一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法
2023-09-18 20:42:15
一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，經過蟲草菌種的篩選、馴化，得到性狀穩定的蟲草菌株，通過液體逐級擴大培養、發酵培養和分離培養，採用一定的發酵培養基配方及分離培養基配方等，並在培養過程中經過一定的溫差及光照刺激、分離培養方法等工藝，得到無需進行提純和深加工的固體活性蟲草菌絲體，遠遠超出現有人工製備蟲草菌絲體的含量，更加適合大規模工業化生產，而且本發明所製備的蟲草菌絲體可不經加工直接食用，最大限度的保留了蟲草菌絲體的生物活性，且具有氣味清香、口感好、食用便捷和藥用保健功效高等優點。
【專利說明】一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及保健食品生產領域，尤其涉及一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法
【背景技術】
[0002]隨著人們生活水平的日益提高，社會活動頻率的不斷加快，社會各界成功人士和廣大中青年工作者負荷進一步加大，中老年人和部分少年兒童急需改善和增強體質，為此研製高級天然營養保健食品成為一個急待開發的重要領域。
[0003]冬蟲夏草為我國具有悠久藥用歷史的滋補強壯名貴中藥，近代藥理藥化研究表明其含有腺苷、甘露醇及人體必須的18種胺基酸和富含多種有益於身體健康的微量元素，具有降血脂、防治動脈硬化、擴張血管、保護心腦組織、鎮靜安神、增強巨噬細胞、提高免疫功能、抑制小鼠艾氏腹水癌、抗炎、抗菌、耐缺氧的良好作用。
[0004]由於天然蟲草有其嚴格的寄生性及特殊的生長環境，加之近年來生態環境的嚴重破壞，天然蟲草資源銳減，價格猛漲。隨著人民生活水平的不斷提高，對蟲草的需求量正日益增大，因此，人工培養蟲草菌絲體替代天然蟲草成為當務之急。現代科學研究表明，蟲草菌絲體中大部分有效成分的含量基本與天然冬蟲夏草相同，蟲草菌絲體同樣具有提高人體免疫力、抗疲勞、預防心腦血管疾病及抗腫瘤等多種促進人體健康的功能，產品保健功效顯著，是天然冬蟲夏草理想的替代品，有廣闊的發展前景。 [0005]但是，目前蟲草菌絲體難以工業化大規模生產，目前所公開的人工蟲草菌絲體的製備方法中一方面普遍具有菌絲體含量低的缺點，菌絲體與培養基的質量比約為1: 61，且含量不穩定；另一方面普遍存在蟲草菌絲體與培養基不易完全分離，且分離的工藝方法非常複雜，一方面影響蟲草菌絲體的生物活性，另一方面影響蟲草菌絲體的純度和口感，且大大增加蟲草菌絲體的生產成本。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對一般蟲草菌絲體製備方法的不足，提供一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，本發明經過將含有蟲草菌絲的發酵產物進行一定條件的分離培養，使蟲草菌絲體在生長過程中自然與分離培養基分離，從而得到純的固體活性蟲草菌絲體，省略一般蟲草菌絲體人工製備中的分離純化工藝，降低生產成本，更加適合大規模工業化生產，而且最大可能的保留並提高蟲草菌絲體的生物活性，提高產品的藥用保健功效。
[0007]本發明的另一個目的是，通過在對蟲草菌種的篩選、馴化過程中採取一定的溫差及光照刺激培養，得到優良的，性狀穩定的蟲草菌種，有利於蟲草菌種的後期培養。
[0008]本發明的又一個目的是，通過在蟲草菌種進行液體培養的營養液中添加一定的微量元素，使蟲草菌絲體的產量得到大幅度提高。
[0009]本發明的技術方案為:[0010]一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，包括以下步驟:
[0011]將含有蟲草菌絲的發酵產物低溫出罐後分裝到裝有一定分離培養基的分裝器皿中進行暗培養，培養至有蟲草菌絲體長出並與所述分離培養基分離，其中所述分離培養基包含下列重量份的組分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及無菌水800-1200 ；
[0012]此外，還包括以下步驟:
[0013]步驟一、蟲草菌種的篩選，將蟲草菌絲接種於蠶蛹，通過自然培育法進行培育，在經過一定條件的溫差和光照刺激後，選取優良蟲草菌株作為蟲草菌種，並將蟲草菌種繼續培養至孢子成熟；
[0014]步驟二、蟲草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲草菌種的子囊部位組織懸於裝有一定濃度生理鹽水的組織培養瓶頂部，進行一定條件的光照培養後將生理鹽水轉接液體培養基進行液體培養，得到性狀穩定的蟲草菌株；
[0015]步驟三、發酵培養，將所得到的性狀穩定的蟲草菌株逐級擴大培養後，接種發酵罐進行一定時間的變溫好氧發酵，得到含有蟲草菌絲的發酵產物。[0016]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，步驟三中發酵所用培養基包含下列重量份的組分:土豆粉8-12，蛋白腖2-4，葡萄糖20-30及無菌水800-1200 ；
[0017]所述變溫好氧發酵的發酵條件為:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培養2_3天後，繼續於18-19度培養1-2天，然後於19-21度培養3_5天。
[0018]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，步驟四中所述發酵產物與分離培養基的重量比為1: 13-18，所述分裝器皿的裝量為總容積的16-18%，分裝完成後於20-24度進行暗培養35-40天。
[0019]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，步驟一中所述蟲草菌絲通過以下方法得到:切取蟲草菌株子囊部位組織，將其進行外部消毒處理後，加入到裝有少量無菌0.5-1%葡萄糖培養液的組織培養瓶中，於22-24度進行組織分離培養3-7天後，經過分離得到蟲草菌絲。
[0020]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，步驟一中所述自然培育法包括以下步驟:
[0021]步驟一，將蟲草菌絲接種於蠶蛹，將接種蟲草菌絲的蠶蛹進行變溫培養，所述變溫培養的培養溫度順次為:12-14度培養2-3天，14-16度培養1_2天，18-19度培養1_2天，
19-21度培養至蠶蛹僵化且有菌絲長出蠶蛹；
[0022]步驟二、將長出菌絲的蠶蛹進行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養2-7天，設定溼度為60-70度，溫度變化率為1-2度/小時。
[0023]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，所述自然培育法的步驟二中，在進行溫度刺激培養至菌絲呈一定的團球狀時對培養物進行不低於200勒克斯的光照刺激。
[0024]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，步驟二中所述光照培養方法為26-30度光照培養30-40小時；所述液體培養方法為將所述生理鹽水接種於含有全麥汁的試管中，於17-19度培養2-5天。
[0025]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，可將得到的性狀穩定的菌株接種固體斜面進行保存，所述固體斜面採用全營養培養基製成，保存溫度為3-4度。
[0026]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，所述性狀穩定的菌株接種固體斜面進行保存後，在使用前需對菌株進行菌株活化，所述菌株活化的方法為:將接種有性狀穩定的菌株的固體斜面於16-18度放置1-2小時後，將菌株轉接至麥汁營養液中，於16-18度培養2-4天。
[0027]優選的是，所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，步驟三中所述逐級擴大培養方法為:將性狀穩定的菌株逐級轉接營養液進行液體搖床培養，每級轉接擴培比例小於或等於40倍，其中所述營養液包括下列重量份的組分:土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無菌水800-1200 ;其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1-3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。[0028]本發明具有以下有益效果:本發明所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，通過將含有蟲草菌絲的發酵產物進行一定條件的分離培養，使蟲草菌絲體在生長過程中自然與分離培養基分離，從而得到純的固體活性蟲草菌絲體，得到無需進行提純和深加工的固體活性蟲草菌絲體,節省了一般方法中對蟲草菌絲體進行提純和加工的生產成本，且其蟲草菌絲體含量達95 %以上，遠遠超出現有人工製備蟲草菌絲體的含量，避免了一般的人工培養蟲草菌絲體含量低且不穩定的不足，而且最大可能的保留並提高蟲草菌絲體的生物活性，提高了產品的藥用保健功效，其生物活性比一般人工製備的蟲草菌絲體的生物活性提高30%以上，且具有氣味清香、口感好、食用便捷和藥用保健功效高等優點，適合大規模工業化生產。
[0029]另外，通過在對蟲草菌種的篩選、馴化過程中採取一定的溫差及光照刺激培養，得到優良的，形態穩定的蟲草菌種，有利於蟲草菌種的後期培養，尤其是通過在蟲草菌種進行液體培養的營養液中添加一定的微量元素組合物，使蟲草菌絲體的產量得到大幅度提高，其產量比目前一般人工製備蟲草菌絲體的方法提高20-30%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為本發明所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法流程圖。【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖1對本發明做詳細說明，以令本領域普通技術人員參閱本說明書後能夠據以實施。
[0032]如圖1所示，一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，包括以下步驟:
[0033]步驟一、蟲草菌種的篩選。選取優良的新鮮冬蟲夏草菌株，切取蟲草菌株子囊部位組織，將其進行外部消毒處理後，加入到底部裝有少量無菌0.5-1%葡萄糖培養液的組織培養瓶中，於22-24度進行組織分離培養3-7天後，經過離心等分離方法分離得到蟲草菌絲。將蟲草菌絲接種於蠶蛹，在生物培養箱中設定一定的培養條件，通過自然培育法進行培育，在經過一定的溫差和光照刺激的培育後，選取優良蟲草菌株作為蟲草菌種，並將蟲草菌種繼續培養至孢子成熟。[0034]其中所述自然培育法具體為:將接種有蟲草菌絲的蠶蛹在生物培養箱中進行變溫培養，所述變溫培養的培養溫度順次為:12-14度培養2-3天，14-16度培養1_2天，18-19度培養1-2天，19-21度培養至蠶蛹僵化且有菌絲長出蠶蛹，將長出菌絲的蠶蛹進行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養2-7天，設定溼度為60-70度，溫度變化率為1_2度/小時，既通過設定生化培養箱的參數，使培養箱內的溫度從13度開始以每小時上升I度的速度升至20-21度後，按照該速度逐漸下落到13度，並按照此規律循環變動進行梯度溫度變化刺激，當培養至菌絲呈一定的團球狀時，肉眼辨別為接種蟲草菌絲處出現直徑約0.2-1毫米的凸起時，對培養物進行不低於200勒克斯的光照刺激，並繼續培養至形成子實體，選擇優良的菌株，待其孢子成熟後進行蟲草菌種的馴化。
[0035]步驟二、蟲草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲草菌種的子囊部位組織用解剖刀切下，懸於裝有0.5-1%濃度生理鹽水的組織培養瓶頂部，進行一定條件的光照培養後將生理鹽水轉接液體培養基進行液體培養，得到性狀穩定蟲草菌株，其中所述光照培養方法為26-30度光照培養30-40小時；所述液體培養方法為將所述生理鹽水接種於含有全麥汁的試管中，於17-19度培養2-5天，全麥汁優選濃度為10-12%的全大麥麥汁。
[0036]步驟三、發酵培養，將所得到的性狀穩定的蟲草菌株逐級擴大培養後，接種發酵罐進行一定時間的變溫好氧發酵，得到含有蟲草菌絲的發酵產物。其中所述逐級擴大培養方法為:將性狀穩定的菌株逐級轉接營養液進行液體搖床培養，培養溫度為16-19度，每級轉接擴培比例小於或等於40倍，所述營養液包括下列重量份的組分:土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無菌水800-1200 ;其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1_3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。
[0037]發酵所用的培養基 包含下列重量份的組分:土豆粉8-12，蛋白腖2-4，葡萄糖
20-30及無菌水800-1200。所述變溫好氧發酵的發酵條件為:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培養2-3天後，繼續於18-19度培養1-2天，然後於19-21度培養3_5天，然後低溫出罐。
[0038]步驟四、分離培養，將發酵產物低溫出罐後分裝到裝有一定分離培養基的分裝器皿中進行暗培養，待蟲草菌絲體與所述分離培養基分離後進行採收，其中所述分離培養基包括下列重量份的組分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及無菌水800-1200。所述發酵產物與分離培養基的重量比為1: 13-18，所述分裝器皿的裝量為總容積的16-18%，分裝完成後於20-24度在無菌間進行暗培養35-40天，待蟲草菌絲體與分離培養基有效分離後，將蟲草菌絲體採收，並在無菌環境下自然低溫晾乾。
[0039]所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法中，也可將得到的性狀穩定的菌株接種固體斜面進行保存，所述固體斜面採用全營養培養基加瓊脂製作而成，保存溫度為3-4度。在接種使用前需對固體斜面保存的菌株進行菌株活化，所述菌株活化的方法為:將接種有性狀穩定的菌株的固體斜面於16-18度放置1-2小時後，將菌株轉接至麥汁營養液中，於16-18度培養2-4天，得到活化復壯的蟲草菌株。
[0040]實施例1
[0041]選取優良的新鮮冬蟲夏草菌株，切取蟲草菌株子囊部位組織，將其進行外部消毒處理後，加入到底部裝有少量無菌1%葡萄糖培養液的組織培養瓶中，於22-24度進行組織分離培養3-7天後，經過離心等分離方法分離得到蟲草菌絲。選取優質蠶蛹，將蟲草菌絲接種於蠶蛹，在生物培養箱中設定一定的培養條件，通過自然培育法進行培育，培養溫度順次為13度2天，14度I天，19度一天，20度培養至蠶蛹僵化且有菌絲長出蠶蛹，將長出菌絲的蠶蛹進行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養2-7天，設定溼度為60-70度，溫度變化率為1-2度/小時，既通過設定生化培養箱的參數，使培養箱內的溫度從13度開始以每小時上升I度的速度升至20-21度後，按照該速度逐漸下落到13度，並按照此規律循環變動進行梯度溫度變化刺激，當培養至菌絲呈一定的團球狀時，肉眼辨別為接種蟲草菌絲處出現直徑約0.2-1毫米的凸起時，對培養物進行不低於200勒克斯的光照刺激，並繼續培養至形成子實體，選擇優良的菌株，待其孢子成熟後進行蟲草菌種的馴化。
[0042]蟲草菌種的馴化方法為，將孢子成熟的蟲草菌種的子囊部位組織用解剖刀切下，懸於裝有0.75%濃度生理鹽水的組織培養瓶頂部，28度光照培養36小時後將生理鹽水轉接含有10-12%的全大麥麥汁的試管中，於18度培養4-5幾天,得到性狀穩定的蟲草菌株。將得到的性狀穩定的菌株接種全營養培養基加瓊脂製作的斜面，於3-4度進行保存。在接種使用前進行菌株活化和復壯，所述菌株活化的方法為:將接種有性狀穩定的菌株的固體斜面於16-18度放置1-2小時後,將菌株轉接至麥汁營養液中，於18度培養3天。
[0043]將性狀穩定的菌株逐級轉接營養液進行液體搖床培養，培養溫度為18度，每級轉接擴培比例小於或等於40倍，其中營養液包括下列重量份的組分:土豆粉20，磷酸二氫鉀2，硫酸亞鐵I，硫酸鎂0.5，葡萄糖20及無菌水1000。經過逐級擴大培養後，接種發酵罐進行一定時間的變溫好氧發酵，發酵所用的培養基包含下列重量份的組分:土豆粉10，蛋白腖3，葡萄糖25及無菌水1000，發酵罐充氧量8.5-9.0ppm,發酵溫度和時間順次為，16度培養2天，18度培養I天，20度培養4天得到含有蟲草菌絲的發酵產物，然後低溫出罐。將含有蟲草菌絲的發酵產物分裝到裝有一定分離培養基的分裝器皿中於22度在無菌間進行暗培養35-40天，所述分離培養基包括下列重量份的組分:葡萄糖10，黃豆柏2及無菌水1000，發酵產物與分離培 養基的重量比為1: 15，所述分裝器皿的裝量為總容積的16-18%。待蟲草菌絲體與所述分離培養基分離後進行採收，並在無菌環境下自然低溫晾乾，得到本發明所述固體活性蟲草菌絲體。
[0044]儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於， 將含有蟲草菌絲的發酵產物低溫出罐後分裝到裝有一定分離培養基的分裝器皿中進行暗培養，培養至有蟲草菌絲體長出並與所述分離培養基分離，其中所述分離培養基包含下列重量份的組分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及無菌水800-1200 ； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、蟲草菌種的篩選，將蟲草菌絲接種於蠶蛹，通過自然培育法進行培育，在經過一定條件的溫差和光照刺激後，選取優良蟲草菌株作為蟲草菌種，並將蟲草菌種繼續培養至孢子成熟； 步驟二、蟲草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲草菌種的子囊部位組織懸於裝有一定濃度生理鹽水的組織培養瓶頂部，進行一定條件的光照培養後將生理鹽水轉接液體培養基進行液體培養，得到性狀穩定的蟲草菌株； 步驟三、發酵培養，將所得到的性狀穩定的蟲草菌株逐級擴大培養後，接種發酵罐進行一定時間的變溫好氧發酵，得到含有蟲草菌絲的發酵產物。
2.如權利要求1所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，步驟三中發酵所用培養基包含下列重量份的組分:土豆粉8-12，蛋白腖2-4，葡萄糖20-30 及無菌水 800-1200 ； 所述變溫好氧發酵的發酵條件為:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培養2_3天後，繼續於18-19度培養1-2天，然後於19-21度培養3_5天。
3.如權利要求1所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，步驟四中所述發酵產物與分離培養基的重量比為1: 13-18，所述分裝器皿的裝量為總容積的16-18%，分裝完成後於20-24度進行暗培養35-40天。
4.如權利要求1所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，步驟一中所述蟲草菌絲通過以下方法得到: 切取蟲草菌株子囊部位組織，將其進行外部消毒處理後，加入到裝有少量無菌0.5-1%葡萄糖培養液的組織培養瓶中，於22-24度進行組織分離培養3-7天後，經過分離得到蟲草菌絲。
5.如權利要求4所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，步驟一中所述自然培育法包括以下步驟: 步驟一，將蟲草菌絲接種於蠶蛹，將接種蟲草菌絲的蠶蛹進行變溫培養，所述變溫培養的培養溫度順次為:12-14度培養2-3天，14-16度培養1_2天，18-19度培養1_2天，19-21度培養至蠶蛹僵化且有菌絲長出蠶蛹； 步驟二、將長出菌絲的蠶蛹進行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養2-7天，設定溼度為60-70度，溫度變化率為1-2度/小時。
6.如權利要求5所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，所述自然培育法的步驟二中，在進行溫度刺激培養至菌絲呈一定的團球狀時對培養物進行不低於200勒克斯的光照刺激。
7.如權利要求1所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，步驟二中所述光照培養方法為26-30度光照培養30-40小時；所述液體培養方法為將所述生理鹽水接種於含有全麥汁的試管中，於17-19度培養2-5天。
8.如權利要求7所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，可將得到的性狀穩定的菌株接種固體斜面進行保存，所述固體斜面採用全營養培養基製成，保存溫度為3-4度。
9.如權利要求8所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，所述性狀穩定的菌株接種固體斜面進行保存後，在使用前需對菌株進行菌株活化，所述菌株活化的方法為: 將接種有性狀穩定的菌株的固體斜面於16-18度放置1-2小時後，將菌株轉接至麥汁營養液中，於16-18度培養2-4天。
10.如權利要求1所述的與培養基分離的固體活性蟲草菌絲體的製備方法，其特徵在於，步驟三中所述逐級擴大培養方法為: 將性狀穩定的菌株逐級轉接營養液進行液體搖床培養，每級轉接擴培比例不大於40倍，所述營養液包括下列重量份的組分:土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無菌水800-1200 ;其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1-3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂.0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。
【文檔編號】C12R1/645GK103897991SQ201410161231
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】楊秀芬 申請人:楊秀芬