用於檢驗凝血的方法和設備的製作方法

2023-09-19 08:26:05 4

專利名稱：：用於檢驗凝血的方法和設備的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於檢驗凝血的方法和裝置的領域。
背景技術：
：止血是指使出血停止的過程。止血是控制凝血的複雜的生物化學網絡的結果。該網絡的主要功能之一是促使血管受傷的部位引發凝血並使血凝局部化。當該網絡無法正確地發揮其功能時可能引起導致大出血的過度出血，或者相反，可能造成過度的凝塊增長，這將導致血栓形成並因此引起心臟病發作和中風。因此，在正確的位置中引發血凝塊的形成並維持局部性凝結響應對該網絡的功能是必要的。然而，調控該響應的機制仍遠未得到表徵，在美國，與凝血異常有關的疾病仍是死亡的第一主因。進行診斷凝血異常的實驗應該包括體內存在的相關時空參數。這些參數包括i)包含見於血管表面上和血管損害區域中的分子的異質表面，ii)模擬血管幾何形狀的通道，和iii)類似於體內所觀察到的血流。引入這些參數的臨床實驗會更精確地診斷與凝血有關的疾病，而且可以減少與這些疾病有關的死亡數量。然而，用以診斷與凝血有關的疾病的現行臨床實驗並不包括這些時空參數。這些方法包括i)活化部分促凝血酶原激酶時間(APTT)測試，ii)凝血酶原時間(PT)測試，和iii)血小板凝集率。缺乏時空參數，這些臨床測試可能造成誤診或甚至不能診斷。因此，需要用於診斷與凝血有關的疾病的新的臨床方法。
發明內容本發明提供了一種用於檢驗凝結活性的設備。在一個實施方式中，所述設備包括輸入血液流體的入口、與所述入口以流體連通的導管(vessel)、和所述導管中的至少兩個補塊(patch)。每個所述補塊包括與來自受試對象的血液流體接觸時能夠引發凝結途徑的激活材料。一個所述補塊中的所述激活材料不同於另一個所述補塊中的所述激活材料；或一個所述補塊在所述激活材料的濃度上不同於另一個所述補塊；或一個所述補塊具有不同於另一個所述補塊的表面積；或一個所述補塊具有不同於另一個所述補塊的形狀；或一個所述補塊具有不同於另一個所述補塊的尺寸。所述設備可以包含多個補塊。在該實例中，一組補塊之間的距離不同於另一組補塊之間的距離。所述設備可以包括與所述導管中的表面聯合的多個補塊，其中第一組補塊在第一位置而第二組補塊在第二位置，並且其中第一組補塊的數量不同於第二組補塊的數量。激活材料可以包括選自由以下凝結刺激物組成的組中的至少一種凝結刺激物組織因子、因子n、因子XII、因子X、玻璃、玻璃樣物質、高嶺土、硫酸葡聚糖、細菌和細菌組分。所述設備可以包括珠子，其中所述補塊與所述珠子聯合。所述設備可以包括作為珠子的補塊。所述補塊還可以包括惰性材料。所述設備的導管可以包括兩個相交的微通道，所述微通道彼此流體連通。本發明提供了一種檢驗凝血的方法。所述方法包括使來自受試對象的血液流體與至少兩個補塊接觸，其中每個所述補塊包括與來自受試對象的血液流體接觸時能夠引發凝結途徑的激活材料。一個所述補塊中的激活材料不同於另一個所述補塊中的激活材料；或一個所述補塊在所述激活材料的濃度上不同於另一個所述補塊；或一個所述補塊具有不同於另一個所述補塊的表面積；或一個所述補塊具有不同於另一個所述補塊的形狀；或一個所述補塊具有不同於另一個所述補塊的尺寸。所述方法包括確定哪些補塊引發來自所述受試對象的血液流體的凝結。當實施所述方法的時候，所述激活材料可以能夠在來自健康受試對象的血液流體中引發凝結途徑。所述接觸保持一段足以至少讓最大的補塊在來自健康受試對象的血液流體中引發凝結途徑的時間。所述方法可以用尺寸可以不同的第一補塊和第二補塊實施，或用激活材料可以不同的第一補塊和第二補塊實施。同樣，第一補塊和第二補塊中的激活材料的濃度可以不同。所述方法也可以包括使來自受試對象的血液流體與第三補塊和第四補塊接觸，其中所述補塊與表面聯合，並且所述第一補塊和第二補塊之間的距離不同於所述第二補塊和第三補塊之間的距離。所述方法可以以每補塊單獨地與珠子聯合來實施。每個珠子的或者尺寸或者形狀可以不同。同時，所述方法可以以凝結途徑為血小板凝集途徑的方式來實施。使來自受試對象的血液流體與補塊接觸可以包括首先使第一量的血液流體與第一濃度的珠子進行第一接觸，和使第二量的血液流體與第二濃度的珠子進行第二接觸，其中各珠子獨立地與含有激活材料和惰性材料的補塊聯合。可以用尺寸逐漸增大的珠子滴定血液流體的等分試樣。所述血液流體可以作為連續流與補塊接觸。作為選擇，血液流體可以以通過非混溶性質所區分幵的液滴的形式與補塊相接觸。所述導管還可以是微流體通道。測定哪些補塊引發凝結可以包括光學觀測。所述光學觀測可以包括測量光的散射。所述方法可以以所述血液流體為選自由全血和血漿組成的組的血液流體的方式實施。所述方法可以包括首先將過量的凝結因子加入到血液流體中然後使血液流體與補塊接觸。所述方法可以包括將測試物質加入到血液流體中然後使血液流體與補塊接觸。所述方法可以包括監測血凝塊的增長速度。所述方法也可以包括將來自不同受試對象的血液流體加入到所述血液流體然後使所述血液流體與補塊接觸。本發明提供了用於測量凝塊增長的設備。所述設備包括包含激活材料的第一區域和與所述第一區域連通的適用於監測凝塊增長的第二區域。當血液流體被放在第一區域時，凝塊形成並增長至所述第二區域。所述設備可以包括包含激活材料的補塊。所述設備可以包括包含第一區域和第二區域的微通道。作為選擇，所述設備可以包括多個平行的微通道，每個微通道包含第一區域和第二區域。所述設備可以包括至少一組交叉的微通道，其中第二區域處在第一組微通道的交叉點處。所述設備可以包括多個微通道和所述微通道的至少兩個交叉點，其中第二區域位於其中的一個交叉點處，並且其中兩個交叉點的尺寸不同。本發明提供了監測凝塊增長的方法，所述方法包括以下步驟使血液流體與所述設備的第一區域接觸(所述第一區域包含激活材料)，和監測所述設備的第二區域內的凝塊增長(其中所述第二區域與所述第一區域連通)。圖1是擴散和反應之間的競爭的示意圖，所述競爭決定凝結的引發是否會在給定的補塊上發生。圖2所示的圖片和曲線圖描述在沒有流動的情況下通過微流體通道的血凝塊的增長的測量結果。圖3所示的圖片和曲線圖描述導管-至-導管結合部如何能夠用來評價血凝塊增長的閾值。圖4所示的基於簡單的化學機理的曲線圖描述用於凝結引發的數值模擬。圖5描述化學模型和血漿中的引發的比例換算關係，其中顯示所述引發如何響應凝結刺激物即組織因子(TF)的量。圖6所示的圖片和曲線圖描述人類血漿的凝結引發如何響應相同面積的表面補塊的形狀。圖7所示的圖片描述簡化的反應-擴散體系的數值模擬如何證明對形狀的響應。圖8所示的圖片和曲線圖描述構造到模仿止血的簡化化學體系如何響應提供相同面積的刺激物的表面補塊的形狀。圖9是以化學模型試驗裝置的示意圖。圖10圖示了描述速率方程的速率圖如何被引入模塊化機制的數值模擬中的曲線圖。圖11是顯示示出模型中引發"凝結"的概率的數值模擬如何顯示對補塊尺寸的閾值響應。圖12示意性描述用於血漿和全血實驗中的微流腔室。圖13描述所產生的酸的量如何取決於補塊的總表面積。圖14描述化學模型中的pH敏感顏料在光致酸表面上的螢光強度譜的定量。圖15描述血漿凝結的引發的定量。圖16描述陣列上血漿凝結的引發的定量。圖17所示的圖片和曲線圖描述人類血漿和簡單的化學模型如何都能引發凝結並且對提供凝結刺激物的補塊的尺寸具有閾值響應。圖18所示的圖片和曲線圖描述化學模型如何正確地預測人類血漿中凝結的體外引發依賴於空間分布而不是依賴於提供組織因子(TF，一種凝結的激活劑)的脂質表面的總表面積。圖19所示的圖片描述化學模型如何正確地預測人類血漿凝結的引發能在通過擴散連通的子閾值補塊的緊密簇(tightduster)上發生。圖20所示的圖片描述化學模型如何正確地預測藉助第二(因子XII)途徑進行的凝結的引發。圖21是所提議的在高(a)和低(b)剪切速率下通過兩個導管的結合部調控凝塊增長的機制的示意圖。圖22是對,的閾值如何通過所述結合部調控凝塊增長的示圖。圖23是通過結合部的凝塊增長如何在結合部而不是在"膜瓣"處受到戶的調控。圖24描述通過結合部的凝塊增長如何能夠通過加入抑制劑而發生改變。圖25是監測在流動的情況下通過結合部的凝塊增長的實驗程序的示圖。圖26是顯示用於在流動的情況下通過結合部的凝塊增長的裝置的實際幾何形狀和尺寸的示意圖。圖27是用於測定APTT和用於滴定阿加曲班的基於栓塞的微流裝置的示圖。圖28描述在使用疏水性側通道的微流裝置中的溶合。圖29是親水性玻璃毛細管如何插入側通道內的示圖和顯示如何通過流速控制注入到栓塞內的體積的圖表。圖30是使用亮視野顯微術檢査的示圖和全血的栓塞內所觀察的凝塊的圖表。圖31描述使用明視野和螢光顯微術檢查的圖片和富含血小板的血漿(PRP)的栓塞內形成纖維蛋白凝塊的圖表。圖32所示的曲線圖描述在將阿加曲班滴定到血樣中的同時在23°C時凝血酶生成和APTT的測量結果。圖33所示的曲線圖描述在將阿加曲班滴定到(a)所匯集的正常血漿、(b)供體血漿中的同時在37。C時的APTT測量結果，以及APTT(c)的對應值及(d)APTT比率的對應值。圖34描述在沒有流動的情況下可用來並行監測多個血樣的凝塊增長的裝置的一個實例。圖35描述能用來監測凝結的三個方面的裝置的實例i)引發，ii)沒有流動的情況下的增長，和iii)流動血樣中的增長。圖36是用於檢驗以下假設的實驗的示意圖，g卩，重要的是單獨補塊的尺寸P而不是總表面區。圖37是用於檢驗以下假設的實驗的示意圖，即，亞閾值補塊群在一起靠近到足以通過擴散來連通時會引發凝結。圖38描述能夠快速表徵個人的凝結勢(clottingpotential)的系統的示意圖。具體實施例方式為了有助於對本發明原理的理解，現在將參考本發明的某些優選的實施方式，而且將使用特定的術語來描述所述實施方式。然而應當理解的是並沒有任何要藉此限定本發明範圍的意思。在此描述的本發明的原理的任何改變、進一步的改進和應用均認為是本發明所屬
技術領域：
的技術人員通常會想到的。血液的凝固是一個複雜的過程，在這一過程中，血液形成固體凝塊。血液凝固是止血(使從受損血管失血停止)的一個重要部分，由此使纖維蛋白凝塊覆蓋受損血管壁從而使流血停止並有助於受損血管的恢復(在Davie，2003，J.Biol.Chem.278:50819-50832;Nemerson,1988,Blood71:1-8中的綜述)。簡而言之，血管受傷時，血小板附著在內皮下組織中的大分子上，然後聚集形成原初止血栓塞。所述血小板刺激血槳凝結因子的局部激活，導致形成能加固所述血小板聚集體的纖維蛋白凝塊。在所述凝結級聯中，所述"接觸激活"途徑(也稱之為"內在"途徑)和組織因子途徑(也稱之為"外在"途徑)導致纖維蛋白形成。當傷口癒合時，所述血小板聚集體和纖維蛋白凝塊被破壞掉。將血小板聚集體和纖維蛋白凝塊限制性形成於受傷位置處對於保持血液流動是必須的。本發明提供了一種能用於測量表面上血液流體凝結時間的設備(也稱為裝置)。能採用諸如溼式和乾式蝕刻和/或其他傳統平版印刷術或微機械加工技術(如軟平版印刷術)製作或製造所述設備。如此處所使用，術語"設備"包括那些被稱為，己知為或者分類為微製作裝置的設備。在一個實例中，本發明的設備可具有每邊約0.3cm約15cm和厚度約1pm約1cm的尺度，但所述設備的尺度也可在這些範圍之外。所述設備可由各種材料製成，並且通常由諸如聚合物、金屬、玻璃、複合物或其他較為惰性的材料等合適的材料製成。所述設備的表面可以是光滑的或者具有圖案的。所述設備的不同側可具有不同的表面。在一個實施方式中，本發明的設備包括輸入血液流體的入口、與所述入口以流體連通的導管、和所述導管中的至少一個補塊。所述補塊包括能在與諸如來自受試者的血液流體等樣品相接觸時引發凝結途徑的凝結刺激物(也稱為"激活材料")。所述補塊也可包括惰性材料。所述惰性材料可與所述激活材料相混合。所述設備的表面可含有凝血刺激物，包括所述外在凝結途徑的激活劑和所述內在凝結途徑的激活劑。例如，表面可包括能引發所述外在凝結途徑的凝結刺激物，諸如組織因子(TF)。表面可包括能引發所述內在凝結途徑的凝結刺激物，諸如玻璃、玻璃樣物質、高嶺土、細菌組分、硫酸葡聚糖、澱粉樣蛋白P、鞣花酸、和其他人工表面。所述凝結刺激物是能引發凝結的任何表面。廣泛已知的引發凝結的表面包括帶負電荷的表面(Gailani和Broze,1991，Science253:909)和結合有凝結因子的表面(Mann,1999，ThrombosisandHaemostasis82:165)。已知能引發凝結的帶負電荷的表面包括玻璃、硫酸葡聚糖和細菌組分(Persson等，2003,J.BiologicalChemistry278:31884)。已知在與表面結合時能引發凝結的凝結因子包括組織因子、因子xn、因子x和因子n(Kop等，1984，J.BiologicalChemistry259:3993;Mann,1999，ThrombosisandHaemostasis82:165)。此外，許多細胞提供能作為刺激物的表面(Mann等，1990，Blood76:1)。所述設備可包含一種類型的血液凝結刺激物。作為另外一種選擇，所述設備可包含兩種以上的刺激物。在所述表面上每種刺激物的濃度可變。例如，凝結刺激物可以在生理濃度、藥物相關濃度、超生理濃度(supraphysiologicalconcentration)或亞生理、濃度(subphysiologicalconcentration)使用。兩種以上的刺激物可相互混合。所述刺激物可以在溶液中。所述刺激物也可以在栓塞中。使用栓塞的技術在以下美國專利和專利申請中描述，在此以參考的方式引入US7,129,091B2;US2006/0003439Al;US2006/0094119Al禾QUS2005/0087122Al。一種以上的剌激物可與其他物質、惰性物質、載體、藥物等相混合。例如，在一個優選實施方式中，重新脂化的TF能以1pmol/L1000pmol/L(在55000nmol/L磷脂囊泡(PCPS)中)的濃度使用。PCPS可由例如25%來自牛腦的磷脂醯絲氨酸(PS)和75%來自蛋黃的磷脂醯膽鹼(PC)構成。當TF在囊泡溶液中時，TF在所述囊泡溶液中的優選濃度是約0.10nM約1000nM。作為另外一種選擇，可以使用DLPC/PS/TexasRedDHPE(79.5/20/0.5摩爾百分比)混合囊泡和在lxHEPES-緩衝生理鹽水/Ca^緩衝液中濃度為0.1mg/mL100mg/mL的重構TF。當在補塊中使用TF時，優選TF濃度為約0.0001fmol/cn^約1.0finol/cm2。同樣，對於在補塊中使用TF，優選0.01nM1000nM的TF終濃度。包含一種以上刺激物的補塊可併入到所述裝置的表面，並且通常所述表面是惰性的，或者是很大程度上是惰性的。補塊中的凝結刺激物濃度是可變的。因此，所述設備的表面可具有多個不同形狀、尺寸、刺激物類型和刺激物濃度的補塊。在一個實例中，用具有相同或不同補塊面積的不同形狀的剌激物的補塊在表面上形成圖案。所述補塊的形狀和尺寸可變。所述補塊的形狀和尺寸的三維考慮包括所述補塊的幾何形狀和尺度考慮。在一個實例中，所述補塊可具有對稱的或規則的形狀(例如圓形、方形、矩形、三角形、星形等)。作為另外一種選擇，所述補塊在尺寸和形狀上可以是不規則的。表面上的補塊的數量和密度是可變的。優選為，所述表面的約1%被補塊覆蓋。所述補塊可位於微流體通道的壁上。在某些實施方式中，所述設備能以通道的形式製造。優選的是，當所述設備以通道的形式製造時，所述設備是微通道。在其他實施方式中，所述設備可具有其中已集成有補塊的經製造通道(導管)。在一個實施方式中，設備可包括兩個以上提供流體連通的相互連接的通道。所述通道可具有不同的諸如長度、寬度、厚度、深度等尺度和幾何形狀，並且也可具有不同形式的橫截面，包括方形、矩形、三角形、圓形橫截面等。在一個實施方式中，本發明提供了包括一個以上通道的設備。例如，這樣的設備可以製造為具有微工程化通道的微流裝置的形式。當所述裝置具有至少一個以上的通道時，所述通道的橫截面可以相同或不同。所述通道可以提供相同或不同的流速。所述通道可以是平行的，相互成角度的或者所述通道可以相交。所述通道可具有結合部，其可被用以評估凝塊增長。優選的是，所述結合部是三方向結合部(具有三條臂的結合部)，諸如Y型結合部或T型結合部。所述臂能提供相同的流速。作為另外一種選擇，所述臂能提供不同的流速，在此情況下，其中一條臂通常具有不同的直徑。刺激物可加入到所述通道中，優選為在所述結合部加入到所述通道中。在另一實施方式中，本發明提供了包括沿通道的一個以上補塊的設備。所述設備也可包括至少兩條通道。在該實例中，補塊可沿一條或多條通道放置。在一個實施方式中，本發明提供了具有流過具有至少兩個通道的設備的連續樣品流的設備。在該實施方式中，流體可流過一條通道，而樣品藉助另一條通道引入。例如，所述流體可包括添加劑、凝結刺激物、藥物，或者所述流體可以是載體流體。在一個實施方式中，所述補塊可以在小珠上。作為另外一種選擇，所述小珠本身可以是補塊。在另一個實施方式中，本發明提供了具有在小珠上的補塊的設備，所述小珠流過具有至少一個結合部的通道。在一個實施方式中，在所述樣品被引入後沒有流動。這可以例如使用疏水玻璃毛細管實現。可以引入樣品而無需將所述流體泵入所述設備。作為另外一種選擇，所述樣品可以通過注射加入。可以將測試物質引入到所述設備中。能監測所述測試物質對血液凝結和/或血液增長的作用。所述測試物質可以是候選藥物、小分子、有機或無機分子、聚合物、核酸、肽、蛋白質、化合物庫的一員、擬肽等。所述測試物質可以在血液與補塊接觸前和/或接觸後加入。在另一個實施方式中，本發明提供了具有一條以上通道的設備，所述通道具有裝著各種剌激物的栓塞和用於將樣品引入栓塞的入口部。所述設備可包括至少一個用於促進凝結的結合部。具有補塊的設備可採用本領域內已知的方法進行製造，例如在Zheng等，2004,AdvancedMaterials16:1365-1368;Delamarche等，2005,AdvancedMaterials17:2911-2933;Sia和Whitesides，2003,Electrophoresis24:3563-3576;Unger等，2000，Science288:113-116中所描述。這些文獻在此為所有目的以參考的方式整體引入。在一個實施方式中，所述設備可至少部分地由彈性材料製造，並且通過單層或多層軟平版印刷(MSL)技術和/或犧牲層封裝法進行製造。基本的MSL法包括在微加工模具上鑄造一系列彈性層，從所述模具上移除所述層，然後將所述層融合在一起。在犧牲層封裝法中，在需要通道的所有地方沉積光致抗蝕劑圖案。可通過多種方法製成所需形狀的補塊，包括但不局限於1)可通過在受支撐的脂質膜上微圖案形成法製造補塊(Groves和Boxer,2002，AccountsChem.Res.35:149-157);2)可採用光刻術製造所述補塊。使用光刻術，可以由在惰性脂質背景中的重構TF製成補塊(Yee等，2004,J.Am.Chem.Soc.126:13962-13972;Yu等，2005,AdvancedMaterials17:1477-1480)。使用光刻術，可以由在惰性疏水性玻璃背景中的親水性玻璃製成補塊(Howland等，2005,J.Am.Chem.Soc.127:6752-6765);3)可採用掃描探針平版印刷術製備補塊(Jackson禾口Groves,2004,J.Am.Chem.Soc.126:13878-13879);4)採用將小滴噴到表面上的諸如噴墨印刷技術或類似技術可將補塊印刷在表面上(Steinbock等，1995，Science269:1857-1860);5)可採用微接觸印刷術製備所述補塊(Xia和Whitesides,1998,AnnualReviewofMaterialsScience,28:153-184);6)補塊可以與小珠聯合，其中採用上述或其他方法形成圖案，或者可以具有均勻的表面組成並且沒有圖案。為了在含有一種以上凝結刺激物的表面上發生凝結，所述表面的尺寸必須大於一定尺寸閾值。根據本發明，關於血液凝結的"補塊尺寸閾值"指引發血液凝結的補塊尺寸的下限。不同形狀的補塊(例如方形或星形)具有不同的閾值，即凝結勢。並且，改變所述補塊的尺度(例如矩形補塊的長寬比)將導致不同的凝結勢。因此，所述補塊形狀將決定是否能發生凝結。所述補塊的厚度或深度通常在約1nm約1pm的範圍內。所述補塊也可以是具有約1nm約1mm的寬度的小珠。為了更好的描述本發明，可以根據所述補塊上相互距離最遠的兩點間的最大距離表示所述補塊尺寸。例如，圓形形式的補塊的補塊尺寸等於該圓形的直徑。方形形式的補塊的補塊尺寸等於該方形的對角線。通常，可用於實踐本發明的補塊的尺寸具有約0.01pm約500|im的尺寸閾值。優選的是，所述補塊尺寸閾值小於約100pm。也可用的是將補塊尺寸表示為所述補塊的面積。這對於比較不同形狀的補塊是特別有用的。優選的是，所述補塊的面積為約1^2約1mm2。可用於實踐本發明的補塊包括小於所述補塊尺寸閾值的補塊；這些補塊也稱為"亞閾值"補塊。所述補塊尺寸閾值取決於刺激物的濃度、藥物濃度和血液供體。優選的是，釆用具有約1)Lim大於1cm的尺寸的補塊進行凝結測量。採用納米圖案化技術，可以在納米尺度上測量凝結的引發。相互靠近的一群亞閾值補塊將引發凝結。在會發生凝結的亞閾值補塊間的距離接近於所述補塊尺寸閾值。例如，對於特定的血液樣品和刺激物濃度，所述補塊尺寸閾值可以是75拜。倘若如此，大於75jLim的補塊將快速引發凝結，反之小於75pm的補塊則不會。當相互距離250(im時，50pm的補塊將不會引發凝結，但相距25pm時則將引發凝結。所述補塊可包含各種添加劑，諸如一種以上標籤、報導分子、螢光分子、染料(例如pH敏感、凝血酶敏感)、微生物(例如細菌、病毒)、藥物、蛋白質、代謝物、金屬離子、凝血因子、促凝結因子或藥物、抗凝結因子或藥物、纖溶因子或藥物，或其他化合物。這些化合物可以包埋、凍幹、偶聯或者以任何其他方式與所述補塊聯合。為了使測試可視化，這些化合物可在本發明的某些優選的實施方式，例如在某些檢驗中使用以測試外部加入的物質對血液凝結等的影響。在給定補塊中任一這些化合物的濃度可變。可以將多於一種的如此化合物加入到補塊中。任一這些化合物可以加入到一個以上的補塊中。當在溶液中監測凝結時也可以加入添加劑。改變所述補塊中指定凝結刺激物的濃度將以可預測的方式改變所述補塊尺寸閾值。同樣，改變凝結抑制藥物的濃度也將以特定方式影響所述補塊尺寸閾值。使用來自不同供體(包括帶有不健康血液的供體)的血流將以可預測的方式給出不同的補塊尺寸閾值。同樣，所述補塊尺寸閾值隨刺激物濃度和所加入的藥物而變化。如果一組小補塊靠近在一起，小補塊能引發凝結。補塊間的距離可在約0.01)im約500pm的範圍內變化。優選的是，補塊間的距離小於約100拜。至少有兩個補塊的第一組中最靠近的成員之間的距離可以與至少有兩個補塊的第二組中最靠近的成員之間的距離不同。在一些實施方式中，所述補塊能單獨使用，而在其他實施方式中，一些補塊可與其他相似或不相似的補塊共同配合使用。因此，在該設備的一個實施方式中，具有相似或不相似的刺激物的補塊可加入到惰性背景中。具有補塊的表面可懸浮在溶液中。以及，表面可形成為微粒或小珠。因此，可用於實踐本發明的補塊可與微粒或小珠聯合。作為另外一種選擇，所述補塊可以是三維立體的並且採用微粒或小珠的形式。所述微粒或小珠的尺寸和形狀可變。本發明的設備可用於各種檢驗，包括(i)檢驗血液凝結；(ii)檢驗凝塊增長；(iii)檢驗血液凝結途徑的完整性；(iv)檢驗物質對血液凝結途徑的完整性的影響；(V)檢驗以防凝塊由一根導管增長至另一根導管。通常而言，本發明的方法包括將樣品與根據本發明描述的補塊相接觸。受檢驗的樣品優選為全血或血流(含血的流體，例如血漿)，但可以還包括血液組分、血漿蛋白溶液和來自於血液的細胞溶液。所述樣品可獲得自多個受試對象，包括人和非人類動物諸如大鼠、小鼠和斑馬魚。優選的是，所述樣品獲得自人類。所述樣品可獲得自單一試樣。作為另外一種選擇，所述樣品可獲得自多個試樣。來自多個試樣或多個受試對象的樣品可在與補塊接觸前相混合；作為另外一種選擇，來自多個試樣或多個受試對象的樣品可順序與所述補塊相接觸。所述樣品可獲得自健康人類或者非人類受試對象。所述樣品可替代性地獲得自不健康的人類或非人類受試對象。也可能的是將獲得自健康受試對象和不健康受試對象的樣品相混合併在所述檢驗中使用所述混合物。以及，可能的是以任何順序依次地加入來自健康或者不健康受試對象的補塊樣品。所述樣品可包含各種添加劑，諸如一種以上標籤、報導分子、螢光分子、染料(例如pH敏感、凝血酶敏感)、微生物(例如細菌、病毒)、藥物、蛋白質、代謝物、金屬離子、凝血因子、促凝血因子或藥物、抗凝血因子或藥物、纖溶因子或藥物，或其他化合物。為了使反應或血液凝塊增長可視化，這些化合物可在本發明的某些優選的實施方式，例如在某些檢驗中使用以測試外部加入的物質對血液凝結等的影響。在所述樣品中任一這些化合物的濃度可變。任一這些化合物可以加入到與一個以上的補塊相接觸的一種以上的樣品中。也可能的是包括向補塊和樣品加入相同或不同的添加劑。使所述樣品與所述補塊相接觸。所述樣品可放置在所述補塊上。例如，所述樣品可被移液到所述補塊上或者使用毛細管輸送至所述補塊。所述樣品能連續地流過所述表面，由此接觸一個以上的補塊。作為另外一種選擇，所述樣品可放置在其將與所述補塊相接觸的表面上。以及，所述補塊可放到樣品中，從而使所述樣品與所述補塊相接觸。與補塊相接觸的樣品量可變。通常，每"106|^1112的補塊面積使用約20fil約100^的樣品。優選的是，每lx106pm2的補塊面積使用約50jxl的樣品。本發明的設備的一個實施方式可用在測量個人血液凝結的潛力的方法中。可根據凝結的時間或可能性確定所述潛力，其中一個以上的以下參數可以發生變化剌激物濃度；補塊的尺寸；補塊的濃度；補塊間的距離；補塊的形狀；微粒的尺寸；微粒的形狀；補塊的濃度；刺激物的類型；血液流的流速；諸如藥物、金屬離子、凝結因子等添加物的濃度；以及正常血液流體的加入。這些的實例在下文中示出。在一個實例中，本發明提供了用於測量凝結時間的方法。測量已與所述補塊相接觸的樣品的凝結時間。由所述樣品的、所述補塊的或者二者的光學性質的變化，可光學觀察血液或血液流體的凝結。在一個方面，所述光學性質可以是顏色、吸光度、螢光、反射係數或化學發光的變化。也可以在檢驗中的單個時刻或多個時刻測量所述光學性質。也可通過測量光從所述樣品、所述補塊或者二者中的散射而檢測所述凝結時間。可以比較樣品間的凝結時間，或者與完全沒有補塊的表面上的凝結時間進行比較。一旦引發凝結之後，凝塊增長的能力可通過在不同的補塊和表面上，和在不同的通道(導管)中的凝塊增長速度而測定。例如，所述凝塊的前沿增長的速度可被測定並表示為隨時間變化的距離。可以在流動條件下測量凝塊增長。作為另外一種選擇，可以在沒有流動的條件下測量凝塊增長。圖2126描述了對通過結合部的凝塊增長的調控。凝塊增長根據在所述結合部有流動血液的導管(流動導管)中的剪切速率，,[s"]，而停止或繼續；同樣，通過結合部的凝塊增長受到在所述結合部處的剪切速率，,[s—1]，的調控。可為了多種原因而採用檢驗血液凝結，包括(i)確定受試對象的血液凝結潛力；(ii)篩選凝結刺激物的效果；(iii)篩選將影響凝結引發、形成和增長的候選藥物；和(iv)篩選可影響凝結引發、成形和增長的藥物濃度。可採用本發明的方法對血液凝結的引發進行撿驗。血液凝結的引發顯示了對補塊尺寸的閾值響應。在一個實例中，本發明提供了基於達姆科勒數(DamkOhlernumber)的標度律以描述表面刺激物的補塊上的凝結引發(Kastrup等，2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:15747-15752)。因此，凝結的引發取決於在所述補塊上形成激活劑的反應時間尺度(tr)和激活劑從所述補塊上擴散運輸出的擴散時間尺度(tD)(圖l)。所述達姆科勒數Da=to/tr的量級決定於所述補塊的直徑p。小的p對應於小的tD和小的Da，這是因為快速發生激活劑擴散離開所述補塊的情況，相反，大的p對應於大的^和大的Da，這是因為激活劑需要長時間從所述補塊的中心擴散至邊緣。當V決而V優時，在Da大時發生凝結引發。很好地確定了標度公式，t=x2/D，其中將時間t、距離x和對於特定分子的擴散係數D關聯在一起，並且所述公式可用於預測引發血液凝結所需的補塊尺寸閾值Pn.。在具有常數tr的特定表面上，激活劑分子在反應進行前擴散的距離應當幾乎與所述Pu的直徑相同。g卩，反應發生需要一定量的時間(g,而在一些臨界補塊直徑(pt》，分子可在反應發生前擴散離幵所述補塊。因此^應當根據ptr=(Dxtr)1/2而用t,4示度。其中，p是所述補塊的直徑，而tr是反應時間尺度。圖1描述了激活劑的擴散(D箭頭)和反應(R箭頭)之間的競爭如何確定是否在指定補塊(p)上發生凝結的引發。在該實例中的補塊表示為在方形表面上以透視圖顯示的圓形。擴散的時間尺度取決於補塊尺寸，而反應的時間尺度與補塊尺寸無關。當所述補塊的直徑P較大時，反應在競爭中超過擴散，而將發生引發。當所述補塊的直徑p較小時，擴散快速地將激活劑從所述補塊上移除，在競爭中超過反應，而不會發生引發。在涉及本發明的設備和方法的各種應用中，包括有觀察和測量閾值響應(其中包括增長波和前緣)以開發診斷工具和發現藥物。可釆用補塊、具有圖案的表面或者栓塞，或者通過組合一個以上的補塊、具有圖案的表面和栓塞完成閾值響應的觀察和測量。當測量在補塊上引發血液凝結的閾值時，可以通過在含有全血或血漿的具有不同表面化學和不同補塊尺寸的小珠或微粒中進行滴定，並監測凝結引發對小珠/微粒組成的依賴性從而完成該測量。例如，所述補塊可以位於懸浮在所述血液流體中的小珠上。血液流體的等分試樣可用數目不斷增加的小珠進行滴定。血液流體的等分試樣可用尺寸不斷增大的小珠進行滴定。所述血液流體可以作為連續流輸送到所述補塊。所述血液流體可以作為由不混溶性流體隔開的栓塞輸送到所述補塊。本發明提供了用於檢驗凝塊根據所述剪切速率由一個導管增長至另一導管的方法。所述剪切速率描述了隨著與表面距離的增加，局部流速V[ms-']的變化。所述剪切速率決定了在接近表面的所有方向上的運輸。在壓力驅動的流動中，在表面的局部流速，V[ms"]為零。本發明還提供了測量凝塊增長速率，以及確定與凝塊形成和增長相關的疾病如何改變該血液凝塊增長速度的方法。這些血液凝結失調或疾病包括血友病、遺傳性出血性失調、活化蛋白C抵抗、vonWillbrand氏病和血凝過快。已知減慢凝塊增長的凝血因子缺陷的實例是因子VIII(fVm)、因子X(fX)和因子XI(fXI)(Ovanesov等，2005,J.Thromb.Haemost3:321-331)。這些因子缺陷與以下出血性疾病相關fVIII缺陷導致血友病A，僅缺陷導致Stuart-Prower病，而fXI缺陷導致血友病C。本發明的方法也可用於檢驗來自於正在接受可影響血液凝結的藥物治療的受試者的樣品。本發明可用於篩選能影響凝塊增長的藥物。例如，可向所述樣品、所述補塊或者同時向所述樣品和所述補塊中加入凝血酶抑制劑、血栓調節蛋白、其他凝血抑制劑或其混合物。以及，所述方法可包括在將所述血液流體暴露於所述補塊之前將血栓調節蛋白或其他抑制劑加入到所述樣品中。凝血抑制劑預計能降低所述凝塊增長，並且可進行本發明的檢驗以更好地表徵這些化合物的作用。作為另外一種選擇，向所述補塊或所述樣品加入的添加劑可包括一種以上的血液凝結因子。以及，所述方法可包括在將所述血液流體暴露於所述補塊之前將過量的凝血因子加入到受試對象血液流體中。凝血因子預計能提高所述凝塊增長，並且可進行本發明的檢驗以更好地表徵這些化合物的作用。本發明提供了檢驗血液凝結途徑的完整性的方法。所述血液凝結途徑可以是血小板聚集途徑。本發明還提供了檢驗物質對血液凝結途徑的完整性的影響的方法。本發明還提供了確定來自不同血液樣品的凝塊如何增長的方法。此外，本發明提供了確定血液流動的存在如何影響血液凝塊增長的方法。在一個實例中，本發明提供了確定不同的通道幾何形狀如何改變血液凝塊增長的方法。測量受試對象血液的血液凝結的增長對不同尺寸的結合部的易受影響性，這也可用於評估特定的藥物濃度的有效性，或者用於檢測在所述凝結過程中所涉及的特定酶和蛋白質的異常。特定血液樣品增長通過不同尺寸的結合部的能力取決於血液中的所述藥物濃度和特定酶的活性。本發明還提供了能用於檢測不同藥物和其他分子，和/或不同濃度的天然生成的蛋白對血液凝塊增長速率的影響的方法。測量存在或者不存在特定藥物的情況下血液凝塊生長的速率可用於確定凝塊將生長得如何。例如，採用本發明的方法，可證明凝血酶抑制劑能防止凝塊增長通過處於低於剪切速率閾值的通道結合部。作為另外一種選擇，含有各種刺激物和濃度的補塊可用以對此進行測試。本發明提供了檢驗以防凝塊由一個導管增長至另一導管的方法。本發明的設備可用通道形式的補塊製備，或者用結合在相互流體連通的流體通道的表面裡的補塊製備。所述通道的幾何形狀可經過製造使得可以測量一定範圍內的凝結活性。諸如血液流體等樣品隨之與所述補塊相接觸。然後監測凝塊增長通過處於低於剪切速率閾值的通道結合部的速率。如果需要，也可以加入各種物質以進一步觀察所加入的物質對凝塊增長通過所述通道結合部的作用。本發明具有比已知用於檢驗血液凝結的方法優越的一項或多項以下優點能使用更小體積的樣品；由於自動化試劑混合使得樣品製備最少；引發血小板聚集以及因此凝結時間的實時觀察的可能；混合速度是可控的。預期的是本發明的方法和裝置除了能夠檢測血液凝結之外還能用於檢測其他生物途徑的活性。例如，可以測試某人的體液在補塊上引發免疫應答的潛力。在該實例中，體液樣品與含有一種以上抗原(例如微生物、細菌、病毒等)的補塊相接觸。監測對於引發的補塊尺寸閾值可用於檢測諸如在細菌表面簇的存在下所述免疫應答的引發等事件。預期的是本發明的方法和裝置能用於檢測包括除血液或血漿之外的流體的樣品中生物途徑的活性。例如，用含有細菌的溶液能測試引發群體感應(quorumsensing)所需的高絲氨酸內酯的量。監測用除血液之外的溶液引發的補塊尺寸閾值可用於檢測諸如引發阿爾茨海默氏症途徑所必需的澱粉樣蛋白(3的量，引發癲癇發作所必需的神經元損傷的量，並且可用於小量細菌的檢測等事件。應當理解本發明並非局限於所描述的具體方法學、方案、受試對象或試劑，並且同樣都可以變化。還應當理解的是此處所使用的術語僅是為了描述特定實施方式的目的，並非旨在限制本發明的範圍，而本發明的範圍僅由所述權利要求進行限定。提供以下實施例以進行描述，但並非限制所要求的發明。實施例採用數值模擬進行自催化體系的標度預測利用人類血漿進行了試驗性測試和驗證。採用三維數值模擬驗證了所述標度預測對於簡單的自催化體系是可行的，所述體系在剌激物的補塊上被激活，並具有與已知的血液凝結組分相同標度的速率和擴散常數。該簡單的自催化體系是基於由本發明人提出的止血模塊機制(Runyon等，2004,Angew.Chem.Int.Edit.43:1531)。簡單的自催化體系在這裡是指基於高階的激活劑自催化形成和低階的激活劑消耗之間的競爭從而表現出閾值響應的體系。該形成與消耗之間的競爭建立了至少兩個穩態，一個穩定而另一個不穩定。所述不穩定的穩態出現在所述濃度閾值，在所述濃度閾值以上時，激活劑的形成快於消耗。所述機制由三個相互作用的模塊構成激活劑的自催化形成，激活劑的線性消耗和激活劑在高濃度下的沉澱(或凝結)。形成和消耗的相互作用在所述體系中建立了兩個穩態，在低濃度激活劑下的穩定穩態，和在高濃度激活劑下的不穩定穩態。通常，激活劑的濃度保持在所述穩定的穩態附近，然而，所述激活劑濃度的較大擾動將推動所述體系至所述不穩定的穩態，此時激活劑將增強並引發沉澱。此處，所述模擬假設該溶液相自催化體系位於含有刺激物補塊的表面上，以及激活劑的反應和由所述補塊擴散進入溶液。使用商業軟體進行模擬(FEMLAB，COMSOL，瑞典)。圖2描述了貫穿無流動的微流體通道的連續不變的凝塊生長(增長)。圖2A是模擬受損血管的微流體通道的螢光顯微圖像。在該圖像中，由於PC:俄勒岡綠(惰性脂類)的脂單層而觀察到綠色螢光。由於所述表面(凝結激活表面)上的單層的DMPC:PS:含TF:VIIa複合物的德克薩斯紅而觀察到紅色螢光。圖2B描述了在60x60pr^無流動的微流體通道中連續凝塊生長的時移螢光顯微圖。用對a-凝血酶具有特異性的螢光底物監測凝結。圖2C是描述在三個不同通道尺寸下的相似凝塊生長速度(Vf)的圖。在所有情況下，Vf在3040^immin"之間。圖3顯示了描述導管-至-導管結合部如何能用於評估血液凝塊增長閾值的顯微圖。圖3A顯示了凝塊向小(20^imx20iom)導管結合部生長的時間序列圖。在此微流設計中，在所述結合部的小通道的寬度小於所述結合部尺寸閾值，從而停止凝塊生長。圖3B顯示了凝塊向大(100pmxl00jim)導管結合部生長的時間序列圖。在此微流設計中，在所述結合部的小通道的寬度大於所述結合部尺寸閾值，從而凝塊繼續生長進入所述較大導管。圖3C描述了對受試對象血漿的結合部尺寸閾值的量化。對於該血漿，所述結合部尺寸閾值為約40iim75^im。圖4顯示了基於簡單化學機制的凝結引發的數值模擬。圖4a描繪了引發時間相對於(vs.)補塊尺寸的曲線。每條曲線對應於在圖例中指示的特定、。圖4b描述了^相對於^的圖如何顯示了1/2次冪的標度關係並且驗證了所述標度預測。測定了來自刺激物均勻表面的多個形成速率的t值。當p對每個仁發生變化時，發現存在補塊尺寸閾值，如圖4a所示。對於每個V觀察到特定值的Ptr。當p〉Ptr時，引發血液凝結，當p〈Ptr時，沒有引發血液凝結。在不同組的試驗中，對簡單非線性化學體系驗證了該預測的準確性。所述模型是由三個反應構成的簡單易興奮(全有-或-全無)體系。所述激活劑是H"。在該體系中的引發對應於通過所述表面上大量形成酸而由鹼性環境轉變為酸性環境。通過照射所述表面上的光致酸分子而形成酸。通過光掩模選擇性地照射部分所述表面而形成酸補塊。通過調節所述照射的強度並由此調節在表面上形成酸，從而獲得不同的tr值。圖5描述了引發血液凝結的標度關係。在圖5a中顯示的是所述化學模型的Ptr相對於tr的圖。顯示在5b中的是血液樣品的Ptr相對於tr的圖。對於每個、值，觀察到特定的W值。Ptr相對於tr的圖顯示了1/2次冪標度關係(圖5a)並且實驗性地驗證了所述標度關係。血液凝結可視為易興奮體系。在這樣的體系中的引發導致形成高濃度的諸如凝血酶等激活劑，以及隨後形成堅固的凝塊。體內形成激活劑的刺激物是組織因子(TF)。為確定所述標度預測是否適用於血液凝結，本發明人測量了暴露於含有TF的磷脂雙層表面的人類血漿的凝結時間。為改變這些試驗中的tr，改變了表面上的TF的濃度，和溶液中的阿加曲班(一種凝血酶抑制劑)的濃度。通過光刻工序得到特定尺寸的TF補塊。對於每個、值，觀察到特定的w值。^相對於tr的圖顯示了1/2次冪標度關係(圖5b)並證明了所述標度預測可應用於複雜的生物體系。本發明的體外實驗預測了引發凝結所必需的血管損傷尺寸與反應的時間尺度相關，如由達姆科勒數描述的那樣。理解此關係將有助於更好地設計診斷工具和治療凝結疾病。理解藥物濃度如何影響Pt將有助於這些藥物的施用。採用本發明實現的正確物理描述可協助預測受試對象有多容易在體內發生血液凝結。通過測量體外實驗中的凝結時間可常規地測定受試對象的血液凝結的潛力，在所述實驗中以某一濃度加入具有非常高濃度的激活劑。這些診斷方法不能接近地模擬體內凝結引發的時空特性，更好的物理描述使之能開發更好的方法。本發明有助於理解全有-或-全無體系的激活(在複雜網絡中的反應)如何在表面上發生。本發明有助於預測複雜網絡的行為。對形狀的響應本發明人證明了對形狀的響應可出現在生物化學網絡水平。本發明人依靠他們所開發的機制(Runyon等，2004,Angew.Chem.Int.Edit.43:1531)和實驗體系(Kastrup等，2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:15747)從而試驗人類血漿的體外凝結的引發。發現該生物化學網絡對形狀有響應-所述刺激物補塊的形狀控制凝結的引發與否。為了表徵所述血液凝結級聯引發(引發)對提供凝結刺激物的補塊的形狀的響應，使用明視野和螢光顯微術分別監測了在剌激物補塊表面上通過凝血酶形成的纖維蛋白和藍色螢光染料(Lo和Diamond,2004，Thromb.Haemost.92:874)。纖維蛋白和凝血酶的形成均指示發生了凝結。組織因子(TF—種刺激引發的膜整合蛋白)的表面補塊用光刻術形成圖案。在含有0.5moP/。的用紅色螢光染料標記的脂質的磷脂雙層中重構TF。在微流腔室中向人類血漿提供各種形狀的TF表面。當比較不同形狀的補塊時，所有補塊的面積(以及因此TF量)保持恆定(3.14xl0m2)。圖6顯示了人類血漿凝結的引發如何響應於具有相同面積和凝結刺激物TF量的表面補塊形狀。圖6a是顯示在含有TF的磷脂雙層的補塊上的凝結的側視示意圖。圖6b是量化了人類血漿在不同縱橫比的矩形補塊上的引發時間的圖表，測量三次。圖6c顯示了時移螢光顯微圖，其顯示了圓形和方形補塊上的凝結，而在窄矩形和星形補塊上不凝結，所述補塊具有相同面積。當人類血漿暴露於含有TF的補塊時，僅僅在特定形狀上出現引發。在超過臨界尺寸的圓形補塊上發生引發。在其他形狀上的引發顯示出不同的趨勢。諸如方形(縱橫比=1:1)的寬矩形在不到四分鐘內引發，而窄矩形(縱橫比$16:1)在48分鐘內未能引發(圖6b、6c)。這些實驗似乎顯示，存在導致引發所需的矩形臨界寬度(對以上實驗為約90,)。令人感興趣的是，星形補塊位於引發的邊界上，僅在一半的試驗中引發(十四次試驗中的七次)。為研究該對形狀的響應背後的機制，本發明人開發了設想簡化的反應-擴散體系的3D數值模擬從而在數值模擬中再現對形狀的響應。在此模擬中，自催化反應混合物與用相同面積(7854pm2)的各種形狀的刺激補塊圖案化的表面相接觸。該模擬重現了在人類血漿中見到的實驗結果(圖7)。圖7描述了證明對形狀的響應的簡化反應-擴散體系的數值模擬。圖7a顯示了僅考慮激活劑從補塊上擴散和一級形成的來自3D模擬的2D濃度圖，顯示了[C]在狹窄補塊上較低。激活劑的擴散移除在狹窄補塊(高縱橫比，左圖)上更加有效，保持[C]在閾值以下，而在較寬補塊(低縱橫比，右圖)上的最大[C]在閾值[C]以上。圖7b描述了在也考慮對應於二級自催化形成和一級抑制的溶液相反應時，對於狹窄補塊(左圖)消耗如何佔主導，保持[C]在閾值以下。對於所述較寬補塊(右圖)形成佔主導，而且[C]增大至所述閾值以上並廣泛增大，導致形成引發。為了表徵在不同形狀的補塊上擴散對激活劑濃度([C])的作用，僅僅考慮來自補塊的激活劑的一級形成;在溶液中的反應未被考慮(圖7a)。對於較寬的矩形(較低的縱橫比)，由所述補塊的中心至離開所述補塊的擴散的時間尺度較長，在較寬補塊上形成比狹窄補塊(高縱橫比)更高的最大[C]。為研究在較寬的和較窄的補塊間的該[C]差異如何影響自催化介質的引發，將溶液相反應加入到所述模擬中(圖7b)。該自催化介質的引發具有對[C]的閾值響應，這是溶液中以下兩步競爭反應的結果1)激活劑的二級自催化形成，和2)所述激活劑的一級消耗或抑制。考慮這些溶液相反應放大了補塊間[C]的微小差異，而引發表現為全有-或-全無響應；[C]或者增大數個量級，導致引發，或者保持在閾值[C]以下，未導致引發。在這些模擬中，弓l發必需的閾值[C]為2xlO'SM。對於給定的一組參數，縱橫比S4:1的矩形在不到12秒內引發，而縱橫比216:1的矩形在IOOO秒之內未引發，此時所述模擬被停止。如果該對形狀的響應的機制是正確的，基於與所述模擬相同的化學原理的非生物體系將重現在人類血獎中觀察到的結果。本發明人開發了試驗性的止血化學模型(Runyon等，2004，Angew，Chem.Int.Edit.43:1531)，重現了在人類血漿中觀察到的對補塊面積的閾值響應(Kastmp等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:15747)。由構成基於激活劑(#)的抑制和自催化形成的自催化體系的已得到很好表徵的非生物反應組成本發明的模型(Nagipal和Epstein,1986,J.Phys.Chem.90:6285)。在此模型中，UV光是引發"凝結"的剌激物。圖8顯示了經構建以模擬止血的簡化化學體系如何響應提供了相同面積的刺激物的表面補塊的形狀。圖8a是在用UV光刺激物照射的光致酸表面的補塊上"凝結"的側視示意圖。圖8b是量化在矩形補塊上的引發時間的圖表，測量三次。圖8c顯示了時移螢光顯微圖，其顯示了在具有小縱橫比的諸如方形的矩形補塊上發生的在在具有相同面積但較大縱橫比的補塊上沒有發生的"凝結"。UV光將所述光致酸(2-硝基苯甲醛)轉變為2-硝基苯甲酸，當[H"]達到引發海藻酸從褐藻鹽中沉澱(由溴苯酚藍變至黃色所指示)所必需的閾值水平時出現"凝結，，(圖8a)。正如在人類血漿中所觀察到和由模擬所預測，具有相同面積(1.26x104,2)的補塊的形狀決定了是否能出現該化學體系的引發。再次，引發取決於所述矩形的縱橫比(圖8b，8c)，其中較寬的矩形引發而較窄的矩形不引發。令人感興趣的是，與人類血漿中的試驗相反，星形在這些試驗中不引發。該觀察結果通過所述數值模擬得以解釋。星形形成與所述閩值相近的激活劑濃度。改變諸如所述激活劑由補塊生成的速率和擴散係數等參數，將改變星形由引發變為不引發，而其他形狀保持相同的響應。這些結果強調了儘管簡化模型和模擬捕捉到所述體系的整體動力學，仍需要實驗測量以建立所述複雜網絡的動力學的更精細的細節。這些結果進一步證明了對形狀的響應不僅在生物體水平上出現，也在更基本的生物化學網絡水平上出現。試劑在緩衝液中使用的所有溶劑和鹽均購買自商業來源並原樣使用，除非另外指明。聚(二甲基矽氧烷)(PDMS，Sylgard牌184SiliconeElastomer試劑盒)購得自DowComing。1,2-二月桂基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)，來自豬腦的L-a-磷脂醯絲氨酸(PS)和1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)購得自AvantiPolarLipids。TexasRed1，2-二(十六烷醯)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TexasRedDHPE)，OregonGreen1,2-二(十六烷醯)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(OregonGreenDHPE)，N-(7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)-1，2-二(十六烷醯)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基銨鹽(NBD-DHPE)，5-(和-6)-羧基SNAFL-l(SNAFL)，羅丹明110，二-(對甲苯磺醯基-L-甘氨醯-L-脯氨醯-L-精氨酸醯胺)和FluoSpheres(硫酸鹽微球體，1.0>m，黃色-綠色螢光(505/515)，2%固體)購得自MolecularProbes/lnvitrogen。正常匯集血漿(人類)(NPP)購得自GeorgeKingBio-Medical,Inc.。叔丁基氧羰基-p-苄基-L-天冬氨醯-L-脯氨醯-L-精氨酸-4-甲基香豆醯-7-醯胺(Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA)購得自PeptidesIntemational。白蛋白(BS)(BSA)和中粘度海藻酸購得自Sigma。人類重組組織因子(TF)和玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)購得自Calbiochem。阿加曲班購得自AbbotLaboratories。溴苯酚藍和亞氯酸鈉(NaC102，80%純度)購得自AcrosOrganics。Krytox氟化脂是Dupont的產品。矽化玻璃蓋片購得自HamptonResearch。無水十六烷、2-硝基苯甲醛和正十八垸基三氯矽烷(OTS)購得自Aldrich。硫代硫酸鈉^328203，99.9%純度)和無水二甲基亞碸(DMSO，99.7%純度)購得自FisherScientific所述化學模型的試劑由溶液相試劑(所述模型反應混合物)和固相圖案化基底構成。所述模型反應混合物是含有NaC102、Na2S203、海藻酸和溴苯酚藍的溶液(Runyon等，2004,Angew.Chem.Int.Ed.43:1531-1536)。含有NaC102和Na2S203的溶液是亞穩定的。通過加入閾值濃度的酸(水合氫離子)，它能被觸發快速地和自催化地反應，從而形成更多的酸(Nagypal和Epstein,1986，J.Phys.Chem.卯6285-6292)。海藻酸在鹼性條件下以海藻酸鈉存在並且是水溶性的。然而，在酸性條件下，海藻酸形成不溶性凝膠。溴苯酚藍是pH指示劑，用於監測反應混合物反應和引發"凝結"的時間。所述反應混合物通過溴苯酚藍的螢光(、=535585nm，^=600680)進行監測。當引發"凝結"時，所述鹼性反應混合物變為酸性，結果導致紅色螢光的猝滅和黃色可見光的出現。所述固相圖案化基底由覆蓋有2-硝基苯甲醛在二甲基矽氧垸-環氧乙垸嵌段聚合物中的分散液的薄層(2030|im)的蓋片構成。通過光掩模的UV照射使2-硝基苯甲醛(非酸性)光致異構化為2-硝基苯甲酸(酸性，pKa<4)。製備兩種穩定溶液作為亞穩定模型反應混合物的前體。製備了兩種穩定溶液。當這兩種溶液合併時，所得溶液構成亞穩定的所述模型反應混合物。溶液1是Na2S203、海藻酸和溴苯酚藍的水溶液，溶液2是NaC102的水溶液。溶液1的製備通過將海藻酸(0.290g，中度粘度)加入到NaOH溶液(50ml，pH-10.8)中製得海藻酸儲備溶液，並通過約9(TC加熱45分鐘而溶解。通過在5mL所述海藻酸儲備溶液中合併Na2S2CV5H20(0.122g，0.492mmol)和溴苯酚藍(鈉鹽)(12.5pi0.17M在NaOH中的水溶液，pH=l1.6)製得Na2S203/海藻酸/溴苯酚藍儲備溶液。該過程形成最終pH為約7的Na2S2CV海藻酸/溴苯酚藍溶液。溶液2的製備通過將NaC102(0.270g，2.99mmol)溶解在10mLMillipore過濾的H20中從而製得NaC102儲備溶液(最終pH約10.7)。該溶液在12小時內使用。將所述試劑合併形成在所述化學模型中使用的亞穩定反應混合物。通過以1:1的體積合併所述Na2S203/海藻酸/溴苯酚儲備溶液和NaC102儲備溶液製得所述模型反應混合物。該過程形成初始為可見的紫色並發出紅色螢光的溶液。加入一滴1NHC1引發"凝結"反應並使所述溶液變為可見的黃色，並猝滅了所述紅色螢光。不加入酸，自發引發(通常在20分鐘內)也將由於亞氯酸鹽/硫代硫酸鹽反應的隨機性導致同樣的紫色至黃色的轉變(Nagypal,I.&Epstein,I.R.，1986，J.Phys.Chem.90:6285-6292)。光致酸塗覆的基底的製備。所述光致酸(2-硝基苯甲醛)一直保持在黑暗中。伴隨攪拌，通過加熱至60'C將所述光致酸溶解到二甲基矽氧烷-環氧乙垸嵌段共聚物(1:1的重量)中。該混合物保持在6(TC直至旋塗。室溫下，通過將50nL的溫熱混合物放置在矽化蓋片(22mm直徑).中心來旋塗所述均勻的光致酸/矽氧烷混合物。所述基底立即以500rpm旋轉10秒，然後以1500rpm旋轉15秒。在5分鐘內，2-硝基苯甲醛從所述矽氧垸流體中固化而出，形成覆蓋在所述蓋片上的薄凝膠狀層(厚度為2030fim)。所述光致酸覆蓋的基底保持在黑暗中並在12小時內使用。測量在微流腔室中的化學模型的"凝結"引發腔室的設計和組裝。通過將PDMS墊片密封到矽化蓋片上從而製成在所述化學模型試驗中使用的微流腔室。所述一次性腔室具有10mm的內徑，20mm的外徑和1mm的深度。將30)iL的所述模型反應混合物液滴放入所述腔室。將塗覆有光致酸基底的玻璃蓋片放在頂部。圖9是所述化學模型試驗裝置的示意圖。將PDMS墊片(PDMS)密封至矽化玻璃蓋片。將所述化學模型反應混合物(30pL，模型反應混合物)放在所述腔室中。將2-硝基苯甲醛(50重量％)在二甲基矽氧烷-環氧乙烷嵌段共聚物中的分散液的光致酸層(2030pm)放置在所述PDMS頂部並與所述化學模型反應混合物相接觸。將光掩模(Photomask,黑色)放在頂部，僅允許UY光(300400nm，UY箭頭)通過特定位置(灰色)。通過UV照射形成酸性補塊。使用100WHg燈從上方照射樣品。光通過熱吸收濾鏡(50mm直徑TechSpecTM熱吸收玻璃)，隨後通過短波-通過濾鏡(Chroma#D350),主要使得300400nm波長達到所述樣品。光隨之通過聚光鏡，散焦在所述樣品上形成直徑約6mm的均勻照射區域。UV光照射通過直接放置在塗覆有所述光致酸分散液的玻璃蓋片頂部的"聚酯薄膜上的銀"光掩模(CAD/ArtServicesInc.)。使用epi-螢光顯微術對所述模型反應混合物成像。使用150W氙燈光源從所述樣品底部來監測模型反應混合物。光透過立方體濾鏡(A^x=535585nm，人加=600680)和5x0.15NA的物鏡。每180ms進行10ms的曝光時間，相機設置在bin-2x2和增益=255。紅色螢光的猝滅指示了所述模型反應混合物已反應並引發"凝結"。對所述pH敏感的染料未見到明顯的光致漂白。當所述"凝結"的引發出現時(在對大補塊照射約22秒以後)，螢光強度的猝滅快速發生，以約lOirKl秒的係數降低。這與簡單的光致漂白並不一致。透過綠光通過濾鏡(HOYA)過濾所述"UV照射源"得到在所述化學模型體系中的酸性補塊的圖像(此處本發明人並非指"凝結"的監測)。綠光通過所述光掩模和試驗裝置至下方的物鏡。從所述樣品下方獲得所述補塊的圖像(參見圖9)。從下方獲取的圖像顯示外觀"模糊"的補i央，這是由於光通過所述光致酸的固體懸浮物的薄層時的失真。分析在所述化學模型體系中"凝結"引發的圖像。對於所述模型反應混合物，原始灰度時移螢光圖顯示當引發"凝結"時螢光的猝滅(由高螢光轉變為低螢光)(圖片參見圖14)。在MetaMorpt^中，這些圖像均勻地假染為黃色並對黑色物體設置閾值。該過程導致所有圖像中的亮黃色和暗區域的反轉。最終結果是在引發"凝結"時圖像由暗色變為亮黃色。該過程使之能使用更靈敏的螢光成像，同時在"凝結"時獲得可視覺觀察到的黃色。所述酸性補塊的原始圖像假染為綠色並在MetaMorpl^中調節水平。所述處理過的MetaMorph⑧圖像在新的AdobePhotoshop文檔中打開並設置為RGB模式。創建由兩層構成的覆蓋圖像(overlaidimage):頂層為所述補塊的綠色圖像，底層為所述"凝結"溶液的黃色圖像。僅當綠色時將頂層的混合選項設置為混合。使用5-(和-6)-羧基-半萘螢光素-l(SNAFL)對由所述化學模型中的補塊產生的酸進行量化製造試驗裝置以量化酸形成。使用與以上所述用於所述化學模型的試驗裝置相似的試驗裝置(相同的照射設置和成像設置)。採用以下不同1)使用不同的腔室，2)使用40x0.85NA物鏡和3)所述模型反應混合物由SNAFL溶液替代。對於這些實驗，所述腔室由繞成直徑約3mm的圓形的直徑100(im的銀線構成並放置在矽化蓋片(22mm)頂部。將矽脂塗抹在銀線周圍。將2(iL在10mM三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，pH=9.7)中的10(iMSNAFL(紅色螢光=鹼性，綠色螢光=酸性)液滴放在所述銀線環中，但不與所述銀線接觸。所述光致酸基底放置在所述銀線頂部並由所述矽脂密封。所述光掩模放置在所述光致酸基底的頂部。用SNAFL生成酸校準曲線。生成SNAFL螢光強度相對於所加入的酸濃度的校準曲線。製備具有不同HC1含量的各SNAFL/Tris溶液。所述溶液的最終pH為6.59.7。測量在所述腔室中的SNAFL/Tris+HC1溶液的綠色和紅色螢光強度。用S形曲線對所述酸滴定校準曲線(綠/紅強度比相對於[1130+])進行擬合。量化不同補塊尺寸的酸形成。補塊陣列和單一補塊的酸形成用所描述的用於SNAFL溶液的試驗裝置進行測量。樣品用UV脈衝照射20秒，使之平衡2分鐘，隨後測量綠色和紅色螢光強度。使用所述螢光強度數據、所測定的校準曲線和所述樣品的已知體積來測定所形成的酸的量(結果參見圖13)。在存在凝結刺激物的表面上引發凝結的模塊機制的數值模擬數值模擬用以說明對於所提出的模塊機制可存在補塊尺寸閾值，其中採用了單一速率等式表示每個模塊的動力學。在此試驗中，本發明人:i)測試了兩個模塊(一個產生激活劑(自催化地)和一個消耗所述激活劑(線性地))間的競爭是否能形成對所述激活劑的濃度的閾值響應；ii)測試了加入了這兩個模塊(即產生激活劑的表面補塊，和擴散)的模擬是否能產生對所述補塊的尺寸的閾值響應；iii)測試血液凝結的生物化學反應的合理參數是否能形成與試驗測量值相同量級的補塊尺寸閾值。目的並非在於預測所述閾值補塊的精確尺寸。反應的時間尺度(tR，單一試驗確定的參數)是所述閾值補塊的尺寸的更簡單和更可靠的預測值。選擇在數值模擬中使用的參數。在所述模塊機制中，在存在"凝結"刺激物的補塊上發生的擴散和反應用商業上的有限元件套裝(finiteelementpackage)FEMLAB3.1版(Comsol，Stockholm,瑞典)進行數值模擬。所述表面由存在"凝結"刺激物和圍繞所述補塊的lmm"惰性"鄰近區域構成。測定了不同的補塊尺寸對濃度曲線和"凝結時間"的影響。為數值模擬激活劑("C")濃度的變化，考慮在溶液中的擴散，以及在溶液中和表面補塊上發生的反應。C可以與在血液中存在的凝血促進分子組相比較。用標準對流擴散方程對C的質量運輸建模。採用5xl0—UmV1的擴散係數(在血液凝結中溶液相蛋白酶如凝血酶的近似值)。在該模擬中未使用對流。選擇l)im的邊界層厚度。對於該邊界層厚度，假設為穿過所述層的側向擴散較快，而所述溶液在側向上是均勻的。所述邊界層的尺寸是相當隨機的，可以使用一定範圍的厚度，只要穿過所述邊界層的厚度的擴散遠比反應速率和跨過最小補塊的擴散速率快。使用所述邊界層將3D模擬簡化為計算上更有效的假-2D模擬。絕緣/對稱的邊界條件可用在所述"惰性"鄰近區域的外緣。在所述模擬中加入三個速率等式:i)在所述補塊表面處的C的形成，速率=k,;ii)溶液中C的自催化形成，速率=k^[C]2+b;和iii)溶液中C的線性消耗，速率^k賺[C]。所使用的數值是[C]鵬^xlO"M，k補塊=lxl(T9Ms-l，k形成2xl。7M-V，b^2xl0-'0Ms-'禾口k消耗-0.2s陽1。這些值是基於在血液凝結中的典型反應的近似值而選擇的(Kuharsky和Fogelson，2001，Biophys.J.80:1050-1074)。使用這些值，出現了兩個穩態，一個在[C]=l.lxlO-9M，一個在8.9xlO力M。通過考慮所述反應速率等式的速率圖，可以理解這些穩態的存在(圖10)。對於描述速率圖的綜述，參見Tyson等，2003，Curr.Opin.CellBiol.15:221-231。圖10描述了所述速率等式的速率圖如何加入到所述模塊機制的數值模擬中(細節參見上文)。圖10A顯示了兩個等式，表示i)C的自催化形成的模塊(曲線)，和ii)C的線性消耗的模塊(直線)。這兩條線的交叉點表示穩態。在[C]=l.lxl(T9M的穩態是穩定的。然而，在[C]=8.9xl(T9M的穩態是不穩定的，並表示C，即閾值[C]。當[CpC時，形成速率大於消耗速率並且出現[C]的快速增長。圖10B描述了另外兩個等式，表示i)所述補塊的表面上的C的形成中所涉及的反應，(水平線)，和ii)在高[C]發生的沉澱的模塊(虛線)。所述沉澱模塊沒有加入到所述模擬中(雖然它加入到所述試驗性化學模型中)，在此為了表述清楚將其示意性地包括在內。在[C]=8.9xl0'9M的穩態是不穩定的，並且表示所述C的濃度閾值，C閩值。當[C]〉C,時，發生快速增長，這將導致產生足夠的[C]以引發沉澱(固體"凝i央"的形成)。在沒有補塊的模擬中(其中補塊尺寸(p)為零)，[C]保持在穩定的穩態值[C]=Uxl0力M。當大的補塊加入到所述模擬中時，在溶液中和在所述補塊上形成的合計C將導致[C]在10秒內超過[C]tr。模擬結果。通過數值模擬得到的濃度曲線表明，在模擬中的"凝結"顯示出了對補塊尺寸(p)的閾值響應(圖11)。採用上述參數，對於p二50pm的補塊，[C]從未增長至Cwi。然而，當p-100，[C]在10秒內增長至CM。所述補塊尺寸閾值ptr，(能引發凝結的最小的p)在50|im60pim之間。p"直隨k,的降低而增加，指明了在所述補塊表面上的形成速率將影響ptl.。由於在補塊表面上形成速率的變化導致的Ptr的該變化與之前的試驗結果相一致，其顯示了當TF濃度降低時，tK增加，並且p^增加。在所述數值模擬中，Ptr的值隨D的增加而增加。圖11描述了所述數值模擬如何指示出在所述模型中引發"凝結"的可能性表現出對補塊尺寸的閾值響應。在模擬中，p^50pm的補塊從未引發"凝結"，但p〉60pm的補塊總是引發"凝結"。所述模擬和試驗在量化上的一致可能是巧合的。反應的時間尺度(tR，單一試驗確定的參數)是對於不同血漿樣品的閾值補塊的尺寸的更簡單和更可靠的預測值。在亞閾值補塊的緊密簇上的"凝結"的數值計算。測定了改變亞閾值補塊間的距離對C的濃度曲線和對"凝結時間"的影響。一簇p-40pm的亞閾值補塊，僅在處於相互足夠近時，形成[C]〉C,:當40pm補塊相隔80pm時，從未達到C隨，然而如果補塊僅相隔20|im，則快速達到C喊並引發"凝結"。製備血漿試驗用的PDMS微流腔室腔室的設計和製造。在所述血漿和全血試驗中使用的微流腔室(圖12)主要由聚(二甲基矽氧烷)(PDMS)構成，由多層、機磨黃銅母模製成。一次性PDMS腔室具有13mm的內徑、20mm的外徑和1mm的深度。圖12描述了血漿試驗用試驗裝置和圖案化磷脂雙層基底。圖12A是用於盛放塗覆有圖案化磷脂雙層的玻璃蓋片的PDMS微流室(灰色)的示意圖。帶有重構組織因子(TF)(深灰色圓圈)的促進凝結的負電荷磷脂在惰性中性脂質背景中形成圖案。所述腔室盛有血漿，並在頂部用矽化玻璃緻密密封。圖12B是所述腔室的截面圖。消除在所述腔室中的對流和背景凝結。為了減少溶液中的對流，將PDMS腔室浸入NaCl溶液(150mM)48小時。為了進一步減少對流和減少在所述PDMS表面的背景凝結，隨之將腔室浸在1%BSA(在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液中，pH=7.3)中12小時。在所述血漿或全血試驗前，用NaCl溶液(150mM)徹底清洗所述腔室。為了在所述PDMS和所述矽化玻璃蓋片之間形成良好密封，通過使用無塵擦拭紙進行擦拭從所述腔室的頂層外表面移除部分BSA。組裝凝結實驗用腔室。所述浸過的腔室放置在35x10mm培養皿(BDBiosciences)中。所述基底(圖案化蓋片)放置在所述腔室中。一薄層的Krytox氟化脂塗抹在所述腔室頂部。然後將適當的血漿或全血樣品(參見下文)放置在所述腔室裡。輕微地向下按壓矽化玻璃蓋片，而擠出過量的血槳，與所述脂接觸並密封所述腔室。然後將NaCl溶液(150mM)裝入所述培養皿，保持所述腔室浸沒以防止透過PDMS的蒸發。所述腔室保持在23'C24i:或者37°C。測量所述腔室裡的對流。在對照試驗中，通過獲取在正常匯集血漿中的螢光微球體(FluoSpheres)的時移螢光顯微圖，測量在所述PDMS腔室裡的流動。測量了單個FluoSphere行進的距離並除以所經過的時間。FluoSpheres(硫酸鹽微球體，l.Opm直徑，黃色-綠色螢光(505/515)，2%固體)的儲備溶液用NaCl溶液(150mM)稀釋(25^iL至5mL)。稀釋的FluoSphere溶液漩渦處理30秒並超聲處理1分鐘以使FluoSphere的聚集體破碎。該FluoSphere溶液(70pL)加入到檸檬酸鹽處理的正常匯集血漿(210jiL)中。所述FluoSphere/血槳混合物加入到腔室中並密封所述腔室。每1分鐘在透過所述腔室的最多10個位置進行拍照。製備圖案化支持磷脂雙層以在空間上控制經由所述組織因子(TF)途徑的凝結引發清潔蓋片以減少汙染並形成親水表面。為獲得在使用磷脂雙層的凝結試驗中的可重複性結果，有必要清除諸如大的玻璃顆粒和灰塵等汙染物。所述蓋片的清潔過程由以下步驟構成1)施用3MScotch膠帶(#810)以移除大的玻璃顆粒，2)用溶液循環(i.EtOH，ii.H20，iii.10%ES7x去汙劑，iv.EtOH，v.Millipore過濾水)進行超聲處理，步驟間用H20和EtOH衝洗以進一步清除鬆散的玻璃顆粒，3)浸泡在新製備的"piranha"溶液(H2S04:H202，3:1，體積比；該混合物與有機材料劇烈反應，必須小心操作)中約20分鐘，和4)用Millipore過濾水徹底衝洗並在N2流中乾燥。清潔的蓋片在乾燥後立即使用。製備脂質-囊泡的溶液。在別處已描述了單層囊泡的製備(Yee等，2004，J.Am.Chem.Soc.126:13962-13972)。簡而言之，在經piranha清潔200780的玻璃小瓶中，適宜的脂質氯仿溶液經混合至所需的濃度和摩爾比例。用N2(氣)流將氯仿蒸發，然後在真空下(50毫託)千燥所述脂質餅至少三小時。通過漩渦攪動將所乾燥的脂質懸浮在Millipore過濾水中(10mg/mL)，然後在4'C水合過夜。所述水合囊泡經過五個冷凍-解凍循環。將它們冷凍在乾冰/丙酮浴中並在溫度設置為高於所述脂質轉變溫度的烘箱中解凍。在高於所述脂質轉變溫度的溫度下通過WhatmanNuckporeTrack-Etch膜(IOOnm孔徑)將這些囊泡擠出十次(Lipex^擠出機，NorthernLipids)。所擠出的囊泡用Millipore過濾水稀釋至儲備濃度(5mg/mL)並在4'C保存。所有囊泡溶液在兩周內使用。將組織因子(TF)重構以得到凝結促進囊泡。將TF重構到在lxHEPES-緩衝鹽水/Ca2+緩衝液中濃度為1.25mg/mL的DLPC/PS/TexasRedDHPE(79.5/20/0.5摩爾百分比)的混合囊泡中。對於圖17、18和19中的試驗，在所述囊泡溶液中的TF濃度為0.40nM(TF:脂質比為2.5xl0,。假設所有TT併入所述囊泡，則計算的表面濃度為0.08ftnol/cm2。對於表1中的試驗，使用0.16nMTF(TF:脂質比為lxlO力的終濃度。在將TF加入所述囊泡溶液後，所述溶液在37'C溫育30分鐘，隨後在12°C保存。所述囊泡在18小時內使用。形成惰性雙層。所述惰性支持磷脂雙層由DPPC(97%)和綠色螢光染料(3%的OregonGreenDHPE或NBD-DHPE)(Jung等，2005,ChemPhysChem6:423-426)構成。在50°C，將215所述DPPC囊泡溶液(在PBS中的0.34mg/mL囊泡)加入到在親水性PDMS腔室中的剛清潔的蓋片從而製備雙層。在加上所述蓋片之前通過用血漿清潔劑(SPIPlasmaPrep)氧化而使所述PDMS具有親水性。所述盛有囊泡溶液的微流腔室在5(TC溫育10分鐘並隨之冷卻至室溫。通過反覆使用NaCl溶液(150mM)清洗除去多餘的囊泡。所述雙層保存在室溫、黑暗中並在24小時內使用。回填到所述惰性雙層中以消除任何暴露的玻璃區域。為確保沒有任何由於所述DPPC雙層中的不完整性而導致的暴露玻璃基底，用30DLPC囊泡溶液(在PBS緩衝液中的2.5mg/mL囊泡)回填所有雙層並使之在室溫下黑暗中溫育40分鐘。通過使用NaCl溶液(150mM)充分清洗而除去多餘的囊泡。將這些雙層在數小時內進行光致圖案化。光致圖案化以選擇性地除去惰性雙層的補塊區域。所述已經用DLPC回填的DPPC雙層利用先前已公開的方法進行光致圖案化(Yee等,2004,丄Am.Chem.Soc.126:13962-13972;Yu等，2005,Adv.Mater.17:1477-1480)。簡言之，將所述雙層塗覆的蓋片放置在光掩模(chromeonquartz，PhotoSciences,Inc.)下的鋁製調整盤上。將該裝置放置在冷卻板(Echotherm,TorreyPinesScientific)上，所述冷卻板設置為0°C以在照射時使所述樣品的溫度保持為20。C3(TC。雙層用深色UV光(在雙壁冷卻石英浸泡井中的Hanovia中等壓力450WHg浸泡燈)照射7分鐘並隨後用NaCl溶液(150mM)徹底衝洗。將圖案化的雙層在2小時內進行回填。通過回填凝結促進脂質到所述雙層的光致移除區域從而形成補塊。為形成所述凝結促進補塊，用30^iL所述TF重構的囊泡溶液(在PBS緩衝液中的1.25mg/mL囊泡)回填所述圖案化雙層並在室溫下溫育4分鐘。含有活性TF的磷脂雙層之前已有製備(Contino等，1994，Biophys.J67:1113-1116(1994))。用NaCl溶液(150mM)有力地衝洗除去多餘的囊泡。立即在凝結試驗中使用圖案化雙層。在矽烷化玻璃蓋片上製備圖案化親水性補塊從而在空間上控制經由因子XII途徑的凝結引發在玻璃蓋片上形成惰性矽烷化表面。之前已描述了使玻璃蓋片矽垸化的詳細過程(Howland等，2005,J.Am.Chem.Soc.127:6752-6765)。簡言之，將剛使用piranha清潔的玻璃蓋片放置在乾淨的玻璃盤中。在N"氣體)氛圍中將無水十六烷(10mL)和正十八烷基三氯矽烷(OTS)(40jnL)加入到所述蓋片。該溶液溫育30分鐘。然後，向所述溶液加入第二份40OTS等分試樣並再溫育45分鐘。通過用無水十六垸衝洗六次，隨後用EtOH衝洗數次以除去過量的OTS。所述矽烷化的蓋片保存在真空並在48小時內使用。光致圖案化以選擇性地在所述惰性矽垸化層中形成親水玻璃補塊。使用上文和文獻(Howland等，2005,J.Am.Chem.Soc.127:6752-6765)中所描述的光致圖案化裝置形成親水性補塊。在光掩模下照射所述矽烷化蓋片2小時。在照射後，用EtOH和Millipore過濾水衝洗所述蓋片。所述圖案化蓋片在30分鐘內使用。用潤溼測試檢測親水性補塊。使用甘油潤溼測試(Wu和Whitesides，2002，J.Micromech.Microeng.12:747-758)檢測親水性區域。所述圖案化蓋片用甘油覆蓋並用溫和的真空除去過量的甘油。該過程將甘油滴僅留在蓋片的曾暴露於UV光的區域(親水性區域)。在成像後，並在加入正常匯集血楽前，用NaCl溶液(150mM)有力地衝洗以除去所述甘油。製備試驗用人類血液樣品由供體血液製備全血和富含血小板的血漿。依據由芝加哥大學的InstitutionalReviewBoard所規定的指南(第12502A號方案)由獨立健康供體獲得血液樣品。在含有3.2%檸檬酸鈉(9:1的體積)的Vacutaine,管中收集全血。通過在300xg離心10分鐘得到富含血小板的血漿(PRP)。製備正常匯集血漿。梓檬酸鹽處理的正常匯集血漿(NPP)(人類)(Butenas等，Blood105:2764-2770)購得自GeorgeKingBio-Medical,Inc.,並在-8(TC保存以1mL等分試樣直至需要使用的時候。需要時，通過在18'C溫育解凍所述血漿。再次鈣化所述血漿樣品並加入凝血酶敏感染料。通過加入含有凝血酶敏感的螢光染料Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA的CaCl2溶液(CaCl2，40mM;NaCl，90mM;和Boc-Asp(OBzl)-Pro畫Arg國MCA，0.4mM)將戶萬有血漿樣品再次鈣化。在每次試驗開始時，所述血漿和含有CaCl2的溶液以體積比1:3進行混合。所述再次鈣化的血槳溶液(400pL)在輕微攪拌下加入到圖9中所示的試驗裝置中。使用明視野顯微術，由纖維蛋白的出現，以及當4-甲基-香豆醯-7-胺(MCA)被凝血酶從Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA上切割下時產生的螢光信號的出現檢測到凝結。全血樣品的再次鈣化和加入凝血酶敏感染料。由以下步驟再次^化全血樣品(Rivard等，2005,J.ThrombosisandHeamostasis3，2039-2043)，1)首先，將全血(376j^L)與凝血酶敏感螢光染料，即羅丹明110-二-(對甲苯磺醯基-L-甘氨醯-L-脯氨醯-L-精氨酸醯胺)(2pL，在DMSO中10mM)相混合，2)然後，所述全血與CaCl2溶液(23.5pL，200mM)相混合。該再次鈣化的全血溶液加入到圖12中所示的試驗裝置中。通過羅丹明110被凝血酶從羅丹明llO-二-(p-甲苯磺醯基-L-甘氨醯-L-脯氨醯-L-精氨酸醯胺)上切割下時產生的螢光信號的出現檢測凝結。在全血試驗中使用羅丹明110染料替代所述MCA染料用於凝血酶檢測，這是因為與MCA相比，在羅丹明IIO的最大激發和發射波長下，紅細胞具有更低的吸光係數。用玉米胰蛋白酶抑制劑來抑制因子XII途徑。對於測量所述TF途徑的凝結時間的試驗(所有試驗使用磷脂雙層和重構TF)，所述因子XII(接觸)途徑用玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)進行抑制。在所述血漿解凍後立即(對於NPP)或者在離心後(對於PRP)，向血漿加入CTI的儲備溶液(6.27mg/mL)至終濃度100(ig/mL，並在每次試驗前在18'C溫育約10小時。對於全血，在收集後加入CTI至終濃度100昭/mL。對於測量所述因子XII(接觸)途徑的凝結時間的試驗(所有試驗用親水性玻璃補塊或明膠)，未加入CTI。替代的是，在每次試驗前將NPP解凍並在18'C保存4小時。血漿凝結引發的成像用螢光顯微術檢測凝結和螢光脂質。使用與具有0.65x耦合器(coupler)的冷卻CCD相機ORCAERG1394(12-位，1344x1024解析度)(HamamatsuPhotonics,K.K.)相連的具有10x0.4NA物鏡的LeicaDMI6000Bepi-螢光顯微鏡獲取圖像。由75WXe光源提供照明。使用三個立方體濾鏡l)DAPI/Hoechst/AMCA(Xex=320400nm，Xem=435495)(色度#31000v2)以檢測MCA，2)德克薩斯紅(、f5305卯nm，Xem=600680)(色度#41004)以檢測所述德克薩斯紅DHPE脂質染料，和3)FITC/Bodipy/FIuo3/DiO(人e屍455505nm，^m=510565)(色度#41001)以檢測所述俄勒岡綠DHPE脂質染料，NBD-DHPE脂質染料和羅丹明110。也使用明視野顯微術(由滷素燈照明)檢測凝結過程中纖維蛋白的形成(實例參見圖15)。使用MetaMorph⑧成像系統(UniversalImagingCorp)收集圖像。用MetaMorpl^成像系統和AdobePhotoshop處理圖像。所有圖像調整均統一地應用於整幅圖像，以及應用於所有組的所得圖像。凝結引發圖像的分析。凝結和所述脂質雙層的原始灰度螢光圖是在MetaMorpl^中被假染色的。由所述立方體濾鏡的發射波長設置顏色。對於所有凝結的螢光圖像，色階調整至相同值。這些圖直接從MetaMorph⑧拷貝粘貼到設置為RGB模式的新AdobePhotoshop文檔中。在AdobePhotoshop中，通過掩蔽所述紅色圖像將來自MCA的藍色螢光圖和所述脂質雙層的代表性紅色螢光圖相重疊。對所有圖像應用統一的轉換，並且以相同的方式對所有圖像進行處理。用以確立在所述化學模型中的"凝結"的弓f發僅僅是由於在所述補塊上形成光誘導所致的酸的其他對照試驗排除加熱和光化學是模型反應混合物的引發的原因。為將所述光掩模的加熱降至最小，使用短波-通過和IR濾鏡除去X400nm的光線。照射沒有敞開的補塊的光掩模並不引發所述反應，提示所述反應並非由所述掩模的加熱而觸發。在沒有2-硝基苯甲醛時的照射不引發所述反應，提示所述化學模型本身的光化學在所使用的條件下並不誘導引發。在沒有照射時，所述模型反應混合物也能穩定500秒1200秒。確定酸形成取決於補塊面積。為測量由所述酸性補塊產生的酸量(IT產生)，所述模型體系被酸敏感螢光染料，5-(和-6)-羧基-半萘螢光素-1(SNAFL)溶液所替代(該溶液的製備參見上文)。通過測量SNAFL的螢光強度測量酸性補塊的各種陣列的W形成(圖13)。測量所述KT的形成以確定具有酸性補塊的相同總表面積a但單個補塊的不同尺寸p的不同陣列產生約相同量的酸。每個陣列具有相同的補塊總表面積(a=5.03xl05,2),每個陣列產生大致相同量的酸(在2倍係數之內)。單個800補塊(a-5.03xl05|am2)以2.9x1(T2nmol/s的速率形成H^，4x400fim補塊陣列(a=5.03xl05Mm2)形成3.4xl(T2nmol/s，16x200|im補塊陣列(a=5.03xl05|11112)形成2.6xl(T2nmol/s，以及64x100|im補塊陣列(a=5.03x105,2)形成1.7xl(T2nmol/s。單個400|am補塊(a=1.26x105pm2)形成7xl(T3nmol/s。圖13描述了產生的酸的量是如何取決於所述補塊的總表面積。在沒有所述模型反應混合物時，用酸敏感染料(5-(和-6)-羧基-半萘螢光素-l，SNAFL，具有雙發射、雙激發性質的染料)檢測HT的產生。首先，通過用HC1滴定，測定SNAFL的螢光強度相對於H"濃度的校準曲線(數據未示出)。然後，在20秒的透過所述光掩模和光致酸層的UV光脈衝之後，每2分鐘測量一次SNAFL的綠色和紅色螢光強度的變化。使用所述螢光強度數據、所測量的校準曲線和已知體積的樣品，確定所產生的H+量。對於具有相同的補塊總表面積a但不同補塊尺寸p的補塊的不同陣列測量了H"的產生。對具有相同總表面積的陣列所述H"的產生大致相同(在2倍係數以內)。對於單個400Mm的補塊也測量了所述lT的產生，其具有比所述陣列小4倍的表面積，產生少2.44.8倍的HT。通過測量所述H^產生線的斜率來測定速率(圖13)。所述單個400pm補塊具有比所述p^200的陣列小四倍的面積，並產生約少4倍的酸，但能引發所述化學模型的"凝結"。所述p^200的補塊並不引發"凝結"。這些結果支持了所述觀點，即閾值並非簡單地由產生的酸的總量所決定，而是由所述產生酸的補塊的尺寸決定。量化在所述光致酸表面的所述化學模型中的pH-敏感染料的螢光強度譜在所述化學模型中的"凝結"的引發導致由鹼性條件變為酸性條件，以及來自所述染料溴苯酚藍的紅色螢光的猝滅。對於所述模型反應混合物，所述原始灰度時移螢光圖顯示了"凝結"引發時螢光的猝滅(由高螢光變為低螢光)。在圖1719中，所述化學模型圖均統一地假染為黃色並對暗色物體設置閾值。該過程導致在所有圖像中亮黃色和暗區域的反轉。圖14描述了在光致酸表面上的化學模型中pH-敏感染料的螢光強度譜的量化。所述原始(未修改)圖像的螢光強度經量化以確定所述化學模型的所有試驗中的"凝結"時間。圖14A是在400,補塊上的化學模型中的"凝結"引發的時移螢光顯微圖和線掃描(虛線)。線掃描顯示在22秒引發"凝結"，並猝滅所述螢光。圖14B顯示了在200iim補塊的陣列上的化學模型的時移螢光顯微圖和線掃描。線掃描顯示在這些補塊上並未引發"凝結"，原因在於螢光強度並未明顯降低。修改和假染圖像並未使所述信息失真，並且假染色圖像的分析給出類似的強度譜。當引發"凝結"時，螢光強度發生的明顯降低。單個400^im補塊在22秒內引發"凝結"(圖14A)。所述"凝塊，，作為反應性前沿從所述補塊增長開來，隨其增長而猝滅螢光。200pm補塊的陣列在220秒之內未能引發"凝結"(圖MB)。在所述補塊中增大的強度是由於少量紅色和綠色光從上方的光源透過所述透明的光掩模補塊(參見圖9中的模型體系示意圖)。由於在用於測量螢光的低放大倍數下的正常非均勻照射，在所述圖像的邊緣出現較低的螢光強度。相反，由所述樣品頂部的UV照射散焦形成直徑約6mm的均勻照射區域。作為對照試驗，對螢光染料的均勻溶液進行成像，其顯示相同程度的非均勻性並且在邊緣處的強度降低。在圖案化支持脂質雙層上的血漿中的凝血酶敏感染料的螢光強度譜的量化血漿凝結的引發導致凝血酶的爆發式形成，其中伴隨著纖維蛋白形成的開始。為檢測血漿中凝結的引發，使用螢光顯微術檢測肽-修飾的香豆素染料的凝血酶誘導切割，其將釋放出4-甲基-香豆醯-7-醯胺(MCA,藍色螢光)(圖15H)，並使用明視野顯微術檢測纖維蛋白的形成(圖151)。對於61jim補塊(圖15AE)，在45分鐘內在所述補塊上沒有引發富含血小板的血漿(PRP)的凝結。圖15描述了血漿凝結的引發的量化。在圖15A和B中顯示的是在含有綠色脂質染料的惰性雙層背景上圖案化的含有紅色脂質染料的TF重構雙層的61jum補塊。圖15C和D顯示在所述61^im補塊上在20分鐘內沒有觀察到由MCA導致的螢光強度的明顯增強。在所述61,補塊上沒有交聯纖維蛋白絲形成或血小板聚集。圖15E顯示了量化圖15C中的螢光強度的線掃描(在(C)中的虛線)。在圖15F和G中顯示的是在含有綠色脂質染料的惰性雙層背景上圖案化的含有紅色脂質染料的TF重構雙層的137(im補塊。在圖15H和I中顯示的是在所述137|im補塊上在2分鐘之內觀察到由於凝血酶而釋放出的MCA所導致的螢光強度的明顯增強。在所述137pm補塊上觀察到交聯纖維蛋白絲的形成和血小板的聚集(實心白色箭頭)。所述空心白色箭頭指出在所述蓋片以下的PDMS腔室中的不完整。圖15J顯示了量化(H)中的螢光強度的線掃描(在(H)中的虛線)。沒有觀察到由於凝血酶而釋放出的MCA所導致的螢光的明顯增強(圖15C和E)，沒有觀察到交聯纖維蛋白絲的形成和血小板的聚集(圖15D)。對於未引發凝結的所有補塊均觀察到該通常響應。對於137,補塊(圖15FJ)，在所述補塊上2分鐘之內引發PRP的凝結。觀察到由於凝血酶而釋放出的MCA所導致的螢光的明顯增強(圖15H和J)。也觀察到交聯纖維蛋白絲的形成和血小板的聚集(圖151)。對於所有引發凝結的補塊均觀察到該通常響應。在圖18C和D中所示的補塊陣列中，觀察到相同的通常響應(圖16)。在圖16中顯示的是在圖18D中所示的陣列上血漿凝結的引發的量化。圖16A和B顯示了對於50pm的補塊的陣列，如何在43分鐘內在補塊上未引發凝結。沒有觀察到由於凝血酶而釋放出的MCA所導致的螢光的明顯增強(圖16A和B)，沒有觀察到交聯纖維蛋白絲的形成。圖16C和D顯示了對於400補塊的陣列，如何在3分鐘之內在所述補塊上引發凝結。觀察到由於凝血酶而釋放出的MCA所導致的螢光的明顯增強(圖16C和D)。也觀察到交聯纖維蛋白絲的形成。測量和消除在盛有血漿的腔室中的對流通過攝取在正常匯集血漿中的螢光微球體(FluoSphere)的時移螢光顯微圖而測量了在所述血漿腔室裡的流動(圖12)。測量個體FluoSphere所移動的距離並除以所耗費的時間(該溶液的製備見上文)。在所述腔室經優化消除流動之後，在所述基底以上10，處的流速通常小於3,/min，在所述基底以上100(jm處的流速通常小於10(^m/min。3[im/min的速率比被引發的凝結的擴散速率(2535^im/min)小10倍。消除流動所採取的步驟。消除流動所採取的步驟包括i)使用密封的PDMS腔室以消除在空氣/血漿界面產生的對流(Marangoni流動)和蒸發，ii)PDMS腔室浸入在NaCl溶液(150mM)中48小時以消除透過所述PDMS的蒸發，並保持恆定的滲透壓，m)然後所述腔室浸泡在PBS(pH=7.3)中的1%BSA中1小時以消除由於表面張力的可能梯度而在PDMS/血漿界面形成的Marangoni流動，iv)在將血漿密封在內之後，將所述腔室浸沒在NaCl溶液(150mM)中，v)使在使用顯微術過程的照射量降至最低，和vi)使載物臺移動(stagemovement)減至最小。在24。C和37°C比較供體富含血小板的血槳和正常匯集血漿的閾值在24。C和37'C測量供體富含血小板的血漿和正常匯集血漿的補塊尺寸閾值。在含有不同尺寸補塊的陣列中的存在凝結刺激物(TF重構雙層)的補塊上測量凝結時間(表l)。在單一試驗中，測量了在七個不同補塊尺寸上的凝結時間。用於製備表1中所述雙層的在囊泡中的TF的濃度是0.16nM(TF:脂質比率為lxlO,。該值比在正文中所描述的試驗中使用的濃度(0.40nM)小約2.5倍。對於正常匯集血漿(NPP)，相比使用[TF]=0.40nM(tR=30s)，使用[TF]=0.16nM形成更長的反應時間尺度，tR=206s，以及相應更大的補塊尺寸閾值P^m](對於[TF]=0.16nM的160土32,相比對於[TF]=0.40nM的75±25,)。測量了來自供體的富含血小板的血槳(PRP)的凝結時間相對於補塊尺寸。對於給定的[TF]，PRP具有比NPP(206s)更短的tR(對於供體X為40s，對於供體Y為48s)，以及相應更小的ptr(對於PRP的85±26|im和卯±7|iim相對於對於NPP的160士32)。表l在24'C和37i:，PRP和NPP的補塊尺寸閾值ptr和反應時間尺tableseeoriginaldocumentpage46*通過將獲得自每個陣列(每個血液樣品共36個陣列)的p&平均而確定Ptr的值。在每個陣列中，測量七個不同的補塊尺寸，CJ是pJ直的標準偏差。模塊化學機制預測在止血中的引發本發明人證明了採用模塊方法構建的簡單化學模型體系能用於預測在止血的複雜網絡中的血液凝結的引發的時空動力學。微流體學用於構建體外環境，其暴露了所述複雜網絡和具有用存在凝結刺激物的補塊圖案化的表面的模型體系。兩個體系均顯示了閾值響應，凝結引發僅發生在大於尺寸閾值的獨立補塊上。兩個體系的補塊尺寸閾值的量級可用達姆科勒數進行描述，測定了反應和擴散之間的競爭。反應在所述補塊上產生激活劑，而擴散從所述補塊上移除激活劑。所述化學模型作出更多由使用人類血漿所證實的預測，指示出用微流體學補充的這樣的化學模型體系可用於預測複雜生物化學網絡的時空動力學。為對所述引發的時空動力學進行建模，大約80個止血反應用以表示三種交互作用模塊，其總體動力學對應於i)較高階的自催化激活劑形成，ii)激活劑的線性消耗，和m)在高濃度激活劑下凝塊的形成。激活劑的濃度C作為對照參數。在這些模塊間的相互作用導致濃度閾值，C值，在其上(而非其下)將引發凝結。在該表示中，止血通常是在低C下的穩定穩態中。C的較小增加保持了C〈CTO,這樣擾動衰減，體系返回所述穩定穩態。大的擾動提高所述濃度至超過不穩定穩態(C>CMtt)，導致激活劑的增加並引發凝結。因此，通過用所具有的動力學與所述模塊的動力學相匹配的至少一個化學反應替代每個模塊可以建立被明顯簡化的功能性止血化學模型。圖17描述了人類血漿和簡單化學模型如何都能引發凝結，而所述凝結對存在有凝結剌激物的補塊的尺寸具有閾值響應。圖17A是用於測試在所述化學模型中的"凝結"的引發的閾值響應的微流裝置的簡化示意圖。所述反應混合物保持在含有2-硝基苯甲醛的光致酸表面上。透過光掩模的UV照射使2-硝基苯甲醛(非酸性)光致異構化為2-硝基苯甲酸(酸性，pKa<4)，形成"凝結刺激物"的酸性補塊(綠色)。當引發"凝結"時，鹼性反應混合物變為酸性，並變黃。圖17B顯示了在補塊p-200imi(頂圖，沒有引發)和p-800(im(底圖，快速引發)的化學模型中的"凝結"(假染的黃色)的引發的時移螢光顯微圖。圖17C顯示了數值模擬，其量化地描述了在所述補塊上的凝結激活劑的產生和激活劑從所述補塊上的擴散在調控凝結引發上競爭。對於亞閾值補塊(頂圖，50|_im)，擴散佔主導，激活劑的濃度從未達到引發凝結所必需的濃度閾值C鵬(虛線)。對於超閾值補塊(底圖，100pm)，激活劑的產生佔主導，超過C雕，導致激活劑的快速增加並凝結。圖17D是用於盛放血漿並使之暴露於存在凝結刺激物的補塊的體外微流體系的示意圖。帶有負電荷的含重構組織因子的磷脂雙層(脂質/TF)(紅色螢光)的補塊在惰性脂質的背景中圖案化。藍色表示凝結。圖17E所示的時移螢光顯微圖顯示了在紅色補塊p=50|im(頂圖，未引發)和p=100|_im(底圖，快速引發)上的血漿凝結(藍色螢光)的引發，其中p[m]是所述補塊的直徑。在所述化學模型中"凝結"的引發顯示了對補塊尺寸的閾值響應為觀察該化學模型體系的量化動力學，本發明人測試了在酸性補塊上的"凝結"的引發是否強有力(在大的補塊而不是小的補塊上引發)(圖18A)。UV光用作引發"凝結"的刺激物。用光掩模將酸的光致化學形成在空間上限制在所述補塊。酸從所述表面補塊擴散進入溶液，而所述"凝結"反應僅在所述酸的局部濃度超過所述閾值C值時引發。圖18描述了所述化學模型如何正確地預測人類血槳的體外凝結引發依賴於所述空間分布，而不是存在有組織因子(TF)(凝結激活劑)的脂質表面的總表面積。圖18A的時移螢光顯微圖是在p-50、200、400和800pm的補塊的陣列(由上至下，綠色)上的化學模型中"凝結"的引發(黃色)。所有陣列具有相同的補塊總表面積(5xl05pm2)。"凝結"在p=50200jim的補塊的陣列上並不引發，但在p=400800,的補塊上快速引發。圖18B是量化了在所述化學模型中對於"凝結"的引發的閾值響應的圖，使用A中所顯示的數據。圖18C的時移螢光顯微圖顯示在p=100pm和p=400pm補塊的陣列(紅色)上血漿的凝結的引發(藍色)，而在p-25pm和p-50nm補塊的陣列上沒有引發(紅色)。在所有陣列中的補塊的總表面積均相同(3.5xl06pm2)。圖18D是量化了對於血漿的凝結的引發的閾值響應的圖，其中使用C中所顯示的數據。通過監測纖維蛋白的出現來測定凝結時間。在所述化學模型中的"凝結"的引發顯示了對補塊尺寸p[m](圓形補塊的直徑)的閾值響應(圖18B，17次試驗)。p24002ptrpm的單個補塊可靠地在約22秒之內引發"凝結"，而pS200Sptr,的單個補塊不能在500秒內導致引發。對照試驗證實了引發是由於在表面上酸的形成，而不是由於樣品的加熱或者溶液的光化學。在所述化學模型中的"凝結"的引發可以用達姆科勒數進行描述為獲得該體系中動力學的半定量描述，本發明人通過考慮反應和擴散的競爭，估算了所述補塊尺寸閾值Ptr[m](引發凝結的最小補塊的尺寸p)。反應在時間尺度tK[s]在所述補塊上形成激活劑，而擴散運輸在時間尺度tD[S]將所述激活劑從補塊上移除。對於p〈ptr的補塊，擴散佔主導，(tDtR)，激活劑局部濃度超過所述閾值c隨，並引發"凝結"。該競爭可由達姆科勒數描述(Bird等，2002，TransportPhenomena,JohnWiley&Sons，NewYork,第二版)，p&對應於在tR=tD時的p(圖18C)。由於to-p2/D，ptr應當標度為pt,(DxtR)1/2，其中D[m、"]是所述激活劑的擴散係數。該尺度預測是合理的，並且與最初為膜補塊尺寸所提出的相一致，所述膜補塊尺寸調控凝結時在膜上的蛋白水解回饋環(Beltrami和Jesty,2001,Math.Biosci.172:1-13)。對於化學模型體系，試驗值200<ptr<400與預測Pe為約470相一致，這是用D(H+)為約10—8mY1和^為約22秒計算的。所述化學模型正確地預測了凝結引發的時空動力學所述化學模型對血液凝結的引發做了四個預測。首先，它預測了補塊尺寸閾值p^的存在和數值，為了驗證該測試，並探明所述止血網絡的引發的動力學，本發明人開發了體外微流體系以在空間上和時間上對凝結的引發進行控制(圖18D)。圖案化支持磷脂雙層用於提供所述凝結刺激物的補塊，其為含有被併入在雙層中的帶有重構人類組織因子(TF)的磷脂醯絲氨酸的脂質表面。TF是在血管損傷和動脈粥樣斑破裂處暴露的膜整合蛋白。這些凝結誘導補塊由惰性脂質雙層(磷脂醯膽鹼)的背景區域所包圍。微流腔室用於盛放覆蓋在所述圖案化脂質表面上的剛再次,丐化的血槳和消除對流。在所述止血網絡中的引發可通過兩個途徑進行，即TF途徑和因子XII途徑。在測試由TF引發的試驗中，使用玉米胰蛋白酶抑制劑對因子XII途徑進行抑制。在該網絡中的"引發"指在凝血酶峰和纖維蛋白的形成開始時達到頂峰的凝結過程。明視野顯微術用於檢測纖維蛋白的形成，而螢光顯微術用於檢測凝血酶誘導的肽-修飾的香豆素染料的切割。在此報導的凝結時間指纖維蛋白出現的時間，並且在所有試驗中，纖維蛋白的出現與螢光增高相關聯。凝結的螢光圖像可統一地被設定閾值以減小所述染料的背景螢光。在該微流系統中的血漿凝結的引發顯示出對補塊尺寸的閾值響應。p2100拜的補塊在少於3分鐘裡引發凝結(44次試驗中有40次引發凝結)，而pS50pm的補塊不引發凝結(28次試驗中有28次不引發凝結，每個試驗中至少30個補塊)(圖18E)。在p^50pm的補塊的試驗中在3275分鐘內觀察到背景凝結(通常不在所述補塊上引發)，與在完全沒有補塊的表面上引發的4570分鐘相吻合，並且與其他人所報導的背景凝結時間相吻合。引發的凝結作為反應性前沿以2535Kim/min的速度擴散。為了預測Ptr的值，採用了約5xl(T11mY的D(凝血酶作為在所述凝結級聯的放大中所涉及的代表性激活蛋白時的近似值)，並釆用約30±5秒的tR(通過測量在非圖案化凝塊誘導雙層上的凝結引發時間而獲得)。預測的Ptr約40Mm，與所述測量50<&<100iim相一致。由於考慮激活劑在膜上的擴散，之前提出了明顯更小的補塊尺寸閾值(數個pm)。所述結果指出ptr決定於蛋白質在溶液中的擴散。第二，所述模型預測了是單個補塊的尺寸(單獨的，沒有相互作用的)，而不是它們的總表面積決定了凝結的引發。為證實該作用，所述化學模型暴露於補塊陣列(圖19A和B)。圖19描述了所述化學模型如何正確地預測了人類血漿凝結的引發能在通過擴散相互連通的亞閾值補塊的緊密簇上發生。圖19A顯示了在所述化學模型體系中，p-200pm的亞閾值補塊的簇的固定時間(54秒)螢光顯微圖。這些補塊引發了在相隔200^im(右圖)時的凝結，在相隔800pm(左圖)時未凝結。圖19B顯示了暴露於血漿的p-50(im的亞閾值補塊(紅色)的簇的固定時間(9分鐘)螢光顯微圖。這些補塊引發了在相隔50pm(右圖)時的凝結，在相隔200iim(左圖)時未凝結。每個陣列具有相同的補塊總表面積(5xl05pm2)，並產生相同量的酸，但只有具有p^400,的補塊的陣列引發"凝結"。總面積是無關的-單個超閾值補塊快速地引發"凝結"，即使它的面積比亞閾值補塊陣列的面積小4倍，並產生少4倍的酸。血漿的凝結(圖19C和D)也顯示了該動力學一在總面積相同的補塊陣列中，僅有p^lOO,的補塊的陣列引發凝結(每個補塊尺寸六次測量)。凝結的引發靈敏地對樣品中的TF的空間分布敏感。知道在所述樣品中的TF量並不足以預測是否能發生凝結一在具有恆定體積的血漿的試驗中，超閾值補塊誘發凝結，而具有20倍大的總表面積，帶有20倍多的TF的亞閾值補塊的陣列則不能。第三，所述模型預測了足夠緊密的亞閾值補塊簇能引發凝結(圖20)。在圖20中的圖像描述了所述化學模型如何正確地預測了經由第二(因子XII)途徑的凝結引發，指示了所述模型描述了體外止血的整個複雜網絡的引發的動力學。顯示了在玻璃上人血漿中經由因子XII途徑的凝結引發的測試。兩張時移螢光顯微圖(圖20A，13分鐘)和(圖20B,21分鐘)顯示了在p-400、200、100、50和25miii(從左至右，白色)的凝塊誘導親水性玻璃補塊的陣列上的凝結引發，所述補塊在惰性矽垸化玻璃的背景上圖案化。對於此處所示的血漿樣品，所述補塊尺寸閾值在IOOpm200拜之間。在所述簇的周界處的補塊上的激活劑的形成降低了所述激活劑從所述中央補塊上離開的擴散流。對於給定的tR，對相隔小於所述擴散長度尺度(等於ptl.)的亞閾值補塊應當發生凝結的引發。為證明該作用，本發明人將化學模型(20(Kpt,400)暴露於兩個亞閾值補塊簇(圖20A)。間隔200)im的200,補塊簇快速引發"凝結"，而間隔800,的簇則不能。數值模擬與這些試驗相一致。這些預測經血漿(5(Kpt,100)的驗證，其中相隔50)im的50jum補塊快速引發凝結，而相隔200pm的補塊簇則不能(九次試驗，圖20B)。已知的是在膜的表面，尤其是血小板的表面上能更快速地發生激活劑的增加，而這些結果進一步確證在設置pj寸溶液中運輸的重要性。第四，如果所述化學模型代表在所述網絡中引發的整體動力學，而不是在所述TF途徑中的反應亞組，則其提出經由所述因子XII路徑的血液凝結的引發也將顯示出閾值響應。為了引發該途徑，本發明人將血漿暴露於帶有負電荷的玻璃；在^為約9分鐘時發生引發。本發明人採用凝血酶的擴散係數預測所述補塊尺寸閾值Ptr(為約(DxtR)^)約為160!im。為了驗證該預測，在惰性、疏水性矽垸化玻璃的背景上形成親水性玻璃的補塊。通過將血漿放置在不同尺寸的補塊的單個陣列上很快地確定了Pt約為100pm(圖9)。在所有14個試驗中，p^200|im的補塊誘發凝結，但p^50pim的補塊則不能。p-100,的補塊接近尺寸閾值，在十四次試驗中僅有四次引發凝結(1219分鐘)，與補塊與補塊間的表面化學的輕微變化或者經由所述因子XII途徑的凝結的引發的隨機性質相吻合。由TF或因子XII途徑引發受試對象的血液凝結的能力可因此快速地通過測量在不同尺寸的補塊的矩陣的單個滑片上的閾值響應而確定。描述止血網絡中凝塊增長的機制如同任何複雜的生物化學網絡一樣，理解止血的調控機制的一種方法是建立起所述網絡的模型。圖21描述了模擬止血動力學的簡單化學模型，其基於簡單調控機制-由激活劑的形成和移除之間的競爭所導致的閾值響應。該閾值響應由僅在激活劑濃度C激,超過臨界濃度C臨界時出現凝結而得以證實。該機製作出了兩個預測1)如果C激活劑保持大於C臨畀，凝塊以具有恆定速度Fv[ms"]的反應性前沿而增長，和2)對於給定幾何形狀的導管，凝塊從阻塞的導管增長進入有流動血液的未受阻塞的導管取決於在所述具有流動血液的導管中的剪切速率,[s"]。圖21是所提議的用於調控凝塊增長通過兩個具有高(a)和低(b)剪切率的導管的結合部的機制的示意圖。當所述激活劑的濃度(')，C激活劑超過臨界濃度C臨界時引發凝結(藍色)。當C激翻j保持大於C臨界時，該凝塊作為具有速率Fv[ms"]的反應性前沿增長通過受阻塞的導管。當所述增長的凝塊到達兩個導管之間的結合部(結合部)時，取決於在有流動血液的導管(流動導管)中的結合部的剪切速率^[s"]而停止增長或者繼續增長。圖21a描述了當在流動導管中的,大於剪切率閾值^fi時凝塊如何在結合部停止增長，這是因為在所述流動導管中激活劑從生長的凝塊上的移除快於其形成，從而保持在所述流動導管中的C激翻」低於C臨界。圖21b描述了當在流動導管中的"j、於^tt時凝塊如何繼續增長通過結合部，這是因為在所述流動導管中激活劑從生長的凝塊上的移除慢於其形成，使得在所述流動導管中的C激翻大於C臨界。本發明提供了微流系統，該微流系統提供了體內和簡單體外試驗的折衷。它使之能精確地控制流動、幾何形狀和表面。該系統可與人類血漿一起使用以驗證所提出的機制的預測並且證實該簡單機制提供了對凝塊增長的時空動力學的調控的深入觀察。在沒有流動時凝塊以恆定速度的反應性前沿增長為對凝塊以恆定速度的反應性前沿增長的預測進行測試，本發明人使用了微流系統以調控和觀察人類血漿中的凝結。該系統用聚(二甲基矽氧烷)(PDMS)製造。圖22描述了在沒有流動時，血液凝塊增長通過微流體通道的測量。在所述通道壁上存在和不存在凝結的膜結合抑制劑血栓調節蛋白(TM)時凝塊以相似的速度(Fv)增長。圖22a是在微流裝置中引發和監測凝塊增長的過程的示意圖。凝結僅在脂質-TF塗覆的通道壁上引發(而在惰性脂質上不引發)並增長進入所述裝置的以惰性脂質塗覆的所述通道壁的部分。圖22b是微流裝置的螢光顯微圖，顯示了具有重構TF的脂質(脂質-TF)能定位在惰性脂質背景的通道的特定區域。圖22c是時移螢光顯微圖，顯示了在血漿引入所述通道後，在0、40和80分鐘時所述凝塊的位置。圖22d顯示了在不存在TM(Fv-20|immin—')和存在TM(脂質:TM=7.6x104，Fv-25iummirf'和脂質:TM=7.6x103，Fv-24拜min")時量化凝塊增長速度的試驗。通過用不同的磷脂圖案化相同通道的壁將凝塊的引發和增長在空間上分開(圖22a)。通過從所述通道的相對末端，將含有磷脂囊泡的兩股層流灌入所述裝置實現該圖案化。一股流體含有引發凝結的脂質混合物一含有重構組織因子的磷酸膽鹼、磷脂醯絲氨酸和Texas1^(1@磷酸乙醇胺(脂質-TF，圖22a)—而另一股流體含有不能引發凝結的脂質一磷脂醯膽鹼(惰性脂質，圖22a)。接著，用NaCl的水溶液衝洗所述通道以移除過量的脂質囊泡，在所述通道壁上留下脂質-TF或惰性脂質的塗層(圖22a、b)。然後，使血槳流入所述裝置，使之與所述脂質-TF相接觸，然後停止流動。用明視野顯微術檢測纖維蛋白形成並螢光顯微術檢測肽-修飾的香豆素染料的凝血酶誘導切割從而對凝結進行監測。僅在塗覆有脂質-TF的通道壁上引發凝結。該凝塊增長進入所述裝置的塗覆有惰性脂質的部分(圖22a)。該凝塊以恆定速度，F,20pmmin—1的反應性前沿增長通過整個所述通道(圖22c、d)。在通道壁上的血栓調節蛋白不影響凝塊增長己提出凝塊增長受血栓調節蛋白(TM，一種位於血管的血管損傷位點附近的血管壁中的凝結抑制劑)的調控。己顯示當TM均勻混合在血漿中時，凝塊增長減小。為了模擬TM在血管壁上的位置，將TM嵌入所述通道壁並測試TM是否能足以停止凝塊增長。本發明人通過形成含有重構TM的惰性脂質囊泡(脂質:TM)並使用以上所述塗覆所述通道壁的程序將TM嵌入所述惰性磷脂表面。對照試驗證實在所述通道壁上的TM活性與之前對單層內皮細胞測量的處於同一量級。所測定的TM活性顯示在表2中，其描述了由帶有重構血栓調節蛋白(TM)的雞蛋PC脂質塗覆表面形成的活化蛋白C(aPC)的量化。顯示了凝塊生長的相應速度。表2由帶有重構血栓調節蛋白(TM)的雞蛋PC脂質塗覆表面形成的活化蛋白C(aPC)的量化_tableseeoriginaldocumentpage54*可能己達到TM濃度的飽禾口(Tseng等，2006,Biomaterials27:2768-2775)。N/A-不適用，因為沒有TM存在。顯示數據僅僅為了與前沿速度進行比較。ND=未測定當所述脂質:TM的摩爾比為7.6><104時，凝塊以與沒有TM時(Fv-ZS^immin-1,綠色三角，圖22c)大約相同的速度增長。為進一步顯示位於所述通道壁的TM不能停止凝塊增長，TM密度增加10倍，沒有觀察到可察覺的Fv變化(圖22c)。其他對照試驗(參見表2)顯示了對於此處使用的兩種濃度的相似TM活性，這是與之前觀察到的高TM濃度的飽和效果相一致。在該裝置(表面-體積比為約0.02^im2^111—3)中存在TM時的凝塊增長提示可能有其他機制對這些條件下的凝塊增長進行調控。剪切率調控凝塊由一根通道增長進入另一通道為驗證流動血液的^調控凝塊增長的預測，本發明人設計微流裝置使凝塊的前邊緣暴露於流動的再次鈣化的血漿。圖22描述了A的閾值如何調節凝塊增長通過所述結合部。圖22a是用於測試凝塊增長通過所述結合部對,的依賴性的微流裝置示意圖。通過監測在所述流動通道(黑色)中的三個區域(虛線框)從而測定凝塊增長通過所述結合部。黑色箭頭指示了流動的方向。圖22b、c是在凝塊到達所述結合部後27分鐘，所述流動通道的所述3個區域的螢光顯微圖。圖22b顯示在^^值時，所述凝塊如何不增長進入所述"膜瓣"。圖22c顯示在,々,時，所述凝塊如何增長進入所述膜瓣並隨之在所述"膜瓣"下遊的流動通道中駐留。圖22d是凝塊增長對f的依賴性的量化。虛線表示短凝結時間和長凝結時間之間的分界。實心圓表示在所述"膜瓣"中觀察到凝結的試驗。空心圓表示在所述"膜瓣"中凝結之前停止的試驗。該裝置使之能在一條通道中沒有流動時引發凝結(引發通道，圖22a)而在有流動血漿的未阻塞相連通道中不導致引發。此外，該裝置在所述流動通道中加入與靜脈瓣相似的幾何形狀以重現在膜瓣中觀察到的再循環流。圖22a描述了該"膜瓣"增加了所述血漿在在所述流動通道中的駐留時間，並且使之能監測凝塊從所述引發通道和所述流動通道之間的結合部(下文中稱之為所述結合部)的增長。對照試驗證實了在所述"膜瓣"中的再循環流。該系統也使之能控制平均流速V平均[ms"]和t本發明人依據,(當在存在流動時研究凝塊形成所通常使用的參數)分析了凝塊增長通過結合部。在壓力驅動的流動中，在表面的局部流速V[ms—']為零。剪切率描述了V隨著距表面的距離的增加而變化，並且確定了在接近表面處各個方向上的運輸。本發明人計算了在具有矩形橫截面的通道的垂直壁的中點處的t當所述凝塊從所述結合部增長至所述"膜瓣"的時間超過30分鐘則認為凝結時間"較長"。圖22d顯示了在所述流動通道中在6080分鐘內如何自發形成凝結。由所述引發通道至所述流動通道的"膜瓣"的增長顯示了對^的閾值響應，在此條件下的剪切速率閾值A隨為約90s"(圖22d)。在所述引發通道中沒有流動時弓I發凝結並增長至所述結合部。在引發通道中沒有流動時總是發生至所述結合部的增長。當在流動通道中的,大於,自時，凝塊增長停止在所述結合部，導致長凝結時間(圖22b)。然而，當在所述流動通道中的,低於,《時，在所述引發通道中的凝塊增長通過所述結合部，首先到達所述流動通道的"膜瓣"，然後達到所述流動通道的位於所述"膜瓣"下遊的其他部分，導致短凝結時間(圖22c)。在,非常接近於4值時，本發明人在具有相同^的兩個試驗中均觀察到短和長的凝結時間(圖23d)，這證實了通過結合部的增長對f的敏感性。在結合部的剪切率而不是在"膜瓣"處的剪切率調控凝塊增長為進一步證實在所述結合部的,調控凝塊增長，本發明人設計了將所述結合部處的,與所述"膜瓣"處的^相分開的裝置。在圖22中所示的裝置中，在所述結合部的^的變化導致在所述"膜瓣"處的^的變化，從而改變在所述"膜瓣"處的再循環速率。圖23描述了通過結合部的凝塊增長是如何受所述結合部的,而不是所述"膜瓣"處的,的調控。顯示了剪切率、凝結時間和所述裝置各部分的示意圖。凝結時間為兩個試驗的平均值。裝置尺寸參見圖26，在圖23ad中的試驗的流速參見表3。在所述結合部和"膜瓣"處的高A(190s")導致長的凝結時間(23a)，而在所述結合部和所述"膜瓣"處的低A(30s")導致短的凝結時間(圖23b)。當所述流動通道在所述結合部變窄從而在所述結合部形成高戶，而在所述"膜瓣"處形成低^時，觀察到長凝結時間(圖23c)，這表明在所述"膜瓣"處的低A不足以促使凝塊增長通過所述結合部。當所述流動通道在所述結合部變寬從而在所述結合部形成低,，而在所述"膜瓣"處形成高戶，觀察到短凝結時間(圖23d)，這提示在所述結合部的，而不是在所述"膜瓣"處的^調控凝塊增長。表3在圖23中顯示的試驗的流速和剪切速率tableseeoriginaldocumentpage57*這是在具有"膜瓣"的通道中的體積流速。在區域1的體積流速(參見圖26)為四倍大。**對於在矩形通道中流動，計算在垂直壁的中點處的剪切速率(Nataraja和Lakshman，1973，IndianJournalofTechnology10:435-438)。***在所述"膜瓣"的剪切速率對應於緊接所述"膜瓣，'的上方或下方的所述矩形通道中的剪切速率(圖26)。在這些區域中的不同剪切速率對應於在所述"膜瓣"中的再循環的不同速率。暫時地抑制凝血酶使在剪切速率閾值以下的凝快增長停止。所提議的調控機制(圖21)提出當激活劑的移除速率超過激活劑的產生速率並在所述流動通道中保持C激翻,隨時，使再次鈣化的血漿流入所述裝置，並如圖21中所示引發凝結。當所述凝塊到達所述結合部時，將PPACK(終濃度=0.75|liM)加入到所述血漿中並在^,m值下流動7分鐘。然後，停止所述PPACK的流動，在f々隨下將再次鈣化的血漿流入，並如圖22所示監測凝結。該7分鐘的PPACK暴露顯著減緩了凝塊增長，由沒有PPACK暴露時的11分鐘增加至有PPACK暴露時的46分鐘(圖24b)。在不存在PPACK時的對照試驗證實了在暴露於^,闊值IO分鐘後，在所述結合部的凝塊保持活性。這些體外結果補充了之前的體內研究，所述體內研究證實了為實現相同的抗血栓形成效果，在血管破損處的周部PPACK施用的濃度要求比在全身施用時低數個數量級。結合來看，這些結果表明不可逆直接凝血酶抑制劑或具有高結合親合性的可逆直接凝血酶抑制劑諸如水蛭素(Kd=20fM)能通過在所述凝塊處對凝血酶的較長時間抑制而有效地防止血栓形成。在試驗中所使用的裝置的幾何形狀和尺寸，其中監測存在流動時在結合部的凝塊增長圖25是監測存在流動時凝塊增長通過結合部的實驗過程。在圖25a中所示的是兩種類型的磷脂囊泡(脂質-TF和惰性脂質)如何流入浸泡在NaCl溶液(150mM)中的PDMS裝置。每股脂質-TF流以0.5(aLmin"流動，而每股惰性脂質流以2.0pLmin"流動15分鐘。為確保所述脂質-TF不流過所述結合部，所述脂質囊泡被順序停止。首先，脂質-TF停止而惰性脂質繼續流動大約1分鐘。為停止所述惰性脂質，被塞住的入口(十字)拔去塞子，在該入口以1.0i!Lmin"開始流動NaCl溶液(150mM)。然後，停止惰性脂質(i)流，在該入口以1.0j_iLmin"開始流動NaCl溶液(150mM)。最後，停止惰性脂質(ii)流。圖25b描述了每次如何通過使NaCl溶液以1.0min"流動20分鐘從而移除過量的脂質囊泡。該過程在所述通道壁上留下脂質塗層。在所述NaCl溶液停止後，從所述NaCl溶液中取出所述裝置並密封出口(i)和出口(iii)(頂部的十字和底部的十字)。為密封所述出口，將少量的(2550)LiL)Norland光學粘合劑81塗抹到所述PDMS並暴露於UV光(X-320400nm)1520秒。接著，通過以3:1的體積流速比率(血漿:CaCl2溶液)流入血漿和CaCl2溶液(CaCl2，40mM;NaCl，90mM;和Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA,0.4mM)將血漿在晶片上再次鈣化。使這些溶液流動約1分鐘然後如上將出口(U)密封(中部十字)。最後，將所述裝置浸沒在EDTA溶液(50mM)中。圖25c描述了在所述通道壁塗覆有脂質-TF的地方如何引發凝結。該凝塊增長至所述結合部，在所述"膜瓣"處監測凝結。圖26是顯示用於在存在流動時凝塊增長通過結合部的裝置的實際幾何形狀和尺寸的示意圖。圖26a顯示了在圖23、24和25中使用的裝置的基本設計。對於在該部分使用的裝置，區域l、2、3和4的高度(h)、寬度(w)和長度(l)都是相同的。圖26b、c、d顯示了對區域2作出的通道幾何形狀的變化，從而在同一試驗中獲得在所述結合部和所述"膜瓣"處的不同剪切速率。對所有四個通道中的區域2作出相同的變化。對於PPACK試驗(圖24)在a和b中所顯示的裝置幾何形狀相同，不同之處在於該裝置具有一個額外的入口使之能轉換溶液。用基於栓塞的微流系統在晶片上滴定抗凝劑阿加曲班以及確定在全血或血漿中的凝結時間開發基於栓塞的微流系統以將抗凝劑(阿加曲班)滴定入血液樣品並採用活化的部分促凝血酶原激酶時間(APTT)測試對凝結時間進行測量。為進行這些試驗，對基於栓塞的系統開發了以下技術i)在所述微通道壁上使用特氟隆AF塗層從而能夠形成含有血液的栓塞並在所述栓塞裡運輸固體纖維蛋白凝塊，ii)使用親水性玻璃毛細管從而能將試劑由水性流中可靠地併入栓塞，iii)使用明視野顯微術來檢測栓塞裡纖維蛋白凝塊的形成，和使用螢光底物，用螢光顯微術來檢測凝血酶的形成，和iv)將阿加曲班(01.5pg/mL)滴定到栓塞中，在室溫(23°C)和生理溫度(37°C)下測量所得APTT。用正常匯集血漿(含較少血小板的血漿，PPP)和用供體血液樣品(全血和富含血小板的血漿，PRP)進行APTT測量。通過基於栓塞的微流裝置測量的APTT值和APTT比率與來自37°C的臨床實驗室結果進行比較。獲得自晶片上測定的APTT數據大約是來自臨床實驗室的那些數據的兩倍，但來自這兩種方法的APTT比率相互吻合。試劑和溶液。所有水溶液在18-MQ去離子水(Millipore，Billerica，MA)中製備。除非另外指明，所有試劑購得自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。人類oc-凝血酶的螢光底物，叔丁基氧羰基-P-苄基-L-天冬氨醯-L-脯氨醯七-精氨酸-4-甲基香豆醯-7-醯胺(^<=365nm，=440nm)，購得自PeptideInstitute,Inc.(大阪，日本)。對於此底物，在37匸的動力學參數為kcat=160s"，KM=11一(50mMTris-HCl，pH8.0禾卩0.15MNaCl、1mMCaCl2fnimg/mLBSA的緩衝溶液中)。所述APTT試劑(Sigma診斷補體)獲得自TrinityBiotech(Wicklow，愛爾蘭)。阿加曲班(100mg/mL的儲備濃度)獲得自GlaxoSmithKline(Philadelphia,PA)。在所述試驗前，該儲備液用150mMNaCl，20mMTris，pH7.8稀釋。1H，lH,2H，2H-四氟-l-辛醇(PFO，98%)獲得自AlfaAesar。活化部分促凝血酶原激酶時間(APTT)測定的方案。血液樣品獲得自健康供體，獲得芝加哥大學醫院放射科的InstitutionalReviewBoard的批准(第12502A號方案)。以1份3.2%檸檬酸鈉9份血液的比例將全血收集在採血器(vacutainer)試管中從而獲得脫鈣的全血。輕微地晃動試管以混合內容物。對於使用供體全血(其含有細胞和血漿)的試驗，使用來自採血器試管的樣品而無需進一步處理。對於使用來自供體的富含血小板的血漿(PRP)的試驗，在將來自釆血器試管的樣品在1600rpm離心10分鐘2次，從而獲得血漿。正常匯集血漿(含較少血小板的血漿，PPP)獲得自GeorgeKingBiomedical(OverlandPark,KS)並保存在-80。C。這些匯集血漿樣品由來自至少30名健康供體的血漿構成。對於使用正常匯集血漿(PPP)的試驗，樣品解凍後在1500rcf離心150分鐘從而移除由於長時間保存而沉澱的碎片。在血液凝結網絡中的反應通常分類為兩個途徑內在途徑和外在途徑。所述APTT測定測量了當由所述內在途徑引發時凝結所需的時間。APTT試劑含有兩種成分i)與因子XII相結合以引發所述內在途徑的帶負電荷的微粒，ii)磷脂以提供因子複合物所需的結合位點。對於補體(Alexin,在所述網絡中使用的APTT試劑)，所述激活劑是鞣花酸而所述磷脂是兔腦腦磷脂。首先，一份脫鈣血液樣品與一份Alexin相混合，並溫育3分鐘以充分活化所述凝結的內在途徑。血漿和Alexin的該混合物隨後用一份2025mM的CaCl2再次鈣化。CaCl2的終濃度為約78mM。過量的CaCl2用於克服檸檬酸鹽的作用。最後，加入CaCl2和在樣品中檢測到纖維蛋白凝塊之間所經過的時間記錄為APTT。該過程用作指導調節所述基於栓塞的微流裝置以適用於測量所述APTT。APTT的臨床結果由芝加哥大學醫院的凝結實驗室(Coagulationlab)用STA凝結分析儀(DiagnosticaStago,Inc.,Parsippany,NJ)進行觀(J量。微流裝置。使用PDMS(聚(二甲基矽氧垸))中的快速原型(prototyping)製造微流裝置。使用之前描述的矽烷化方案使微通道疏水化和親氟化，不同之處是向所述裝置通入1.5小時而不是1小時的十三氟-l,l,2，2，-四氫辛基)-l-三氯矽烷蒸氣。除了所述矽烷化方案以外，所述微通道用無定形特氟隆(TeflonAF1600，聚[4，5-二氟-2，2-二(三氟甲基)-1,3-間二氧雜環戊烯-共-四氟乙烯])塗覆。首先，微通道用在FC-70和FC-3283的1:4(v/v)混合物中的1%(w/v)TeflonAF1600溶液填充。對於在37。C進行的試驗，微通道用在FC-70和FC-3283的1:1(v/v)混合物中的2.5%(w/v)TeflonAF1600溶液填充。然後，裝置在7(TC烘焙過夜直至溶液蒸發。複合玻璃/PDMS毛細管裝置如前所述進行製造(Zheng等，2004,Angew.Chem.Int.Edit43:2508-2511)，不同之處在於在與所述PDMS裝置相連之前，用PlasmaPrepII血漿清潔劑使所述玻璃毛細管親水化。微流體試驗。如前所述進行微流體試驗，並具有以下改進。使用氟化載體流形成栓塞，所述氟化載體流是10:1(v/v)的FC-70:PFO，其中在23°c，y=10mNm"禾bp=24mPa。所述氟化載體流的流速保持在3nL/min。用於形成栓塞的水溶液是Alexin和血液樣品(或者是全血、富含血小板的血漿或含較少血小板的血漿，在下一段中有更詳細的信息)。對於Alexin,對在23。C進行的試驗，流速為0.3nL/min，對37。C進行的試驗，流速為1.2fiL/min。對於所述兩股血流，在23。C總流速為0.3|iL/min，在37。c總流速為1.2^L/min。在溶合結合部將一滴100mMCaCl2溶液(300mOs)注射到每個栓塞中。對23。C，所述CaCb溶液的流速為0.2pL/min，對37。C，為0.4|uL/min。由所述Alexin、兩股血流和所述CaCl2溶液的流速估計，所述CaCl2的濃度對於在23'C進行的試驗和在37'C進行的試驗分別為25mM和14mM。過量的CaCl2用於克服檸檬酸鹽的影響。對於37r進行的試驗，顯微加熱臺(BrookIndustries,LakeVilla,IL)用於將所述裝置保持在37°C。在該部分的所有圖中(除了在圖28中)，所述微流裝置的主要PDMS通道為300(imx270|im(寬x高)，小通道為100(amxlOO(im。在圖28a中，所述主要PDMS通道和側通道均為200jimx250jLim。在圖28b中，所述主要PDMS通道為200|_imx250|jm，小側通道為50jamx50jim。在圖28c中，所述主要PDMS通道為200(imx260pm，所述側臂和轉角體積(cornervolume)的高度為80[im。用全血樣品測量APTT。對於全血的微流體試驗，在水性注射器中的儲備溶液是i)Alexin,ii)全血和iii)含有3.0pg/mL阿加曲班的全血。用LeicaDMIRB或DMI6000顯微鏡進行試驗。使用SpotInsight彩色數位相機(DiagnosticsInstruments,Inc)光學檢測到用全血形成的栓塞裡的纖維蛋白凝塊。用血槳樣品測量APTT。對於血漿(富含血小板的或者含較少血小板的)的微流試驗，在三個水性注射器中的出版儲備溶液是i)Alexin,ii)含有150螢光底物的血漿，其通過將3.5的底物溶液加入到246.5血漿中而製備，和iii)含有150螢光底物和3.0pg/mL阿加曲班的血漿，其通過將3.5底物溶液和0.75mL的阿加曲班(1mg/mL)加入到245.5)iL血漿中而製備。用LeicaDMI6000顯微鏡進行試驗。使用DAPI濾鏡d-350土25nm，A^^460i25nm)和冷卻CCDORCAERG1394(12-位，1344x1024解析度)(HamamatsuPhotonics,K.K.，濱松市，日本)，在所述顯微鏡上通過螢光監測所述螢光底物被a-凝血酶的切割。用明視野顯微術在顯微鏡上對血漿樣品裡的纖維蛋白凝塊進行監測。進行APTT試驗所用的微流體晶片的整體設計所述微流裝置由五個不同的區域構成栓塞形成區、混合區、溫育區、溶合結合部和檢測區(圖27)。在圖27中顯示的是用於測量所述APTT和用於滴定阿加曲班的基於栓塞的微流裝置的示意圖。含有Alexin(所述APTT試劑)和血液(血漿或全血)的栓塞形成在所述栓塞形成區，然後運輸至溫育區(顯微圖，左上方)。流動3分鐘後，在溶合結合部將CaCl2溶液注射到每個栓塞中(顯微圖，右上方)。所述CaCV液滴在所述顯微圖中用虛線描繪。在所述檢測區，在栓塞裡形成的凝塊經觀察為時間的函數(顯微圖，右下方)。形成三種水性試劑的栓塞i)Alexin,ii)去鈣化的血液和iii)混合有阿加曲班的去鈣化血液。所述血液樣品可以是供體全血、供體血漿(PRP)或正常匯集血漿(PPP)。所述Alexin的流速和所述血流的合併流速保持為1:1比例，正如APTT測定所要求的。通過改變所述兩股血流的相對流速，使栓塞裡的阿加曲班的濃度發生變化。巻繞的通道加入到所述微流體網絡的設計中以促進所述栓塞裡的試劑的混合。微通道在所述溫育區的長度經特別設計從而使得在所述水性和氟化載體流體流的總流速下，所述栓塞的溫育時間為3分鐘，正如APTT測定所指定的(圖27，微通道網絡的上部區域)。所述溶合結合部需要用於在溫育後將CaCl2注射到栓塞中(圖27，微通道網絡的右側)。關於該結合部的更多信息以下給出。為加速CaCl2在所述栓塞裡的混合，在所述微通道網絡中設計有另一巻繞通道。當所述血液的栓塞和所述CaCl2溶液在所述溶合結合部混合時，確定所述APTT的開始時間(1=0)。這與在臨床實驗室中使用的APTT測定的開始時間等於將CaCl2加入到所述血液樣品中的時間是相一致的。然而，在預備微流體試驗中，所述凝結時間似乎取決於所述混合速率。已知混合速率影響各種大量的自催化體系。為了在所述栓塞裡更可靠地運輸所述纖維蛋白凝塊而不粘附於所述PDMS微通道壁，所述微通道表面首先用氟化矽烷進行處理，然後塗覆無定形特氟隆。為確定在所述栓塞裡形成纖維蛋白凝塊的時間點，在所述檢測區(圖27，所述微通道網絡的下部區域)用明視野和螢光顯微術獲取圖像並分析。將液流溶合到流動栓塞的兩種新方法為對基於栓塞的微流系統進行多步測定，將試劑注射到栓塞中是必須的。對於栓塞類微流體學之前已開發出有三種溶合方法i)在其移動通過含有試劑的通道時將試劑直接注射入栓塞；ii)當液滴和栓塞35的形成之間的頻率相吻合時，將小液滴溶合到所述主要通道中的鄰近較大的栓塞中；iii)將10滴更小的液滴溶合到單個較大的栓塞中。然而，這三種方法難以在該測定中實現。在這些低流速下(對所述CaCl2流，0.10.2mm/s)，當CaCl2直接注射到經過的栓塞中時在所述側通道中發生CaCl2流的汙染(圖28a)。如果使用更小寬度和高度的側結合部，形成CaCl2的小液滴而在所述結合部不與經過的栓塞相溶合(圖28b)。圖28描述了用疏水性側通道在微流裝置裡溶合。在圖28a中顯示的是當所述側通道是疏水性時(矽烷化的PDMS)，在所述側通道較大(200nm寬和250|_im高)時汙染如何發生(在5次試驗中有5次發生)。圖28b描述了當所述側通道太小時(20]im的寬和高)，不發生溶合(4次試驗中有4次不發生)。另一種溶合的方法是以與所述經過的栓塞相同的頻率形成CaCl2液滴。圖28c顯示了在所述結合部，在所述經過的栓塞間的所述載體流如何流入所述側臂從而從所述CaCl2流中撞出液滴。在圖28d中顯示的是在不同水分數wf(A)中對於Ucad2/U水性=0.125，獲得持續溶合。在恆定的wf-0.4，僅對於Ucac,2/U水性=0.125(—，測得了高百分比的溶合(95%)。每個符號表示來自100個栓塞的測量結果。所有的比例尺均為100[im。本發明人實現了兩種新的溶合方法。對於第一種方法，所述溶合結合部經過設計使得所述栓塞間的氟化載體流流入所述側臂中而在轉角體積中撞出CaCl2的液滴(圖28c)。為了實現該設計，所述水性栓塞和栓塞間的載體流間隔的尺寸表徵為不同的水分數，wf。使用該設計，在經過該結合部的栓塞和在所述轉角部分中形成的液滴間的頻率相匹配。成功的溶合取決於Ucad2/U水性的比率而不是所述水分數wf。水分數wf-U水性/U總量，其中U水性[pL/min]是所述血液和Alexin的水性流的總體積流速。U總量[pL/min]是所述血液、Alexin和載體流的總體積流速，而UCaC12[pL/min]是CaCl2流的流速。存在栓塞長度和栓塞間載體流體流作為wf和U總量[jiL/min]的函數的依賴性。對於w廬0.4，當UCaCI2/U她=0.125時，觀察到最高百分比的成功溶合事件(95%)，其中Ucad2保持在0.1^iL/min(圖2d，實心符號)。如果Ucad2/U她保持在0.125，對於從0.360.45的不同wf觀察到成功的溶合(92。/。99。/。)(圖2d，空心符號)。該方法的優點是不需要更多的製造嘗試。然而，在較大範圍的Ucad2/U水性中不能持續一致地出現溶合。圖29a描述了使用插入在側通道中的親水性玻璃毛細管的持續一致的溶合。圖29b顯示了進入所述栓塞的CaCl2的注射體積V注射的cac,2[nL]是如何受到流速[(oL/min]的控制的，其中，Ucad2是CaCl2流的流速，U水性是Alexin和血液流的總水性流速。在所述圖中，每個符號表示10個栓塞的測量結果。至少兩個符號是為Ucad2/LU性的每一個值顯示的，其中一些符號重合。在圖29a中顯示的方法依賴於對所述側通道的表面化學的控制。使用小側通道以避免後-汙染(back-contamination)(如圖28b中所示)但其形成為親水性的。通過將親水性毛細管插入到該側通道中從而製造溶合結合部。由於浸潤性所述CaCl2溶液保持吸附於所述毛細管，而沒有形成在圖28b中看到的不希望的液滴。在此實例中，重要的是(i)為了使該方法工作，用所述主通道的邊緣插入所述毛細管流，和(ii)具有比CaCl2液滴尺寸更大的血液栓塞尺寸(Ucad2/U*性<1，在此處的試驗中通常為0.170.33)。當這兩個要求滿足時，在本發明人用於APTT測定的水性流的流速(0.62.4^L/min)和CaCl2流的流速(0.20.4(aL/min)下，觀察到持續一致的溶合(100°/。，在不同裝置中進行超過40次的試驗)。注射到所述栓塞中的CaCl2體積，V艦的cad2[nL]隨著UCaCI2/U水性線性地增加(圖29b)。通過控制所述流速，可容易地對注射試劑的量進行精確控制。該溶合方法可用於在測量APTT時直接注射CaCl2溶液。檢測栓塞裡的凝塊和分析圖像以測量所述APTT和凝血酶形成所述APTT是由加入CaCl2至在所述血液樣品中檢測到纖維蛋白凝塊所經過的時間。在測試中心所使用的大多數床旁分析裝置(point-of-caredevke)和商售機器中，通過檢測光學透光度的變化或磁微粒的移動來檢測所述纖維蛋白凝塊的形成。此處，在栓塞裡的纖維蛋白凝塊是用明視野顯微術檢測，而在栓塞裡的凝血酶形成是用螢光顯微術檢測的。通過分析獲取的栓塞移動通過所述微通道的圖像，本發明人建立了測定栓塞中APTT的標準化方法。檢測供體全血栓塞中的纖維蛋白凝塊。對於用全血形成的栓塞，明視野顯微術用於檢測在所述纖維蛋白凝塊中俘獲的紅細胞(RBC)。圖30描述了使用明視野顯微術觀察全血的栓塞中的凝塊。圖30a描述了在單個全血栓塞移動通過所述微通道時如何對其進行跟蹤。時間t[秒]是所述栓塞在與CaCl2溶合後移動的時間。當紅細胞不再在所述栓塞裡移動並在所述栓塞的後半部觀察到緻密凝塊時，認為所述栓塞裡的全血完全凝結(a，底部圖像)。圖30b描述了如何通過分析栓塞的圖像(如在a中的)，測定所述檢測區裡每個時間點的含有纖維蛋白凝塊的栓塞的百分比。在每個時間點總共至少採用20個栓塞進行測定。試驗在23'C進行。所述APTT經測定為RBC在所述栓塞裡不再移動(相對於所述所述流過所述微通道的運動)的時間。以2幀/秒獲取單個栓塞的系列圖片。為跟蹤單個栓塞，所述顯微鏡臺以相對於所述栓塞移動通過所述微通道的速度相同的速度移動。在凝結前，所述RBC均勻分布並在所述栓塞裡由於內部循環而移動。在一些時間以後，在所述栓塞裡出現小塊的RBC，但其他RBC依然通過內部循環而移動(圖30a，頂圖t-121sec)。在移動栓塞裡的剪切力(約2s")遠比通過激活血小板而誘導凝結所需的剪切力(約750S")要小。在隨後的時間，在纖維蛋白凝塊中俘獲的更大更緻密的RBC塊移動到所述栓塞的後半部，而其他RBC由於被俘獲在所述纖維蛋白網絡中而不移動(圖30a，底圖，t=136sec)。對於在圖30a中顯示的栓塞，在23。C，栓塞的APTT是t-136sec。t轉換[s]定義為由凝結的第一跡象(圖30a，頂圖)至RBC不再相對於栓塞移動時(圖30a，底圖)所經歷的時間。對於在圖30a中顯示的栓塞，t轉換為15秒。也可從許多栓塞統計地確定所述APTT。在每個時間點，對至少20個栓塞獲取圖像。由每個時間點的一組圖片，對含有纖維蛋白凝塊的栓塞數目計數。該數目除以栓塞的總數目得到在每個時間點的"凝結的栓塞的百分比"(圖30b)。所述APTT為50°/。的全血栓塞凝結的時間。所述ATPP在23°〇時為122秒(圖30b)，與之前測量的ATPP在23'C的175±58秒和在25。C的104土20秒相一致。由9個全血栓塞所測得的平均t轉換為15.4士2.8秒。檢測由供體血槳(富含血小板)形成的栓塞裡的凝塊。臨床實驗室經常用血漿而不是全血測量APTT。本發明人用兩種方法測定血漿中的APTT:用明視野顯微術觀察緻密纖維蛋白凝塊的形成和用螢光顯微術檢測螢光底物由凝血酶所導致的切割。圖31描述了使用明視野和螢光顯微術觀察在富含血小板的血漿(PRP)的栓塞中的纖維蛋白凝塊的形成。圖31a顯示了在單個血漿栓塞移動通過所述微通道時如何對其進行跟蹤(a，左圖)。用數字索貝爾濾鏡處理明視野圖像以更加容易地看到凝塊(a，右圖)。當所述纖維蛋白凝塊緻密化進入所述栓塞的後半部並且所述栓塞的後續圖像看起來一樣(對比t=112.5秒的圖和t=115.5秒的圖)時，認為血漿已經完全凝結。圖31b描述了在血漿中含有凝血酶的螢光底物的栓塞如何形成。所述底物的螢光強度增加。在此圖中，每條黑色虛線表示來自個體栓塞的螢光強度，其中當單個栓塞移動通過所述微通道時，對其進行跟蹤(總共顯示了4個栓塞)。用螢光顯微術收集的圖像中得到的整合強度與用明視野顯微術得到的圖像中觀察到的凝結栓塞的百分比(紅色方形)進行比較。當所述螢光強度為最大螢光信號的約30%時，約50%的栓塞凝結。每個符號表示在所述檢測區的每個時間點至少IO個栓塞的測量結果。試驗在23'C進行。為了使用明視野顯微術觀察血漿中的纖維蛋白凝塊，對移動通過所述微通道的單個栓塞獲取了時間序列圖像(圖31a，左圖)。藉助於數字迴旋濾鏡索貝爾(來自Metamorphsoftware)的使用來對所述凝塊進行視覺檢測(圖31a，右圖)。對於在圖31a中顯示的栓塞，所述APTT為約113秒，t轉換為14秒。t轉換[s]定義為由凝結的第一跡象(圖31a，第一幅圖)至纖維蛋白凝塊不再相對於栓塞移動時(圖31a，第五幅圖)所經歷的時間。使用螢光顯微術，可以對於血漿栓塞獲得所述凝血酶形成的更量化的測定。本發明人使用凝血酶的螢光底物。當被凝血酶切割時，所述底物的螢光強度增大約10倍。凝血酶是在所述凝結網絡中形成的最終酶，並且它通過切割纖維蛋白原驅動形成纖維蛋白。纖維蛋白凝塊在低濃度的凝血酶(210nM)下形成，而大部分的凝血酶(約1pM)是在所述凝塊完全形成後產生的。相比所述底物，凝血酶更傾向於切割纖維蛋白原。當單個血漿栓塞移動通過所述微通道時對其進行跟蹤，螢光強度經測量為時間的函數(所示為4個栓塞，每個栓塞由一條黑色虛線表示，31b)。雖然每個單獨栓塞的實際APTT並不相同，但相對螢光強度由0增加至l所需的時間是相同的。為測定多個栓塞的平均APTT,本發明人將通過明視野顯微術的纖維蛋白凝塊的檢測與通過螢光顯微術的凝血酶形成的檢測相關聯。在每個時間點由明視野和螢光顯微術從相同試驗獲取圖像。明視野圖像經過分析以測定作為時間的函數的凝結栓塞百分比。所述APTT(約100秒)測定為50%的栓塞含有纖維蛋白凝塊的時間。該APTT與螢光強度為最大螢光信號的約30。/。相關聯(圖31b)。阿加曲班的滴定和APTT和凝血酶形成的測量為測定所述抗凝劑對APTT的影響，在將阿加曲班滴定到正常匯集血漿、供體血漿或供體全血的樣品中時測量APTT。正常匯集血槳的APTT的測量是在中心臨床實驗室中的凝結儀器的標準校準過程。因此，本發明人也由正常匯集血漿得到APTT。對於晶片上滴定，兩股入流血液中的一股含有3|Lig/mL的阿加曲班。通過改變這兩股血流的相對流速，改變所述栓塞裡的阿加曲班的濃度。試驗在23"和37"進行。圖32描述了在23t:，當阿加曲班滴定入血液樣品時，凝血酶形成和APTT的測量。圖32a、b描述了在血漿中凝血酶形成的檢測。圖32c顯示了在全血中APTT的測量結果。圖32d顯示了由(c)所得的APTT比率。在所述栓塞裡的阿加曲班的濃度為0嗎/mL、0.5)Lig/mL、0.75嗎/mL和1.0jig/mL。每個符號表示至少20個栓塞的測量結果。如圖32c所示，對於全血樣品，所述APTT是凝結的栓塞的百分比為50%時的時間。圖32d描述了如何測定全血樣品在每個濃度的阿加曲班下的APTT比率。所述APTT比率是具有阿加曲班的APTT與沒有阿加曲班的基線APT丁的比率。對在23。C進行的試驗，阿加曲班對供體血漿樣品的凝血酶形成的影響令人滿意地與所述正常匯集血漿的結果相一致(圖32a、b)。所述APTT比率是血漿中具有阿加曲班的APTT與沒有阿加曲班的基線APTT的比率。對於供體全血樣品，在23。C的APTT比率顯示了對阿加曲班濃度的依賴性(圖32d)。通常，0.22.0pg/mL的阿加曲班劑量是得到1.53.0的APTT比率所需要的。在23°C，使用該晶片上APTT測定，對於0.5pg/mL的阿加曲班劑量，得到2.3的APTT比率，對於1.0嗎/mL的阿加曲班劑量，得到2.8的APTT比率(圖32d)。對於該供體，觀察到APTT比率對阿加曲班濃度的非線性依賴性。所述依賴性從血漿試驗至全血試驗是可以再現的。在37'C生理溫度下進行試驗需要求所述方案進行兩個修改。首先，使用更濃的特氟隆AF溶液(2.5%w/v代替23'C測量所用的1%w/v)塗覆所述微通道以防止纖維蛋白凝塊粘附到所述微通道壁上。纖維蛋白凝塊在較高溫度下更容易粘附到所述通道壁上。第二，採用Alexin和血液樣品的更高注射流速以形成更大的栓塞(栓塞的寬度-長度比為約1:3)。圖33描述了在37'C將阿加曲班滴定入(a)正常匯集血漿和(b)供體血漿中時的APTT測量結果，以及所述(c)APTT和(d)APTT比率的對應值。對於兩個血漿樣品，所述APTT為50%的栓塞含有纖維蛋白凝塊的時間。在所述栓塞裡的阿加曲班的濃度為0|Lig/mL、0.25pg/mL、0.5嗎/mL和1.5昭/mL。每個符號表示至少20個栓塞的測量結果。圖33c描述了正常匯集血槳的臨床APTT的值如何比用所述基於栓塞的微流體試驗測量的正常匯集血漿和供體血漿的APTT低約兩倍。圖33d顯示了在正常匯集血漿的臨床APTT和所述基於栓塞的微流體試驗的正常匯集血漿和供體血漿的APTT之間，所述APTT比率如何很好地相吻合。以與23"C試驗相同的方式滴定阿加曲班，在37'C測量了正常匯集血漿(圖33a)和供體血槳(圖33b)的APTT。在37。C獲得的APTT比率在23'C獲得的APTT短約2.5倍。在這兩個溫度下的APTT比率相似。在0.5jig/mL的阿加曲班在23'C得到2.3的APTT比率(圖6d)，在37°C得到約2.1的APTT比率(圖33b)。1.0嗎/mL的阿加曲班在23。C得到2.8的APTT比率(圖32d),在37。C得到2.7的APTT比率(圖33d)。在37。C通過晶片上檢驗測定的APTT值和APTT比率與來自37'C的臨床實驗室結果相比較。匯集血漿樣品與阿加曲班(01.5pg/mL)混合併提交給芝加哥大學醫院的凝結實驗室(Coagulationlab)進行APTT測量。由所述凝結實驗室獲得APTT與本發明人從晶片上檢驗獲得的APTT有約一半是吻合的(圖33c)。然而，來自這兩種方法的相應APTT比率彼此非常一致(圖33d)。兩項技術的開發使得呈現在該實例中的工作得以進行。首先，特氟隆AF塗層的使用有助於使纖維蛋白凝塊儘可能少地粘附到所述微通道的壁上。其次，通過將所述試劑流通過狹窄的親水性玻璃毛細管注入實現了所述試劑由水性流可靠地加入到栓塞中。該溶合方法對於進行多步檢驗測定和在栓塞中的反應將是重要的，尤其是在當必須將交叉感染降至最低和試劑的比率必須變化時。本發明的方法將可用於使用血液的其他測定，例如凝血酶原時間(PT)測定和在所述血液樣品中的其他待分析物的檢測。使用預裝載的試劑盒對單個血液樣品快速進行多個測試和滴定(Zheng等，2005,Angew.Chem.Int.Edit.44:2520-2523)是可以用該基於栓塞的微流系統實現的令人激動的機遇。圖36是檢驗以下假設的試驗的示意圖，所述假設為重要的是個體補塊的尺寸p，而不是總表面積。圖36a描述了以下假設，活化表面的小補塊(ps)的陣列並不引發凝結。圖36b描述了單個的大補塊(Pl)是如何引發凝結的。在(a)中的九個補塊的總活化表面積等於(b)寧的大補塊的總活化表面積。所述活化表面是用於化學模型試驗的酸性表面，是用於血漿試驗的含有組織因子的帶有負電荷的脂質。圖37是檢驗以下假設的試驗的示意圖，所述假設為當相距足夠近從而通過擴散而連通時，一簇亞閾值補塊將引發凝結。圖37a描述了以下假設，當具有活化表面的一簇亞閾值補塊在相隔距離d大於所述擴散長度尺度PtJ寸不能引發凝結。圖37b顯示了當亞閾值補塊的分隔距離小於Ptl.時，其是如何引發凝結的。所述活化表面是用於化學模型試驗的酸性表面，是用於血漿試驗的含有組織因子的帶有負電荷的脂質。圖38描述了能快速表徵個人凝血勢的系統的示意圖。圖38a描述了不同尺寸的補塊的單個陣列，可用於快速地測量特定血液樣品的補塊尺寸閾值。使用兩種類型的活化表面，具有重構TF的帶有負電荷的脂質(對於外在途徑)，和親水性玻璃(對於內在途徑)。屈38b描述了如何能在微流體通道裡製造補塊陣列。每個通道可含有一系列的組織因子補塊和一系列的親水性玻璃補塊。在通道間，諸如補塊尺寸範圍、TF濃度和藥物劑量等參數可以變換。對於大數量的和多類型的樣品，包括商購可得的具有凝血因子異常的血漿樣品和添加了諸如阿加曲班和肝素等藥物的血樣，可以實現高通量測量。應當理解的是，本發明並不局限於所描述的特定的裝置、方法學、方案、受試對象或試劑，並且這些都是可變化的。也應當理解的是，此處所使用的術語僅是為了描述特定實施方式的目的，而並非旨在限制本發明的範圍，本發明的範圍僅僅由權利要求所限定。對於本領域技術人員而言顯而易見的對通常能遇到的各種條件和參數的其他合適的修改和適應調整是在本發明的範圍之內。所有引用的出版物、專利和專利申請在此為所有目的以參考的方式全文引入。為所有目的以參考的方式全文引入的還有在線提供的與一些上述引用的出版物相關的補充材料(包括信息、文本、圖片、圖像、表格和電影)。權利要求1.一種用於檢驗凝結活性的設備，所述設備包括輸入血液流體的入口；與所述入口以流體連通的導管；和在所述導管中的至少第一補塊和第二補塊，其中(a)所述補塊各自包含當與來自受試對象的血液流體接觸時能夠引發凝結途徑的激活材料；和(b)(i)所述第一補塊中的所述激活材料不同於所述第二補塊；或(b)(ii)所述第一補塊中的激活材料的濃度不同於所述第二補塊；或(b)(iii)所述第一補塊具有不同於所述第二補塊的表面積；或(b)(iv)所述第一補塊具有不同於所述第二補塊的形狀；或(b)(v)所述第一補塊具有不同於所述第二補塊的尺寸。2.如權利要求1所述的設備，所述設備包括多個補塊。3.如權利要求2所述的設備，其中第一組兩個補塊的補塊間距離不同於第二組兩個補塊的補塊間距離。4.如權利要求2所述的設備，其中第一組補塊處在第一位置並且第二組補塊處在第二位置；並且其中所述第一組中的補塊數量不同於所述第二組中的補塊數量。5.如權利要求l所述的設備，其中所述激活材料包含至少一種選自由以下凝結刺激物組成的組中的至少一種凝結刺激物組織因子、因子II、因子XII、因子X、玻璃、玻璃樣物質、高嶺土、硫酸葡聚糖、澱粉樣蛋白P、鞣花酸、細菌和細菌組分。6.如權利要求1所述的設備，其中所述補塊是珠子。7.如權利要求1所述的設備，所述設備還包括珠子，其中所述補塊與所述珠子聯合。8.如權利要求1所述的設備，所述補塊還包含惰性材料。9.如權利要求1所述的設備，其中所述導管包含二個相交的微通道，並且其中所述通道彼此流體連通。10.—種檢驗凝血的方法，所述方法包括將來自受試對象的血液流體與至少第一補塊和第二補塊接觸，其中(a)所述補塊各自包含當與來自受試對象的血液流體接觸時能夠引發凝結途徑的激活材料；和(b)(i)所述第一補塊中的所述激活材料不同於所述第二補塊；或(b)(ii)所述第一補塊中的激活材料的濃度不同於所述第二補塊；或(b)(iii)所述第一補塊具有不同於所述第二補塊的表面積；或(b)(iv)所述第一補塊具有不同於所述第二補塊的形狀；或(b)(V)所述第一補塊具有不同於所述第二補塊的尺寸；以及測定哪些補塊引發來自所述受試對象的所述血液流體的凝結。11.如權利要求IO所述的方法，其中所述激活材料能夠在來自健康的受試對象的血液流體中引發凝結途徑。12.如權利要求10所述的方法，其中所述接觸的時間足以使至少最大的補塊能夠在來自健康的受試對象的血液流體中引發凝結途徑。13.如權利要求10所述的方法，所述方法還包括其中聯合有補塊的表面。14.如權利要求13所述的方法，所述方法還包括將來自所述受試對象的血液流體與所述表面聯合的第三補塊接觸，並且其中所述第一補塊和所述第二補塊之間的距離不同於所述第二補塊和所述第三補塊之間的距離。15.如權利要求13所述的方法，其中所述表面是微流體通道。16.如權利要求15所述的方法，其中所述血液流體以通過非混溶性質所區分開的液滴的形式與補塊相接觸。17.如權利要求15所述的方法，其中所述血液流體作為連續流與所述補塊接觸。18.如權利要求10所述的方法，其中所述補塊各自獨立地為珠子。19.如權利要求10所述的方法，其中所述補塊各自獨立地與珠子聯合。20.如權利要求18所述的方法，其中各個所述珠子的所述尺寸或形狀不相同。21.如權利要求10所述的方法，其中所述凝結途徑是血小板凝集途徑。22.如權利要求10所述的方法，其中所述接觸包括首先使第一量的血液流體與第一濃度的珠子進行第一接觸，和使第二量的血液流體與第二濃度的珠子進行第二接觸；其中各珠子獨立地與含有激活材料和惰性材料的補塊聯合。23.如權利要求21所述的方法，其中用尺寸逐漸增大的珠子滴定血液流體的等分試樣。24.如權利要求10所述的方法，其中所述測定包括光學觀測。25.如權利要求10所述的方法，其中所述測定包括測量光的散射。26.如權利要求IO所述的方法，其中所述血液流體為選自由全血、血液組分、血漿、血漿蛋白溶液和血液細胞溶液組成的組。27.如權利要求10所述的方法，所述方法還包括首先將過量的凝血因子加入到所述血液流體中然後使所述血液流體與所述補塊接觸。28.如權利要求10所述的方法，所述方法還包括將測試物質加入到血液流體中然後使所述血液流體與所述補塊接觸。29.如權利要求10所述的方法，所述方法還包括監測血液凝塊的增長速度。30.如權利要求10所述的方法，所述方法還包括將來自不同受試對象的血液流體加入到所述血液流體中然後使所述血液流體與所述補塊接觸。31.—種用於測量凝塊增長的設備，所述設備包括包含激活材料的第一區域；和與所述第一區域連通的適用於監測凝塊增長的第二區域；其中當所述血液流體被放在所述第一區域時，凝塊形成並增長至所述第二個區域。32.如權利要求31所述的設備，所述設備還包括含有所述激活材料的補塊。33.如權利要求31所述的設備，其中所述設備包括含有所述第一區域和所述第二區域的微通道。34.如權利要求31所述的設備，其中所述設備包括多個微通道，各微通道含有隔開的第一區域和第二區域。35.如權利要求31所述的設備，所述設備包括至少一組交叉的微通道，其中所述第二個區域處在第一組所述微通道的交叉點處。36.如權利要求35所述的設備，所述設備包括多個微通道和所述微通道的至少兩個交叉點，其中所述第二個區域位於其中的一個所述交叉點處，並且其中所述兩個交叉點的尺寸不同。37.—種監測凝塊增長的方法，所述方法包括以下步驟使血液流體與設備的第一區域接觸，所述第一區域包含激活材料；和監測所述設備的第二區域內的凝塊增長，所述第二區域與所述第一區域是連通的。全文摘要本發明提供了一種用於檢驗血液凝結活性的設備。所述設備包括輸入血液流體的入口和導管中的材料的兩個以上的補塊。所述材料能夠在血液流體中引發凝結途徑。本發明還提供了一種用於測量凝塊增長的設備，所述設備包括帶有能夠引發凝結途徑的材料的區域和對凝塊增長進行監測的區域。本發明還提供了一種檢驗血液凝結活性的方法，所述方法包括檢驗凝血途徑的完整性，檢驗物質對凝血途徑完整性的影響，監測凝塊增長和避免凝塊從一個導管到另一個導管的增長。文檔編號A61B5/00GK101410049SQ200780011260公開日2009年4月15日申請日期2007年1月31日優先權日2006年1月31日發明者克裡斯蒂安·J·卡斯特魯普,勞斯特姆·F·伊斯馬吉洛夫,峰沈,海倫·宋,馬修·K·魯尼恩申請人:芝加哥大學