一種基於毛細管的順序注射分析裝置及其使用方法
2023-09-19 08:28:20
專利名稱：一種基於毛細管的順序注射分析裝置及其使用方法
技術領域：
本發明涉及的領域為流動分析，特別是涉及一種基於毛細管的順序注射裝置及其使用方法。
背景技術：
流動分析是六七十年代以來發展起來的一種自動化分析技術，隨著社會的發展，傳統的以玻璃器皿和量器為主要工具的手工操作模式逐漸無法滿足人們的需求，出現了管道連續流動分析技術。Ruzicka與Hansen於1975年提出了流動注射分析(Flow injection analysis，FIA)的概念，他們利用了細管道(＜1mm內徑)中液體層流狀態的可控性與重現性，加上準確的時間(即流速)控制，實現了重現、但非完全的混合狀態，並在此基礎上來實現重現、而未必完全的化學反應.這一觀念的提出大大提高了分析速度，使每小時測定上百試樣成為可能，同時也促進了分析系統的微型化。順序注射分析(Sequential Injection Analysis，簡稱SIA)是1990年Ruzicka和Marshall提出的。順序注射分析系統的核心部件是一個多通道選擇閥。此閥的各個通道位置分別與檢測器、樣品、試劑等通道相連，公共通道與一個可以抽吸和推動液體的泵相通。通過泵的作用，順序從不同的通道吸入一定體積的區帶到泵與閥之間的儲存管中。然後將這些溶液區帶推至檢測器，在這一過程中樣品和試劑的區帶之間在管道中由於徑向和軸向的分散作用而互相滲透引起試劑與樣品帶的重疊和混合，試劑與樣品發生比學反應，導致反應產物的形成。在檢測器中可以得到與正常流動注射分析中類似的峰型信號。
20世紀九十年代出現了基於微加工的通道網絡晶片的微流控分析技術，把試樣的採集、預處理、分析檢測等集成在幾平方釐米的面積內，可以高效、快速地完成試樣分析和檢測，是目前分析化學領域的熱點之一。微流控分析發展之初借鑑了流動注射分析；經過十幾年的發展，微流控分析有了廣闊的發展，同時提出了一些基於微晶片的流動注射(Andrew M.Leach，Aaron R.Wheeler，and Richard N.Zare.Flow Injection Analysis in a MicrofluidicFormat.Analytical Chemistry，2003，75967-972)和順序注射系統(Richard Davidsson，Frédéric Genin，Martin Bengtsson，et.al.Microfluidic biosensing systems Part I.Development and optimisation of enzymatic chemiluminescent m-biosensors based onsilicon microchips.Lab On a Chip，2004，4481-487)。在前面的專利(微分析晶片的高通量連續換樣裝置及其使用方法，中國專利申請號200410016224.8)中，提出了一種基於毛細管取樣探針的高通量連續換樣裝置及其使用方法，通過在樣品液槽上加工取樣缺口，使得快速連續的微量可控制體積進樣成為可能。基於這一技術，建立了基於微流控晶片的高通量流動注射分析系統(Wen-Bin Du，Qun Fang，Qiao-Hong He，Zhao-Lun Fang.High-Throughput Nanoliter Sample Introduction Microfluidic Chip-Based FlowInjection Analysis System with Gravity-Driven Flows.Analytical Chemistry，2005.771330-1337)。其特點是無須藉助泵閥，依靠重力和表面張力作用，實現自動快速的流動注射分析；且可以實現多樣品的連續快速換樣。
一般流動分析的系統往往採用機械閥系統(如採樣閥和多通閥等)實現試樣的引入、試劑、載流的切換和混合等操作。而本發明利用了毛細管出口作為液體驅動端，利用毛細管入口作為試樣、試劑和載流的順序無閥引入端。實現了無閥多液體的順序引入。基於這一特點，系統的結構大大簡化。而相同的微流體操作如果要在微流控晶片上實現，需要加工混合通道和多個樣品試劑液槽，而且成本高。
發明內容
本發明的目的在於突破以往順序注射、流動注射基於注射泵和多通閥以及盤管的結構特點所帶來的微型化局限，建立一種基於毛細管通道的快速順序注射分析系統，不需要採用昂貴複雜的多位選擇閥，即可實現納升級無閥多液體的順序引入，完成高通量微流控順序注射分析操作。
本發明提供一種基於毛細管的順序注射分析裝置，由毛細管、試樣管陣列液體引入系統、毛細管內液體驅動系統和毛細管內試樣的檢測系統組成，其特徵是毛細管出口作為液體驅動端，毛細管入口作為試樣、試劑和載流的順序無閥引入端，所述毛細管入口端與試樣管陣列液體引入系統的試樣管出口相連通，試樣管陣列液體引入系統由兩個以上的試樣管構成的陣列和試樣管平臺組成，試樣管固定於試樣管平臺上，毛細管出口與液體驅動系統連接。
根據本發明，所述的毛細管是系統的主體部分，液體從入口端流向出口端，並在毛細管內進行混合、反應。毛細管材質可以是多種多樣的，包括石英，或者玻璃，或者金屬，或者高分子聚合物材料。毛細管通道內徑在10納米至5毫米之間，較佳的內徑是5～250微米。毛細管管壁厚度在1微米至5毫米範圍內。毛細管長度在1毫米至10米範圍內，較佳的管長範圍是5毫米～50釐米。
根據本發明，所述的試樣管呈水平放置固定在試樣管平臺上。在試樣管的底部需特殊加工一個寬度在10微米至30毫米範圍，深度在1微米至5毫米範圍的供毛細管進口端出入的試樣管出口。試樣管內裝入液體的種類包括試樣液、試劑液、載液。試劑液的作用是與試樣發生化學反應，通過測定化學反應的產物間接完成對試樣的定性和定量分析。試劑液的種類可以有多種。載液的作用是攜帶試樣液和試劑液由毛細管進口端流向毛細管出口端。具體選擇何類液體，以及裝有這些液體的試樣管的排列順序，需要依據具體的分析體系而定。由於試樣管出口的尺度較小，當試樣管水平放置時，依靠表面張力的作用，裝入試樣管內的液體不會由試樣管出口溢出。試樣管的外徑範圍是0.5毫米至10釐米，較為常用的是在2毫米至2釐米之間。試樣管內轉載液體的體積範圍是1納升至100毫升，由此也決定了試樣管的長度。
根據本發明，所述的試樣管陣列液體引入系統中，安裝有試樣管的試樣管平臺能進行一維，或者二維，或者三維的平移運動，或者能進行二維或者三維的轉動，或者能進行上述平移和轉動的複合運動。移動的目的是使平臺上的各試樣管按一定順序與毛細管進口端接觸，實現按既定程序的多液體順序引入。
根據本發明，裝置中採用的液體驅動系統，與毛細管出口連接。驅動液體的方向為從毛細管進口向毛細管出口流動或者抽吸。驅動系統採用重力驅動動力，或者電滲驅動動力，或者機械驅動動力。採用機械驅動動力的驅動系統包括注射泵，或者蠕動泵，或者往復泵。
重力驅動流的通常方法是將毛細管出口端通過一定長度的導管與一水平廢液管相連，在水平廢液管與毛細管入口端形成一定的液位差，即可實現重力驅動。
驅動系統的驅動流速範圍是1皮升/分鐘至10毫升/分鐘。
根據本發明，在所述的基於毛細管的順序注射分析裝置中，向毛細管內引入液體的方法是，移動試樣管平臺帶動試樣管與毛細管入口端接觸，毛細管入口端通過試樣管出口浸入試樣管內液體中一定時間，在驅動系統驅動下，一定體積的試樣管內液體流入到毛細管中。
採用上述方法進行液體引入，引入毛細管中液體的體積由兩個因素決定，毛細管口在試樣管內液體中的停留時間和液體在毛細管中的流速。通過改變上述兩因素，可改變引入液體的體積。在液體引入過程中，毛細管進口在試樣管液體中的停留時間範圍是1毫秒至60分鐘；被引入毛細管的每一種液體的體積範圍是1飛升至500微升。當毛細管進口端在兩個試樣管之間切換時，當流速較快時，有可能將氣泡吸入毛細管內影響測定。解決的方法是採用快速切換的方法，使在毛細管進口端的液體尚未縮入毛細管內而產生氣泡之前就切換到下一個試樣管；或者利用液體在毛細管出口端的表面張力，使得在切換過程中，毛細管內液體保持停流狀態。
本發明所述的毛細管上順序注射分析裝置的使用方法是，移動試樣管平臺帶動其上的多個試樣管按一定順序依次與毛細管入口端接觸，毛細管入口端通過試樣管進口浸入試樣管內液體中停留一定時間，在驅動系統驅動下，使一定體積的不同試樣管內的液體，種類至少包括試樣液和載液，按一定順序被引入毛細管內，液體從毛細管入口端以一定流速流向毛細管出口端，在流動的過程中，順序引入毛細管內的試樣液與其它液體之間發生物理混合，與試劑液之間發生化學反應，在毛細管出口端附近，通過對試樣本身，或者試樣與試劑的化學反應的產物進行檢測。
對試樣的測定能直接進行的分析體系，順序注射分析過程中僅需向毛細管內引入試樣液和載液兩類液體(見實施例二)。對於因條件的限制，對試樣的測定不能直接進行的分析體系，需藉助試樣與試劑的化學反應，通過測定化學反應的產物間接完成對試樣的定性和定量分析。因此順序注射分析過程中需向毛細管內引入試樣液、載液和試劑液三類液體(見實施例一)。
根據本發明，對於毛細管內試樣的反應產物的檢測方法，通常採用柱上檢測模式，或者流出檢測模式。前者檢測點位於毛細管上，後者檢測由毛細管出口流出的試樣，可以使用的檢測技術包括化學發光法，螢光法，光度法，電化學方法，質譜法等。
根據不同的分析體系，試樣管中裝載液體的種類不同，同時試樣管在平臺上的排列順序也不同，即各液體引入毛細管中的順序和體積也不同。通過改變裝有不同種類液體的多個試樣管在試樣管平臺上的排列順序，可改變毛細管內液體的引入順序。不同的液體的引入順序對分析性能有較大影響，需要在具體實驗系統上通過優化實驗進行選擇。
與現有技術相比，本發明的優點是1.試樣試劑的消耗量極低，達到微流控晶片的水平，適合於體積微小珍貴的生化樣品的分析。
2.系統分析通量高，分析的重現性好。
3.本系統利用了毛細管出口作為液體驅動端，利用毛細管入口作為試樣、試劑和載流的順序無閥引入端。實現了無閥多液體的順序引入。基於這一特點，系統的結構大大簡化，系統加工簡單方便，成本低。
圖1本發明結構示意圖；圖2本發明實施例一系統進行分析得到的信號記錄圖；圖3發明的實施例二的結構示意圖；圖4採用本發明優選實施例二系統進行分析得到的信號記錄圖。
圖中毛細管1、毛細管入口端2、毛細管出口端3、試樣管4、試樣管缺口5、試樣管平臺6、標準溶液7、試劑液8、9、載液10、發光檢測系統11、發光鏡12、塑料軟管13、廢液管14、去離子水15、試樣管平臺陣列轉盤16、螢光素標準溶液17、18、19、20、21、螢光檢測系統2具體實施例方式實施例一圖1為根據本發明的優選實施例一的結構示意圖。採用石英毛細管(1)(內徑75微米，外徑375微米)構建系統，毛細管長5釐米，毛細管進口端(2)的保護層用鋒利的小刀刮去，毛細管進口端(2)表面用二氯二甲基矽烷進行矽烷化處理以避免液體引入過程中的殘留汙染。試樣管(4)由200微升塑料離心管制成，底部均加工有寬0.8毫米，深1毫米的缺口(5)。四個試樣管(4)水平排列於在一維電控平移臺(6)上。四個試樣管(4)內分別加入100微升的試樣液-過氧化氫標準溶液(7)，試劑液-魯米諾溶液(8)(7毫摩爾/升，pH＝10.5)、試劑液-鐵氰化鉀溶液(9)(20毫摩爾/升)，和載液-去離子水(10)。毛細管上的化學發光檢測系統採用光電倍增管(11)作為光電轉換器件，放在毛細管(1)上方0.5釐米處，檢測區域距毛細管出口端(3)的距離為1釐米。毛細管(1)下方用一發光鏡(12)增加光電倍增管(11)收集的光量。毛細管出口端(3)與PVC塑料軟管(13)(內徑2毫米，20釐米長)相連，軟管出口連接一水平放置的由1毫升醫用注射器改裝的水平廢液管(14)，組成重力液流驅動系統。廢液池和軟管中事先充滿去離子水(15)。通過調節廢液管(14)相對於毛細管進口端(2)的垂直距離，調節毛細管(1)內的液體流速。
圖2採用本發明優選實施例一系統進行分析得到的信號記錄圖。廢液管(14)相對於毛細管進口端(2)的垂直距離為6釐米，在室溫25攝氏度，測得流速為10.1納升/秒。使毛細管進口端(2)通過缺口(5)浸試樣管(4)內進行液體引入。計算機控制電控平移臺進行一維平移運動，使毛細管進口端(2)依次浸入魯米諾溶液(7)、過氧化氫溶液(8)、鐵氰化鉀溶液(9)和載液(10)。其中在前三個溶液內各停留0.5秒時間(進樣量為5納升)，在載液(10)停留5秒時間。分析通量可達到500樣/小時。如圖為1微摩爾/升過氧化氫標準系列的記錄圖，信號峰高相對標準偏差為1.0％(n＝4)。
實施例二圖3為根據本發明的優選實施例二的結構示意圖；
採用石英毛細管(1)(內徑75微米，外徑375微米)構建系統，毛細管(1)長6釐米，毛細管進口端(2)的保護層用鋒利的小刀刮去，毛細管進口端(2)表面用二氯二甲基矽烷進行矽烷化處理以避免液體引入過程中的殘留汙染。試樣管(4)由200微升塑料離心管制成，底部均加工有寬0.8毫米，深1毫米的缺口(5)。10個試樣管(4)水平排列於試樣管陣列轉盤(16)上，盤上平均分布10個樣品管(4)。試樣管內依次間隔裝入100微升不同濃度的螢光素標準溶液(試樣液)和載液-去離子水(9)，不同濃度的螢光素標準溶液包括50納摩爾/升(17)、100納摩爾/升(18)、150納摩爾/升(19)、200納摩爾/升(20)和250納摩爾/升(21)螢光素溶液。轉盤(16)由細分步進電機驅動，通過電腦並口通訊，控制轉動方向、角度和停留的時間，實現自動液體引入和進樣體積的精確控制。毛細管內試樣的檢測採用雷射誘導螢光檢測系統(22)(激發光波長473納米)。檢測點距毛細管出口端(3)的距離為1釐米。毛細管出口端(3)與PVC塑料軟管(13)(內徑2毫米，20釐米長)相連，軟管出口連接一水平放置的由1毫升醫用注射器改裝的水平廢液管(14)，組成重力液流驅動系統。廢液池和軟管中事先充滿去離子水(15)。通過調節廢液管(14)相對於毛細管進口端(2)的垂直距離，調節毛細管(1)內的液體流速。
圖4為採用本發明優選實施例二系統進行分析得到的信號記錄圖。廢液管(14)相對於毛細管進口端(2)的垂直距離為20釐米，在室溫25攝氏度，測得流速為26.4納升/秒。計算機控制轉盤(16)進行轉動，使毛細管進口端(2)依次浸入螢光素溶液(21)、載液(10)、螢光素溶液(20)、載液(10)、螢光素溶液(19)、載液(10)、螢光素溶液(18)、載液(10)、螢光素溶液(17)和載液(10)。在各螢光素溶液內停留時間均為1秒(進樣量為26.4納升)，在各載液(10)內停留時間均為7.3秒。循環重複上述操作，得到50-250納摩爾/升標準曲線(R2＝0.9998)。分析通量達到每小時400樣以上。
權利要求
1.一種基於毛細管的順序注射分析裝置，由毛細管、試樣管陣列液體引入系統、毛細管內液體驅動系統和毛細管內試樣的檢測系統組成，其特徵是毛細管出口作為液體驅動端，毛細管入口作為試樣、試劑和載液的順序無閥引入端，所述毛細管入口端與試樣管陣列液體引入系統的試樣管出口相連通，試樣管陣列液體引入系統由兩個以上的試樣管構成的陣列和試樣管平臺組成，試樣管固定於試樣管平臺上，毛細管出口與液體驅動系統連接。
2.根據權利要求1所述的基於毛細管的順序注射分析裝置，其特徵在於，裝置中採用的毛細管的材質為石英，或者玻璃，或者金屬，或者高分子聚合物材料；毛細管通道內徑在10納米至5毫米之間；毛細管管壁厚度在1微米至5毫米範圍內；毛細管長度在1毫米至10米範圍內。
3.根據權利要求1所述的基於毛細管的順序注射分析裝置，其特徵在於，試樣管出口寬度在10微米至30毫米範圍，深度在1微米至5毫米；試樣管的外徑範圍是0.5毫米至10釐米。
4.根據權利要求1所述的基於毛細管的順序注射分析裝置，其特徵在於，試樣管平臺能進行一維，或者二維，或者三維的平移運動，或者能進行二維或者三維的轉動，或者能進行平移和轉動的複合運動。
5.根據權利要求1所述的基於毛細管的順序注射分析裝置，其特徵在於液體驅動系統與毛細管出口端連接，液體從毛細管入口端流向毛細管出口端，驅動系統採用重力驅動動力，或者電滲驅動動力，或者機械驅動動力。
6.權利要求1所述的基於毛細管的順序注射分析裝置的使用方法，其特徵在於，移動試樣管平臺帶動其上的多個試樣管按一定順序依次與毛細管入口端接觸，毛細管入口端通過試樣管進口浸入試樣管內液體中停留一定時間，在驅動系統驅動下，使一定體積的不同試樣管內的液體，至少包括試樣液和載液，按一定順序被引入毛細管內；液體從毛細管入口端以一定流速流向毛細管出口端；在毛細管出口端附近，對試樣或者其化學反應的產物進行檢測。
7.根據權利要求6所述的基於毛細管的順序注射分析裝置的使用方法，其特徵在於對毛細管內試樣或者其反應產物的檢測方法採用柱上檢測模式，或者流出檢測模式，包括化學發光法，螢光法，光度法，電化學方法，質譜法。
8.根據權利要求6所述的基於毛細管的順序注射分析裝置的使用方法，其特徵在於，毛細管進口端在試樣管液體中的停留時間範圍是1毫秒至60分鐘。
9.根據權利要求6所述的基於毛細管的順序注射分析裝置的使用方法，其特徵在於被引入毛細管的每一種液體的體積範圍是1飛升至500微升。
10.根據權利要求6所述的基於毛細管的順序注射分析裝置的使用方法，其特徵在於在毛細管內的液體流速是1皮升/分鐘至10毫升/分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種基於毛細管順序注射分析裝置及其使用方法，該裝置的特徵是，系統由毛細管、試樣盤和毛細管出口液流驅動系統三部分組成。利用試樣管陣列的移動，在毛細管內實現多試樣和試劑液體的引入、在線快速混合、反應和檢測。本發明的優點是系統結構簡單，容易實現自動化操作，試樣試劑消耗量低，分析通量高。
文檔編號G01N33/48GK1818662SQ200610049830
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月14日 優先權日2006年3月14日
發明者方群, 杜文斌 申請人:浙江大學