礦物與骨骼代謝的調節的製作方法

2023-09-18 23:13:35 2

專利名稱：礦物與骨骼代謝的調節的製作方法
礦物與骨骼代謝的調節交叉引用本申請要求2005年8月30日提交的美國臨時申請第60/713，154號；2005年9 月13日提交的第60/717,115號;和2006年7月19日提交的第60/807,797號的優先 權，這些申請的內容以參見方式引入本說明書中。發明領域本發明涉及一種治療方法，該方法包括調節受到甲狀旁腺素(PTH)激素作 用影響的代謝和生物學功能，包括但不限於骨骼組織的形成、破壞和轉換。更 具體地說，本發明涉及控制甲狀旁腺素(PTH)的代謝的方法。發明背景PTH是一種由甲狀旁腺產生並全身循環的內分泌激素，在哺乳動物中起到關鍵性作用。與一些其它激素如骨化三醇(維生素D3的活性形式)、降鈣素和PTHrp協同作用，己知PTH能夠調節鈣(Ca)和磷酸鹽(P04)的全身及局部代謝。Ca和P04在各種細胞的生物學和生理學功能所必需的許多基礎過程以及如 骨、軟骨和牙齒等骨骼組織的礦化過程中起重要作用。具體地說，骨骼礦化依 賴於Ca和P04的體內調節，並且Ca-P04體內動態平衡中的任何失調都將對一些 重要組織，包括腎、脈管系統以及硬組織的完整性造成嚴重影響。在腎中，Ca和P04被動擴散進入腎小球濾液中流失，並在遠端和近端小管 主動重吸收，以維持其在如血液等體液中的生理學水平。在腸中，從食物吸收 Ca和P04，並且已知這種吸收的調節有助於Ca和P04的全身動態平衡。還知道骨 骼組織，尤其是骨，是在Ca和P04體內動態平衡中起重要作用的器官之一。骨 骼組織儲存或釋放Ca和P04，以維持其足夠的循環水平。在一些與Ca和P04代謝有關的激素中，己知PTH是最具影響力的激素，不 僅影響Ca和P04的體內動態平衡，還影響骨質轉換。PTH提高了在腎小管中對 Ca的主動重吸收，從而增加循環Ca。並且，PTH能夠抑制在腎小管中對P04的主動重吸收，從而減少循環P04。 PTH提高了骨骼組織的轉換，並根據微環境提 高和降低骨量。通常，骨連續暴露於PTH可導致較高的骨重吸收，使更多的Ca 從骨組織進入循環。PTH由甲狀旁腺產生並分泌進入循環。甲狀旁腺對血清中的Ca和P04水平 敏感，以調節其PTH的分泌。例如，低血清Ca水平或高血清P04水平可提高PTH 分泌，而高血清Ca水平或低血清P04水平可降低其分泌。已克隆了Ca敏感性分 子(Ca傳感器或Ca受體)，併合成了其激動劑和拮抗劑以治療性調節甲狀旁腺的 PTH分泌水平。降鈣素由甲狀腺產生並抑制破骨細胞功能，從而減少骨重吸收。這樣，更 多的Ca被保留在骨中而不是進入循環。骨化三醇在腸中刺激從食物中吸收Ca，以提高其循環水平。骨化三醇也可 影響骨質轉換並減少PTH分泌。除了這些已知多年的激素之外， 一些新鑑別的分子被稱為"磷調素 (phosphatonin)",能選擇性地調節P04血清水平，這些分子如基質細胞外磷酸 糖蛋白(MEPE; Genomics 67 54 2000， Bone 34 303 19 2004)，成纖維細胞生長因 子-23 (FGF-23; JCEM 86 49500 2001)，和巻曲相關蛋白-4 (FRP-4; Current Opinion in Nephrology and Hypertension 11 4243 0 2002)等。認為這些"磷調素" 分子通過抑制鈉(Na+)依賴性磷酸鹽協同轉運蛋白(NaPi或NPT; Hilfiker， PNAS 95(24) (1998)， M564-14569)來減少腎小管中P04的主動重吸收。認為鈉(Na+)依賴性磷酸鹽協同轉運蛋白是主要負責腎小管和腸中P04主動轉運的分子。通過觀察患有罕見疾病患者的臨床徵兆來識別這些具有磷調素活性的分 子，所述疾病包括X-連鎖的低磷血症性佝僂病(XLH)、常染色體顯性徇僂病 (ADR)和腫瘤誘導的骨軟化症(TIO)[或者稱為致癌性低磷血症性骨軟化症 (OHO)]。這些疾病具有非常類似的症狀，例如低磷血症(異常低的血清P04水平)、 磷酸鹽尿(P04過度滲入尿液)、循環中極低的骨化三醇水平以及骨軟化症，雖然 Ca和PTH的血清水平在正常範圍內。因此，公布的MEPE、 FGF-23和FRP-4的生物學數據還進一步提示，其生 物學活性對P04和骨化三醇是選擇性的(Bone 34 303-319 2004; Am J Physiol Renal Physiol. 2005 Feb; 288(2):F363-70; J Clin Invest. 2003 Sep; 112(5):785-94)。Ca和P04體內動態平衡紊亂和礦物質代謝激素如PTH和骨化三醇的不平衡 是慢性腎病中觀察到的典型症狀。普遍認為它們是一些嚴重的繼發性併發症如脈管鈣化的致病因素，通常導致心臟衰竭、腦血管疾病、甚至疾病進程加速、以 及腎性骨營養不良症(與慢性腎病有關的嚴重骨質流失)。慢性腎病通常需要幾年最終發展成末期腎病(ESRD)，末期腎病患者需要通 過透析或腎臟移植來維持生命。在疾病惡化過程中，Ca、 P04和PTH的不平衡 逐漸加劇。為了減少腎臟濾過功能，P04的血清水平在開始時升高。為防止這 種P04升高，則分泌更多的PTH,因為PTH具有抑制腎小管對P04重吸收的活性。 這通常稱為繼發性甲狀旁腺功能亢進症。 一旦PTH水平升高不足以防止血清P04 升高，則血清P04水平開始顯著升高(高磷血症)。伴隨該過程，較高的PTH增加 了Ca的腎臟重吸收和骨重吸收，推高了血清Ca水平。所有這些事件的結果是， 慢性腎病患者通常表現為高磷血症、高血清鈣-磷(Ca.P)產物、甲狀旁腺功能亢 進和腎性骨營養不良症。因此，使Ca、 P04和PTH的血清水平正常化，並治療受損骨骼代謝(g卩，腎 性骨營養不良症)是這些患者的臨床需要。為了解決慢性腎病患者中複雜的Ca、 PCU和PTH失衡，開發和使用了一些 治療性化合物。開發了 "磷酸鹽結合劑"如碳酸鈣、醋酸鈣(PhosLo)、司維拉 姆氯化物(Renagel⑧)和碳酸鑭(Fosrenol)來控制高磷血症。但是，這些藥物僅僅在P04被吸收進入血液之前，在腸道中與食物中的P04相結合。雖然它們具有一定程度的療效，但順應性低，因為每餐需要服用大量藥丸並至少持續幾周。即 使患者順應性好，血清磷酸鹽水平的降低通常也不多。開發或正在開發一些控制PTH的療法。鈣受體激動劑如Cinacalcet結合甲狀 旁腺上鈣受體並減少PTH的產生和分泌。但是，鈣激動劑不能有效減少血清磷 酸鹽。慢性腎病患者中通常採用維生素D3及其衍生物來解決上述問題。但是，它 們有時會刺激腸中Ca吸收，並且其過度使用有時會導致動力性骨病，該病的骨 質轉換幾乎完全停止且骨不能重建。因此，對於包括慢性腎病患者在內廣大患者來說，非常希望有一種能夠解 決磷酸鹽和鈣水平問題、同時降低PTH水平的獨特療法。附圖簡要說明圖l顯示了大鼠單次注射後，由大腸桿菌(E.coli)或CHO細胞製備的重組人 MEPE (rbMEPE)在不同時間點的血漿濃度圖2顯示了採用不同給藥方案在小鼠腹膜內(intraperiotoneously)注射 rhMEPE後，在不同時間點小鼠中用肌酸酐標準化的磷酸鹽血漿水平。圖3顯示了採用不同給藥方案在小鼠腹膜內注射rhMEPE後，在不同時間點 小鼠中甲狀旁腺素(PTH)的血漿水平。圖4顯示了大鼠單次注射聚乙二醇化的rhMEPE (PEG-MEPE)後， 一直到約8 小時的各個時間點處MEPE的血漿濃度。圖5顯示了小鼠單次注射小時後24小時的時間點，PEG-MEPE的血漿濃度。圖6顯示了小鼠單次注射PEG-MEPE後24小對的時間點，完整甲狀旁腺素 (iPTH)的血漿濃度。圖7顯示了小鼠單次注射PEG-MEPE後72小時的時間點，MEPE的血漿濃度。圖8顯示了小鼠單次注射PEG-MEPE後72小時的時間點，小鼠中iPTH的血 漿濃度。圖9顯示了採用不同給藥方案在小鼠腹膜內注射rhMEPE時，在不同時間點 小鼠中用肌酸酐標準化的鈣的血漿水平。發明內容在描述本發明方法之前，應理解本發明並不限於所述具體方法，因為這些 方法可以變化。還應理解，本文所用術語僅僅是為了描述具體實施方式
，而不 應解釋為限制性的，本發明的範圍僅由所附權利要求書所限定。當提供數值範圍時，應理解除非另有說明，也具體包括該範圍上下限之間 的所有中間值，到下限單位的十分之一。所述範圍內的任何所述值或中間值與 所述範圍內的任何其它所述或中間值的每個較小範圍都包括在本發明內。這些 較小範圍的上限和下限可獨立地包括在該範圍內或排除在外，上下限之一、兩 者都不、或兩者都包括在所述較小範屈內的各個範圍同樣包括在本發明的範圍 內，除非所述範圍具體排除了該值。如果所述範圍包括上下限之一或兩者都包 括，排除所述上下限之一或兩者都排除的範圍也包括在本發明內。除非另有說明，本文所用的所有科技術語具有本發明所屬領域普通技術人 員通常所理解的相同涵義。雖然類似於或等價於本文所述的任何方法也可用於 本發明的實施或測試，現在將描述一些有潛力和優選的方法和材料。本文提及 的所有出版物以參見方式引入本文中，用以說明和描述與引用的出版物有關的方法和/或材料。應理解，如果存在衝突，以本發明的內容代替所含出版物的任 何說明內容。必須注意，如本說明書及所附權利要求書所用，單數形式"一"、"一個"和"這 個"包括複數形式，除非另有清楚說明。因此，例如，"一個肽"包括"多個這 種肽"，"一種體液"包括一種或多種體液及本領域技術人員已知的其等價物，等等。本文所述出版物僅指在本發明遞交日之前公開的內容。本說明書所述任何 內容都不應解釋為承認本發明並沒有將日期寫成早於事實上先於本發明的出 版物。而且，出版物提供的日期可能與實際出版日不同，可能需要分別證實。定義本文所用術語"治療"、"治癒"等通常是指獲得所需的藥理學和/或生理 學效果。該效果可以是預防性的，完全或部分地預防疾病或其症狀；和/或治療 性地完全或部分治癒疾病和/或與疾病有關的不良反應。本文所用術語"治療" 覆蓋了哺乳動物(尤其是人)疾病的任何治療，包括(a)預防傾向於發病但尚未 診斷為患病的對象發生疾病；(b)抑制疾病，即阻止其發展；或(c)緩解疾病，使 疾病復原。本發明旨在治療患有與磷酸鹽代謝紊亂有關的醫學病症的患者。因 此，本發明的治療包括預防、抑制或緩解與鈣、磷酸鹽、或PTH紊亂有關的任 何醫學病症。本發明治療方法包括治療罕見疾病，例如X-連鎖的低磷血症性佝僂病 (XLH)、常染色體顯性佝僂病(ADR)和腫瘤誘導的骨軟化症(TIO)(也稱為致癌 性低磷血症性骨軟化症(OHO))。本發明方法包括治療伴有極低血清P04水平的 各種形式的低磷血症和治療與P04過度滲入尿液有關的磷酸鹽尿。方法包括治 療循環中極低的鈣三醇水平和治療骨軟化症，雖然Ca和PTH的血清水平在正常 範圍內。本發明治療包括以任何方式監測、測量和/或測定Ca、 P04和PTH中任一種 或其各自的水平，然後給予本發明的製劑；可還包括進一步監測、測量和/或測 定Ca、 P04和PTH中任一種或其各自的水平，然後再次給予相同劑量的製劑和/ 或基於再次測量水平調整劑量以確定第一次給藥對Ca、 P04和PTH中任一種或其各自的水平的影響，從而調節給藥方案。本文所述測量和給藥的步驟可按需 要重複進行，持續幾天、幾周、幾個月或幾年。測定可以是對血液、尿液、或任何其它體液或組織的測量。"治療有效量"是指能夠在一定程度上緩解患者疾病或病症的一種或多種 症狀的量；或者使與疾病或病症有關或引起的一種或多種生理學或生物化學參 數部分地或完全恢復到正常的量。因此，治療有效量可以是能夠有效地預防性 降低疾病或病症發生可能的量。治療有效量可以是在給藥前測量和給藥後測量 之後，對Ca、 P04和/或PTH水平具有治療意義效果的量。發明的一般描述本發明涉及一種控制甲狀旁腺素(PTH)的方法，該方法完全不同於目前所 理解的生理學機制。在本發明一個具體的實施方式中，提供了控制PTH循環水 平的新方法。根據本發明的一個實施方式，製劑包含載體和選自SEQIDNO:2、 3、 5、 6、 8-13的肽及其任意生物學上可操作的包含至少51個胺基酸的片段。在 另一個實施方式中，測試患者體液(例如血清和/或尿液)來確定Ca、 P04和PTH 中任一種或全部的水平。給予製劑，合適的時間段之後，再次測定患者體液中 Ca、 P04和PTH任一種或全部的水平。測定首次治療後所得水平之後可能需要 調整劑量。然後重複給予製劑繼續進行治療，然後測定各水平、按需要調整劑 量並再次給予製劑。可以根據需要，由護理人員確定給藥、測定、調整劑量和 再次給藥的頻率。圍繞Ca、 P04和PTH體內動態平銜的現有理論Ca和P04是維持人體健康功能極重要的礦物質。哺乳動物中，血液中Ca的 水平嚴格維持在8.5 11 mg/dL的範圍內，成年動物中血液中磷(P)的水平維持在 2.7~4.5 mg/dL的範圍內。如果人進行正常飲食，尿液中鈣的預期含量為100-300毫克/天，尿液中磷 酸鹽的正常水平為900-1300毫克/天。當血液中這些礦物質的濃度超出正常範圍 時將導致一些健康問題。例如，高鈣血症(Ca水平過高)通常引起神經元興奮過 度，有時導致癲癇，而在高鈣血症的極端病例中將導致昏迷或死亡。已知磷酸鹽 濃度過高可導致成骨細胞(骨形成細胞)凋亡而破壞骨骼重建。也知道高磷血症(磷 酸鹽濃度過高)通常通過沉積過量磷酸鹽和鈣形成的不溶性鹽而導致血管鈣化， 引起各種心血管和腦血管疾病，例如動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、中風等。 低磷血症(異常低的磷酸鹽水平)通常破壞了骨骼重建，在正常仍在生長期的較年輕的患者中導致生長遲緩。根據幾十年來已被接受的內分泌學的現有理論，內源性激素如PTH、骨化三醇和降鈣素在調節Ca和P04的體內動態平衡中起著關鍵作用。其中，認為PTH 在調節體內動態平衡中起到首要作用。PTH的首要功能是維持哺乳動物的Ca體內動態平衡。PTH能夠在鈣被動濾 過腎小球之後，在腎小管刺激Ca從尿液主動重吸收到血清中。PTH結合腎小管 細胞上表達的受體，上調包括蛋白激酶A(PKA)等蛋白激酶，從而上調細胞中 的cAMP，並增加Ca重吸收。PTH試驗的參考範圍可根據實驗室而有些不同， 必須與結合鈣檢測結果進行解釋。下面是一些典型的範圍完整PTH: 165 pg/mL， PTHN-末端(包括完整PTH): 24pg/mL， PTH C-末端(包括C-末端，完 整PTH，和中間分子)50-330 pg/mL。PTH還可通過受體作用於成骨細胞及PKA和其它激酶介導的信號傳導級聯 反應。在骨骼細胞持續暴露於循環PTH的生理學條件下，PTH刺激的成骨細胞 又剌激破骨細胞，加速骨重吸收。總之，當骨骼組織釋放更多的鈣進入循環時， PTH加速了整個骨質轉換。結合腎小管和骨骼組織中的這些激素功能，PTH增加了血中Ca的濃度。甲狀旁腺具有調節PTH生成水平的機制。甲狀旁腺表達能夠檢測鈣循環水 平的感應分子，稱為鈣受體或鈣傳感器。如果檢測到鈣水平高，甲狀旁腺下調 其PTH生成。如果檢測到鈣水平低，則提高PTH生成。這樣，甲狀旁腺根據循 環鈣水平調節PTH的產生和分泌，並維持鈣的體內動態平衡。PTH還對P04體內動態平衡起作用。己知PTH能抑制腎臟近端小管處P04重 吸收。PTH結合腎小管細胞上的受體，活化PKA介導的級聯反應，降低腎小管 細胞上鈉-依賴性磷酸鹽協同轉運蛋白(NaPi)的數量和/或活性，從而抑制P04重 吸收。艮P， PTH降低血清中的P04濃度。雖然詳細機制尚未了解，似乎甲狀旁腺能夠檢測循環P04水平，從而調節 其PTH產生。當循環P04水平維持高水平時，甲狀旁腺產生更多的PTH以降低血清P04水平。 —總之，PTH與如Ca和P04等礦物質之間存在相互調節機制。因此，改變這 些分子生理學水平的方法必須將這些相互聯繫的機制考慮在內。調節PTH的現有方法迄今為止開發了一些調節Ca和P04代謝的方法。根據一種方法，開發了一種能夠修飾甲狀旁腺上鈣受體的合成分子，用作 激動劑或拮抗劑。激動劑向甲狀旁腺發送相當於循環鈣水平較高的信號，從而減少PTH產生。拮抗劑則發送相反信號以增加PTH產生。激動劑可用於治療導致PTH分泌過度的疾病。鈣激動劑Censapar已批准作 為治療慢性腎病中的繼發性甲狀旁腺功能亢進的治療劑。正在開發拮抗劑來治 療骨質流失，因為已知用PTH脈衝樣剌激骨組織能促進骨形成，而脈衝樣給予 短半衰期的鈣拮抗劑可能導致甲狀旁腺脈衝樣產生PTH。另一種方法包括採用PTH選擇性抗體。因而，抗體選擇性地中和循環PTH 以治療甲狀旁腺功能亢進疾病。許多病例中，PTH調節的最終好處是調節鈣代謝和/或骨質轉換。然而，因 為PTH也會影響P04代謝，PTH本身也分別受到Ca和P04的調節，所以現有的調 節PTH的方法限於目前所理解機制。Ca和PO4代謝的傳統理解如上所述，PTH在腎小管中增加了Ca的重吸收並減少P04的重吸收，從而 提高Ca血清水平和降低P04血清水平。PTH還能從骨組織攝取鈣，以增加血清 Ca水平。當PTH水平極低時，血清Ca水平顯著降低，並且由於PTH抑制作用降 低而使P04從尿液進入血清的重吸收增加。因此，通常認為Ca和P04總是以相反 方向運動。具體地說，基本上不可能同時降低Ca和P04的血清水平。並且，基 於目前對內分泌學的理解，同時控制所有三種物質(Ca、 P04和PTH)也被認為是 不可能的。磷調素一一種磷酸鹽調節激素八十年代以來存在這樣的假設存在一種或多種主要調節P04代謝的內源 性分子。這種假想分子稱為"磷調素"， 一些研究組曾試圖分離這些分子。過去幾年鑑定了幾種新的分子，發現其能夠調節血清P04水平。這些分子 可以被稱為"磷調素"(參見美國專利第6,818，745號)，包括MEPE、 FGF-23和 FRP-4。所有這些分子似乎能夠降低P04血清水平而不影響Ca或PTH的血清水 平。所有這三種分子從一些罕見疾病鑑別或與其相關，這些疾病的典型特徵是極低的血清P04水平，極低的維生素D3水平和骨軟化症，但血清中Ca和PTH處 於正常水平。在與"磷調素"的這些候選分子有關的疾病中的臨床觀察結果也 強烈地提示，它們是P04的主要和選擇性調節因子，但不影響Ca或PTH。與Ca、 P04和PTH調節方面的傳統理解相比，"磷調素"的發現似乎是一 種進步，因為它提供了控制P04但不增加Ca的方法。然而，尚未實現同時控制Ca和P04或控制所有三種物質Ca、 P04和PTH(參 見美國專利第6,673，900號)。控制PTH本發明的一個實施方式公開和描述了控制PTH血清水平的方法。該方法的 特徵在於，在短時間內(例如24小時)一次或多次給予對象包含MEPE分子的制 劑，同時測定體液中的PTH。給藥方法或途徑可以是靜脈內、皮下、腹膜內、 或其它方式的注射、吸入、噴霧、鼻腔噴霧、或其它氣霧劑形式、或任何其它 口服製劑、外用製劑、栓劑、及其它給藥途徑，並且可以在給藥之前、兩次給 藥之間、或給藥之後進行測定。接受治療的患者可以是任何哺乳動物，MEPE分子可以是選自(SEQIDNo. 1、 2、 4、 5、 7、 8、 10或12)的多個序列中的單個序列，或具有生物學活性且在 磷調素活性方面基本上等價於活性全長分子胺基酸序列的包含至少51個連續 胺基酸的功能片段之一。這些分子中的任一種可以聚乙二醇化、糖基化和/或磷 酸化。注射時間和頻率可以是任意數字，包括但不限於0-168小時內一次、兩次 或多次。可以在每次或任一次給藥之前、給藥期間或給藥之後，測定Ca、 P04 或PTH中任一種或全部三種物質的水平。給予MEPE分子比168小時更長的持續 時間，以使PTH血清水平保持較長時間，也包括在本發吸的範圍內。給予的 MEPE可以是緩釋製劑，以減少給藥頻率和測量頻率。公開了控制甲狀旁腺素(PTH)水平、磷酸鹽水平(P04)和鈣水平(Ca)中任一 種或所有三種物質水平的方法。該方法包括測定患者的PTH、 P04和Ca中任一 種或所有三種物質的水平，然後給予患者治療有效量的具有磷調素活性的氨基 酸序列。序列可以是SEQIDNO:2、 3、 5、 6或8-13,可包括51個或更多個氨基 酸。在任意時間段內測量和給藥步驟可重複任意次數，以實現對患者的有效治 療。本發明的另一方面是製造用於與本文所述方法(包括上述具體方法)聯用的製劑。該製劑可包含具有本文所述磷調素活性的肽與載體的組合，所述載體可 以是注射用載體或本文所述其它類型的載體，包括可吸收的膠原海綿。載體的 具體類型可根據在患者上進行的特定治療來選擇。公開了實現特定方法所用的 製劑。並且公開了實現特定治療方法所用製劑的製造方法。實施例1和


圖1顯示了遺傳工程化大腸桿菌或中國倉鼠卵巢(CH0)細胞製備的重組人MEPE(rhMEPE)的藥代動力學。如圖所示，大腸桿菌和CHO-製備的 rhMEPE都顯示循環中相對短的保留時間。實施例2和圖2顯示了rhMEPE對P04血清水平的作用。如本領域過去己經說 明的(美國專利第6,673,900號，Bone 32 (2) 303-319， 2004)，齧齒動物給予 rhMEPE後，P04血清水平降低。同一實施例(實施例2)中的圖3顯示，在有限的時間內(例如4-24小時)，通過 靜脈內或腹膜內注射途徑多次推注MEPE分子能夠降低PTH血清水平。在這些 結果之前，認為PTH難以進行調節。具體地說，基於以下事實認為這是令人振 奮的結果在MEPE由骨或TIO腫瘤細胞過度產生的情況下，XLH或TIO腫瘤患 者中PTH血清水平通常正常。過去從TIO腫瘤中鑑定並克隆了MEPE,作為磷調素的候選物，認為它能夠 降低血清P04水平但不會影響PTH水平或具體地降低PTH水平。為了進一步證實該觀察結果，對大腸桿菌來源的rhMEPE的聚乙二醇化形 式(PEG-MEPE)進行測試。實施例3和圖4顯示了PEG-MEPE具有非常長的半衰 期。與在鼠中的循環半衰期約為3.5分鐘的大腸桿菌或CHO-製備的rhMEPE相 比，相同模型中PEG-MEPE的半衰期延長至約11個小時。因此，rhMEPE聚乙二醇化使其能夠在循環中保持超過24小時，如實施例4 的圖5所示。如同一實施例的圖6所示，接受單次推注PEG-MEPE的動物的血漿 PTH水平顯示PTH血漿水平降低的趨勢。如果如實施例5所述將實驗周期延長到72小時，PTH血漿水平清楚地顯示劑 量-依賴關係，並且與對照相比統計學顯著性降低(見圖8)。還證實，在0小時點 以最高劑量單次推注後，72小時點在循環中仍然留有PEG-MEPE(見圖7)。總之，首次意外地發現，給予動物MEPE分子能有效降低PTH循環水平。同時控制Ca、 PC^和PTH在本發明另一個實施方式中，公開並描述了一種方法，該方法包括在短時間內(例如不到24小時)單次或多次(伴有間歇測量)給予包含MEPE分子的製劑， 測定Ca和P04的血清水平，兩者的血清水平同時降低。雖然已知MEPE是"磷調素"，能夠降低血清P04水平，但並不知道它同時 能夠降低血清Ca水平。本領域中存在這樣的普遍理解體內天然動態平衡中的一種升高時，另一 種將下降，當一種下降時，則另一種升高。因此，同時降低Ca和P04的血清水 平是一種全新的且未曾預料的成就。參見AEBroadus的"礦物質平衡和體內動 態平衡"，《代謝骨疾病和礦物質代謝紊亂的引物》(Primer on Metabolic Bone dieases and Disorders of Mineral Metabolism)第5版、第16章、第105-111頁，2003 年，MJFavus編輯，ASBMR出版，華盛頓特區。圖9是實施例2的一部分結果，表明給予rhMEPE後，隨著PTH水平的下降(圖 3) Ca血清水平降低。因為已知PTH的重要生物學功能之一是調節Ca血清水平，試驗中觀察到的 血清Ca水平的降低似乎是自然的，因為它跟隨著血漿PTH水平的下降。但是， PTH和Ca的下降與P04血清水平的下降(圖2)同時發生的事實則是令人驚奇的觀 察結果，因為過去認為這是幾乎不可能實現的。綜合圖2、 3和9的結果，給予MEPE分子後，循環中Ca、 P04和PTH的水平 同時降低。此外，發現MEPE能夠抑制腸細胞中的鈉依賴性磷酸鹽協同轉運，有助於 降低血清P04水平。因為假設"磷調素"活性是通過抑制腎臟對P04的重吸收來 控制血清P04水平，這種磷調素的腸道活性也是新發現。這些觀察結果提示了礦物質和PTH體內動態平衡的新機制，因為當PTH 水平降低時，鈉依賴性磷酸鹽協同轉運應該增加，因為與傳統理論一致，己知 PTH能抑制這種轉運。因此，雖然由於MEPE的"磷調素"預期活性，將直接影響腎小管細胞， 降低鈉依賴性磷酸鹽協同轉運，MEPE還能夠以獨立於其"磷調素"活性的機 制降低PTH血清水平，從而也降低Ca血清水平。治療方法本發明還涉及治療Ca、 P04和/或PTH代謝失衡以及由這些失衡直接或間接導致的後續臨床問題的患者的方法。本發明的另一個實施方式提供了治療甲狀旁腺功能亢進的方法。該方法的特徵在於，給予甲狀旁腺功能亢進患者包含MEPE的製劑。在又一個實施方式中，公開了同時治療高磷血症和甲狀旁腺功能亢進的方 法，該方法包括給予MEPE以同時降低循環的PTH、 Ca和P04水平。在另一個實 施方式中，公開了通過降低血中Ca-P產物來治療和/或預防心血管疾病的方法， 該方法通過給予MEPE以減少血管過度鈣化，這顯著有益於腎病患者。並且， 近來發現，PTH與Ca—起在提高心血管死亡率方面起著重要的作用。參見"鈣、 鈣調節激素和鈣模擬物對心血管死亡率的影響"(Calcium, calcium regulatory hormones, and calcimimetics: impact on cardiovascular mortality). J Am Soc Nephrol. 2006年4月；17(4，增刊2):S78-80。 給予MEPE能更全面地改善這些病 症。在本發明的另一個實施方式中，給予MEPE以同時降低PTH、 Ca和P04的血 清水平(對腎病患者是理想的)，並通過使鈣結合到骨中來實現骨的重建(以治療 腎性骨營養不良症和其它骨疾病)。實施這些方法中的任一種或所有方法，可結 合測定Ca、 P04和PTH中的任一種或所有三種物質的水平，可還包括基於各個 時間點的測量結果來調節劑量。因此，在任何所需的治療時間內，給藥、測量、 調節劑量和測量可以按任意順序和次數重複進行。給藥方法給藥方法或途徑可以是靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、皮內、口服或外用 途徑。口服給藥可採用片劑、膠囊、糖漿劑、酏劑或緩釋組合物。外用給藥可包 括泡沫、凝膠、乳霜、軟膏、經皮貼片或糊劑。合適的劑量形式取決於應用或進入 途徑。製劑可以是混懸劑、溶液劑或乳劑，可包含諸如助懸劑、穩定劑和/或分散 劑等試劑。也可使用載體或賦形劑來促進該分子的給藥。載體的例子包括各種糖， 例如乳糖、葡萄糖或蔗糖、或澱粉類、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和 生理學上相容的溶劑。SEQIDNO:2、 3、 5、 6、 8-13中任一種的包含51個胺基酸 的生物活性片段可添加到任一種的這些載體或其它載體上，例如包括與rhBMP— 起銷售的ACS在內的任意類型的吸收性膠原海綿(ACS)，Ca、 PO^卩PTH水平的測量方法可通過標準醫學技術，例如血或尿分析，來測定鈣、P04和PTH水平。例如，測量體液中鈣和磷酸根離子的已知方法包括滴定、比色、原子吸光光度 法、火焰光度法、電極方法和酶方法。此外，通常採用兩種試驗來測定完整PTH 及其末端片段。採用C-末端PTH分析來確定伴隨著繼發性和三發性甲狀旁腺功能亢進的正在進行的PTH代謝改變。同時測定的完整PTH和N-末端片段的分析 能更加準確地檢測PTH水平的突發變化。測定鈣、P04和PTH水平的代表性方法 包括但不限於下列文獻所述的方法美國專利第6,521，460號、第6,387,646號； 和美國專利申請第20050191664號、第20050130321號和第20030174802號；以 及Liesener等，Anal Bioanal Chem. 2005年8月，382(7): 1451-64; Clin Chim Acta. 2005年7月1日，357(1):43-54; Clin Lab. 2005; 51(2):31-41等；它們公開的內容 以參見方式引入本說明書中。實施例下面的實施例為本領域普通技術人員對於如何製備和使用本發明提供了 完整的描述和說明，而不是為了限制發明人認為的本發明的範圍，也不表示下 面的試驗是全部或唯一進行的試驗。儘量確保所用數字的準確性(例如量、溫度 等)，但應考慮到一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份數是重量份數，分子 量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。實施例1:大腸桿菌和CHO細胞製備的rhMEPE的藥動學曲線 在Sprague-Dawley大鼠(約300克)中插入股靜脈和頸靜脈導管，分別用於給 藥和取血。每種物質類型採用四隻大鼠。用鹽水稀釋rhMEPE後注射(0.5毫升)， 目標劑量為l毫克/公斤。在0、 0.5、 1、 2、 5、 10、 15和30分鐘取血。將血液 離心收集血漿，然後-8(TC下冷凍備用。採用合成的MEPE片段製備兔多克隆抗 體，用競爭性ELISA測定MEPE血漿水平。在這些條件下，ELISA的線性檢測範 圍為約10納克/毫升到1000納克/毫升。各大鼠樣品進行復管分析，.由標準曲線 確定MEPE水平。圖l顯示了兩種物質的半衰期相似，為約3.5分鐘。但是，大腸桿菌物質的 Cm^為約6500納克/毫升，而CHO物質的Cn^為約16,500納克/毫升。作為總暴 露量實施例2: rhMEPE對磷酸鹽和甲狀旁腺素(PTH)血槳水平的影響 0、 2小時和4小時點，在SpragueDawley大鼠(約300克)中注射2毫克/公斤 的大腸桿菌製備的rhMEPE三次。在注射MEPE之前(O小時點)、然後是首次注射 後2小時(2小時時間點)、第二次注射後2小時(4小時時間點)、第三次注射後2小 時(6小時時間點)，分別取血，最後如所述在24小時或26小時取血。收集血清， 測定肌酸酐、P04和PTH。圖2和3分別顯示了相對血清肌酸酐和PTH標準化後， rhMEPE對血清P04的影響。如圖2和3分別所示，給予rhMEPE導致P04和PTH組分快速降低。此外，最 後一次注射rhMEPE後，血清水平保持下降至少20小時。實施例3:偶聯聚乙二醇(PEG)的大腸桿菌rhMEPE的藥動學曲線 採用大腸桿菌表達系統製備rhMEPE。然後添加PEG來修飾MEPE蛋白。試 驗中所用物質的平均分子量為約130kD。用鹽水稀釋PEG-MEPE後，靜脈內(通 過股靜脈導管)以l毫克/公斤的劑量注射給大鼠(約300克)。試驗中共採用4隻大 鼠。然後在各時間點，一直到注射後4小時收集血液，用競爭性ELISA測定MEPE。 圖4顯示了單次推注PEG-MEPE後，MEPE的血漿濃度隨時間的變化。由該研究 可知，PEGE-MEPE的半衰期為約10.9小時。這相對於非PEG MEPE大約3分鐘 的半衰期是顯著的進步。由這些數據，我們可以預期通過單次給予PEG-MEPE 來維持提高的生物學效應。實施例4:注射後24小時PEG-MEPE對甲狀旁腺素(PTH)血漿水平的影響 如實施例3所述製備PEG-MEPE。大鼠(N:5/組)靜脈內注射鹽水或0.1毫克/ 公斤或1.0毫克/公斤的PEG-MEPE。注射後24小時收集血液，用ELISA測定MEPE 水平(圖5)，或血漿甲狀旁腺素(PTH)水平(圖6)。相對於鹽水對照，給予O.l 和l.O毫克/公斤劑量的PEG-MEPE後，其檢測到的血漿MEPE水平分別為對照 組的約3倍和70倍。在同一試驗中測定PTH的血漿水平(圖6)，發現給予 PEG-MEPE後24小時，該水平下降。因此，單次注射PEG-MEPE能夠降低PTH， 這樣又能降低血清鈣水平。實施例5:注射後72小時PEG-MEPE對甲狀旁腺素(PTH)血漿水平的影響 如實施例3所述製備PEG-MEPE。大鼠(N二5/組)靜脈內注射鹽水或0.1毫克/公斤，1.0毫克/公斤，或10.0毫克/公斤PEG-MEPE。注射後72小時取血，用ELISA 測定MEPE水平(圖7)，或血漿甲狀旁腺素(PTH)水平(圖8)。注射後72小時， 高劑量組中給予PEG-MEPE導致相當高的MEPE血漿水平，而在l毫克/公斤組中 為可檢測的水平。在同一試驗中測定PTH的血漿水平(圖8)，發現給予PEG-MEPE 後72小時，該水平以劑量依賴性方式降低。因此，單次給予PEG-MEPE可導致 PTH在72小時後以劑量依賴性方式降低。值得注意的是，即使在低劑量組中檢 測不到MEPE的血漿水平，且中等劑量組中檢測值有些低，PTH水平仍然降低。 因此，似乎大多數MEPE從循環中清除後，仍然存在對PTH水平的作用。實施例6: rhMEPE對鈣血漿水平的影響在實施例2所述同一試驗中，以相同的方案取血並分析血清鈣濃度。圖9顯 示了相對血清肌酸酐標準化後，rhMEPE對Ca+的影響。如圖9所示，給予rhMEPE導致血清鈣快速下降。此外，似乎在最後一次注 射MEPE後至少20小時，該水平仍然降低。結合實施例2所述同一試驗的結果，結果表明注射rhMEPE可同時降低所有 三種物質，即P04、 PTH和Ca。序列表全長序列參見2004年1月6日公布的美國專利第6,673，900號，其內容如同本 文引用的專利和出版物以及PeterRowe的後續出版物一樣，以參見方式引入本 說明書中，還參見2005年6月26日公布的美國專利第6，911，425號，其內容像本 文引用的專利和出版物一樣，以參見方式引入本說明書中。人MEPE全長525個胺基酸序列一2個變體(SEQ ID No. 1)從全長序列切除16個胺基酸信號序列後的人MEPE 509個胺基酸序列一類 似SEQ ID No. 1的2個變體(SEQ ID No. 2)來自人MEPE C-末端的430個胺基酸序列一類似SEQ ID No. l的2個變體 (SEQ ID No. 3)獼猴MEPE全長胺基酸序列(SEQ ID No. 4)切除信號序列後的獼猴MEPE(SEQ ID No. 5)對應於人MEPE SEQ ID No. 3的獼猴MEPE C-末端部分(SEQ ID No. 6) 犬MEPE全長胺基酸序列(SEQ ID No. 7)切除信號序列後的犬MEPE(SEQ ID No. 8)對應於人MEPE SEQ ID No. 3的犬MEPE C-末端部分(SEQ ID No. 9) 大鼠MEPE全長胺基酸序列(SEQ ID No. 10) 切除信號序列後的大鼠MEPE(SEQ ID No. 11) 小鼠MEPE全長胺基酸序列(SEQ ID No. 12) 切除信號序列後的小鼠MEPE(SEQ ID No. 13)上述內容僅僅闡述了本發明的原理。應理解，本領域技術人員能夠設計體 現本發明原理的各種設置，.雖然這些設置在本文中沒有清楚描述和顯示，這些 設置也包括在本發明的精神和範圍內。而且，本文所述的所有實施例和條件語 言原則上是為了幫助讀者理解本發明的原理和發明者為促進本領域發展所要 傳遞的概念，應解釋為並不限於這些具體描述的實施例和條件。而且，敘述本 發明的原理、方面和實施方式的所有內容以及其具體的實施方式都包括其結構 和功能等價概念。此外，認為這些等價概念包括目前己知的等價物和將來開發 的等價物，即執行相同功能而開發的任何元件，無論其結構如何。因此，本發 明的範圍並不限於本文所述和所示的示例性實施方式。而是，本發明的範圍和 精神體現在所附權利要求書中。
權利要求
1. 一種用於降低甲狀旁腺素循環水平的藥物組合物，其包含載體和治療有效量的選自以下的分子SEQ ID No.2、3、5、6、8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性片段。
2. 如權利要求l所述的組合物，其特徵在於，所述製劑還用於實現以下效果(a) 降低磷酸鹽循環水平；(b) 降低腎小管細胞中鈉依賴性磷酸鹽協同轉運蛋白的作用； (C)降低磷酸鹽腸吸收；(d) 降低腸細胞中鈉依賴性磷酸鹽協同轉運蛋白的作用；和(e) 使患者循環中的磷酸鹽吸收到患者硬組織中。
3. 如權利要求2所述的組合物，其特徵在於，所述組合物用於實現所有 (a)-(e)的作用，且所述硬組織是骨。
4. 如權利要求l所述的組合物，其特徵在於，是經一段時間內按一定量給 予而實現以下作用的製劑(a) 降低患者^循環水平；(b) 使循環中的鈣吸收到患者硬組織中；且其中，所述胺基酸序列由以下來源產生經遺傳改造的大腸桿菌、哺乳動 物細胞和中國倉鼠卵巢細胞。
5. 如權利要求l所述的組合物，其特徵在於，所述胺基酸序列是聚乙二醇化的。
6. —種治療患者的方法，所述方法包括以下步驟(a) 測定患者的甲狀旁腺素(PTH)、磷酸鹽(P04)和鈣(Ca)水平；(b) 給予患者一定劑量包含載體和具有磷調素活性的肽的製劑；和(c) 再次測量患者的(PTH)、 (P04)和(Ca)水平，以確定給予所述具有磷調素 活性的肽之後的水平。
7. 如權利要求l所述的方法，所述方法還包括(d) 基於步驟(c)中確定的(PTH)、 (P04)和(Ca)水平，調節步驟(b)中的劑量。
8. 如權利要求7所述的方法，所述方法還包括(e)重複任選自(a)-(d)的步驟。
9. 一種用於治療患有甲狀旁腺功能亢進的藥物製劑，所述製劑包含 載體和治療有效量的選自以下的分子SEQIDNo.2、 3、 5、 6、 8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性 片段。
10. 如權利要求9所述的製劑，其特徵在於，所述組合物用於治療繼發性甲 狀旁腺功能亢進。
11. 如權利要求10所述的製劑，其特徵在於，所述繼發性甲狀旁腺功能亢 進與慢性腎病有關。
12. —種用於治療同時患有甲狀旁腺功能亢進和高磷血症的患者的藥物制 劑，所述製劑包含載體和治療有效量的選自以下的分子SEQIDNo. 2、 3、 5、 6、 8-13所表 示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性 片段。
13. 如權利要求12所述的製劑，其特徵在於，所述患者患有慢性腎病。
14. 一種用於降低患有高鈣血症、高磷血症或其組合的對象的循環中的鈣-磷產物的組合物，所述組合物包含載體和治療有效量的選自以下的分子SEQIDNo. 2、 3、 5、 6、 8-13所表 示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性 片段。
15. 如權利要求14所述的組合物，其特徵在於，所述組合物用於慢性腎病 患者。
16. 如權利要求14所述的組合物，其特徵在於，所述組合物用於心血管疾 病患者。
17. —種用於治療患有甲狀旁腺功能亢進和高鈣-磷產物的對象以同時降 低鈣、磷和甲狀旁腺素的循環水平的組合物，所述組合物包含載體和治療有效量的選自以下的分子SEQIDNo. 2、 3、 5、 6、 8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性 片段。
18. 如權利要求17所述的組合物，其特徵在於，所述組合物用於慢性腎病患者。
19. 如權利要求17所述的組合物，其特徵在於，所述組合物用於心血管疾 病患者。
20. —種用於治療骨質流失的的組合物，所述組合物包含載體和治療有效量的選自以下的分子SEQIDNo.2、 3、 5、 6、 8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性 片段。
21. 如權利要求20所述的組合物，其特徵在於，所述組合物用於治療腎性 骨營養不良症導致的骨質流失。
22. 如權利要求21所述的組合物，其特徵在於，循環鈣和磷酸鹽摻入或吸 收到骨骼組織中。
23. 如權利要求22所述的組合物，其特徵在於，所述骨骼組織是骨。
24. —種用於控制患者甲狀旁腺素水平的組合物，所述組合物包含 選自SEQIDNo. 2、 3、 5、 6、 8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性片段的肽。
25. 如權利要求24所述的組合物，其特徵在於，所述甲狀旁腺素水平獨立 於鈣和磷酸鹽水平進行控制。
26. 如權利要求25所述的組合物，其特徵在於，所述組合物的給予時間為 三天或更長。
27. 如權利要求25所述的組合物，其特徵在於，所述組合物的給予時間為 五天或更長。
28. 如權利要求24所述的組合物，其特徵在於，所述肽經注射給予，並且 所述肽是緩釋製劑。'
29. 如權利要求24所述的組合物，其特徵在於，所述肽的給予抑制腸細胞 中鈉依賴性磷酸鹽協同轉運。
30. —種用於控制患者鈣水平的藥物組合物，所述組合物包含 選自SEQIDNo. 2、 3、 5、 6、 8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性片段的肽。
31. 如權利要求30所述的組命物，其特徵在於，所述組合物被製成適合注 射給予。
32. —種用於同時控制患者鈣和磷酸鹽水平的藥物組合物，所述組合物包含選自SEQIDNo.2、 3、 5、 6、 8-13所表示的胺基酸序列，及其包含至少51 個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性片段的肽。
33. 如權利要求32所述的組合物，其特徵在於，獨立於甲狀旁腺素水平同' 時控制所述鈣和磷酸鹽水平。
34. —種包含可接受的賦形劑和藥學活性成分的藥物組合物，其包含藥學 有效量的一種或多種選自下組的分子具有SEQIDNo. 2、 3、 5、 6、 8-13所表 示的胺基酸序列，及其包含至少51個胺基酸長度並具有磷調素活性的生物活性 片段。
全文摘要
公開了一種方法，該方法包括測定患者的鈣、磷酸鹽和甲狀旁腺素水平。用包含具有磷調素活性化合物的製劑治療患者，然後再次進行測量。基於測量結果調節製劑劑量，在需要時可以不斷重複測量、給藥和調節劑量。
文檔編號A01N37/18GK101282640SQ200680037773
公開日2008年10月8日 申請日期2006年8月23日 優先權日2005年8月30日
發明者D·羅森, T·哈伯伯格, 熊谷是成 申請人:阿克勒斯股份有限公司