檢測和/或鑑定腺伴隨病毒(aav)序列以及分離所鑑定的新型序列的方法

2023-09-19 05:25:15 2

專利名稱：檢測和/或鑑定腺伴隨病毒(aav)序列以及分離所鑑定的新型序列的方法
技術領域：
本發明提供了從組織或細胞來源樣品的DNA中檢測和分類AAV序列的方法。本發明還提供了用該方法鑑定的AAV序列以及用這些序列構建的載體。
背景技術：
腺伴隨病毒(AVV)是細小病毒家族的一個成員，是一個小的無包膜的二十面體， 其基因組為4. 7kb-6kb的單鏈線性DNA分子。AVV開始時被歸為依賴病毒，因為這個病毒是作為純化的腺病毒株中的汙染物而被發現的。AVV的生命周期包括潛伏期和感染期，在潛伏期內，AVV基因組在感染後以位點特異性的方式整合到宿主染色體內，在感染期內，伴隨著腺病毒或單純皰疹病毒的感染，整合的病毒基因組隨後恢復、複製並包裝成具有感染性的病毒顆粒。AVV因其具有非致病性、廣泛的宿主範圍包括非分裂細胞以及位點特異性整合等特徵而成為一個極具吸引力的基因轉移工具。
最近的研究表明，AVV載體是一個優選的基因治療工具。到目前為止，已經有6個不同血清型的AVV被從人或非人靈長類動物(NHP)體內分離出來並被鑑定。其中，人血清2 型首先被開發為基因轉移工具，現已被廣泛用於在不同靶組織和動物模型中進行基因轉移試驗。利用AVV2來源的載體治療某些人類疾病的臨床試驗也在進行之中，其中包括囊性纖維化和血友病B。我們所想要的是用於基因轉移的AAV來源的載體。

發明內容
本發明的一個方面涉及根據在缺少輔助病毒共感染的情況下AVV的潛伏和整合特性，利用生物信息學分析、PCR擴增以及克隆技術從各種人源及非人靈長類動物(NHP)組織的細胞DNA中檢測和鑑定AVV序列的新方法。
本發明的另外一個方面涉及利用本發明的上述方法所檢測到的AVV序列的分離方法。本發明還包括利用這些新的AVV血清型製備載體的方法，僅僅根據衣殼的基因序列和i^p/cap基因連接處的結構就可以用這些載體進行血清學和基因轉移的研究。
本發明的另外一個方面涉及利用本發明所描述的試劑，如通用引物對/探針和定量實時PCR進行血清學、流行病學、生物分布及傳播模式的研究。
本發明的另外一個方面涉及利用RACE和其他分子技術從不同來源的細胞DNA中分離新AVV血清型的完整且有感染性的基因組的方法。
本發明還涉及利用不同來源的輔助腺病毒從人或NHP細胞系中恢復新的AVV血清型基因組的方法。
3 本發明的另一個方面涉及新的AVV血清型、含該血清型的載體及利用該血清型的方法。
從下面對發明的詳細描述中可以很容易地理解本發明的這些方面及其他方面。


圖IA到IAAAR描述的是至少編碼AAV cap蛋白的核酸序列的比對。這些圖列出了包含ITR、r印區和衣殼區的如下新型AAV血清型的全長序列新型AAV血清型7 [SEQ IDNO 1],以及以前報導的 AAVl [SEQ IN NO :6]，AAV2 [SEQ ID NO 7]禾口 AAV3[SEQ IDNO :8]。新型AAV血清型AAV8 [SEQ ID NO 4]和AAV9[SEQ ID NO 5]是該共同提交的申請的主題。這個比對中所涉及的本發明的其他新型克隆包括42-2[SEQ ID NO 9], 42-8 [SEQ ID NO 27], 42-15[SEQ ID NO :28]，42_5b[SEQ ID NO :29]，42_lb[SEQ IDNO :30] ；42-13[SEQ ID NO: 31]，42-3a[SEQ ID NO :32]，42-4[SEQ ID NO :33]，42_5a[SEQID NO 34],42-10[SEQ ID NO: 35],42-3b[SEQ ID NO :36]，42-11[SEQ ID NO 37], 42-6b[SEQ ID NO :38]，43-1[SEQ ID NO :39]，43-5 [SEQ ID NO :40]，43-12 [SEQ IDNO :41]，43-20 [SEQ ID NO :42]，43-21 [SEQ ID NO :43]，43-23[SEQ ID NO :44]，43-25[SEQ ID NO :45]，44. 1[SEQ ID NO :47]，44. 5[SEQ ID NO :47]，223. 10[SEQ IDNO 48],223. 2[SEQ ID NO :49]，223. 4[SEQ ID NO :50]，223. 5[SEQ ID NO :51]，223. 6[SEQ ID NO :52]，223. 7[SEQ ID NO 53],A3. 4[SEQ ID NO :54]，A3. 5[SEQ IDNO 55],A3. 7[SEQ ID NO :56]，A3. 3[SEQ ID NO :57]，42. 12[SEQ ID NO :58]，44. 2[SEQID NO :59]。AAVlO [SEQ ID NO :117]，AAVll [SEQ ID NO :118]和 AAV12[SEQ ID NO :119]的特徵區域序列也列在圖中。AAV基因組結構中的關鍵標記也在圖中標識出來。斷裂的空間用黑點表示。AAV1[SEQ ID NO 6]的3，ITR用與以前報導的序列同樣的結構表示。TRS代表末端進化位點。要注意的是AAV7是所報導的唯一利用GTG作為VP3起始密碼子的AAV。
圖2A到2F顯示的是以前所報導的AAV血清型1 [SEQ ID NO 64], AAV2 [SEQ IDNO 70], AAV3 [SEQ ID NO :71]，AAV4 [SEQ ID NO :63]，AAV5 [SEQ ID NO :114]，和 AAV6[SEQ ID NO 65]以及本發明的新型AAV序列的vpl衣殼蛋白的胺基酸序列的比對，本發明的新型 AAV序列包括Cl [SEQ ID NO :60]，C2 [SEQ ID NO :61]，C5 [SEQ IDNO 62], A3-3 [SEQ ID N0: 66], A3-7 [SEQ ID NO :67]，A3_4[SEQ ID NO :68]，A3-5 [SEQID NO :69]，3. 3b [SEQ ID NO: 62]，223.4[SEQ ID NO :73]，223-5[SEQ ID NO :74]，223-10[SEQ ID NO 75],223-2[SEQ ID NO :76] ,223-7 [SEQ ID NO :77]，223-6 [SEQID NO :78]，44-1 [SEQ ID NO :79]，44-5 [SEQ ID NO :80]，44-2[SEQ ID NO :81]，42-15[SEQID NO :84]，42-8[SEQ ID NO :85]，42-13[SEQ ID NO :86],42-3A[SEQ ID NO :87]，42-4[SEQ ID NO :88]，42_5A[SEQ ID NO :89]，42-1B[SEQ ID NO :90],42-5B[SEQ IDNO :91]，43-1[SEQ ID NO :92]，43-12[SEQ ID NO :93]，43-5[SEQ ID NO :94]，43-21[SEQID NO :96]，43-25[SEQ ID NO :97]，43-20[SEQ ID NO :99]，24. 1[SEQ ID NO :101]，42. 2[SEQ ID NO 102],7.2[SEQ ID NO :103]，27. 3[SEQ ID NO : 104]，16. 3[SEQ IDNO :105]，42.10[SEQ ID NO : 106]，42-3B[SEQ ID NO : 107]，42-11[SEQ ID NO: 108]， Fl[SEQ ID NO :109]，F5[SEQ ID NO :110]，F3[SEQ ID NO :111]，42_6B[SEQ ID NO :112]， 42-12[SEQ ID NO :113] 新血清型 AAV8[SEQ ID NO :95]和 AAV9[SEQ ID NO :100]是此共同提交的專利申請的主題。
圖3A到3C顯示的是AAV7 rep蛋白[SEQ ID NO 3]的胺基酸序列。
具體實施例方式在本發明中，發明者發現了一種方法可以利用腺伴隨病毒(AVV)在缺少輔助病毒共感染的情況下具有穿過細胞核整合到細胞DNA並達到潛伏感染的能力。該方法利用聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的技術可以從人和非人靈長類動物來源的或其他來源的組織DNA 內檢測、鑑定和/或分離AVV序列。另外，該方法還適於檢測、鑑定和/或分離如下所描述的其他整合的病毒及非病毒序列。
本發明還涉及利用本發明的方法所鑑定的核酸序列。其中一種腺伴隨病毒是一個新的血清型，本文中被稱為血清型7 (AVV7)。本文所涉及的其他新型腺伴隨病毒血清型包括 AAVlO, AVVll和AVV12。其他利用本發明的方法所鑑定的新型AVV血清型也包括在本說明書中。參見附圖和所列的序列，本文已納入作為參考。
本發明還涉及這些AAV序列的片段。其中特別有意義的AAV片段是cap蛋白，包括vpl、vp2、vp3和超變區，rep蛋白，其中包括r印78、r印68、rep52和r印40，以及編碼這些蛋白的序列。這些片段都可被用於各種載體系統和宿主細胞中。這種片段可以單獨使用， 也可以和其他AAV序列或片段、或者其他AAV或非AAV病毒序列的元件聯合使用。在一個特別優選的實施方式中，載體含有本發明的AAV cap和/或rep序列。
如本文所描述，核酸序列是用任何一種公用的或商業的多序列比對程序如 "Clustal W」來比對的，這些程序可從網際網路的伺服器上下載。另外，還使用了 VectorNTI 程序。還可以使用本領域所熟知的許多算法來測算核苷酸序列的同一性，其中包括那些上面所描述的程序中的序列。另外，多聚核苷酸序列還可用i^asta進行比較，這是GCG 6. 1版本中的一個程序。Fasta能將所查詢的序列與所檢索到的序列之間最佳重疊區域進行比對並計算出其序列同一性的百分率。例如，兩個核酸序列之間同一性的百分率可以利用Fasta 軟體，參考GCG 6. 1版本中所提供的默認參數(字號為6，評分矩陣採用NOPAM因子)來確定，本文已納入作為參考。胺基酸序列也可用相似的程序來處理，如「Clustal X」程序。一般來說，這些程序的設置都是默認的，但是如果有必要本領域的技術人員也可以改變這些設置。另外，本領域的技術人員也可以使用其他的算法或電腦程式，只要這些程序能如參考算法和程序一樣測算序列的同一性或比對核酸序列。
術語「基本同源」或「基本一致」用於核酸或核酸片段時是指在一個核酸序列中適當插入或刪除一些核苷酸後與另一個核酸序列比較，其核苷酸序列同一性至少佔到所比較序列的95%到99%。當稱兩個序列同源時必須比較其全長序列、其開放閱讀框架或至少含 15個核苷酸的適宜核酸片段。適宜核酸片段的例子在本文中有描述。
術語「基本同源」或「基本一致」用於胺基酸或其片段時是指在一個胺基酸片段中適當插入或刪除一些胺基酸後與另一個胺基酸片段比較，其胺基酸序列同一性至少佔到所比較序列的95%到99%。當稱兩個序列同源時必須比較其全長序列、其蛋白質如cap蛋白、I^P蛋白，或至少含8個胺基酸的適宜片段，較好的是含15個胺基酸的片段。適宜片段的例子在本文中有描述。
術語「高度保守的，，是指至少80 %的序列同一性，優選的為至少90 %的序列同一性，更優選的為超過97%的序列同一性。本領域的技術人員可以很容易地通過本領域所熟知的算法和電腦程式來確定序列的同一性。
術語「序列同一性百分率」或「一致的」用於核酸序列時是指當將兩個序列一起比對時其核苷酸殘基是一樣的。序列同一性比較的長度可以超過基因組的全長，基因編碼序列的全長，或至少約含500-5000個核苷酸的片段。但是，也可以比較小片段之間的同一性， 如約含9個核苷酸的片段，通常含至少約20-M個核苷酸、至少約觀-32個核苷酸、至少約 36個或更多個核苷酸。同樣，「序列同一性百分率」也可以用於確定胺基酸序列，確定全長蛋白質或其片段的同一性。適宜的片段至少約含8個胺基酸，也可以最多達700個胺基酸。 適宜片段的例子在本文中也有描述。
AAV序列及其片段可用於製備rAAV，也可作為反義轉移載體、基因治療載體或疫苗載體。本發明還涉及核酸分子、基因轉移載體以及含本發明的AAV序列的宿主細胞。
如本文所描述，含本發明所述的AAV衣殼蛋白的本發明的載體特別適用於利用中和抗體消除AAV血清型來源載體以及其他病毒載體的效應。本發明的rAAV載體特別適合 rAAV再注射和重複的基因治療。
本發明的這些和其他實施方式以及優點下面有更詳細的描述。如本說明書和權利要求書中所描述的，術語「含有」和「包括」以及其他類似的詞語是指還可以包含其他的部分、元件、整體、步驟等。相反的，術語「由...組成」及其類似的詞語是指不包含其他的部分、元件、整體、步驟等。
I.本發明的方法 A.通過分子克隆技術檢測序列 本發明的一個方面涉及檢測和/或鑑定樣品中靶核酸序列的方法。該方法特別適於檢測整合到細胞染色體上的病毒序列，如腺伴隨病毒(AAV)和逆轉錄病毒等。本說明書以AAV為參照，以它為例子進行說明。但是，根據本說明書，本領域的技術人員也可以很容易地利用逆轉錄病毒(如貓白血病病毒(O^eLVhHTLVI和HTLVII)和慢病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬感染性貧血病毒、以及泡沫病毒)等來實施本發明。另外，本發明的方法還可用於檢測整合到宿主細胞染色體內或未整合到宿主細胞染色體內的其他病毒或非病毒序列。
本文所描述的樣品可以是任何含核酸的樣品，如組織、組織培養物、細胞、細胞培養物、以及生物液體，其中包括而不限於尿液和血液。這些核酸序列可以是質粒來源的DNA 或RNA、任何來源的天然DNA或RNA，其中包括細菌、酵母、病毒、以及較高等的生物如植物或動物。DNA或RNA的提取可以使用本領域技術人員所熟知的任何方法，如Sambrook編寫的「分子克隆實驗室手冊」(Molecular Cloning =ALaboratory Manual)(紐約冷泉港實驗室)所描述的方法。樣品的來源以及提取核酸的方法並不是對本發明所作出的限制。另外，本發明的方法可以直接用於含DNA的樣品或從該樣品中得到(或提取)的核酸。
本發明的方法包括利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增含DNA的樣品，所用的第一組引物是雙鏈核酸序列第一區特異性的，因此可以得到擴增序列。
如本文所描述，每個區域都是基於至少兩個血清型(即AAV)或病毒株(即慢病毒)的核酸序列的比對而確定的，其中所述每個區所含有的序列5』末端高度保守，中間部分優選可變的但不是必須的，3』末端也是高度保守的，這些序列保守或可變是相對於至少兩個比對的AAV血清型的序列而言的。5』和/或3』高度保守的核苷酸至少約有9個，較好的是至少有18個鹼基對。對於可變區來說，不需要有保守的序列，這些序列可以是相對保守的，即比對的血清型或病毒株之間具有小於90^^80%或70%的同一性。
每個區可以跨越約IOObp到101Λ鹼基對的長度，但是特別優選的是其中一個被稱為特徵區域的，即該區具有足夠的獨特性，能用來鑑定靶組織來源的擴增序列。例如，在一個實施方式中，第一區是一個約250bp的片段，與任何已知的AAV序列都能區別開，該序列是AAV來源的經正性鑑定的擴增區。而且，該區內的各種序列都具有足夠的獨特性，可用於鑑定擴增序列所來源的血清型。一旦被擴增(及被檢測)後，序列可用常規的限制性酶切他任何經本發明鑑定的新血清型內該區的限制性酶切圖譜比較就可以鑑定該序列。上述血清型都是本發明所鑑定和涉及的。
根據本文所描述的方法，本領域的技術人員可以很容易地鑑定其他整合病毒上的這種區，並且易於檢測和鑑定這些序列。因此，一對理想的通用引物應被設計在高度保守的末端，這組引物可用於擴增樣品中所選擇的區。本發明的這一方面可用於設計檢測靶序列 (如AAV)是否存在以及鑑定AAV血清型的診斷試劑盒，所用的判斷標準可以包括本文所描述的或利用本文所描述的技術分離出的血清型的限制性酶切圖譜。例如，PCR產物的快速鑑定或分子血清型的確定可以通過酶切PCR產物並與限制性酶切圖譜比較來完成。
因此，在一個實施方式中，AAV的「特徵區域」可能跨越AAV 1 [SEQ ID NO 6]的約 2800到3200區域，以及AAV 2、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6上的相應區域。優選的區域約為 250bp，位於 AAV 1[SEQ ID NO 6]的 2886 到 3143 區，以及 AAV 2 [SEQ IDNO 7], AAV3 [SEQ ID NO 8]以及其他AAV血清型上的相應區域。見圖1。為了快速檢測樣品中的AAV，所用的引物為該特徵區域特異性的。但是，本發明並不僅限於那些與本文所鑑定的AAV特徵區域完全相配的序列，本領域的技術人員可以對這個區加以改動，使之成為比特徵區域短點或長點的片段。
PCR引物是用本領域技術人員所熟知的方法合成的。每對PCR引物都由5』引物和 3』引物組成，見Sambrook等，本文已引用。術語「引物」指一個寡核苷酸片段，在適當的條件下，與核酸鏈互補的引物延伸產物在該點開始合成。但是，也可以使用雙鏈引物，只要在製備延伸產物前將其處理使之分開就可以了。引物含有約15到25個或更多個核苷酸，優選至少18個核苷酸。但是在某些情況下較短的如7到15個核苷酸也可以使用。
引物要選擇與所要擴增的特定序列的不同鏈足夠互補的序列，並且還能與其各自的鏈雜交。因此，引物序列並不需要是所要擴增區域的精確序列。例如，可以將一段非互補的核苷酸片段連接到引物的5』末端，但是剩餘的引物部分要與該鏈完全互補。另外，非互補鹼基或較長的序列可以分散在引物內，只要引物序列與所要擴增的序列足夠互補，能與之雜交，該鏈可以作為模板來合成引物的延伸產物就可以了。
根據本發明，特徵區域的PCR引物是基於兩個或多個比對序列(即兩個或多個AAV 血清型)的高度保守區而設計的。引物的序列在5』末端或中間可以加以改動，並不一定要和兩個或多個比對的AAV血清型完全互補。但是，引物的3』末端至少要有5個以上的核苷酸是與兩個或多個比對的AAV血清型完全互補的，優選9個以上的鹼基對完全互補，更優選的是18個鹼基對完全互補。這樣，引物的3』末端由至少5個與比對序列100%—致的核苷酸組成。但是，也可以在引物的3』末端加上1、2、或多個變性的核苷酸。
例如，AAV特徵區域的引物對是基於AAV衣殼內的如下特異區而設計的。5』弓丨物是基於 AAV2[SEQ ID NO 7]的 nt 28674891，5，-GGTAATTCCTCCGGAAATTGGCATT3，，見圖 1。 3，引物是基於 AAV2[SEQ ID NO 7]的 nt 2867-2891,5'-GACTCATCAACAACAACTGGGGATTC-3『 。但是，本領域的技術人員可以基於MV 1^4￥3，狀￥4^4￥5^4￥6的相應區域，或基於4八￥7， AAV10, AAVl 1, AAV12或本發明的其他AAV所提供的信息來設計引物對。另外，還可以利用本領域技術人員所熟知的方法設計其他的引物對來擴增這個特徵區域。
B.靶序列的分離 如本文所描述，本發明的第一引物對用於特異性地擴增靶序列即AAV血清型的特徵區域，以便於檢測該靶序列。如果還需要檢測其他的序列，即，如果需要鑑定一個新的血清型，那麼特徵區域需要延伸，這樣，本發明還需要一個或多個附加的引物對。這些引物對適宜設計成包含第一引物對的5』引物或3』引物和該引物對獨特的第二引物，這樣，該引物對可以擴增出特徵區域的5』區或3』區，該序列與特徵區域的5』末端或3』末端互補。例如，第一引物對由5』引物Pl和3』引物P2組成以擴增特徵區域。為了延伸特徵區域的3』 末端，第二引物對應由引物Pl和3』引物P4組成，該引物對可以擴增特徵區域及其下遊的序列。為了延伸特徵區域的5』末端，第三引物對應由5』引物P5和引物P2組成，該引物對可以擴增特徵區域及其上遊的序列。如果需要，這些延伸步驟可以重複(或同時進行)。因此，從這些擴增步驟中得到的產物與常規步驟所得到的產物接合就得到了所需要長度的獨立序列。
第二和第三引物對與特徵區域的引物對一起用於擴增比對序列上的高度保守區。 本文所用的術語「第二」或「第三」引物對只是為了便於描述，並不表示這些引物添加到反應混合物中或用於擴增的順序。第二引物對所擴增的區域是經過選擇的，這樣一旦擴增出來後其5』末端就可以與特徵區域的3』末端互補雜交。同樣，第三引物對所擴增的區域也是經過選擇的，這樣一旦擴增出來後其3』末端就可以與特徵區域的5』末端互補雜交。還可以設計出其他的引物對，這些引物對所擴增的區域可以與第二或第三引物對以及下面的引物對擴增產物的5』末端或3』末端互補雜交。
例如，如果以AAV為靶序列，第一引物對(Pl和P2)用於從樣品中擴增特徵區域。 在一個優選實施方式中，特徵區域位於AAV衣殼之內。第二引物對(Pl和P4)用於將特徵區域的3』末端延伸到AAV序列3』 ITR之前的區域，即以特徵區域為錨擴增出含AAV衣殼整個3，末端的產物。在一個實施方式中，P4引物位於AAV2[SEQ ID NO 7]的nt 4435-4462， 以及其他AAV血清型的相應序列上。結果得到一個約1. 6kb的產物，該產物含有0. 25kb的特徵區域。第三引物對(P3和P2)用於將特徵區域的5』末端延伸到AAV序列rep基因的 3』末端，即以特徵區域為錨擴增出含AAV衣殼整個5』末端的產物。在一個實施方式中，P3 引物位於AAV2[SEQ ID NO 7]的nt 1384-1409，以及其他AAV血清型的相應序列上。結果得到一個約1. 7kb的產物，該產物含有0. 25kb的特徵區域。另外，第四引物對用於將含AAV 衣殼整個5』末端的延伸產物進一步延長到包含rep序列。在一個實施方式中，P5引物位於 AAV2 [SEQ ID NO 7]的nt 108-133，以及其他AAV血清型的相應序列上，與P2引物合用。
完成了所希望數量的延伸步驟之後，利用特徵區域為錨或標記將各種延伸產物連接起來就得到了一個完整的序列。在本文所描述的一個實施例中，至少含有一個完整的AAV cap基因的AAV序列被擴增出來，當然也可以擴增出更大的序列，這要根據所進行的擴增步驟的多少。
8 將延伸產物組裝成一個完整的AAV序列所用的方法是本領域技術人員所熟知的。 例如，用DraIII消化擴增產物，可以在特徵區域的DraIII位點上將其裂解，得到一個限制性酶切片段，將此片段與含完整AAV cap基因分產物從新連接起來。但是也可以利用其他合適的技術將延伸產物組裝成一個完整的序列，見Sambrook等，本文已引用。
除了上面所描述的多步驟延伸方法，本發明的另外一個實施方式是直接擴增出一個3. Ikb的片段，該片段含有全長的cap序列。為了從NHP組織或血液DNA中直接擴增3. Ikb的全長cap片段，需要鑑定AAV基因組中其他兩個高度保守區以便於用PCR方法擴增這個大片段。保守區內的一個引物位於r印基因的中間(AVlns 5，GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3，，SEQ ID NO 6 的 nt)，另一個引物位於 cap 基因下遊的另一個保守區內(AV2cas :5，CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3，，SEQ IDNO :7)，而這結合可以擴增出含全長cap基因的AAV序列。一般來說，擴增完成以後，產物經克隆和測序其準確率都可以達到99. 9以上。利用該方法，發明者至少分離出50個衣殼克隆並隨之進行了鑑定。其中37個克隆來源於獼猴(rh. 1-rh. 37)，6個克隆來源於短尾猴(cy. 1-cy. 6),2 個克隆來源於狒狒(bb. 1和bb. 2)，5個克隆來源於黑猩猩(ch. 1-ch. 5)。這些克隆在說明書的其他地方也作了鑑定，連同其來源的物種以及存在新型序列的動物組織。
C.分離新型AAV的其他方法 本發明的另外一個方面涉及從細胞中分離新型AAV的其他方法。該方法包括用具有AAV輔助病毒功能的載體感染細胞；分離含AAV的感染克隆 』分離AAV的測序；以及將分離的AAV序列與已知的AAV血清型進行比較，如果分離的AAV與已知的AAV血清型序列有區別就說明存在新型AAV。
在一個實施方式中，具有輔助功能的載體提供了腺病毒的基本功能，包括如Ela， Elb，E2a，E40RF6。在一個實施方式中，輔助功能是由腺病毒提供。腺病毒可以是野生型的， 可以是人源的也可以是非人源的，最好是非人靈長類動物(NHP)來源的。各種腺病毒的DNA 序列可以從Genbank上找到，包括Ad5型[Genbank登錄號M73^0]。腺病毒序列可從已知的任何類型的腺病毒中獲得，如血清型2，3，4，7，12和40，還包括任何本發明已經鑑定的人源類型[見Horwitz，上面已引用]。同樣，已知可以感染非人動物(如黑猩猩)的腺病毒也可用於構建本發明的載體。見美國專利No. 6，083，716。除了野生型腺病毒之外，具有必須輔助功能的重組病毒或非病毒載體(如質粒、游離體等)也可使用。這些重組病毒是本領域所熟知的，可以通過已發表的方法製備。見美國專利No. 5，871，982和6，251，677，其中描述了一種雜合的Ad/AAV病毒。對腺病毒類型的選擇並不預示著對下列發明的限制。從美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)可以得到各種腺病毒株，另外也可以從各種商業機構或研究機構獲得。而且，許多這種病毒株的序列都可以從各種資料庫中查詢到，如PubMed和GenBank。
另外，感染性AAV可以用基因組步行技術(Siebert等，1995，Nucleic Acid Research,23 :1087-1088, Friezner-Degen φ,1986, J.Biol.Chem. 261 :6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)分離。基因組步行技術特別適於鑑定和分離與本發明方法所鑑定的新型序列相鄰的序列。例如，這個技術可用於分離新型AAV血清型的反向末端重複序列(ITR)，其根據就是用本發明的方法鑑定的新型AAV的衣殼和/或rep序列。該技術也可用於分離與本發明所鑑定和分離的其他AAV或非AAV序列相鄰的序列。見實施例3和4。
本發明的方法可用於各種流行病學研究，生物分布研究、通過AAV載體或其他整合病毒來源的載體進行基因治療的檢測。因此，這些方法可用於製備預包裝的試劑盒便於臨床醫生、研究人員和流行病學家使用。
II.診斷試劑盒 本發明的另外一個方面涉及檢測樣品中是否已知的或未知的腺伴隨病毒(AAV)。 這種試劑盒包括AAV核酸序列特徵區域特異性的第一對5』和3』PCR引物。另外，該試劑盒還可以包含3. Ikb片段特異性的第一對5』和3』 PCR引物，該片段含有本文所鑑定的全長 AAV衣殼核酸序列(即AVlns和AV2cas引物)。試劑盒還可以任選添加本文所描述的兩對或多對5』和3』弓丨物，以及PCR探針。這些引物和探針按照本發明可用於擴增每種AAV血清型的特徵區域，如用定量PCR方法。
本發明還涉及用於鑑定用本發明的方法檢測到的AAV血清型，和/或將新的血清型與已知的血清型區別開來。這種試劑盒還包含一種或多種限制性內切酶，AAV血清型的標準以用於「標記的限制性酶切分析」，和/或其他確定所檢測到的AAV血清型的試劑。
另外，本發明的試劑盒還包含說明書、陰性和/或陽性對照、容器、樣品的稀釋液和緩衝液、標記比較的對照表、一次性手套、防汙染說明、加樣棒或容器、樣品製備試管、以及其他任何需要的試劑，如介質、洗滌試劑和濃縮試劑。這些試劑可從本文所描述的試劑中選擇，液可以從常規的試劑中選擇。在一個優選實施方式中，洗滌試劑是等滲鹽溶液，可用於緩衝生理pH，如磷酸緩衝鹽(PBS)；洗脫試劑是含0.4M NaCl的PBS，以及濃縮試劑和設備。例如，本發明的技術人員都知道可以使用試劑如聚乙烯甘油(PEG)或NH4SO4，設備如過濾裝置。例如，含有100K膜的過濾裝置可以濃縮rAAV。
本發明的試劑盒可用於實現本文所描述的方法，也可用於生物分布、流行病學、新型AAV病毒在人和NHP傳播模式的研究。
因此，本發明的方法和試劑盒可用於靶病毒序列的檢測、鑑定和分離。該方法和試劑盒特別適用於檢測、鑑定和分離AAV序列，其中包括新的AAV血清型。
在一個值得注意的實施例中，發明者利用本發明的方法促進了對克隆AAV序列的分析，結果顯示不同動物來源的克隆片段之間的原病毒序列具有異質性，所有的序列都與已知的6個AAV血清型不同，其變異區主要集中在衣殼蛋白的超變區。令人吃驚的是AAV 序列的分散性在從一個短尾猴的單一組織如淋巴結中分離出來的克隆中特別明顯。這種異質性的最好解釋是動物個體內AAV序列存在明顯的進化，部分可能是由於有限數目的共感染親本病毒之間發生同源重組。這些研究說明天然AAV感染過程中廣泛傳播病毒的序列進化可能導致了一群準種的形成，這種準種在衣殼超變區的比對上是互不相同的。這是第一個DNA病毒發生快速分子進化的例子，這種方式以前被認為只發生於RNA病毒。
本文描述了幾種用本發明的方法鑑定的新型AAV血清型及其特徵。
III.新型AAV血清型 A.核酸序列 本文描述了用本發明的方法所鑑定的新型AAV血清型的核酸序列。見SEQ IDNO 1,9-59,以及117-120，本文已納入作為參考。也可參見圖1和表中所列的序列。
新血清型AAV7的全長序列，包括AAV 5』 ITR，衣殼，r印，和AAV 3』 ITR顯示在SEQ
10ID NO 1 中。
對於本發明的其他新的AAV血清型，本文描述了按照本發明的方法分離的約 3. Ikb的片段。該片段含有編碼全長衣殼蛋白的序列和編碼！·印蛋白的全部或部分序列。 這些序列包括下面所鑑定的克隆。
對於其他的新AAV血清型來說，本文描述了編碼衣殼蛋白的特徵區域。例如，本發明的AAVlO核酸序列包含了圖1所顯示的序列[見SEQ ID NO :117，255bp長]。本發明的 AAVll核酸序列包含了圖1所顯示的序列[見SEQ ID NO :118，258bp長]。本發明的AAV12 核酸序列包含了圖1所顯示的序列[見SEQ ID N0:119，255bp長]。利用本文所描述的方法，AAV10、AAV11和AAV12序列可以很容易地被鑑定，並用於各種目的，如AAV7和本文所描述的其他新血清型所用的各種目的。
圖1顯示的是本發明的非人靈長類(NHP)AAV核酸序列，以前文獻所報導的AAV血清型 AAV 1[SEQ ID NO :6]、AAV2[SEQ ID NO 7]和 AAV3[SEQ ID NO 8]與其一起比對。這些新型NHP序列包括下面表1中所列的序列，該序列是通過克隆數目來鑑定的。
表 1
權利要求
1.一種腺伴隨病毒(AAV)載體，所述載體包括AAV衣殼，該衣殼包含至少一個AAV 8 vp3衣殼蛋白，該蛋白具有包含SEQ ID NO :95的胺基酸203-738的序列或者與其有至少 95%同一性的胺基酸序列，所述衣殼具有包封在其中的具有AAV反向末端重複序列和與調節序列操作性連接的異源基因的小基因，所述調節序列指導所述異源基因在宿主細胞內表達。
2.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述AAV衣殼包含胺基酸序列vp2衣殼蛋白， SEQ ID NO 95 的 aa 138-738。
3.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述AAV衣殼包含胺基酸序列vpl衣殼蛋白， SEQ ID NO 95 的 aa 1-738。
4.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述AAV衣殼由選自以下的核酸序列編碼vpl, nt 2121-4335 ；vp2, nt 2532-4335 ；和vp3, nt 2730-4335 ；其中所述核苷酸編號是AAV8，SEQ ID NO 4的。
5.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述AAV衣殼是還包含與AAV8vp3異源的胺基酸序列的人工衣殼。
6.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述AAV通過重組方法製得。
7.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述反向末端重複序列來自AAV8以外的 AAV,由此提供假型AAV。
8.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述異源基因選自因子VIII序列、α-1抗胰蛋白酶序列和HIV序列。
9.如權利要求1所述的AAV，其特徵在於，所述表達控制元件包括組織特異性啟動子。
10.如權利要求9所述的AAV，其特徵在於，所述組織特異性啟動子是肝臟特異性啟動子。
11.一種製備如權利要求1-10中任一項所述的包含AAV血清型衣殼的重組腺伴隨病毒 (AAV)的方法，所述方法包括培養宿主細胞的步驟，該宿主細胞包含(a)編碼AAV衣殼的分子，所述AAV衣殼包含至少一個AAV8 vp3衣殼蛋白，該蛋白具有包含SEQ ID NO :95的胺基酸203-738的序列或者與其有至少95%同一性的胺基酸序列；(b)功能性r印基因；(c)包含AAV反向末端重複序列(ITR)和轉基因的小基因；以及(d)能將該小基因包裝到AAV衣殼蛋白中的足夠的輔助功能。
12.一種用於製備如權利要求1-10中任一項所述重組腺伴隨病毒(AAV)的包裝宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼AAV衣殼蛋白的分子，所述AAV衣殼蛋白具有AAV8 vp3衣殼蛋白，該蛋白具有包含SEQ ID NO :95的胺基酸203-738的序列或者與其有至少95%同一性的胺基酸序列；具有AAV反向末端重複序列和與調節序列操作性連接的異源基因的小基因，所述調節序列指導所述異源基因在宿主細胞內表達；和功能性rep基因。
13.—種在包含如權利要求1-10中任一項所述腺伴隨病毒的培養基中的宿主細胞。
14.一種包含如權利要求1-10中任一項所述AAV和生理相容性載體的組合物。
15.如權利要求1-10中任一項所述腺伴隨病毒在製備用於將轉基因遞送到細胞的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了從組織或細胞來源樣品的DNA中檢測和分類AAV序列的方法。本發明還提供了用該方法鑑定的AAV序列以及用這些序列構建的載體。
文檔編號C12R1/93GK102181480SQ20111008189
公開日2011年9月14日 申請日期2002年11月12日 優先權日2001年11月13日
發明者G·高, J·M·威爾森, M·阿爾維拉 申請人:賓夕法尼亞州立大學託管會