一種全量程c反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒的製作方法

2023-09-19 07:32:50

專利名稱：一種全量程c反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種膠體金增強的免疫比濁檢測試劑盒；更具體來說，涉及一種全量程C反應蛋白免疫比濁檢測試劑盒。
背景技術：
C反應蛋白(C-reactive protein)是人體中的肝臟細胞所產生的特殊蛋白，為發炎反應的指標；C-反應蛋白的分子量為115KD，由含有五個相同的末端糖基化的多肽亞單位組成，每個亞單位含有187個胺基酸，這些亞單位間通過非共價鍵連結成環狀的五聚體，並有一個鏈間二硫鍵。C-反應蛋白最早是Tillett及Francis等人於1930年時在急性大葉性肺炎患者 的血清中發現的，他們發現存在一種能在Ca2+存在時與肺炎球菌細胞壁中的C-多糖發生特異性沉澱反應的物質。1941年,Avery等測知它是一種蛋白質,故稱為C反應蛋白(C-反應蛋白)。1944年,Jones將其作為臨床風溼熱診斷標準的次要指標之一。後來，人們在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都測到了 C-反應蛋白，於是人們認為，C-反應蛋白是組織損傷的一種非特異性反應。進一步研究發現，病毒或細菌感染、梗塞、免疫複合物沉積等因素都可導致組織損傷。在組織損傷的急性期，肝臟合成的一些血漿蛋白顯著增力口，這些蛋白質通稱為急性時相蛋白，其中C-反應蛋白是急性時相蛋白中變化最顯著的一種。C-反應蛋白在正常人血清中只含有微量，一般在lmg/L以下，它的濃度保持長期穩定，半衰期長(約18-20小時)，且不受性別及食物的影響；在組織受到損傷、炎症、感染或腫瘤破壞時C-反應蛋白可以在數小時內急劇上升，可增高數倍或數百倍，2-3天達峰值，急性炎症時濃度可達1000mg/L，待病情改善時逐漸下降，恢復正常。C-反應蛋白被廣泛應用於臨床疾病的早期診斷及鑑別診斷，其升高可見於1、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如風溼性關節炎、全身性血管炎、多肌痛風溼病；2、術後感染及併發症的指標手術後病人C-反應蛋白升高，術後7-10天C-反應蛋白水平應下降，如C-反應蛋白不降低或再次升高，提示可能並發感染或血栓栓塞；3、可作為細菌性感染和病毒性感染的鑑別診斷大多數細菌性感染會引起患者血清C-反應蛋白升高，而病毒性感染則多數不升高。超敏C 反應蛋白(High sensitivity C-reactive protein,以下簡稱 hs_C_ 反應蛋白)與C-反應蛋白並不是兩種蛋白，只是從靈敏度上加以區分，超敏C反應蛋白(hs-C-反應蛋白)最低檢測限達0. lmg/1 ;原先認為C-反應蛋白是正常的血清卻發現同未來發生心血管疾病密切相關，大量研究資料表明，動脈粥樣化的血栓形成除了是脂肪堆積的過程外也是一個慢性炎症過程；hs C-反應蛋白輕度升高與冠狀動脈事件、中風及周圍血管病相關，是一項獨立的危險因素；hs-C-反應蛋白已被證實是由慢性炎症引發心血管疾病的獨立危險因素，檢測其濃度對心血管疾病的幹預及預後起重要作用而被臨床重視。流行病學調查也顯示，hs-C-反應蛋白水平升高者發生急性腦卒中的機率是正常健康人的2倍，發生心肌梗死的機率是正常者的3倍。2003年歐洲高血壓防治指南(ESH/ESC)正式推薦，高血壓患者需檢測hs-C-反應蛋白水平。C反應蛋白的常用檢測有免疫比濁法和酶聯免疫吸附法等。由於酶聯免疫吸附法檢測耗時且操作複雜，已經不能滿足大型醫院快速定量檢測的要求，而免疫比濁法隨著全自動生化儀的普及，已經發展出來多種快速免疫比濁檢測技術。1977年Sternberg創立了速率散射免疫比濁法，其基本原理是抗原抗體在緩衝液中快速形成抗原抗體複合物，當一定波長的光沿著水平軸照射時，碰到小顆粒的免疫複合物可導致光散射，散射強度與免疫複合物的含量成正比。但免疫比濁法由於檢測靈敏度仍然不能達到臨床要求，於是出現了乳膠增強免疫比濁法。乳膠增強免疫透射比濁法的基本原理是首先將抗體吸附在一種膠乳顆粒上，當遇到相應的抗原時，抗原抗體結合而出現乳膠凝集。單個乳膠顆粒的大小在入射波長之內，光線可透過，當兩個以上的乳膠顆粒凝集時，可阻礙光線透過，使得透射光減少，其減少程度與抗原的量成正比。此法提高了檢測的靈敏度和準確度，得到了廣泛的應用。目前國內用於全自動生化儀的乳膠增強免疫透射比濁法C-反應蛋白檢測試劑出現了兩種(普通C-反應蛋白檢測試劑盒和超敏C-反應蛋白檢測試劑盒)，普通C-反應蛋白檢測試劑 盒有較高的線性但靈敏度不好，超敏C-反應蛋白檢測試劑盒有較高的靈敏度但線性較低，這樣就出現了一種試劑兩種名稱，用途也有所區別。近幾年來，隨著檢驗技術的發展，市場上開始出現了一種全量程C-反應蛋白檢測試劑盒，但這種全量程C-反應蛋白檢測試劑盒的靈敏度依然不高，只能達到O. 5mg/L，達不到臨床對超敏C反應蛋白的檢測要求；而檢測上限也只有300mg/L，也滿足不了部分急性炎症病人高濃度C反應蛋白的診斷需求。而且乳膠增強免疫比濁法反應後會產生沉澱，不利於生化儀的清洗，而且乳膠製造成本較高，導致乳膠增強免疫比濁試劑盒價格偏高。

實用新型內容本實用新型所要解決的技術問題是提供一種高靈敏全量程C-反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，該試劑盒不僅線性範圍寬、靈敏度高，而且製造成本低廉，反應後不產生沉澱方便生化儀清洗。本實用新型解決上述技術問題所採用的技術方案是一種全量程C-反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，包括包裝盒，所述包裝盒的內部設有底座，所述底座上設有試劑瓶，所述試劑瓶包括試劑瓶一和試劑瓶二。所述試劑瓶一的容積是試劑瓶二的4倍。所述試劑瓶一包括瓶身一和設置在瓶身一上方的瓶蓋一；所述瓶身一和瓶蓋一通過螺紋連接。所述試劑瓶二包括瓶身二和設置在瓶身二上方的瓶蓋二，所述瓶身二和瓶蓋二通過螺紋連接。所述底座的上表面設有凹部一和凹部二 ；並且所述瓶身一和瓶身二的下端恰好分別容納在所述凹部一和凹部二中，上端突出在底座的外部。一種全量程C-反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，包括試劑Rl和試劑R2 ;所述試劑Rl的組分包括10 20mmol/L的緩衝液、O. 5% 2%w/v的促凝劑、O. 5% 2%w/v的BSA、0. 07% O. l%w/v的防腐劑；所述試劑R2的組分包括0. 1% O. 5%w/v標記有抗人C-反應蛋白抗體的膠體金顆粒、O. 2% 2%w/v的穩定劑、10 20mmol/L的緩衝液、O. 07%
O.l%w/v的防腐劑；所述膠體金顆粒直徑為35nm 60nm。由於抗體的活性容易受到蛋白酶的分解、高溫變性、滲透壓等影響，所以必須加入穩定劑來穩定抗體的結構和活性。所述穩定劑為蛋白質、PEG、糖和無機鹽中的一種或多種；所述蛋白質為BSA或明膠；所述糖為蔗糖、海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一種或多種；所述無機鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣中的一種或多種。所述的緩衝液為磷酸鹽緩衝液、硼酸鹽緩衝液、甘氨酸緩衝液、檸檬酸-磷酸鹽緩衝液、tris緩衝液和HEPES緩衝液中的一種或多種；所述緩衝液pH值為6 8. 5。所述緩衝液可以為其他具有相似特徵的緩衝液。所述促凝劑為PEG20000。促凝劑主要作用是可以增加抗原抗體反應速率。本實用新型所述的促凝劑優選O. 05% 2%w/v的PEG20000。 為了防止試劑受到微生物汙染，本實用新型試劑Rl和試劑R2中還加入了防腐劑，本實用新型所述的防腐劑為疊氮化鈉、硫柳汞、苯酚中的一種或多種。優選的，本實用新型防腐劑為O. 07% O. l%w/v的疊氮化鈉。所述抗人C-反應蛋白抗體為多克隆抗體或多克隆抗體與單克隆抗體的混合物。所述試劑R2的製備方法為製備膠體金溶液，將用緩衝液稀釋後的抗人C-反應蛋白抗體溶液加入到所述膠體金溶液中，製備得到含有膠體金-抗人CRP抗體複合物的溶液，離心去掉上清液,用溶液A溶解膠體金-抗人CRP抗體複合物，恢復至所述含有膠體金-抗人CRP抗體複合物的溶液體積的1/50 1/10，製得試劑R2 ;所述溶液A的組分包括緩衝液、穩定劑、和防腐劑。本實用新型所述的一種全量程C-反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，用於測定人血清或血漿中的C-反應蛋白含量。本實用新型試劑盒的測定原理本實用新型利用抗原抗體專一性特異性反應原理和金顆粒聚集導致顏色改變的原理，將抗人C-反應蛋白抗體標記上膠體金顆粒，待測樣品中的人C-反應蛋白與多個抗體發生反應，產生抗原抗體複合物，使得膠體金顆粒聚集成大顆粒，從而導致溶液顏色發生明顯改變，光吸收發生改變，光吸收的變化量與抗原抗體複合物的量成正比，從而與C-反應蛋白抗原量成正比。配套全自動生化儀則可實現自動定量檢測。綜上所述，本實用新型與現有技術相比，具有如下優點(I)、本實用新型試劑盒具有靈敏度高，特異性強，穩定性好的特點，可用於檢測血清或血漿中C-反應蛋白含量，適用於臨床全自動生化分析儀。本實用新型試劑盒檢測C-反應蛋白的靈敏度可以達到O. Olmg/L,檢測上限達到500mg/L。(2)、本實用新型試劑盒反應後不產生沉澱，便於生化儀的清洗，延長了生化儀的使用壽命。(3)、本實用新型的試劑盒採用膠體金標記抗體，降低了 C-反應蛋白免疫比濁檢測試劑盒的製造成本，具有較大的市場競爭力。(4)、本實用新型的試劑盒的包裝盒的內部設有底座，結構穩定。

[0028]圖I是本實用新型試劑盒的結構示意圖。圖中，附圖標記所對應的部件是1_包裝盒，2-底座，3-試劑瓶一，31-瓶身一，32-瓶蓋一，4-試劑瓶二，41-瓶身二，42-瓶蓋二，5-凹部一，6-凹部二。
具體實施方式
下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本實用新型，但不以任何方式限制本實用新型。實施例一一種全量程C-反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒的結構包括包裝盒1，所述包裝盒的內部設有底座2，所述底座上設有試劑瓶，所述試劑瓶包括試劑瓶一 3和試劑瓶二 4。所述試劑瓶一 3的容積是試劑瓶二 4的4倍。所述試劑瓶一 3包括瓶身一 31和設置在瓶身一上方的瓶蓋一 32 ；所述瓶身一和瓶蓋一通過螺紋連接。所述試劑瓶二 4包括瓶身二 41和設置在瓶身二上方的瓶蓋二 42，所述瓶身二和瓶蓋二通過螺紋連接。所述底座的上表面設有凹部一 5和凹部二 6 ;並且所述瓶身一和瓶身二的下端恰好分別容納在所述凹部一和凹部二中，上端突出在底座的外部。試劑盒內容納試劑製備I :(I)試劑Rl的製備按如下步驟向20mmol/L Tris緩衝液(ρΗ7· 5)中加入終濃度為O. 5% (w/v)的BSA，加入終濃度為2% (w/v)的PEG20000，加入終濃度為O. 09% (w/v)的NaN3。由此製得試劑Rl。(2)膠體金的製備按如下步驟a)玻璃容器的清潔用自來水流水衝洗乾淨,然後用1% 2%鹽酸浸泡過夜,取出用大量自來水衝洗，然後用洗潔劑洗滌並用流水衝洗乾淨，再用蒸餾水浸泡過夜，然後進行膠體金潤洗。b)準備1%氯金酸和1%檸檬酸鈉溶液，O. 2um濾膜過濾。c)取IOOOml圓底燒瓶I個，放入轉子，加入500ml超純水。d)加入5ml I %氯金酸,600rpm,熱約至溶液沸騰,立即吸取1%朽1檬酸鈉溶液5ml快速加入到燒瓶中。繼續加熱攪拌約lOmin，溶液先變黑色，然後逐漸變紫紅色。e)冷卻關閉加熱開關並繼續攪拌lOmin，然後停止攪拌冷卻至室溫，用超純水恢復到原體積。f)電鏡掃描製得的膠體金顆粒直徑為40nm，製得的膠體金備用。(3)試劑R2的製備按如下步驟a)將抗人C-反應蛋白抗體用磷酸鹽緩衝液(pH7. 2)稀釋成O. lmg/ml ；b)用K2CO3調節膠體金溶液的pH到8. O ；c)將抗體溶液加入到膠體金中，並攪拌反應30分鐘，其中抗體溶液與膠體金溶液的體積比為I 10 ；d)將終濃度為2% (w/v)的BSA加入到上述膠體金溶液中，並攪拌反應30分鐘；e) IOOOOrpm離心30分鐘，然後用溶液A復溶至原體積的1/10，製得試劑R2 ;製備得到的試劑R2標記有抗人C-反應蛋白抗體的膠體金顆粒的濃度為O. l%w/v。所述溶液A 的成分包括20mmol/L Tris 緩衝液 ρΗ8· O、O. 2% (w/v)的穩定劑、O. 1% (w/v)的 NaN3。所述O. 2% (w/v)的穩定劑是指IOOml溶液A中穩定劑的質量為O. 2g。所述穩定劑的組成成分包括O. 7%NaCl、2%BSA和O. 5%蔗糖。所述O. 7%NaCl是指NaCl的質量佔穩定劑總質量的 O. 7%。實施例二試劑盒製備2 (I)試劑Rl的製備向10mmol/L檸檬酸鹽緩衝液(pH6. 5)中加入終濃度為2% (w/v)的BSA，加入終濃度為O. 5% (w/v)的PEG20000，加入終濃度為O. 09% (w/v)的NaN3。由此製得Rl試劑。(2)膠體金的製備a)玻璃容器的清潔用自來水流水衝洗乾淨,然後用1% 2%鹽酸浸泡過夜,取出·膠體金潤洗。b)準備1%氯金酸和1%檸檬酸鈉溶液，O. 2um濾膜過濾。c)取IOOOml圓底燒瓶I個，放入轉子，加入500ml超純水。d)加入5ml I %氯金酸,600rpm,熱約至溶液沸騰,立即吸取1%朽1檬酸鈉溶液4ml快速加入到燒瓶中。繼續加熱攪拌約lOmin，溶液先變黑色，然後逐漸變紫紅色。e)冷卻關閉加熱開關並繼續攪拌lOmin，然後停止攪拌冷卻至室溫，用超純水恢復到原體積。f)電鏡掃描製得的膠體金顆粒直徑為50nm，製得的膠體金備用。(3)試劑R2的製備a)將抗人C-反應蛋白抗體用磷酸鹽緩衝液(ρΗ7· 2)稀釋成O. lmg/ml ；b)用K2C03調節膠體金溶液的pH到8. Oc)將抗體溶液加入到膠體金中，並攪拌反應30分鐘，其中抗體溶液與膠體金溶液的體積比為I 10 ；d)將終濃度為O. 1% (w/v)的PEG20000加入到上述膠體金溶液中，並攪拌反應30分鐘；e) IOOOOrpm離心30分鐘，然後用溶液A復溶至原體積的1/25，製得試劑R2。試劑R2標記有抗人C-反應蛋白抗體的膠體金顆粒的濃度為O. 25%w/v。所述溶液A包括lOmmol/LTris緩衝液pH8. O>2% (w/v)的穩定劑、0. 07% (w/v)的硫柳萊。所述穩定劑包括
0.9%NaCl、0. 1%PEG20000 和 1% 海藻糖。實施例三試劑盒製備3(I)試劑Rl的製備向10mmol/L磷酸鹽緩衝液(ρΗ6· 5)中加入終濃度為1% (w/v)的BSA，加入終濃度為1% (w/v)的PEG20000，加入終濃度為0. 09% (w/v)的NaN3。由此製得Rl試劑。(2)膠體金的製備a)玻璃容器的清潔用自來水流水衝洗乾淨,然後用1% 2%鹽酸浸泡過夜,取出用大量自來水衝洗，然後用洗潔劑洗滌並用流水衝洗乾淨，再用蒸餾水浸泡過夜，然後進行膠體金潤洗。[0071]b)準備1%氯金酸和1%檸檬酸鈉溶液，O. 2um濾膜過濾。c)取IOOOml圓底燒瓶I個，放入轉子，加入500ml超純水。d)加入5ml 1%氯金酸，600rpm,熱約至溶液沸騰，立即吸取1%檸檬酸鈉溶液3ml快速加入到燒瓶中。繼續加熱攪拌約lOmin，溶液先變黑色，然後逐漸變紫紅色。e)冷卻關閉加熱開關並繼續攪拌lOmin，然後停止攪拌冷卻至室溫，用超純水恢復到原體積。f )電鏡掃描製得的膠體金顆粒直徑為60nm，製得的膠體金備用。(3)試劑R2的製備a)將抗人C-反應蛋白抗體用磷酸鹽緩衝液(pH7. 2)稀釋成O. lmg/ml ；b)用K2C03調節膠體金溶液的pH到8. O·c)將抗體溶液加入到膠體金中，並攪拌反應30分鐘，其中抗體溶液與膠體金溶液的體積比為I 10 ；d)終濃度為1% (w/v) BSA和終濃度為O. 05%的PEG20000加入到上述膠體金溶液中，並攪拌反應30分鐘；e)IOOOOrpm離心30分鐘，然後用溶液A復溶至原體積的1/20，製得試劑R2 ;試劑R2標記有抗人C-反應蛋白抗體的膠體金顆粒的濃度為O. 2%w/vo所述溶液A包括15mmol/LTris緩衝液pH8. 0、1% (w/v)的穩定劑、1% (w/v)的苯酚。所述穩定劑包括0. 9%NaCl、1%BSA、0. 05%PEG20000 和 O. 2% 明膠。實施例四全量程C-反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒的臨床使用( I)本實用新型試劑盒的一些測試條件及參數如下a)分析方法2點終點法；波長660nm ;樣品量3ul ；R1 200ul ；R2 50ul ;校準方式樣條函數Spline ;反應方式上升；測定溫度37°C。b)測定步驟先加入試劑R1200ul，然後加入樣本3ul，孵育37°C 5分鐘後，加入50ul試劑R2，立即讀取第一點，反應5分鐘後讀取另一點，得到吸光度值的差值。c)計算方法6點定標，以樣條函數為計算模式。根據吸光度與參考血清的值做劑量/響應曲線，樣品含量可根據其吸光度值在劑量/響應曲線上算出。(2)檢測標準曲線通過本實用新型的方法，採用日立7020型自動分析儀得到了 6種不同含量的C-反應蛋白參考血清的標準曲線見圖I。每個點代表I種含量的參考血清。其中X軸表示C-反應蛋白的含量，Y軸表示吸光度值。實施例五檢測試劑盒性能試驗( I)靈敏度試驗測定5種不同C-反應蛋白含量的樣品，每個樣品重複測定10次，計算均值和標準差，結果見表1，從表I可知，本實用新型試劑盒的靈敏度為O. Olmg/L。表I
權利要求1.一種全量程C反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，其特徵在於包括包裝盒(1)，所述包裝盒的內部設有底座(2)，所述底座上設有試劑瓶，所述試劑瓶包括試劑瓶一(3)和試劑瓶二⑷。
2.根據權利要求I所述的一種全量程C反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，其特徵在於所述試劑瓶一(3)的容積是試劑瓶二(4)的4倍。
3.根據權利要求I所述的一種全量程C反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，其特徵在於所述試劑瓶一(3)包括瓶身一(31)和設置在瓶身一上方的瓶蓋一(32);所述瓶身一和瓶蓋一通過螺紋連接。
4.根據權利要求3所述的一種全量程C反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，其特徵在於所述試劑瓶二(4)包括瓶身二(41)和設置在瓶身二上方的瓶蓋二(42)，所述瓶身二和瓶蓋二通過螺紋連接。
5.根據權利要求4所述的一種全量程C反應蛋白膠體金免疫比濁檢測試劑盒，其特徵在於所述底座的上表面設有凹部一(5)和凹部二(6);並且所述瓶身一和瓶身二的下端恰好分別容納在所述凹部一和凹部二中，上端突出在底座的外部。
專利摘要本實用新型提供了一種全量程CRP膠體金免疫比濁檢測試劑盒，包括包裝盒，所述包裝盒的內部設有底座，所述底座上設有試劑瓶，所述試劑瓶包括試劑瓶一和試劑瓶二。本試劑盒通過膠體金來增強濁度，達到定量檢測的目的。本實用新型方法解決了乳膠增強免疫比濁法反應後產生沉澱不利於生化儀清洗的問題。
文檔編號G01N33/68GK202720236SQ20122027891
公開日2013年2月6日 申請日期2012年6月11日 優先權日2012年6月11日
發明者徐彩霞, 葉佳穎, 劉獻文, 孫火明 申請人:寧波鼎鑫生物科技有限公司