋陽藥科大學學報,2001,18(2):113)。對急慢性肝炎、肝硬化和代謝中毒性肝損傷具有較好的療效(宋立人,洪恂,丁緒亮,等.現代中藥學大辭典.北京人民衛生出版社,2001,496-498)。由於水飛薊賓難溶於水及一般有機溶劑,口服吸收差,其生物利用度較低,從而影響了其臨床療效。目前,以水飛薊賓為有效單體的治療藥物劑型有口服製劑水飛薊素片、益肝靈片、水飛薊賓卵磷脂複合物硬膠嚢等。商品名有利肝隆,利加隆,益肝靈等。注射劑主要是做成水飛薊賓衍生物,如葡-N甲胺鹽,二乙胺鹽,N,二甲基甘氨酸鹽,玻璃酸酶鈾鹽等或製成包合物再做成水溶性注射劑。在我國,生產水飛薊賓製劑有幾十年的歷史,常見的劑型主要為片劑、膠嚢等,因此對於該有效單體的新劑型開發前景廣闊。微粒製劑的研究已經成為當今藥劑學研究的一個熱點。而微粒製劑靶向給藥系統的載體材料以天然的高分子材料,尤其是天然蛋白質類高分子材料更具研究價值。蛋白類高分子均易於代謝,但近年來,由於動物來源的蛋白高分子材料可能攜帶病毒,因此植物來源的高分子蛋白材料就顯示出更大的優勢,例如能夠包埋多種活性物質、不會被病毒或朊病毒(prion)汙染、具有藥理惰性和無毒等特點,而且植物來源的多糖和蛋白質有望成為合成聚合物的優良替代品(徐暉,姬雅菊,王紹寧,等.聚合物納米顆粒的製備及其應用(II)利用合成聚合物或天然大分子製備納米顆粒.中國藥劑學雜誌,2004,2(4):91-99)。植物蛋白包括植物白蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白4種,與動物蛋白相比,植物蛋白更易於分離純化、價格也更低廉。醇溶蛋白是從穀類植物貯存蛋白中以適當濃度乙醇提取的分子量在10OkD~3OkD的一組蛋白質。具有較多的中性和親脂性基團,除在極端pH值條件下醇溶蛋白在水中溶解度極低。其主要組成是約40%的穀氨酸和14%的脯氨酸,幾乎沒有帶電荷的胺基酸。國內外對於醇溶蛋白的研究僅限於穀物育種、麵包品質等農學與食品科學領域。國外藥劑學方面對於醇溶蛋白作為藥物載體的研究也較少。根據醇溶蛋白的性質決定其可以通過去溶劑化法製備成納米粒,在整個製備過程中僅僅使用乙醇,而沒有引入其他有機溶劑,大大降低生產成本,有效的解決了微粒製劑有機溶劑殘留的問題,並為其工業化提供了保證。另外,醇溶蛋白來源豐富,容易分離提純,並且有很好的生物相容性,經體外試驗證明沒有細胞毒性。研究表明,由於其內部的財建及S-S鍵而呈摺疊狀二級結構,醇溶蛋白所形成的肽泡狀藥物載體與腸上皮細胞,肝細胞以及皮膚角質細胞具有一定親和性,可以作為轉染試劑(載體),能夠將藥物運輸到細胞內,提高藥物作用效果(Teglia,A.,Secchi,G..Newproteiningredientsforskindetergency:relativewheatproteinsurfactantcomplexes.Int.J.Cosmet.Sci.,1994,16:235-246)。另夕卜,由於其表面大量的活性基團可以偶聯特異性抗體,識別抗原,達到胞內靶向給藥的目的。國內外文獻檢索結果表明還未發現利用醇溶蛋白載體材料包裹水飛薊賓製成納米製劑的報導。
發明內容本發明要解決的技術問題之一是提供了一種具有肝靶向的納米組合物,此納米組合物是由小麥醇溶蛋白與水飛薊賓共同製成,可提高藥物的包封率和載藥量,同時解決了水飛薊賓水難溶性問題,具有肝臟靶向性,提高水飛薊賓的臨床療效。本發明進一步提供了小麥醇溶蛋白與水飛薊賓的納米組合物的凍乾粉針劑,並提供了相應的製備方法。本發明所述的納米組合物是水飛薊賓以單體形式包裹並吸附於小麥醇溶蛋白形成的,其中治療性成分水飛薊賓的質量百分含量為2%~20%,該納米組合物的粒經大小為50~500mn。小麥醇溶蛋白來源於小麥麵筋粉,所述納米組合物中載體材料小麥醇溶蛋白的製備方法是一種快速簡便的蛋白質提取純化方法(I.Ezpeletaetal.Gliadinnanopariclesforthecontrolledreleaseofall-trans-retinoicacid,//7f/屍力ar/z/131(1996)191-200.),用稀乙醇(40%~80°/。)對穀類作物進行提取,經過兩次離心得到小麥醇溶蛋白粗提物,並採用水-酸水-水透析法純化得到小麥醇溶蛋白。其分子量範圍通過電泳測定,結果小麥醇溶蛋白是在200KD-30KD之間的一組蛋白質的組合物。本發明所述的納米組合物,其特徵在於該納米組合物是通過去溶劑化法製備、並在乙醇環境下以固化劑(醛、酮類)固化得到的,具體步驟如下A.將水飛薊賓與小麥醇溶蛋白溶解於70%乙醇中,形成相a;B.將無水乙醇迅速倒入攪拌狀態下的a相中;C.滴加醛酮類固化劑固化,旋轉蒸發除去乙醇,即得水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物膠體溶液。上述製備方法中還包括在水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物膠體溶液中加入2%~10%藥學上可接受的凍幹支架劑,經冷凍乾燥製得水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑。上述製備方法中所述的凍幹支架劑包括甘露醇,蔗糖,乳糖,葡萄糖,果糖,木糖醇,海藻糖中的一種或幾種。上述製備方法中所述的醛、酮類固化劑包括曱醛、戊二醛或丁二酮,使用濃度為0.1%~1%。本發明所述的納米組合物製備方法,還包括,在水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物膠體溶液中加入表面活性劑或穩定劑,其中表面活性劑或穩定劑包括卵磷脂、泊洛沙姆188(Poloxamer188)、大豆磷脂、吐溫類、司盤類、十二烷基石克酸鈉、蔗糖脂肪酸酯類的一種或幾種。本發明所述的納米組合物製備過程中採用的攪拌速度為500~1000rpm,充分去溶劑化10~30min,使載體材料包裹藥物形成納米粒子。固化劑固化4h8h即可將納米粒固化,隨著固化時間的延長,藥物的釋i文程度降低,釋放速度減慢。本發明所述的納米組合物以注射途徑給藥時被內皮網狀系統攝取而到達肝臟,從而提高肝臟內部藥物濃度,降低給藥劑量,提高治療肝炎的治療效果。本發明所述的納米組合物的有益效果(1)載藥後納米組合物電子顯微鏡下觀察呈微嚢狀結構,體外釋放結果表明,載藥納米組合物在適當釋放介質中的體外釋放行為與空白藥物相比呈現明顯的緩釋效果,釋放曲線符合weibull模型。(2)本發明所述的納米組合物在小鼠體內組織分布實驗中具有肝臟靶向性。取昆明種小鼠50隻,體重(20±2)g,雌雄各半,隨機分為10組,每組5隻。其中5組尾靜脈注射給予納米組合物凍乾粉針劑(臨用前用水復溶,製成每ml含水飛薊賓(SN)0.56mg,按5.6mg/kg進行給藥)作為實驗組,另外5組尾靜脈注射給予對照藥水飛薊賓(SN)溶液(用70%乙醇溶解,滴加0.2M氫氧化鈉配製成每ml含SN0.56mg的溶液)作為對照組;於給藥後2min、5min、15min、30min、60min眼眶取血處死,全血置肝素化塑料離心管中。迅速解剖處死小鼠取出心、肝、脾、肺、腎、腦等器官,濾紙吸乾,稱重後,立即冷藏備用。全血於10,OOOrpm離心lOmin,分離血漿,備用。所有樣品均置-20。C水箱中冷凍保存。按臟器的重量,加入2倍(或4倍)體積的生理鹽水,勻漿處理。勻漿液i文入冰箱-2(TC冷凍保存,供樣品配製時使用。以乙腈和0.4%乙酸(32.5:67.5)溶液為流動相,生物樣品經甲醇沉蛋白處理後利用ds柱進行分離,採用內標法測定。測定結果顯示水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物與對照藥物相比,延長了水飛薊賓在肝中的滯留時間,並增加了藥物的肝臟分布,對照藥物(水飛薊賓)與水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物的體內平均滯留時間(MRT)分別為為4.90min和12.97min(P<0.05)。其中對照藥物的肝臟分布為10%,而製備成納米組合物後的肝臟分布提高為28.6%,具有一定肝靶向性。(3)本發明所述的納米組合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響試驗結果說明,水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑對四氯化碳致小鼠急性肝損傷有明顯的防治作用。供試品按照實施例1方法製備的水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑(SN-GNP)方法取昆明種小鼠72隻,雌雄各半,隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(甘利欣50mg/kg)、SN-GNP小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(20mg/kg)劑量組,共6組,每組12隻。陽性對照組及SN-GNP各組均按0.lml/10g尾靜脈注射給藥,空白對照組與模型對照組給予等體積的生理鹽水,每日1次,共8日,並於第7日給藥1.5小時後除空白對照組外,其餘各組均按0.lml/10g體積腹腔注射0.12%四氯化碳花生油溶液進行造模。造模後禁食不禁水16h,摘眼球取血測血清ALT、AST,同時取肝稱重,計算肝臟係數。結果SN-GNP小、中、大劑量組與模型對照組比較,ALT值明顯降低,差異有顯著性(P<0.05~P<0.001);SN-GNP中、大劑量組與模型對照組比較,AST值明顯降低,差異有顯著性(P<0.05、P<0.01);SN-GNP各劑量組肝臟係數有降低趨勢。表lSN-GNP對四氯化碳致小鼠急性肝損傷血清ALT、AS.T的影響(;±s)tableseeoriginaldocumentpage100.05.結論水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑對四氯化碳致小鼠急性肝損傷有明顯的防治作用。討論四氯化碳致小鼠急性肝損傷是目前保肝降酶藥物篩選的最經典模型之一。四氯化石灰進入體內後,經肝臟細胞色素P450激活,生成三氯曱基自由基,通過氧吸附而攻擊內質網膜上的磷脂分子,引起膜的脂質過氧化,三氯曱基自由基繼而與膜脂質和蛋白質大分子進行共價維合,引起膜結構和功能完整性的破壞,三氯曱基自由基還抑制細胞膜和微粒體膜上鈣泵活性,使Ca"離子內流增加,從而引起細胞中毒死亡。胞漿內的ALT、AST轉氨酶大量釋放到血液中,引起血清中ALT、AST轉氨酶活性顯著升高,並使肝臟腫大。本實驗以四氯化碳為造模劑,以聯苯雙酯為陽性對照,以血清ALT、AST含量及肝臟係數為觀察指標,來研究水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑是否具有保肝活性。結果表明,造模成功,陽性藥有效,說明方法可行,水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑小、中、大劑量組與模型對照組比較,ALT值明顯降低,差異有顯著性;水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑中、大劑量組與模型對照組比較,血清AST值明顯降低,差異有顯著性;水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑各劑量組肝臟係數有降低趨勢。說明水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑對四氯化碳致小鼠急性肝損傷有明顯的防治作用。本發明的主要優點如下1、載體材料小麥醇溶蛋白適合於包裹水難溶性藥物,有利於提高藥物的包封率和載藥量,本發明中所述的水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物的包封率為70~80%。2、該載體材料小麥醇溶蛋白的製備方法簡單,適合產業化,應用於納米給藥載體具有一定的新穎性。3、本發明所述的水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物,提高了肝內藥物濃度,對於治療肝臟疾病具有一定意義。4、水飛薊賓的臨床療效確切,但其難溶於水等物理性質限制了臨床應用,此方法很好的解決了該問題,使得水飛薊賓藥物的研究開發具有廣闊的空間與良好的發展前景。具體實施例實施例1小麥醇溶蛋白lOOmg與15mgPoloxa匿188以12ml70%乙醇溶液溶解,再加入18.8mg水飛薊賓(SN),1500rpm速度磁力攪拌使溶解,迅速加入1%Poloxamer188溶液28ml,繼續攪拌30min,S走轉蒸發除去部分乙醇,即得納米組合物膠體溶液。向此溶液中加入葡萄糖400mg,甘露醇200mg,充分溶解,凍幹即得納米組合物凍乾粉針劑。加去離子水復溶後測定粒徑為203nm,多分散指數(PDI)0.217。實施例2小麥醇、溶蛋白200mg與30mgPoloxamer188以15ml70y。乙醇、溶液溶解,再加入10mg水飛薊賓(SN),2500rpm速度^f茲力攪拌使溶解,迅速加入無水乙醇36ml,繼續攪拌20min,滴加1%戊二醛溶液1.2ml,繼續攪拌固化8-12h,旋轉蒸發除去部分乙醇,即得納米組合物膠體溶液。向此溶液中加入葡萄糖200mg,甘露醇200mg,充分溶解,凍幹即得納米組合物凍乾粉針劑。加去離子水復溶後測定粒徑為280nm,多分散指數(PDI)0.112。實施例3小麥醇溶蛋白120mg與16mg卵磷脂以6ml70%乙醇溶液溶解,再加入2.4mg水飛薊賓(SN),500rpm速度磁力攪拌使溶解,迅速加入無水乙醇24ml,繼續攪拌30min,滴加2%甲醛溶液2.4ml,繼續攪拌固化8-12h,旋轉蒸發除去部分乙醇,即得納米組合物膠體溶液。向此溶液中加入葡萄糖100mg,甘露醇100mg,充分溶解,凍幹即得納米組合物凍乾粉針劑。加去離子水復溶後測定粒徑為480nm,多分散指數(PDI)0.352。實施例4小麥醇溶蛋白120mg與8mg卵磷脂、8mgPoloxamer188以10m簡乙醇溶液溶解,再加入2.4mg水飛薊賓(SN),500rpm速度/F茲力攪拌使溶解,迅速加入無水乙醇24ml,繼續攪拌30min,滴加2%丁二酮溶液1.4ml,繼續攪拌固化8-12h,旋轉蒸發除去部分乙醇,即得納米組合物膠體溶液。向此溶液中加入葡萄糖100mg,甘露醇100mg,充分溶解,凍幹即得納米組合物凍乾粉針劑。加去離子水復溶後測定粒徑為320nm,多分散指數(PDI)0.218。權利要求1、一種納米組合物,其特徵在於是由水飛薊賓和載體材料小麥醇溶蛋白組成的,粒徑為50~500納米,其中水飛薊賓的質量百分含量為2%~20%。2、如權利要求l所述的納米組合物,其特徵在於載體材料小麥醇溶蛋白是分子量範圍在200KD30KD的一組蛋白質,來源於小麥麵筋粉。3、如權利要求1或2所述的納米組合物,其特徵在於該納米組合物是通過去溶劑化法製備、並在乙醇環境下以醛、酮類固化劑固化得到的,具體步驟如下A.將水飛薊賓與小麥醇溶蛋白溶解於70%乙醇中,形成相a;B.將無水乙醇迅速倒入攪拌狀態下的a相中;C.滴加醛酮類固化劑固化,旋轉蒸發除去乙醇,即得水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物膠體溶液。4、如權利要求3所述的納米組合物的製備方法,其特徵在於還包括在水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物膠體溶液中加入2%~10°/。藥學上可接受的凍幹支架劑,經冷凍乾燥製得水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物凍乾粉針劑。5、如權利要求3所述的納米組合物的製備方法,其特徵在於,還包括,在水飛薊賓小麥醇溶蛋白納米組合物膠體溶液中加入表面活性劑或穩定劑。6、如權利要求5所述的納米組合物的製備方法,其特徵在於表面活性劑或穩定劑為卵磷脂、大豆磷脂、泊洛沙姆188(Poloxamer188)、吐溫類、司盤類、十二烷基^fu酸鈉、蔗糖脂肪酸酯類的一種或幾種。7、如權利要求3所述的納米組合物的製備方法,其特徵在於使用的固化劑醛、酮類化合物包括曱醛、戊二醛或丁二酮,濃度為0.1°/。~1%。8、權利要求1~7任一權利要求所述的納米組合物在製備治療肝炎藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種新型給藥系統載體材料小麥醇溶蛋白與水飛薊賓製成的肝靶向納米組合物。並提供了該納米組合物的製備方法,是通過去溶劑化法達到藥物與材料在同一體系中共沉澱;通過該方法製備的納米組合物膠體溶液還可以與藥學上可接受的凍幹支架劑混合後製成注射用凍乾粉針劑。該納米組合物能夠提高藥物在肝臟部位的血藥濃度,從而更好的發揮治療肝炎的藥效作用。文檔編號B82B3/00GK101317840SQ20071011050公開日2008年12月10日申請日期2007年6月6日優先權日2007年6月6日發明者周亞偉申請人:周亞偉