編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在轉導細胞中的表達的製作方法

2023-09-19 05:58:25

專利名稱：編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在轉導細胞中的表達的製作方法
技術領域：
及背景本發明涉及編碼具類肝素酶(heparanase)活性的多肽的多核苷酸(下文中稱作hpa)，包括此多核苷酸的載體和表達類肝素酶的轉導細胞。本發明還進一步涉及具類肝素酶活性的重組蛋白。
硫酸乙醯肝素蛋白多糖硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)是與脊椎動物和無脊椎動物組織中的許多細胞的細胞表面和胞外基質(ECM)有關的普遍存在的大分子(1-4)。基本的HSPG結構包括蛋白核心以及與之共價相連的幾條線性硫酸乙醯肝素鏈。這些多糖鏈通常由重複的己糖醛和D-葡糖胺二糖單元組成，這些單元不同程度地被N-和O-連接的硫酸組分和N-連接的乙醯基團所取代(1-4)。對ECM分子參與細胞附著、生長和分化的研究顯示，HSPG在胚形態發生、血管發生、軸突旁枝突起和組織修復中處於關鍵地位(1-5)。HSPG是血管的重要組分(3)。在大血管中，它們主要集中在血管內膜和內血管中膜，而在毛細血管中，它們主要在內皮下基底膜，支持內皮細胞繁殖和遷移並穩定毛細血管壁的結構。HSPG與ECM大分子如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白等在質膜上的不同附著位點相互作用的能力暗示了此蛋白多糖在ECM組分的自組裝和不溶性，以及細胞粘著和細胞運動中起著重要作用。硫酸乙醯肝素(HS)鏈的裂解可導致內皮下ECM的降解，從而在血源細胞的外滲中起決定性作用。HS分解代謝可在炎症、創傷修復、糖尿病和癌症轉移中觀察到，說明降解HS的酶在病理過程中起重要作用。類肝素酶活性曾在活化的免疫系統細胞和高度轉移的癌細胞中描述過(6-8)，但由於缺乏探索疾病狀況下類肝素酶潛在的病原作用的生物工具，因此阻礙了研究。
腫瘤細胞侵入和轉移中類肝素酶的參與停留在不同器官毛細血管床內的循環腫瘤細胞必須侵入內皮細胞內層並降解其底層基底膜(BM)以便侵入血管外組織，從而發生轉移(9，10)。轉移的腫瘤細胞經常附著在鄰近內皮細胞之間的胞間連接處或附近。轉移細胞附著之後，胞間連接破裂，內皮細胞邊界收縮，通過內皮缺口向暴露的底層基底膜遷移(9)。一旦定位在內皮細胞和BM之間，則侵入細胞必須降解BM的內皮下糖蛋白和蛋白多糖以便遷移出血管區室。若干細胞酶(例膠原酶IV，纖溶酶原激活物，組織蛋白酶B，彈性蛋白酶等)與BM的降解有關(10)。在這些酶中，有一種內切-β-D-葡糖苷酸酶(類肝素酶)，它在特殊鏈內位點裂解HS(6，8，11)。HS降解性類肝素酶的表達與小鼠淋巴瘤(11)、纖維肉瘤和黑素瘤(8)細胞的轉移潛力相關。此外，在患有轉移腫瘤的動物和黑素瘤患者的血清(8)和癌症患者的腫瘤活組織(12)中檢測到類肝素酶水平升高。
本發明人以前研究過通過局部微環境對細胞增殖和腫瘤發展進行控制，主要著眼於細胞與培養的角膜和血管內皮細胞產生的細胞外基質(ECM)之間的相互作用。該培養ECM在其形態外觀及分子組成方面與體內的內皮下層十分類似。它包括膠原(主要是III型和IV型，及少量I型和V型)，蛋白多糖(主要為硫酸乙醯肝素和硫酸皮膚素蛋白多糖，以及少量硫酸軟骨素蛋白多糖)，層粘連蛋白，纖連蛋白，巢蛋白和彈性蛋白(13，14)。細胞降解培養ECM中的HS的能力可通過以下方法研究使細胞與新陳代謝地硫酸鹽標記的ECM相互作用，對釋放到培養基中的降解產物進行凝膠過濾(瓊脂糖6B)分析(11)。完整的HSPG在柱的空體積之後洗脫(Kav＜0.2，Mr≈0.5×106)，而標記的HS側鏈降解片段在更接近柱的Vt時洗脫(0.5＜Kav＜0.8，Mr＝5-7×103)(11)。
本發明者還研究了各種非抗凝劑類型的肝素對類肝素酶的抑制作用，這些肝素有可能用於防止血源細胞的外滲。包括16個或更多糖單位並在N和O位置都具硫酸基團的肝素可最成功抑制類肝素酶。O-脫硫作用消除了肝素對類肝素酶的抑制作用，而只要N-取代分子分子量大於等於4,000道爾頓，則O-硫酸化、N-乙醯化肝素保持高抑制活性(7)。對實驗動物用類肝素酶抑制劑(例如，肝素的非抗凝劑類型)處理，則顯著減少(＞90％)B16黑素瘤、Lewis肺癌和乳腺癌細胞誘導的肺部轉移(7，8，16)。與抗凝血酶III具高和低親合性的肝素級分表現出相似的高抗轉移活性，這表明肝素的類肝素酶抑制活性而非其抗凝活性在多糖的抗轉移特性中起作用(7)。
癌症患者尿中的類肝素酶活性為嘗試進一步闡明類肝素酶在腫瘤發展中的作用及與人類癌症的相關性，對尿樣進行類肝素酶活性檢查(16a)。在一部分、而非所有癌症患者的尿樣中檢測到類肝素酶活性。在患有侵入性轉移疾病的患者的尿液中檢測到高水平的類肝素酶活性，而在健康供體的尿液中檢測不到類肝素酶活性。
在20％的正常人和微球蛋白尿胰島素依賴型糖尿病(IDDM)患者中也發現有類肝素酶活性，這很可能是由於糖尿病性腎病——導致成人腎衰竭的最重要的疾病所致。
類肝素酶可能參與腫瘤血管發生成纖維細胞生長因子為結構相關的多肽家族，具有對肝素高親和性的特徵(17)。它們對血管內皮細胞高度促有絲分裂，且是最有效的新血管形成的誘導物之一(17，18)。已從體外生成的內皮下ECM(19)和角膜的基底膜(20)中提取出了鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，提示ECM可作為bFGF的儲存器。免疫組化染色顯示bFGF定位在多種組織和血管的基底膜中(21)。儘管bFGF在正常組織中普遍存在，但這些組織中的內皮細胞通常增殖很低，說明bFGF以某種方式與其作用位點隔離。對bFGF與ECM相互作用的研究表明bFGF與ECM中HSPG結合，且能通過HS降解酶以活化形式釋放(15，20，22)。已證實血小板、肥大細胞、嗜中性粒細胞和淋巴瘤細胞表達的類肝素酶活性與從ECM和基底膜釋放活性bFGF有關(23)，說明類肝素酶活性可能不僅參與細胞遷移和侵入，而且還可能誘發間接新血管反應。這些結果說明ECM HSPG是bFGF、可能還是其它肝素結合性生長促進因子的天然儲存庫(24，25)。因此，bFGF從其在基底膜和ECM內的儲備中移位可能是正常和病理狀況下誘導新血管形成的一種新機制。
近來的研究顯示，肝素和HS參與bFGF與高親和力細胞表面受體的結合及bFGF細胞信號傳導(26，27)。此外，達到最佳效果所需的HS的大小與類肝素酶釋放的HS片段的大小相似(28)。對血管內皮細胞生長因子(VEGF)也得到類似結果(29)，表明有一個涉及HS與肝素結合性生長因子的細胞相互作用的雙重受體機制在起作用。因此推斷ECM中內皮細胞生長因子的限制化避免了它們系統性地作用於血管內皮，從而維持極低速率的內皮細胞轉換和血管生長。另一方面，bFGF作為與HS片段的複合體從ECM內的儲備中釋放出來可能會刺激例如創傷癒合、炎症和腫瘤發展等過程中的局部內皮細胞增殖和新血管生成(24，25)。
免疫系統細胞的類肝素酶的表達類肝素酶的活性與免疫系統內活化細胞脫離循環並引起炎症和自身免疫反應的能力有關。血小板、粒細胞、T和B淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞與內皮下ECM的相互作用與通過特異性類肝素酶活性降解HS有關(6)。類肝素酶在各種活化信號(例如凝血酶，鈣離子載體，免疫複合體，抗原，有絲分裂原，等)刺激下從細胞內區室(例如溶酶體，特殊顆粒，等)釋放，說明其受調控地參與炎症和細胞免疫。
參考文獻6中回顧了關於類肝素酶的觀察結果，列舉如下文第一，蛋白水解活性(纖溶酶原激活物)和類肝素酶協同參與炎性白細胞和惡性細胞對ECM HSPG的順序降解。
第二，大部分血小板類肝素酶以潛伏形式存在，很可能是作為與硫酸軟骨素的複合體存在。該潛伏酶被腫瘤細胞衍生因子活化，隨後可在腫瘤轉移過程中促進通過血管內皮的細胞侵入。
第三，強刺激劑(例如凝血酶)誘導血小板類肝素酶從α-顆粒中釋放，但ECM上血小板活化不誘導釋放。
第四，因閾值激活和細胞在ECM上孵育，優先並很容易地釋放嗜中性粒細胞類肝素酶。
第五，嗜中性粒細胞與ECM的接觸抑制了毒性酶(蛋白水解酶，溶菌酶)和氧自由基的釋放，但不抑制能使血細胞滲出的酶(類肝素酶，明膠酶)的釋放。當可溶因子而非可被吞噬的刺激劑刺激時，可觀察到內皮下ECM的這種保護作用。
第六，細胞內類肝素酶在T細胞系暴露於特異抗原下幾分鐘內即被分泌。
第七，有絲分裂原(ConA，LPS)誘導體外維持的正常T和B淋巴細胞合成與分泌類肝素酶。T淋巴細胞類肝素酶也可通過體內抗原免疫接種而誘導。
第八，前B淋巴瘤和B淋巴瘤表達類肝素酶活性，但漿細胞瘤和靜息狀態的正常B淋巴細胞不表達。
第九，活化的巨噬細胞在與ECM孵育過程中表達類肝素酶活性，但僅極少或根本沒有酶釋放到培養基中。誘導人骨髓白血病細胞分化為成熟巨噬細胞時，得到相似結果。
第十，低劑量的類肝素酶抑制性非抗凝劑型肝素抑制T細胞介導的遲髮型超敏反應和實驗性自身免疫(30)。
第十一，血小板、嗜中性粒細胞和轉移腫瘤細胞表達的類肝素酶活性從ECM和基底膜釋放活化的bFGF。從ECM內的儲備中釋放bFGF可在如創傷癒合、炎症和腫瘤發展的過程中引發局部的新血管反應。
第十二，類肝素酶產生的ECM降解產物中具有能體內抑制T細胞介導的炎症的三硫酸化雙糖(31)。此種抑制與雙糖對活化的T細胞進行的生物活性TNFα體外生產的抑制作用相關(31)。
其它潛在的治療應用哺乳動物的類肝素酶除了參與腫瘤細胞轉移、炎症和自身免疫之外，還可用於調節肝素結合性生長因子的生物利用率(15)；針對肝素結合性生長因子(例如bFGF，VEGF)和細胞因子(IL-8)的細胞反應(31a，29)；與血漿脂蛋白的細胞相互作用(32)；對某些病毒和一些細菌及原生動物感染的細胞易感性(33，33a，33b)；和澱粉狀蛋白斑的分解(34)。由此證明類肝素酶可能在諸如創傷癒合、血管發生、再狹窄、動脈粥樣硬化、炎症、神經變性疾病和病毒感染之類狀況中有用。哺乳動物類肝素酶能作為血精蛋白的潛在替代物用於中和血漿肝素。抗類肝素酶的抗體可應用於活組織檢查樣品、血漿樣品和體液中的微轉移、自身免疫損害和腎衰竭的免疫檢測及診斷中。在基礎研究中也有普遍用途。
編碼類肝素酶的hpa基因的鑑別有助於在異源表達系統中製備重組酶。如能獲得重組蛋白，將為解決蛋白結構功能關係鋪平道路，並且為開發新抑制劑提供工具。
病毒感染細胞表面上硫酸乙醯肝素的存在是單純皰疹病毒(33)和登革病毒(33a)與細胞結合併進一步感染細胞的主要條件。因此通過類肝素酶除去細胞表面硫酸乙醯肝素可消除病毒感染(33)。事實上，用細菌類肝素酶(降解硫酸乙醯肝素)或肝素酶(降解類肝素)處理細胞，能降低兩種相關的動物皰疹病毒與細胞的結合，使細胞對病毒感染至少有部分抗性。有跡象表明細胞表面硫酸乙醯肝素也參與HIV感染(33b)。
神經變性疾病在Genstmann-Straussler綜合症，Creutzfeldt-Jakob疾病和Scrape的朊病毒蛋白澱粉樣蛋白斑中鑑別出了硫酸乙醯肝素蛋白多糖(34)。類肝素酶可分解這些被認為也在早老性痴呆發病機理中起作用的澱粉樣蛋白斑。
再狹窄和動脈粥樣硬化因內皮損傷和富含膽固醇的脂蛋白累積造成的動脈平滑肌細胞(SMC)增殖是動脈粥樣硬化和再狹窄發病機理中的基本事件(35)。HS除了參與SMC增殖(即肝素結合性生長因子的低親和性受體)外，還參與脂蛋白結合、滯留和攝取(36)。已證明HSPG和脂蛋白脂酶參與可使富含膽固醇的脂蛋白發生顯著細胞和間質積累的新分解代謝途徑(32)。後一種途徑可能因促進富含apoB和apoE的脂蛋白(即LDL，VLDL，乳糜微粒)的積累而高度促進動脈粥樣硬化，而與細胞固醇含量的反饋抑制無關。因而預計通過類肝素酶除去SMCHS可抑制SMC增殖和脂類積累，因此可以阻止再狹窄和動脈粥樣硬化的發展。
因此，人們已普遍認識到，得到編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸，包含此多核苷酸的載體，表達類肝素酶的轉導細胞及具類肝素酶活性的重組蛋白，將是有必要的並且非常有益的。
發明概述本發明提供編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸(即下文所指的hpa、hpa cDNA或hpa基因)，本發明還提供包含此多核苷酸的載體，表達類肝素酶的轉導細胞和具類肝素酶活性的重組蛋白。
在此報導對編碼類肝素酶的人hpa基因的克隆和通過轉染宿主細胞表達重組類肝素酶。
對從人肝癌細胞分離的類肝素酶的純化製品進行胰蛋白酶消化和微量測序。公開的YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)序列用於篩選EST資料庫中相應的DNA序列的同源物。鑑定到兩個緊密相關的EST序列，其後發現二者相同。兩種克隆都包括1020bp的插入片段，此插入片段包括973bp的開放閱讀框及隨後的27bp 3′非翻譯區和多聚腺苷酸尾。未鑑定到翻譯起始位點。
使用根據EST克隆序列和複合體的接頭選擇的引物，通過對來自胎盤Marathon RACE cDNA複合體的DNA進行PCR擴增實施對缺失的hpa 5′端的克隆。獲得900bp PCR片段，該片段與鑑定出的EST 3′編碼克隆部分重疊。連接的cDNA片段(hpa)為1721bp長(SEQ IDNO9)，其中包括編碼543個胺基酸的多肽(SEQ ID NO10)的開放閱讀框，計算分子量為61，192道爾頓。
運用Marathon RACE通過PCR擴增從人SK-hep1細胞系克隆延伸的5′序列。將SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列與從人胎盤分離的hpa cDNA(SEQ ID NO9)序列裝配起來。裝配序列包括開放閱讀框SEQ ID NO13和15，該閱讀框編碼如SEQ ID NO14和15所示的592個胺基酸的多肽，計算分子量為66，407道爾頓。
運用杆狀病毒表達系統，通過在昆蟲細胞中表達hpa的整個開放閱讀框，檢測hpa基因產品在體外實驗中催化硫酸乙醯肝素降解的能力。含hpa基因的病毒感染的細胞的提取物和條件培養基，經實驗證明其對可溶性的ECM衍生HSPG和完整ECM均有高水平硫酸乙醯肝素降解活性。肝素是類肝素酶的另一底物，它抑制上述降解活性。用不含hpa基因的相似構建體感染的細胞及未轉染細胞都不具備此活性。在哺乳動物表達系統中證實從延伸的5′克隆表達的類肝素酶有對肝素的活性。
運用RT-PCR研究hpa RNA在不同組織和細胞系中的表達模式。發現hpa RNA僅在已知具類肝素酶活性的組織和細胞中表達。
運用一系列單染色體人/CHO和人/小鼠體細胞雜合體將人類肝素酶基因定位在人第4號染色體上。該新分離的類肝素酶序列可用於鑑定鋪展染色體中具有人類肝素酶基因的染色體區。
根據本發明以下描述的優選實施方案中進一步描繪的特徵，本發明提供包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，該多核苷酸片段包括SEQ ID NO9的核苷酸63-1691或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869，它們編碼完整的人類肝素酶。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供包括能與hpa cDNA雜交，尤其是與SEQ ID NO9的核苷酸1-721雜交的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸序列與SEQ ID NO9或13至少60％同源，優選至少70％同源，更優選至少80％同源，最優選至少90％同源。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，依照本發明的多核苷酸片段包括SEQ ID NO9或13的一部分(片段)。例如，這些片段可包括SEQ ID NO9的核苷酸63-721和/或SEQ ID NO9中編碼具類肝素酶催化活性的多肽的區段。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，由該多核苷酸片段編碼的多肽包括SEQ ID NO10或14中所示胺基酸序列或其功能性部分。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，該多核苷酸序列編碼具類肝素酶活性的多肽，所述多肽與SEQ ID NO10或14至少60％同源，優選至少70％同源，更優選至少80％同源，最優選至少90％同源。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，該多核苷酸片段編碼具類肝素酶活性的多肽，該多肽因此可能是SEQ ID NO10或14所示胺基酸序列的等位變體、種變體和/或誘導變體。任何此類變體也可被認作同系物。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供一種單鏈多核苷酸片段，它包括與編碼具如上述類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸鏈的至少一部分互補的多核苷酸序列。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供包括編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列的載體。
該載體可為任何適當形式，包括但不限於噬菌體、病毒、質粒、噬菌粒、粘粒、杆粒或甚至人工染色體。編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列可包括以上描述的任何多核苷酸片段。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供含有包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的外源多核苷酸片段的宿主細胞。
該外源多核苷酸片段可為以上描述的任何片段。宿主細胞可為任何形式，如原核細胞、真核細胞、細胞系或作為多細胞生物一部分的細胞(例如轉基因生物的細胞)。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供包含具類肝素酶催化活性的多肽的重組蛋白。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供包含具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的藥物組合物。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供包括含有具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的醫療裝置的醫療設備。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供包括過表達類肝素酶催化活性的細胞的類肝素酶過量表達系統。
根據描述的優選實施方案中的進一步特徵，本發明提供鑑定鋪展的染色體中包含人類肝素酶基因的染色體區的方法，包括以下步驟(a)將鋪展的染色體與編碼類肝素酶的標記多核苷酸探針雜交；(b)洗滌鋪展的染色體，從而除去過剩的未雜交探針；及(c)搜尋與所述雜交的標記多核苷酸探針相關的信號，其中探測到信號指示包含人類肝素酶基因的染色體區。
本發明能用於開發抑制腫瘤細胞轉移、炎症和自身免疫的新藥。對編碼類肝素酶的hpa基因的鑑定使在異源表達系統中生產重組酶成為可能。
附圖簡述本發明僅通過舉例的方式，參考附圖在此描述，其中

圖1顯示hpa cDNA的核苷酸序列和推斷的胺基酸序列。在EST(表達序列標誌)和PCR擴增的cDNA(反轉錄RNA)之間，存在位於799位的單核苷酸差異(A改為T)，此差異及其導致的胺基酸替代(Tyr改為Phe)在各取代單元的上下標出。半胱氨酸殘基和聚腺苷酸化共有序列下劃線標出。星號表示終止密碼子TGA。
圖2表示以pFhpa2病毒感染的High Five細胞的溶解產物降解可溶的硫酸鹽標記HSPG底物。pFhpa2病毒(●)或對照pF2病毒(□)感染的High Five細胞的溶解產物與硫酸鹽標記的ECM衍生的可溶性HSPG(峰I)溫育(18h，37℃)。將溫育培養基隨後加入到Sepharose6B上進行凝膠過濾。低分子量HS降解片段(峰II)僅在與pFhpa2感染的細胞溫育時產生，而pF2感染的細胞的溶解產物不造成HSPG底物(◇)的降解。
圖3a-b表示可溶性的硫酸鹽標記HSPG底物被pFhpa2和pFhpa4感染細胞的培養基降解。將pFhpa2(3a)或pFhpa4(3b)病毒(●)或對照病毒(□)感染的High Five細胞的培養基與硫酸鹽標記的ECM衍生的可溶HSPG(峰I，◇)溫育(18h，37℃)。溫育培養基隨後加至Sepharose 6B上進行凝膠過濾。低分子量HS降解片段(峰II)僅在與含hpa基因的病毒溫育時產生。對照病毒感染細胞的培養基不降解HSPG底物。
圖4表示pFhpa2感染的細胞表達的類肝素酶活性的大小分級分離。將pFhpa2感染的High Five細胞的培養基加到50kDa的截留膜上。在高分子量(＞50kDa)部分(●)而非低分子量(＜50kDa＝(○)部分中發現有類肝素酶活性(峰I底物(◇)轉換為峰II HS降解片段)。
圖5a-b表示肝素對pFhpa2和pFhpa4感染的High Five細胞表達的類肝素酶活性的影響。將pFhpa2(5a)和pFhpa4(5b)感染的HighFive細胞的培養基與硫酸鹽標記的ECM衍生的可溶HSPG(峰I，◇)在缺乏(●)或存在(△)10μg/ml肝素時溫育(18h，37℃)。在肝素-類肝素酶活性的一種強有力抑制劑存在時完全不產生低分子量HS降解片段(6，7)。
圖6a-b表示病毒感染的High Five和Sf21細胞對硫酸鹽標記的完整ECM的降解。將High Five(6a)和Sf21(6b)細胞鋪在硫酸鹽標記的ECM之上，以pFhpa4(●)或對照pF1(□)病毒感染(48h，28℃)。將對照未感染Sf21細胞(R)同樣鋪在標記的ECM上。培養基的pH調至6.0-6.2，37℃溫育24小時。通過在Sepharose 6B上凝膠過濾，分析釋放到溫育培養基中的硫酸鹽標記物質。僅有含hpa的病毒感染的細胞可產生HS降解片段。
圖7a-b表示病毒感染的細胞對硫酸鹽標記的完整ECM的降解。將High Five(7a)和Sf21(7b)細胞鋪在硫酸鹽標記的ECM上，以pFhpa4(●)或對照pF1(□)病毒感染(48h，28℃)。對照未感染的Sf21細胞(R)也鋪在標記的ECM上。培養基的pH調至6.0-6.2，28℃溫育48小時。通過在Sepharose 6B上進行凝膠過濾，分析釋放到溫育培養基中的硫酸鹽標記的降解片段。僅有含hpa的病毒感染的細胞產生HS降解片段。
圖8a-b表示pFhpa4感染細胞的培養基對硫酸鹽標記的完整ECM的降解。將pFhpa4(●)或對照pF1(□)病毒感染的High Five(8a)和Sf21(8b)細胞的培養基與完整的硫酸鹽標記ECM溫育(48h，30℃，pH6.0)。還將ECM與對照未感染Sf21細胞(R)的培養基溫育。對釋放到反應混合物中的硫酸鹽標記物質進行凝膠過濾分析。僅在pFhpa4感染細胞的培養基中測得類肝素酶活性。
圖9a-b表示肝素對pFhpa4感染細胞的培養基中的類肝素酶活性的影響。在缺乏(●)或存在(V)10μg/ml肝素時，將硫酸鹽標記的ECM與pFhpa4感染的High Five(9a)和Sf21(9b)細胞的培養基溫育(24h，37℃，pH6.0)。將釋放到溫育培養基中的硫酸鹽標記物質在Sepharose 6B上凝膠過濾。肝素存在時，類肝素酶活性(峰II HS降解片段的產生)被完全抑制。
圖10a-b表示在肝素-Sepharose上純化重組類肝素酶。將pFhpa4病毒感染的Sf21細胞的培養基進行肝素-Sepharose層析。用NaCl梯度0.35-2M(◇)進行各級分的洗脫。圖10a(●)表示洗脫級分中的類肝素酶活性。對級分15-28進行15％SDS-聚丙烯醯胺凝膠電脈，而後硝酸銀染色。證明在級分19-24中的主蛋白帶(MW～63,000)與類肝素酶活性之間有相關性。
圖11a-b表示在Superdex 75凝膠過濾柱上純化重組類肝素酶。將從肝素-Sepharose上洗脫的活性級分(圖10a)集中，濃縮，並加到Superdex 75 FPLC柱上。收集各級分並檢查各級分的等分樣品的類肝素酶活性(C，圖11a)，由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳而後硝酸銀染色分析(圖11b)。可見級分4-7中的主蛋白帶(MW～63,000)的存在與類肝素酶活性間有相關性。
圖12a-e表示對來自人胚組織(12a)、人胚外組織(12b)和不同起源的細胞系(12c-e)的總RNA進行RT-PCR，示hpa基因的表達。使用hpa特異性引物(I)、GAPDH持家基因的引物(II)和無逆轉錄酶的對照反應的RT-PCR產物，證明RNA樣品(III)中無基因組DNA或其它汙染。M-DNA分子量標準VI(Boehringer Mannheim)。12a泳道1-嗜中性細胞(成熟的)，泳道2-肌肉，泳道3-胸腺，泳道4-心臟，泳道5-腎上腺。12b泳道1-腎，泳道2-胎盤(8周)，泳道3-胎盤(11周)，泳道4-7-痣(完全水泡狀脂塊)，泳道8-細胞滋養層細胞(新分離)，泳道9-細胞滋養層細胞(體外1.5h)，泳道10-細胞滋養層細胞(體外6h)，泳道11-細胞滋養層細胞(體外18h)，泳道12-細胞滋養層細胞(體外48h)。12c泳道1-JAR膀胱細胞系，泳道2-NCITT睪丸腫瘤細胞系，泳道3-SW-480人肝癌細胞系，泳道4-HTR(SV40轉化的細胞滋養層)，泳道5-HPTLP-I肝細胞癌細胞系，泳道6-EJ-28膀胱癌細胞系。12d泳道1-SK-hep-1人肝癌細胞系，泳道2-DAMI人巨核細胞系，泳道3-DAMI細胞系+PMA，泳道4-CHRF細胞系+PMA，泳道5-CHRF細胞系。12e泳道1-ABAE牛主動脈內皮細胞，泳道2-1063人卵巢細胞系，泳道3-人乳腺癌MDA435細胞系，泳道4-人乳腺癌MDA231細胞系。
圖13表示人hpa的核苷酸序列與小鼠EST cDNA片段(SEQ ID NO12)的比較，小鼠EST cDNA片段與人hpa的3′末端(起始於SEQ IDNO9的核苷酸1066)80％同源。在排列的終止密碼子下劃線。
圖14表示hpa基因的染色體定位。以hpa特異引物擴增後，將從體細胞雜合體衍生的DNA的PCR產物與倉鼠、小鼠和人基因組DNA的PCR產物通過0.7％瓊脂糖凝膠分離。泳道1-BstEII消化的LambdaDNA，泳道2-無DNA對照，泳道3-29，PCR擴增產物。泳道3-5-人、小鼠和倉鼠各自的基因組DNA。泳道6-29，分別表示染色體1-22和X與Y的人單染色體體細胞雜合體。泳道30-BstEII消化的Lambda DNA。僅在泳道5和9觀察到約2.8kb的擴增產物，分別代表人基因組DNA和衍生自攜人染色體4的細胞雜合體的DNA。這些結果證明hpa基因位於人染色體4上。
優選實施方案的描述本發明涉及編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸，在下文中可互換地稱作hpa、hpa cDNA或hpa基因，還涉及包括該多核苷酸的載體，表達類肝素酶的轉導細胞和具類肝素酶活性的重組蛋白。
在詳細解釋本發明的至少一個實施方案前，必須了解本發明的應用不限於下文說明書或附圖所示的構建細節和各成分的排列。本發明能用於其它實施方案或以不同方式實施。而且，必須了解在此所用的術語和專門名詞是為描述目的而不應認作限制。
本發明能用於開發各種疾病的治療方法，開發這些疾病的診斷方法以及為基礎研究特別是醫學和生物學領域提供新工具。
特別地，本發明可用於開發抑制腫瘤細胞轉移、炎症和自身免疫的新藥物。對編碼類肝素酶的hpa基因的鑑定使在異源表達系統中生產重組酶成為可能。
進一步地，本發明能用於調節肝素結合性生長因子的生物利用率，針對肝素結合性生長因子(例如bFGF，VEGF)和細胞因子(IL-8)的細胞反應，細胞與血漿脂蛋白的相互作用，對病毒、原生動物和一些細菌感染的細胞易感性，和神經變性斑的分解。因此重組類肝素酶是創傷癒合、血管發生、再狹窄、動脈粥樣硬化、炎症、神經變性疾病(例如Genstmann-Straussler綜合症，早老性痴呆症，Scrape)，和某些病毒、細菌和原生動物感染的潛在治療物。重組類肝素酶可作為魚精蛋白的潛在替代物用於中和血漿肝素。
如在此所用的，術語「調節」包括實質性地抑制、減緩或逆轉一種疾病的進展，實質性地改善疾病或狀況的臨床症狀，或實質性地阻止疾病或狀況的臨床症狀的出現。因此「調節子」包括可調節疾病或狀況的因子。對病毒、原生動物和細菌感染的調節包括實質性地中斷、阻止或減少任何病毒、細菌或原生動物活性和/或病毒、細菌或原生動物生命周期的階段，或者減少或阻止病毒、細菌或原生動物對目標，如人或低等動物的感染的任何作用。
如在此所用的，術語「創傷」包括對目標軀體的任何部分的任何傷害，包括但不僅限於急性疾病，如在紫外輻射如日灼下過度暴露造成的灼傷、化學灼傷、放射灼傷、熱灼傷，因勞動和分娩而對身體組織如會陰造成的傷害，包括在醫學方法如外陰切開術過程中持續的損傷，外傷誘導的損傷包括切除，在汽車和其它機械事故中持續的損傷，子彈、刀片及其它武器所致的損傷，和外科術後損傷，以及慢性疾病如褥瘡，涉及糖尿病和循環不良的疾病，和所有類型的痤瘡，等。
針對重組酶產生的抗類肝素酶抗體，可用於活組織檢查標本、血漿樣品和體液中微轉移、自身免疫損害和腎衰竭的免疫檢測和診斷中。這種抗體也可用作類肝素酶活性的中和劑。
在此報導對編碼類肝素酶的人hpa基因的克隆和通過轉染細胞表達重組類肝素酶。這是首次克隆的哺乳動物類肝素酶基因。
對從人肝癌細胞分離的類肝素酶的純化製品進行胰酶消化和微量測序。
利用公開的YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)序列篩選EST資料庫，尋求相應的DNA序列的同源物。鑑定到兩個緊密相關的EST序列並發現二者相同。
兩克隆都包括1020bp的插入片段，此插入片段包括973bp的開放閱讀框及隨後的27bp的3′非翻譯區和聚腺苷酸尾，但未鑑定到翻譯起始位點。
通過對來自胎盤Marathon RACE cDNA複合體的DNA進行PCR擴增，使用根據EST克隆序列和複合體的接頭選擇的引物，克隆缺失的5′末端。
獲得900bp的PCR片段，與鑑定到的3′編碼EST克隆部分重疊。連接的cDNA片段(hpa)長1721bp(SEQ ID NO9)，包括編碼具有如圖1和SEQ ID NO11所示543個胺基酸、計算分子量為61192道爾頓的多肽(SEQ ID NO10)的開放閱讀框。
觀察到EST克隆和PCR擴增的cDNA之間在799位有一個單核苷酸差異(A→T)。此區別導致單個胺基酸取代(Tyr改為Phe)(圖1)。此外，發表的EST序列包括一個未鑑定的核苷酸，對兩個EST克隆的DNA測序將該未鑑定核苷酸分辨為兩個核苷酸(分別為SEQ ID NO9中1630和1631位的G和C)。
體外實驗中hpa基因產物催化硫酸乙醯肝素降解的能力通過運用杆狀病毒表達系統在昆蟲細胞中表達完整的開放閱讀框而檢測。
已證明含hpa基因的病毒感染的細胞的提取物和條件培養基對可溶性的ECM衍生HSPG和完整ECM均有高水平的硫酸乙醯肝素降解活性，此活性被肝素抑制，而被不含hpa基因的類似構建體感染的細胞或非感染細胞則無此活性。
用RT-PCR檢測hpa RNA在不同組織和細胞系中的表達模式。發現其僅在已知具類肝素酶活性的組織和細胞中表達。
使用Marathon RACE，通過PCR擴增，從人SK-hep1細胞系克隆延伸的5′序列。將SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列與從人胎盤分離的hpa cDNA序列(SEQ ID NO9)裝配起來。裝配的序列包括一個開放閱讀框，SEQ ID NO13和15，它編碼如SEQ ID NO14和15所示的592個胺基酸的多肽，計算分子量為66407道爾頓。此開放閱讀框顯示指導催化活性的類肝素酶在哺乳動物細胞表達系統中的表達。Western印跡分析中用抗類肝素酶抗體可檢測表達的類肝素酶。
運用一系列單染色體的人/CHO和人/小鼠體細胞雜合體將人類肝素酶基因定位在人染色體4上。因此新分離的類肝素酶序列能用於鑑定鋪展的染色體中含人類肝素酶基因的染色體區域。
因此，本發明提供包含編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段(單鏈或雙鏈DNA或RNA)術語「類肝素酶催化活性」或與其相當的術語「類肝素酶活性」都指對乙醯肝素或硫酸乙醯肝素蛋白多糖底物特異的哺乳動物內切糖苷酶水解活性，這種活性與通過β-消除的方法降解肝素或硫酸乙醯肝素的細菌酶(肝素酶I，II和III)的活性相反(37)。
在本發明優選的實施方案中，多核苷酸片段包括SEQ ID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869，它們編碼完整的人類肝素酶。
但本發明的範圍不僅限於人類肝素酶，因其是對編碼任何哺乳動物類肝素酶的開放閱讀框(ORF)的首次公開。運用hpa cDNA、其部分或根據其序列設計的合成寡核苷酸，本領域技術人員能夠鑑定到包括來自其它哺乳動物物種的同源序列的基因組和/或cDNA克隆。
因此本發明進一步涉及包括能與hpa cDNA，尤其是與SEQ ID NO9的核苷酸1-721雜交(嚴格或允許雜交條件下的鹼基配對，參見如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis.T.(1989)分子克隆，實驗室指南，冷泉港實驗室出版社，紐約)的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
事實上，編碼具類肝素酶活性的多肽的任何多核苷酸序列和與SEQID NO9或13至少60％同源、優選至少70％同源、更優選至少80％同源、最優選至少90％同源的任何多核苷酸序列均在本發明範圍內。
根據本發明的多核苷酸片段可包括SEQ ID NO9或13的任何部分。例如，它可包括SEQ ID NO9的核苷酸63-721，這是一個新序列。它可包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的SEQ ID NO9或13的任何區段。
當在此和以下的權利要求部分應用術語「編碼具類肝素酶催化活性的多肽」時，指的是能夠指導在例如ECM和細胞表面相關HS的降解中有催化活性[如其活性所需，也可以是在翻譯後修飾(包括但不限於蛋白水解，例如除去信號肽和蛋白原或前蛋白原序列)、甲硫氨酸修飾、糖基化、烷基化(如甲基化)、醯化等後有此活性]的多肽的合成。
在本發明優選的實施方案中，此多核苷酸片段編碼的多肽包括SEQID NO10或14中所示的胺基酸序列或其功能性部分，即具類肝素酶催化活性的部分。
編碼具類肝素酶活性的多肽的任何多核苷酸片段都在本發明範圍內。因此，該多肽可為SEQ ID NO10或14所示胺基酸序列或其功能性部分的等位變體、物種變體和/或誘導變體。
事實上，與SEQ ID NO10或14至少60％同源、優選至少70％同源、更優選至少80％同源、最優選至少90％同源的任何編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸序列，均在本發明的範圍內。
本發明還提供單鏈多核苷酸片段，此片段包括與編碼具如上述類肝素酶活性之多肽的多核苷酸鏈的至少一部分互補的多核苷酸序列。術語「互補」在此用於指鹼基配對的能力。
此單鏈多核苷酸片段可為DNA或RNA，甚至包括核苷酸類似物(例如硫代核苷酸)，它可為合成的寡核苷酸或由轉導的宿主細胞製備，它可為仍能提供特異鹼基配對的任何希望的長度(例如長8或10個核苷酸，優選更多核苷酸)，且它可包括不妨礙鹼基配對的錯配序列。
本發明進一步提供包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的載體。
載體可為任何類型。它可為感染細菌的噬菌體或感染真核細胞的病毒。它也可為質粒、噬菌粒、粘粒、杆粒或人工染色體。編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列可包括上述的任何多核苷酸片段。
本發明進一步提供包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的外源多核苷酸片段的宿主細胞。
外源多核苷酸片段可為以上描述的任何片段。宿主細胞可為任何類型。它可為原核細胞、真核細胞、細胞系或作為生物體一部分的細胞。外源多核苷酸片段可永久或瞬時存在於細胞中。換而言之，按穩定或瞬時轉染、轉化或轉導獲得的轉導細胞均在本發明範圍內。在此運用的術語「外源的」指多核苷酸片段是從外部引入細胞的。其中多核苷酸片段可以任何挎貝數單個存在，它可整合到一或多個染色體的任何部位或作為染色體外物質存在。
本發明進一步提供包括過量表達類肝素酶催化活性的細胞的類肝素酶過量表達系統。細胞可為被包括編碼具類肝素酶活性之多肽的多核苷酸序列和指導類肝素酶過量表達的合適的啟動子和增強子序列的任何適當載體瞬時或穩定轉染或轉化的宿主細胞。過量表達細胞也可以是在表達細胞的內源類肝素酶基因上遊插入啟動子和/或增強子序列(例如通過同源重組)而得到的細胞，此插入將指導從內源基因的過量表達。在以下說明書和權利要求中所用的術語「過量表達」指在其它條件相同下表達水平高於給定細胞通常具有的表達基礎水平。
本發明進一步提供包括具類肝素酶催化活性的多肽的重組蛋白。
重組蛋白可通過任何常規的蛋白純化方法純化至幾乎均質和/或與添加物混合。重組蛋白可運用以上描述的任何細胞製備。重組蛋白可以任何形式存在可為結晶形式、脫水乾粉形式或存在於溶液中。重組蛋白可用於獲得純類肝素酶，純類肝素酶又可用於產生單克隆或多克隆的抗類肝素酶抗體，並作為抗類肝素酶抑制劑或藥物篩選試驗或系統中的篩選活性組分。
本發明進一步提供包括具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的藥物組合物。
局部給藥的製劑可包括，但不限於洗液，藥膏，凝膠劑，膏狀物，栓劑，滴劑，液體，噴霧劑和粉末。常規的水性、粉狀或油基藥學載體、增稠劑及其它是必要的或所希望的。外被的保險套、斯坦特固定膜、活動的墊及其它醫療裝置也有用。事實上，本發明的範圍包括含有具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的任何醫療設備，如醫療裝置。
口服的組合物包括粉末或顆粒，水或非水介質中的懸浮液或溶液，粉袋、膠囊或片劑。增稠劑、稀釋液、調味品、分散輔助劑、乳化劑或粘合劑也可能合乎需要。
用於胃腸外給藥的製劑可包括，但不限於無菌水溶液，其中還可包含緩衝液、稀釋液和其它合適添加物。
所用劑量取決於待治療疾病的嚴重性和反應性，但通常為每天1劑或更多，療程為幾天至幾個月或者直到治療有效或病狀成功減低。本領域的普通技術人員能很容易確定最佳劑量、給藥方法和重複率。
本發明還提供鑑定鋪展的染色體上包含人類肝素酶基因的染色體區的方法。該方法包括以下方法步驟，其中第一步將鋪展的染色體(細胞間期或中期)與編碼類肝素酶的標記多核苷酸探針雜交。此標記優選螢光標記。第二步中，洗滌鋪展的染色體，從而除去過剩的未雜交探針。最後查找與雜交的標記多核苷酸探針相關的信號，其中探測到的信號指示包含人類肝素酶基因的染色體區。本領域的普通技術人員會懂得如何在合適的標記反應中運用在此公開的序列以及如何運用標記的探針在原位雜交中探測包含人類肝素酶基因的染色體區。
現參照下述實施例，這些實施例及上述說明書均以非限制方式一起闡明本發明。
實施例以下方法和實驗細節在隨後的實施例中引用。
從人肝癌細胞系和人胎盤純化類肝素酶並進行特性鑑定選擇人肝癌細胞系(SK-hep-1)作為純化人腫瘤衍生的類肝素酶的來源。基本上如授予Fuks的美國專利No.5,362,641中所描述的進行純化，所述的專利全文收入參考文獻。簡要的，懸浮培養500升5×1011細胞，類肝素酶通過應用以下步驟提純240,000倍(i)在pH6.0，NaCl梯度0.3-1.4M進行陽離子交換(CM-Sephadex)層析，(ii)在pH7.4，0.1％CHAPS存在時，NaCl梯度0.3-1.1M，進行陽離子交換(CM-Sephadex)層析；(iii)在pH7.4，0.1％CHAPS存在時，NaCl梯度0.35-1.1M，進行肝素-Sepharose層析；(iv)在pH6.0，包含0.1％CHAPS和1M NaCl的緩衝液中進行Con A-瓊脂糖凝膠層析，用0.25M α-甲基甘露糖苷洗脫；和(v)在pH7.4，0.1％CHAPS存在時，用NaCl梯度0.25-1M進行HPLC陽離子交換(Mono-S)層析。
合併活性級分，TCA沉澱，對沉澱物進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和/或胰酶消化和反相HPLC。純化蛋白的胰酶消化肽通過反向HPLC(C8柱)分離，對均質的峰進行胺基酸序列分析。
對純化的酶進行反相HPLC，並用胺基酸順序分析儀(AppliedBiosystems)進行N-末端胺基酸測序。
細胞如前述由牛眼建立牛角膜內皮細胞(BCEC)的培養物(19，38)。培養物原代維持在補充10％新生小牛血清和5％FCS的DMEM(1g葡萄糖/升)中。活躍細胞生長階段，每隔一天加bFGF(1ng/ml)(13，14)。
鋪有ECM的皿的製備將BCEC(2-50代)以2×105細胞/毫升的初始密度鋪在4孔板中，在無硫酸鹽的Fisher培養基加5％葡聚糖T-40中培養12天。在接種後第一天和第5天加入Na235SO4(25μCi/ml)，將培養物與標記物溫育，不換培養基。用含0.5％Triton X-100和20mMNH4OH的PBS溶解(5分鐘，室溫)細胞層，隨後PBS洗4次，暴露內皮下ECM。ECM保持完整，無細胞碎片，並牢固附著於組織培養皿的全部區域上(19，22)。
為製備可溶的硫酸鹽標記的蛋白多糖(峰I物質)，用胰酶消化ECM(胰酶25μg/ml，6h，37℃)，消化液通過反透析濃縮，將濃縮物質加到Sepharose 6B凝膠過濾柱上。收集得到的高分子量物質(Kav＜0.2，峰I)。結果顯示多於80％的標記物質由硫酸乙醯肝素蛋白多糖組成(11，39)。
類肝素酶活性將細胞(1×106/35mm培養皿)、細胞溶解產物或條件培養基在20mM磷酸鹽緩衝液(pH6.2)存在時於35S標記的ECM上溫育(18h，37℃)。也將細胞溶解產物和條件培養基與硫酸鹽標記的峰I物質(10-20μl)溫育。收集溫育培養基，離心(18000×g，4℃，3分鐘)，在Sepharose CL-6B柱(0.9×30cm)上凝膠過濾分析硫酸鹽標記的物質。用PBS洗脫級分(0.2ml)，流速為5ml/h，用Bio-fluor液閃計數放射性。蘭色葡聚糖表示已佔體積(Vo)，酚紅表示總內含體積(Vt)。後者與自由硫酸根共遷移(7，11，23)。HS側鏈的裂解片段在0.5＜Kav＜0.8(峰II)從Sepharose 6B洗脫(7，11，23)。在Vo後洗脫(Kav＜0.2，峰I)由胰酶從ECM釋放的近乎完整的HSPG，以及與PBS單獨溫育時較低程度釋放的HSPG。加到柱上的標記物質的回收在不同實驗中範圍從85％-95％(11)。每個實驗至少進行3次，洗脫位置(Kav值)變化不超過+/-15％。
hpa cDNA的克隆從I.M.A.G.E協會(2130 Memorial ParkwaySW，Hunstville，AL 35801)得到cDNA克隆257548和260138。cDNA最初克隆到質粒載體pT3T7D-Pac的EcoR I和Not I克隆位點。儘管這兩個克隆被報導略有區別，但DNA序列分析測定證明它們彼此相同。Marathon RACE(cDNA末端的快速擴增)人胎盤(多聚腺苷酸)cDNA複合體由Tel Aviv大學Yossi Shiloh教授贈送。此複合體不含載體，包括反轉錄的cDNA片段，所述片段的兩末端均連接了雙鏈和部分單鏈的銜接子。所用特異複合體的結構在參考文獻39a中描述。
根據Clontech實驗室提供的方法，進行hp3 PCR片段的擴增。擴增所用的模板是來自以上複合體的樣品。擴增所用的引物為第一步5′-引物AP15′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，SEQ ID NO1；3′-引物HPL2295′-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3′，SEQ ID NO2。
第二步嵌套5′-引物AP25′-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3′，SEQID NO3；嵌套3′-引物HPL1715′-GCATCTTAGCCG TCTTTC TTCG-3′，SEQ ID NO4。HPL229和HPL171是根據EST克隆的序列選擇的。它們各自包括SEQ ID NO9的核苷酸933-956和876-897。
PCR程序為94℃4分鐘，而後94℃40秒、62℃1分鐘、72℃2.5分鐘30個循環。用Expand High Fidelity(Boehringer Mannheim)進行擴增。將所得約900bp的hp3 PCR產物用Bfr I和PvuII消化。用EcoR I消化克隆257548(phpa1)，末端補平，然後Bfr I進一步消化。此後將hp3 PCR產物的PvuII-Bfr I片段克隆至phpa1克隆的平端-Bfr I端，得到完整cDNA克隆在pT3T7-pac中的載體，稱為phpa2。
DNA測序序列測定用載體特異性和基因特異性引物，使用自動DNA測序儀(Applied Biosystems 373A型)進行。每個核苷酸讀自至少兩個獨立的引物。
序列的計算機分析運用Blast網絡伺服器進行資料庫檢索分析序列相似性。對DNA和蛋白序列的序列分析和對比用Wisconsin大學Genetic Computer Group(GCG)開發的DNA序列分析軟體包完成。
RT-PCR用TRI-Reagent(Molecular research center Inc.)根據生產製造商指導製備RNA。取1.25μg RNA進行逆轉錄反應，採用MuMLV反轉錄酶(Gibco BRL)和Oligo(dT)15引物，SEQ ID NO5，(Promega)。用Taq聚合酶(Promega)進行所得第一鏈cDNA的擴增。運用以下引物HPU-3555′-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3′，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9或11中的核苷酸372-394。HPL-2295』-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3′，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或11中的核苷酸933-956。PCR程序94℃4分鐘，然後94℃40秒、62℃1分鐘、72℃1分鐘30個循環。
重組類肝素酶在昆蟲細胞中的表達將細胞、High Five和Sf21昆蟲細胞系在SF900II-SFM培養基(Gibco BRL)中作為單層培養物維持培養。
重組的杆狀病毒用Bac to Bac系統(GibcoBRL)構建包含hpa基因的重組病毒。轉移載體pFastBac用Sal I和Not I消化，並與XhoI和Not I消化的phpa2的1.7kb片段連接。所得質粒稱為pFasthpa2。重複製備命名為pFasthpa4的相同質粒，二者獨立地應用於進一步的實驗中。根據生產製造商的說明，用pFasthpa2、pFasthpa4和pFastBac產生重組杆粒。後者作為陰性對照。轉染重組杆粒DNA到Sf21昆蟲細胞中。轉染5天收穫重組病毒並用其感染T-25瓶中的3×106個High Five昆蟲細胞。感染後2-3天後收穫細胞。將4×106個細胞離心，重懸於包含20mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液、50mMNaCl的反應緩衝液中。細胞經過三個凍融循環，溶解產物保存在-80℃。條件培養基保存在4℃。
重組類肝素酶的部分純化通過肝素-Sepharose柱層析，隨後通過Superdex 75柱凝膠過濾進行重組類肝素酶的部分純化。對pFhpa4病毒感染的Sf21細胞的培養基(150ml)進行肝素-Sepharose層析。在含0.1％CHAPS和1mM DTT的10mM乙酸鈉緩衝液(pH5.0)存在時用0.35-2M NaCl梯度洗脫1ml級分。檢測每級分25μl樣品的類肝素酶活性。類肝素酶活性在0.65-1.1M NaCl範圍洗脫(級分18-26，圖10a)。對每級分中5μl進行15％SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀染色。合併從肝素-Sepharose洗脫的活性級分(圖10a)並在YM3截留膜上濃縮(X6)。將0.5ml的濃縮物質加到30ml Superdex 75 FPLC柱上，該柱用含0.8M NaCl、1mM DTT和0.1％CHAPS的10mM乙酸鈉緩衝液(pH5.0)平衡過。以流速0.75ml/分鐘收集各級分(0.56ml)。從每級分中取等分檢測類肝素酶活性，並進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀染色(圖11b)。
實施例1
hpa基因的克隆將從人肝癌細胞(SK-hep1)分離的類肝素酶的純化級分進行胰酶消化和微量測序。篩選EST(表達序列標記)資料庫以尋找相應於所獲肽的DNA序列的同源物。兩個EST序列(登記號N41349和N45367)中包含編碼肽YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)的DNA序列。這兩個序列衍生自從8-9周胎盤的cDNA文庫(Soares)製備的克隆257548和260138(I.M.A.G.E.協會)。發現兩個克隆是相同的，它們包括1020bp的一個插入片段，此插入片段包含973bp的開放閱讀框(ORF)及隨後的27bp 3′非翻譯區和聚腺苷酸尾。在這些克隆的5′末端未鑑定到翻譯起始位點(AUG)。
通過對胎盤Marathon RACE cDNA複合體的DNA進行PCR擴增，進行對缺失的5′末端的克隆。獲得900bp的片段(命定為hp3)，它與已鑑定的3′編碼EST克隆部分重疊。
連接的cDNA片段長1721bp(SEQ ID NO9)，它包括編碼543個胺基酸、計算分子量為61 192道爾頓的多肽(SEQ ID NO10)的開放閱讀框，如圖1和SEQ ID NO11所示。克隆257548和260138中包括的部分cDNA插入片段的3′末端起始於SEQ ID NO9和圖1的核苷酸G721。
如圖1中進一步顯示，在EST克隆和PCR擴增序列之間有單個序列差異，導致EST中的Tyr246替換為擴增的cDNA中的Phe246。從兩個獨立的擴增產物證實PCR擴增的cDNA片段的核苷酸序列。該新基因命名為hpa。
如上所述，EST克隆257548和260138中所含的部分cDNA插入片段的3′末端起始於hpa(SEQ ID NO9)的核苷酸721。運用計算機模擬分析hpa cDNA形成穩定二級結構、如包括在721位附近的核苷酸序列的莖和環結構的能力。研究發現，在核苷酸698-724(SEQ IDNO9)之間很可能形成穩定的莖環結構。此外，hpa基因的5′末端區具高GC含量的特點，GC含量高達70％，而在3′區，GC含量僅為約40％。這些發現可解釋EST克隆的不成熟終止及因此引起的5′末端缺失。
為檢測hpa基因產物在體外試驗中催化硫酸乙醯肝素降解的能力，用杆狀病毒表達系統在昆蟲細胞中表達完整的開放閱讀框。包含hpa基因的病毒所感染的細胞的提取物表現有高水平的硫酸乙醯肝素降解活性，而在以不含hpa基因的類似構建體感染的細胞及未感染細胞的提取物中則不含此活性。這些結果在隨後的實施例中進一步說明。
實施例2可溶的ECM衍生的HSPG的降解以包含pFasthpa質粒的重組杆狀病毒或含無插入片段的質粒的對照病毒感染High Five細胞的單層培養物(72h，28℃)。收穫細胞，在類肝素酶反應緩衝液中經過三個凍融循環使之裂解。隨後將細胞裂解物與硫酸鹽標記的ECM衍生HSPG(峰I)溫育(18h，37℃)，再對反應混和物進行凝膠過濾分析(Sepharose 6B)。
如圖2所示，底物本身包括在Vo之後洗脫的幾乎所有高分子量(Mr)物質(峰I，級分5-20，Kav＜0.35)。當HSPG底物與以對照病毒感染的細胞的裂解物溫育時，得到相似的洗脫圖。與之形成對照，HSPG底物與以包含hpa的病毒感染的細胞的裂解物溫育，導致高分子量底物完全轉換為低分子量的標記降解片段(峰II，級分22-35，0.5＜Kav＜0.75)。
在峰II洗脫的片段顯示是硫酸乙醯肝素的降解產物，因為它們(i)比用鹼性氫硼化物或木瓜蛋白酶處理而從ECM釋放的完整硫酸乙醯肝素側鏈(Kav近似0.33)小5-6倍；且(ii)抗木瓜蛋白酶或軟骨素酶ABC的進一步消化，且對亞硝酸脫氨基作用敏感(6，11)。
在Sf21細胞中獲得相似的結果(未給出)。同樣，在以含hpa的病毒(pFhpa)感染的細胞中探測到類肝素酶活性，而在以對照病毒(pF)感染的細胞中檢測不到。此結果是從兩個獨立產生的重組病毒獲得的。未感染的High Five細胞對照的裂解物無法降解HSPG底物。
在隨後的實驗中，將標記的HSPG底物與感染的High Five或Sf21細胞的條件培養基溫育。
如圖3a-b所示，由高Mr峰I底物向代表HS降解片段的低Mr峰II的轉變所反映的類肝素酶活性，發現存在於pFhpa2或pFhpa4病毒而非對照pF1或pF2病毒感染的細胞的培養基中。在對照未感染的High Five或Sf21細胞的培養基中未探測到類肝素酶活性。
將以pFhpa4病毒感染的細胞的培養基通過50kDa截留膜，從而獲得對重組類肝素酶的分子量的粗略估定。如在圖4中說明，所有的酶活性保留在上層部分，而流過(＜50kDa)物質中無活性。此結果與hpa基因產物的預期分子量一致。
為進一步表徵肝素對hpa產物的抑制作用，檢查類肝素酶介導的HS降解的強抑制劑(40)。
如圖5a-b所示，由峰I底物向峰IIHS降解片段的轉變在肝素存在時被徹底消除。
綜上所述，這些結果表明被包含新鑑定的人hpa基因的杆狀病毒感染的昆蟲細胞以活性形式表達類肝素酶。
實施例3完整ECM中HSPG的降解接著研究完整的感染昆蟲細胞降解完整、天然產生的ECM中的HS的能力。為此目的，將High Five或Sf21細胞接種在代謝性地硫酸鹽標記的ECM上，隨後用pFhpa4或對照pF2病毒感染(48h，28℃)。而後將培養基pH調到6.2-6.4，細胞在標記ECM中進一步培養48h(28℃)或24h(37℃)。對釋放到溫育培養基中的硫酸鹽標記物質進行Sepharose 6B上的凝膠過濾分析。
如圖6a-b和7a-b所示，ECM與對照pF2病毒感染的細胞溫育造成標記物質的恆定釋放，此標記物幾乎全部(＞90％)由在Vo之後或與之同洗脫的高Mr片段(峰I)組成。以前的研究顯示，存在於ECM本身和/或由細胞表達的蛋白水解活性負責高Mr物質的釋放(6)。此近乎完整的HSPG為類肝素酶進行的隨後降解提供了可溶底物，類肝素酶被肝素抑制時相對大量的峰I物質積累也說明了這一點(6，7，12，圖9)。另一方面，標記的ECM與pFhpa4病毒感染的細胞溫育導致60％-70％的ECM相關放射性以低Mr的硫酸鹽標記片段的形式(峰II，0.5＜Kav＜0.75)釋放，而不論感染細胞與ECM是在28℃還是在37℃溫育。對照完整未感染Sf21或High Five細胞無法降解ECM HS側鏈。
在隨後的實驗中，如圖8a-b所示，以pFhpa4或對照pF1病毒感染High Five細胞和Sf21細胞(96h，28℃)，將培養基與硫酸鹽標記的ECM一起溫育。僅在與pFhpa4感染細胞的條件培養基溫育時，才從ECM釋放低Mr HS降解片段。如圖9所示，肝素存在時，這些片段不再產生。在對照未感染細胞的培養基中，未檢測到類肝素酶活性。這些結果說明pFhpa4病毒感染的細胞所表達的類肝素酶，當其與天然產生的完整ECM的其它大分子成分(即纖連蛋白，層粘連層白，膠原蛋白)複合時，能以類似於報導的高度轉移腫瘤細胞或免疫系統活化細胞中的方式降解HS(6，7)。
實施例4重組類肝素酶的純化通過肝素-Sepharose層析從pFhpa4感染的Sf21細胞的培養基中部分純化重組類肝素酶(圖10a)，隨後對合併活性級分通過FPLCSuperdex 75柱凝膠過濾(圖11a)。觀察到1個63kDa蛋白，如銀染SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳所探測的，其量與有關柱級分中的類肝素酶活性相關(分別為圖10b和11b)。此蛋白在對照pF1病毒感染細胞的培養基中未探測到，將其加到肝素-Sepharose上進行相似分級分離(未示)。
實施例5各種細胞類型、器官和組織中hpa基因的表達參考圖12a-e，應用RT-PCR估計各種細胞類型和組織中hpa基因的表達。為此目的，反轉錄總RNA並擴增之。在人腎、胎盤(8和11周)和痣組織中，以及在新鮮分離的和短期(1.5-48h)培養的人胎盤細胞滋養層細胞中，清楚顯示有預期的585bp長的cDNA(圖12a)，以上細胞均已知表達高類肝素酶活性(41)。正常人嗜中性粒細胞也表達hpa轉錄物(圖12b)。與之形成對照，在胚胎人肌肉組織、胸腺、心臟和腎上腺中，無可檢測水平的hpa mRNA表達(圖12b)。部分而非所有人膀胱癌細胞系(圖12c)、SK肝癌(SK-hep-1)，卵巢癌(OV1063)、乳腺癌(435，231)、黑素瘤和巨核細胞(DAMI，CHRF)人細胞系(圖12d-e)表達hpa基因。
以上描述的hpa轉錄本的表達模式經確定與各種組織和細胞類型中測定的類肝素酶活性水平有極好相關性(未示)。
實施例6hpa同源基因篩選EST資料庫，尋找與hpa基因同源的序列。鑑定到三種小鼠EST(登記號Aa177901，源於小鼠脾，Aa067997源於小鼠皮膚，Aa47943源於小鼠胚)，將其裝配為包含629bp的部分開放閱讀框(缺失5′末端)和195bp的3′非翻譯區的824bp cDNA片段(SEQ ID NO12)。如圖13所示，編碼區與hpa cDNA序列的3′末端80％相似。這些EST很可能是編碼小鼠類肝素酶的小鼠hpa同源物的cDNA片段。
搜尋共有序列蛋白區，發現類肝素酶和幾種前體蛋白如前膠原蛋白Alpha1前體，酪氨酸蛋白激酶RYK，Fibulin-1，胰島素樣生長因子結合蛋白和幾種其它蛋白間在氨基末端有同源性。此氨基末端高度疏水並包含潛在的跨膜區。與已知信號肽序列的同源性說明它能作為信號肽為蛋白定位發揮功能。
實施例7從人SK-hep1細胞系分離hpa cDNA的延伸5′末端使用Marathon RACE(cDNA末端快速擴增)試劑盒(Clontech)，通過PCR擴增從人SK-hep1細胞系分離hpa cDNA的5′末端。按照生產製造商說明使用TRI-Reagent(Molecular research center Inc.)從SK-hep1細胞製備總RNA。使用mRNA分離試劑盒(Clonetech)分離PolyA+RNA。
按照生產製造商推薦構建Marathon RACE SK-hep1 cDNA複合體。使用銜接子特異引物AP15′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(SEQ ID NO1)，和相應於SEQ ID NO9核苷酸119-99的hpa特異性反義引物hpl-6295′-CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG-3′(SEQ IDNO17)，進行第一輪擴增。所得PCR產物進行第二循環擴增，使用銜接子特異性嵌套引物AP25′-ACTCACTATAGGGCTC GAGCGGC-3′，SEQ ID NO3，和相應於SEQ ID NO9核苷酸83-63的hpa特異性反義嵌套引物hpl-666 5′-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3′，SEQ IDNO18。PCR過程如下熱起始94℃1分鐘，隨後30個循環90℃30秒，68℃4分鐘。從瓊脂糖膠提取所獲的300bp DNA片段，將其克隆到載體pGEM-T Easy(Promega)中。獲得的重組質粒命名為pHPSK1。
確定pHPSK1插入片段的核苷酸序列，發現其包括胎盤hpa cDNA(SEQ ID NO9)5′末端的62個核苷酸和上遊的額外178個核苷酸，即SEQ ID NO13和15的頭178個核苷酸。
鑑定到SK-hep1 cDNA和胎盤cDNA之間有單個核苷酸差異。胎盤cDNA(SEQ ID NO9)第9位的「T」衍生物，在SK-hep1 cDNA(SEQID NO13)的相應第187位被「C」衍生物替換。
此差異可能是由於在胎盤cDNA克隆的5′末端有突變，通過對從胎盤分離的幾個額外cDNA克隆(它們如SK-hep1 cDNA一樣在SEQ IDNO9的第9位包括C)進行序列分析證實了這一點。
將SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列與從人胎盤分離的hpa cDNA序列(SEQ ID NO9)裝配起來。裝配後序列包括編碼如SEQ ID NO14和15中所示計算分子量為66407道爾頓的592個胺基酸的多肽的開放閱讀框。該開放閱讀框側接有93bp的5′非翻譯區(UTR)。
實施例8hpa基因的上遊基因組區的分離使用Genome Walker試劑盒(Clontech)，按照生產製造商說明分離hpa基因的上遊區。此試劑盒包括5種人基因組DNA樣品，每個樣品用不同限制性核酸內切酶消化產生平末端EcoRV，ScaI，DraI，PvuII和SspI。
將平末端DNA片端與部分單鏈的銜接子連接。使用銜接子特異性引物和基因特異性引物，對基因組DNA樣品進行PCR擴增。使用ExpandHigh Fidelity(Boehringer Mannheim)擴增。
第一循環擴增使用ap1引物5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，SEQ ID NO19，和相應於SEQ ID NO9核苷酸83-63的hpa特異性反義引物hpl-6665′-AGGCTTCG AGCGCAGCAGCAT-3′，SEQ IDNO18。PCR程序如下熱起始94℃3分鐘，然後36個循環，每循環為94℃40秒67℃4分鐘。
將第一次擴增的PCR產物按1∶50稀釋。將稀釋樣品的1μl用作第二次擴增的模板，其中使用嵌套的銜接子特異性引物ap25′-ACTATA GGGCACGCGTGGT-3′，SEQ ID NO20，和相應於SEQ ID NO9核苷酸62-42的hpa特異性反義引物hpl-690，5′-CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC-3′，SEQ ID NO21。所得的擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。從5個擴增反應獲得5種不同的PCR產物。從凝膠中提取SspI消化DNA樣品所得的約750bp的DNA片段。將純化的片段連接到質粒載體pGEM-T Easy(Promega)上。所獲的重組質粒命名為pGHP6905，確定hpa插入片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO16中給出了594個核苷酸的部分序列。SEQ ID NO16的最後一位核苷酸相應於SEQ ID NO13的核苷酸93。SEQ ID NO16中的DNA序列包括hpa cDNA的5′區和被預測為包括hpa基因啟動子區的基因組上遊區501個核苷酸。
實施例9
592個胺基酸的HPA多肽在人293細胞系中的表達通過將相當於SK-hep1 hpa cDNA 5′末端的110bp與胎盤cDNA相連，構建592個胺基酸的開放閱讀框(SEQ ID NO13和15)。更具體而言，將胎盤hpa DNA的Marathon RACE-PCR擴增產物用Sac I消化，並將近似1kb片段連接到Sac I消化的pGHP6905質粒中。所得質粒用Ear I和Aat II消化，鈍化Ear I粘性末端，分離出約280bp的Ear I/已鈍化Aat II片段。使用Klenow片段補平EcoR I消化的pFasthpa，並進一步用Aat II消化，將所得pFasthpa與上述片段連接。所獲質粒包括1827bp的插入片段，此插入片段包括1776bp的開放閱讀框，31bp的3′UTR和21bp的5′UTR。此質粒命名為pFastLhpa。
構建哺乳動物表達載體以驅動592個胺基酸的類肝素酶多肽在人細胞中表達。用BssHII和Not I從pFastLhpa切下hpa cDNA。將所得1850bp的BssHI I-Not I片段連接到Mlu I和Not I消化的哺乳動物表達載體pSI(Promega)中。將所得重組質粒pSIhpaMet2轉染到人293胚胎腎細胞系中。
592個胺基酸的類肝素酶的瞬時表達通過Western印跡分析檢測，使用凝膠移位試驗檢查酶活性。這些操作在1998年5月1日提交的美國專利申請NO.09/071,739中有詳細描述，此申請在此全文納入參考文獻。轉染後3天收穫細胞。將收穫的細胞重懸於包括150mMNaCl，50mM Tris pH7.5，1％Triton X-100，1mM PMSF和蛋白酶抑制劑混和物(Boehringer Mannheim)的裂解緩衝液中。對40μg蛋白提取物樣品進行SDS-PAGE分離。將蛋白轉到PVDF Hybond-P膜(Amersham)上。將膜與親合純化的多克隆抗類肝素酶抗體溫育(如美國專利申請號09/071,739中所述)。在轉染細胞中觀察到約50kDa的主帶及約65kDa的次帶。在pShpa轉染的細胞的提取物中觀察到相似的圖(如美國專利申請號09/071,739中所述)。這兩條帶很可能代表轉染細胞產生的重組類肝素酶蛋白的兩種形式。65kDa蛋白很可能代表類肝素酶前體，而50kDa蛋白在此推測為已加工或成熟形式。
pShpaMet2轉染細胞中表達的重組蛋白的催化活性通過凝膠移位試驗檢測。轉染細胞和模擬轉染細胞的提取物在含20mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液(pH5.4)，1mM CaCl2，1mM DTT和50mM NaCl的反應體系中於37℃與肝素(每反應6μg)溫育過夜。然後將反應混合物在10％聚丙烯醯胺凝膠上分離。與轉染細胞提取物溫育的肝素分子與對照相比快速遷移，這清楚表明了重組類肝素酶的催化活性。快速遷移說明高分子量肝素分子的消失和低分子量降解產物的產生。
實施例10hpa基因的染色體定位利用從UK HGMP Resource Center(Cambridge，England)獲得的單染色體人/CHO和人/小鼠體細胞雜合體板對hpa基因進行染色體作圖。
對40ng每種體細胞雜合體DNA樣品進行PCR擴增，使用相應於SEQ ID NO9核苷酸564-586的hpa引物hpa565 5′-AGCTCTGTAGATGTGCTATACAC-3′(SEQ ID NO22)，和相應於SEQ IDNO9核苷酸897-876的反義引物hpl 171 5′-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3′(SEQ ID NO23)。
PCR程序如下94℃3分鐘熱起始，然後7個循環94℃45秒、66℃1分鐘、68℃5分鐘，隨後30個循環94℃45秒、62℃1分鐘、68℃5分鐘、最後72℃10分鐘延伸。
反應用Expand long PCR(Boehringer Mannheim)進行。所得擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖14所述，從染色體4及對照人基因組DNA獲一條約2.8kb的帶。2.8kb的擴增產物被認為是基於對基因組hpa克隆的擴增(未示數據)。在小鼠和倉鼠的對照DNA樣品和其它人染色體的體細胞雜合體中，都未獲得擴增產物。
儘管結合具體實施方案描述了本發明，但對本領域技術人員而言，顯然還有許多變換方式、修改和變動。所以，本發明包括落入所附權利要求精神和寬範圍內的所有這些變換方式、修改和變動。
上文按數字引用的參考文獻列表1. Wight.T.N.，Kinsella，M.G.，和Qawrnstromn.E.E.(1992)，蛋白多糖在細胞粘附，遷移和增殖中的作用。Curr.Opin.Cell Biol.4,793,8012. Jackson，R.L.，Busch，S.J和Cardin，A.L.(1991)，糖胺聚糖分子特性，蛋白相互作用及在生理過程中的作用。Physiol.Rev.，71，481-539.3. Wight，T.N.(1989)動脈蛋白多糖的細胞生物學，Arteriosclerosis，9，1-204. Kjellen，L.，和Lindahl，U.(1991)蛋白多糖結構和相互作用。生物化學年度綜述(Annu.Rev.Biochem.)，60443-4755. Ruoslahti，E.，和Yamaguchi，Y.(1991)蛋白多糖作為生長因子活性的調節子。細胞(Cell)，64，867-8696. Vlodavsky，I.，Eldor，A.，Haimovitz-Friedman，A.，Matzner，Y.，Ishai-Michaeli，R.，Levi，E.，Basbkin，P.，Lider，O.，Naparstek，Y.，Cohen，I.R.，和Fuks，Z.(1992)類肝素酶通過血小板和免疫系統的循環細胞的表達在血細胞滲出和外滲中的可能參與Invasion Metastasis，12112-1277. Vlodasky，I.，Mohsen，M.，Lider，O.，Ishai-Michaeli，R.，Ekre，H.-P.，Svahn，C.M.，Vigoda，M.，和Peretz，T.(1995).類肝素酶抑制型肝素對腫瘤轉移的抑制。Invasion Metastasis，14，290-302.8. Nakajima，M.，Irimura，T.，和Nicolson，G.L.(1988).類肝素酶和腫瘤轉移，細胞與生物化學雜誌(J.Cell.Biochem.)，36157-1679. Nicolson，G.L(1988).腫瘤轉移的器官特異性在特異二級位點惡性細胞優先粘附，侵入和生長的作用，Cancer Met.Rev.7，143-188.10. Liotta，L.A.，Rao，C.N.，Barsky，S.H.(1983).腫瘤侵入和細胞外基質，Lab.Invest.，49，639-649.11. Vlodavsky，I.，Fuks，Z.，Bar-Ner，M.，Ariav，Y.，和Schirrmacher，V.(1983)。內皮下細胞外基質中淋巴瘤細胞調節的硫酸鹽蛋白多糖的降解與腫瘤細胞轉移的關係。癌症研究(CancerRes.)43，2704-2711.12. Vlodavsky，I.，Ishai-Michaeli，R.，Bor-Ner，M.，Fridman，R.，Horowitz，A.T.，Fuks，Z.和Biran，S.(1988).類肝素酶參與腫瘤轉移和血管發生，Is.J.Med.，24，464-470.13. Vlodavsky，I.，Lin，G.M.，和Gospodarowic Z.D.(1980).在各種形態的細胞外基質上維持的人腫瘤細胞的形態外觀，生長行為和遷移活性。細胞，19，607-616.14. Gospodarowicz，D.，Delgado，D.，和Vlodavsky，I.(1980).細胞外基質對體外細胞增殖的允許作用。美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，77，4094-4098.15. Bashkin，P.，Doctrow，S.，Klagsbkun，M.，Svahn，C.M.，Folkman，J.，和Vlodavsky，I.(1989)鹼性成纖維細胞生長因子與內皮下細胞外基質結合併被類肝素酶和肝素樣分子釋放。生物化學(Biochemistry)，28，1737-1743.16. Pari sh，C.R.，Coombe，D.R.，Jakobsen，K.B.，和Underwood，P.A.(1987).硫酸鹽多糖通過阻斷腫瘤細胞衍生的類肝素酶抑制腫瘤轉移的證據。Int.J.Cancer，40511-517.16a. Vlodavsky，I.，Hua-Quan Miao.，Benezra，M.，Lider，O.，Bar-Shayit，R.，Schmidt，A.，和Peretz，T.(1997).細胞外基質，硫酸乙醯肝素蛋白多糖和硫酸乙醯肝素降解酶在血管發生和轉移中的參與，《腫瘤血管發生》。C.E.Lewis，R.Bickwell N.Ferrara編.Oxford University Press.Oxford UK，pp.125-14017. Burgess，W.H.，和Maciag，T.(1989肝素結合的(成纖維細胞)生長因子蛋白家族，生物化學年度綜述，58，575-606.18. Folkman，J.，和Klagsbrun，M.(1987).血管生成因子。科學(Science)，235，442-4479. Vlodavsky，I.，Folkman，J.，Sullivan，R.，Friolman，R.，Ishai-Michaelli，R.，Sasse，J.，和Klagsburn，M.(1987).內皮細胞衍生的鹼性成纖維細胞生長因子合成並沉積到內皮下細胞外基質。美國國家科學院院報，84，2292-229620. Folkman，J.，Klagsbrun，M.，Sasse，J.，Wadzinski，M.，Ingber，D.，和Vlodavsky，I.(1980)。肝素結合的血管形成蛋白-鹼性成纖維細胞生成因子貯存在基底膜。Am.J.Pathol.，130，393-400.21. Cardon-Cardo，C.，Vlodavsky，I.，Haimovitz-Friedman，A.，Hicklin，D.，和Fuks，Z(1990).在正常人組織中鹼性成纖維細胞生長因子的表達。Lab.Invest.，63，832-840.22. Ishai-Michaeli，R.，Svahn，C.-M.，Chajek-Shaul，T.，Korner，G.，Ekre，H.-P.，和Vlodavsky，I.(1992).從血管內皮和細胞外基質釋放鹼性成纖維細胞因子過程中肝素的大小和硫酸鹽化的重要性。生物化學，31，2080-2088.23. Ishai-Michaeli，R.，Eldor，A.，和Vlodavsky，I.(1990).血小板，嗜中性粒細胞和淋巴瘤細胞表達的類肝素酶活性從細胞外基質釋放活化的成纖維細胞生長因子。Cell Reg.，1，833-842.24. Vlodavsky，I.，Bar-Shavit，R.，Ishai-Michaeli，R.，Bashkin，P.，和Fuks.Z.(1991).成纖維細胞生長因子的細胞外螯合和釋放一種調控機制？Trends Biochem.Sci.16，268-27125. Vlodavsky，I.，Bar-Shavit.R.，Korner，G.，和Fuks，Z.(1993).細胞外基質結合的生長因子，酶和血漿蛋白。《基底膜細胞和分子方面》(D.H.Rohrbach和R.Timpl編)，pp327-343.Academic Press Inc.Orlando.Fl.26. Yayon，A.，Klagsbvun，M.，Esko，J.D.Leder，P.，和Ornitz，D.M.(1991).細胞表面鹼性成纖維細胞生長因子與其高親和性受體結合需肝素樣分子。細胞64，841-848.27. Spivak-Kroizman，T.，Lemmon，M.A.，Dikic，I.，Ladbury，J.E.，Pinchasi，D.，Huang，J.，Jaye，M.，Crumley，G.，Schlessinger，J.，和Lax，I.(1994)肝素誘導的FGF分子的寡聚化是FGF受體二聚化，活化和細胞增殖的根源，細胞79，1015-1024.28. Ornitz，D.M.，Herr，A.B.，Nilsson，M.，West，a.，J.，Svahn，C.-M.，和Waksman，G.(1995).合成的類肝素衍生的二糖和三糖引起的FGF結合及FGF受體活化。科學，268，432-436.29. Gitay-Goren，H.，Soker，S.，Vlodavsky，I.，和Neufeld，G.(1992)血管內皮生長因子(VEGF)與細胞表面受體結合需要細胞表面相關的肝素樣分子。生物化學雜誌，267，6093-609830. Lider.O.，Baharav，E.，Mekori，Y.，Miller，T.，Naparstek，Y.，Vlodavsky，I.，和Cohen，I.R.(1989).T淋巴細胞類肝素酶的類肝素抑制劑處理動物造成的對實驗性自身免疫疾病的抑制和異體移植物存活期延長。臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)，83，752-75631. Lider，O.，Cahalon，L.，Gilat，D.，Hershkovitz，R.，Siegel，D.，Margalit，R.，Shoseyov，O.，和Cohn，I.R.(1995).抑制腫瘤壞死因子α的二糖由類肝素酶從細胞外基質形成。美國國家科學院院報，92，5037-504131a. Rapraeger，A.，Krufka，A.，和Olwin，B.R.(1991).bFGF介導的成纖維細胞生長和成肌細胞分化中對硫酸乙醯肝素的需求。科學，252，1705-1708.32. Eisenberg.S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.，和Vlodavsky，I.(1992)脂蛋白脂肪酶增強脂蛋白對細胞表面和細胞外基質的硫酸乙醯肝素的結合。臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)，90，2013-2021.33. Shieh，M-T.，Wundunn，D.，Montgomery，R.I.，Esko，J.D和Spear.P.G.J(1992).單純皰疹病毒的細胞表面受體是硫酸乙醯肝素蛋白多糖。細胞生物學雜誌116，1273-1283.33a. Chen，Y.，Maguire，T.，Hileman，R.E.，Fromm，J.R.，Esko，J.D.，Linhardt，R.J.，和Marks，R.M.(1997).登革熱病毒的侵染性取決於包膜蛋白與靶細胞硫酸乙醯肝素的結合。Nature Medicine3，866-87133b. Putnak，J.R.，Kanesa-Thasan，N.，和Innis，B.L.(1997).登革熱病毒推定的細胞受體。Nature Medicine 3，828-829.34. Narindrasorasak，S.，Lowery，D.，Gonzalez-DeWhitt，P.，Poorman，R.A.，Greenberg，B.，Kisilevsky，R.(1991)阿爾茨海默β-澱粉樣前體蛋白和硫酸乙醯肝素蛋白多糖的基底膜型間的高親合性相互作用。生物化學雜誌，266，12878-8335. Ross，R.(1993)動脈粥樣硬化的發病機理對二十世紀九十年代的透視。自然(Lond.).，362801-80936. Zhong-Sheng，J.，Walter，J.，Brecht，R.，Miranda，D.，Mahmood Hussain，M.，Innerarity，T.L.和Mahley，W.R.(1993)硫酸乙醯肝素蛋白多糖在載脂蛋白E豐富的殘跡脂蛋白被培養細胞結合和攝取中的作用。生物化學雜誌，268，10160-10167.37. Ernst，S.，Langer，R.，Cooney，Ch.L.，和Sasisekharan，R.(1995).糖胺聚糖的酶降解。Critical Reviews in Biochemistry andMolecular Biology，30(5)，387-44438. Gospodarowicz，D.，Mescher，AL.，Birdwell，CR.(1977).成纖維細胞和表皮生長因子體外對角膜內皮細胞增殖的刺激。Exp EyeRes 25，75-89.39. Haimovitz-Friedman，A.，Falcone，D.J.，Elder，A.，Schirrmacher，V.，Vlodavsky，I.，和Fuks，Z(1991)腫瘤細胞衍生因子造成的血小板類肝素酶的活化。血液，78，789-796.39a. Savitsky，K.，Platzer，M.，Uziel，T.，Gilad，S.，Sartiel，A.，Rosental，A.，Elroy-Stein，D.，Siloh，Y.和Rotman，G.(1997).共濟失調—毛細血管擴張非翻譯序列的結構多樣性表明ATM基表達的複雜的轉錄後調節。核酸研究25(9)，1678-1684.40. Bar-Ner，M.，Eldor，A.，Wasserman，L.，Matzuer，Y.，和Vlodavsky，I.(1987)修飾的和非抗凝肝素種對類肝素酶介導的細胞外基質硫酸乙醯肝素的降解的抑制。血液，70，551-557.41. Goshen，R.，Hochberg，A.，Korner，G.，Levi，E.，Ishai-Michaeli，R.，Elkin，M.，de Grot，N.，和Vlodavsky，I.(1996)胎盤類肝素酶的純化和鑑定及其在培養的細胞滋養層的表達。Mol.Human Reprod，2，679-684.
序列表(1)一般信息(i)申請人 Iris Pecker，Israel Vlodavsky 和 ElenaFreinstein(ii)發明名稱 編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在轉導細胞中的表達(iii)序列數 23(iv)通信地址(A)地址Mark M.Friedman c/o Robert Sheinbein(B)街 2940 Birchtree Lane(C)城市Silver Spring(D)州 Maryland(E)國家美國(F)郵政編碼20906(v) 機讀形式(A)介質類型1.44M，3.5吋軟盤(B)計算機Twinhead*Slimnote-890TX(C)作業系統MS DOS6.2版視窗3.11版(D)軟體相應視窗2.0的Word，轉化為ASCI文件(vi)當前申請信息(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請信息(A)申請號 08/922，170(B)申請日1997年9月2日(viii)律師/代理人信息(A)名字Friedmam，Mark M.
(B)登記號 33，883(C)參考/摘要號910/1(ix)電信信息(A)電話972-3-5625553(B)傳真972-3-5625554(C)電報(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度 27(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓樸結構線狀(xi)序列描述SEQ ID NO1CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度 24(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓樸結構線狀(xi)序列描述SEQ ID NO2GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO3
ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO4GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度15(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO5TTTTTTTTTT TTTTT 15(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO6TTCGATCCCA AGAAGGAATC AAC 23(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO7GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度9(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO8Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg5 9(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度1721(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO9CTAGAGCTTT CGACTCTCCG CTGCGCGGCA GCTGGCGGGG GGAGCAGCCA GGTGAGCCCA 60AGATGCTGCT GCGCTCGAAG CCTGCGCTGC CGCCGCCGCT GATGCTGCTG CTCCTGGGGC 120CGCTGGGTCC CCTCTCCCCT GGCGCCCTGC CCCGACCTGC GCAAGCACAG GACGTCGTGG 180ACCTGGACTT CTTCACCCAG GAGCCGCTGC ACCTGGTGAG CCCCTCGTTC CTGTCCGTCA 240CCATTGACGC CAACCTGGCC ACGGACCCGC GGTTCCTCAT CCTCCTGGGT TCTCCAAAGC 300TTCGTACCTT GGCCAGAGGC TTGTCTCCTG CGTACCTGAG GTTTGGTGGC ACCAAGACAG 360ACTTCCTAAT TTTCGATCCC AAGAAGGAAT CAACCTTTGA AGAGAGAAGT TACTGGCAAT 420CTCAAGTCAA CCAGGATATT TGCAAATATG GATCCATCCC TCCTGATGTG GAGGAGAAGT 480TACGGTTGGA ATGGCCCTAC CAGGAGCAAT TGCTACTCCG AGAACACTAC CAGAAAAAGT 540TCAAGAACAG CACCTACTCA AGAAGCTCTG TAGATGTGCT ATACACTTTT GCAAACTGCT 600CAGGACTGGA CTTGATCTTT GGCCTAAATG CGTTATTAAG AACAGCAGAT TTGCAGTGGA 660ACAGTTCTAA TGCTCAGTTG CTCCTGGACT ACTGCTCTTC CAAGGGGTAT AACATTTCTT 720GGGAACTAGG CAATGAACCT AACAGTTTCC TTAAGAAGGC TGATATTTTC ATCAATGGGT 780CGGAGTTAGG AGAAGATTAT ATTCAATTGC ATAAACTTCT AAGAAAGTCC ACCTTCAAAA 840ATGCAAAACT CTATGGTCCT GATGTTGGTC AGCCTCGAAG AAAGACGGCT AAGATGCTGA 900AGAGCTTCCT GAAGGCTGGT GGAGAAGTGA TTGATTCAGT TACATGGCAT CACTACTATT 960TGAATGGACG GACTGCTACC AGGGAAGATT TTCTAAACCC TGATGTATTG GACATTTTTA 1020TTTCATCTGT GCAAAAAGTT TTCCAGGTGG TTGAGAGCAC CAGGCCTGGC AAGAAGGTCT 1080GGTTAGGAGA AACAAGCTCT GCATATGGAG GCGGAGCGCC CTTGCTATCC GACACCTTTG 1140CAGCTGGCTT TATGTGGCTG GATAAATTGG GCCTGTCAGC CCGAATGGGA ATAGAAGTGG 1200TGATGAGGCA AGTATTCTTT GGAGCAGGAA ACTACCATTT AGTGGATGAA AACTTCGATC 1260CTTTACCTGA TTATTGGCTA TCTCTTCTGT TCAAGAAATT GGTGGGCACC AAGGTGTTAA 1320TGGCAAGCGT GCAAGGTTCA AAGAGAAGGA AGCTTCGAGT ATACCTTCAT TGCACAAACA 1380CTGACAATCC AAGGTATAAA GAAGGAGATT TAACTCTGTA TGCCATAAAC CTCCATAACG 1440TCACCAAGTA CTTGCGGTTA CCCTATCCTT TTTCTAACAA GCAAGTGGAT AAATACCTTC 1500TAAGACCTTT GGGACCTCAT GGATTACTTT CCAAATCTGT CCAACTCAAT GGTCTAACTC 1560TAAAGATGGT GGATGATCAA ACCTTGCCAC CTTTAATGGA AAAACCTCTC CGGCCAGGAA 1620GTTCACTGGG CTTGCCAGCT TTCTCATATA GTTTTTTTGT GATAAGAAAT GCCAAAGTTG 1680CTGCTTGCAT CTGAAAATAA AATATACTAG TCCTGACACT G 1721(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度543(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu5 10 15Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro20 25 30Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro35 40 45Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn50 55 60Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu65 70 75 80Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly85 90 95Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe100 105 110Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys115 120 125Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp130 135 140Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe145 150 155 160Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe165 170 175Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu180 185 190Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu195 200 205Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn210 215 220Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser225 230 235 240Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser245 250 255Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg260 265 270Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu275 280 285Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr290 295 300Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile305 310 315 320Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly325 330 335Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala340 345 350Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys355 360 365Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val370 375 380Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro385 390 395 400Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr405 410 415Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg420 425 430Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly435 440 445Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu450 455 460Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu465 470 475 480Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn485 490 495Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met500 505 510Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser515 520 525Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile530 535 540 543(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度1718(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO11CT AGA GCT TTC GAC 14TCT CCG CTG CGC GGC AGC TGG CGG GGG GAG CAG CCA GGT GAG CCC AAG 62ATG CTG CTG CGC TCG AAG CCT GCG CTG CCG CCG CCG CTG ATG CTG CTG 110Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu5 10 15CTC CTG GGG CCG CTG GGT CCC CTC TCC CCT GGC GCC CTG CCC CGA CCT 158Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro20 25 30GCG CAA GCA CAG GAC GTC GTG GAC CTG GAC TTC TTC ACC CAG GAG CCG 206Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro35 40 45CTG CAC CTG GTG AGC CCC TCG TTC CTG TCC GTC ACC ATT GAC GCC AAC 254Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn50 55 60CTG GCC ACG GAC CCG CGG TTC CTC ATC CTC CTG GGT TCT CCA AAG CTT 302Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu65 70 75 80CGT ACC TTG GCC AGA GGC TTG TCT CCT GCG TAC CTG AGG TTT GGT GGC 350Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly85 90 95ACC AAG ACA GAC TTC CTA ATT TTC GAT CCC AAG AAG GAA TCA ACC TTT 398Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe100 105 110GAA GAG AGA AGT TAC TGG CAA TCT CAA GTC AAC CAG GAT ATT TGC AAA 446Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys115 120 125TAT GGA TCC ATC CCT CCT GAT GTG GAG GAG AAG TTA CGG TTG GAA TGG 494Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp130 135 140CCC TAC CAG GAG CAA TTG CTA CTC CGA GAA CAC TAC CAG AAA AAG TTC 542Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe145 150 155 160AAG AAC AGC ACC TAC TCA AGA AGC TCT GTA GAT GTG CTA TAC ACT TTT 590Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe165 170 175GCA AAC TGC TCA GGA CTG GAC TTG ATC TTT GGC CTA AAT GCG TTA TTA 638Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu180 185 190AGA ACA GCA GAT TTG CAG TGG AAC AGT TCT AAT GCT CAG TTG CTC CTG 686Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu195 200 205GAC TAC TGC TCT TCC AAG GGG TAT AAC ATT TCT TGG GAA CTA GGC AAT 734Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn210 215 220GAA CCT AAC AGT TTC CTT AAG AAG GCT GAT ATT TTC ATC AAT GGG TCG 782Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser225 230 235 240CAG TTA GGA GAA GAT TAT ATT CAA TTG CAT AAA CTT CTA AGA AAG TCC 830Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser245 250 255ACC TTC AAA AAT GCA AAA CTC TAT GGT CCT GAT GTT GGT CAG CCT CGA 878Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg260 265 270AGA AAG ACG GCT AAG ATG CTG AAG AGC TTC CTG AAG GCT GGT GGA GAA 926Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu275 280 285GTG ATT GAT TCA GTT ACA TGG CAT CAC TAC TAT TTG AAT GGA CGG ACT 974Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr290 295 300GCT ACC AGG GAA GAT TTT CTA AAC CCT GAT GTA TTG GAC ATT TTT ATT 1019Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile305 310 315 320TCA TCT GTG CAA AAA GTT TTC CAG GTG GTT GAG AGC ACC AGG CCT GGC 1067Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly325 330 335AAG AAG GTC TGG TTA GGA GAA ACA AGC TCT GCA TAT GGA GGC GGA GCG 1115Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala340 345 350CCC TTG CTA TCC GAC ACC TTT GCA GCT GGC TTT ATG TGG CTG GAT AAA 1163Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys355 360 365TTG GGC CTG TCA GCC CGA ATG GGA ATA GAA GTG GTG ATG AGG CAA GTA 1211Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val370 375 380TTC TTT GGA GCA GGA AAC TAC CAT TTA GTG GAT GAA AAC TTC GAT CCT 1259Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro385 390 395 400TTA CCT GAT TAT TGG CTA TCT CTT CTG TTC AAG AAA TTG GTG GGC ACC 1307Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr405 410 415AAG GTG TTA ATG GCA AGC GTG CAA GGT TCA AAG AGA AGG AAG CTT CGA 1355Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg420 425 430GTA TAC CTT CAT TGC ACA AAC ACT GAC AAT CCA AGG TAT AAA GAA GGA 1403Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly435 440 445GAT TTA ACT CTG TAT GCC ATA AAC CTC CAT AAC GTC ACC AAG TAC TTG 1451Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu450 455 460CGG TTA CCC TAT CCT TTT TCT AAC AAG CAA GTG GAT AAA TAC CTT CTA 1499Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu465 470 475 480AGA CCT TTG GGA CCT CAT GGA TTA CTT TCC AAA TCT GTC CAA CTC AAT 1547Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn485 490 495GGT CTA ACT CTA AAG ATG GTG GAT GAT CAA ACC TTG CGA CCT TTA ATG 1595Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met500 505 510GAA AAA CCT CTC CGG CCA GGA AGT TCA CTG GGC TTG CCA GCT TTC TCA 1643Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser515 520 525TAT AGT TTT TTT GTG ATA AGA AAT GCC AAA GTT GCT GCT TGC ATC TGA 1691Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile530 535 540 543AAA TAA AAT ATA CTA GTC CTG ACA CTG 1718(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度824(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO12CTGGCAAGAA GGTCTGGTTG GGAGAGACGA GCTCAGCTTA CGGTGGCGGT GCACCCTTGC 60TGTCCAACAC CTTTGCAGCT GGCTTTATGT GGCTGGATAA ATTGGGCCTG TCAGCCCAGA 120TGGGCATAGA AGTCGTGATG AGGCAGGTGT TCTTCGGAGC AGGCAACTAC CACTTAGTGG 180ATGAAAACTT TGAGCCTTTA CCTGATTACT GGCTCTCTCT TCTGTTCAAG AAACTGGTAG 240GTCCCAGGGT GTTACTGTCA AGAGTGAAAG GCCCAGACAG GAGCAAACTC CGAGTGTATC 300TCCACTGCAC TAACGTCTAT CACCCACGAT ATCAGGAAGG AGATCTAACT CTGTATGTCC 360TGAACCTCCA TAATGTCACC AAGCACTTGA AGGTACCGCC TCCGTTGTTC AGGAAACCAG 420TGGATACGTA CCTTCTGAAG CCTTCGGGGC CGGATGGATT ACTTTCCAAA TCTGTCCAAC 480TGAACGGTCA AATTCTGAAG ATGGTGGATG AGCAGACCCT GCCAGCTTTG ACAGAAAAAC 540CTCTCCCCGC AGGAAGTGCA CTAAGCCTGC CTGCCTTTTC CTATGGTTTT TTTGTCATAA 600GAAATGCCAA AATCGCTGCT TGTATATGAA AATAAAAGGC ATACGGTACC CCTGAGACAA 660AAGCCGAGGG GGGTGTTATT CATAAAACAA AACCCTAGTT TAGGAGGCCA CCTCCTTGCC 720GAGTTCCAGA GCTTCGGGAG GGTGGGGTAC ACTTCAGTAT TACATTCAGT GTGGTGTTCT 780CTCTAAGAAG AATACTGCAG GTGGTGACAG TTAATAGCAC TGTG824(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度1899(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO13GGGAAAGCGA GCAAGGAAGT AGGAGAGAGC CGGGCAGGCG GGGCGGGGTT GGATTGGGAG 60CAGTGGGAGG GATGCAGAAG AGGAGTGGGA GGGATGGAGG GCGCAGTGGG AGGGGTGAGG 120AGGCGTAACG GGGCGGAGGA AAGGAGAAAA GGGCGCTGGG GCTCGGCGGG AGGAAGTGCT 180AGAGCTCTCG ACTCTCCGCT GCGCGGCAGC TGGCGGGGGG AGCAGCCAGG TGAGCCCAAG 240ATGCTGCTGC GCTCGAAGCC TGCGCTGCCG CCGCCGCTGA TGCTGCTGCT CCTGGGGCCG 300CTGGGTCCCC TCTCCCCTGG CGCCCTGCCC CGACCTGCGC AAGCACAGGA CGTCGTGGAC 360CTGGACTTCT TCACCCAGGA GCCGCTGCAC CTGGTGAGCC CCTCGTTCCT GTCCGTCACC 420ATTGACGCCA ACCTGGCCAC GGACCCGCGG TTCCTCATCC TCCTGGGTTC TCCAAAGCTT 480CGTACCTTGG CCAGAGGCTT GTCTCCTGCG TACCTGAGGT TTGGTGGCAC CAAGACAGAC 540TTCCTAATTT TCGATCCCAA GAAGGAATCA ACCTTTGAAG AGAGAAGTTA CTGGCAATCT 600CAAGTCAACC AGGATATTTG CAAATATGGA TCCATCCCTC CTGATGTGGA GGAGAAGTTA 660CGGTTGGAAT GGCCCTACCA GGAGCAATTG CTACTCCGAG AACACTACCA GAAAAAGTTC 720AAGAACAGCA CCTACTCAAG AAGCTCTGTA GATGTGCTAT ACACTTTTGC AAACTGCTCA 780GGACTGGACT TGATCTTTGG CCTAAATGCG TTATTAAGAA CAGCAGATTT GCAGTGGAAC 840AGTTCTAATG CTCAGTTGCT CCTGGACTAC TGCTCTTCCA AGGGGTATAA CATTTCTTGG 900GAACTAGGCA ATGAACCTAA CAGTTTCCTT AAGAAGGCTG ATATTTTCAT CAATGGGTCG 960CAGTTAGGAG AAGATTATAT TCAATTGCAT AAACTTCTAA GAAAGTCCAC CTTCAAAAAT 1020GCAAAACTCT ATGGTCCTGA TGTTGGTCAG CCTCGAAGAA AGACGGCTAA GATGCTGAAG 1080AGCTTCCTGA AGGCTGGTGG AGAAGTGATT GATTCAGTTA CATGGCATCA CTACTATTTG 1140AATGGACGGA CTGCTACCAG GGAAGATTTT CTAAACCCTG ATGTATTGGA CATTTTTATT 1200TCATCTGTGC AAAAAGTTTT CCAGGTGGTT GAGAGCACCA GGCCTGGCAA GAAGGTCTGG 1260TTAGGAGAAA CAAGCTCTGC ATATGGAGGC GGAGCGCCCT TGCTATCCGA CACCTTTGCA 1320GCTGGCTTTA TGTGGCTGGA TAAATTGGGC CTGTCAGCCC GAATGGGAAT AGAAGTGGTG 1380ATGAGGCAAG TATTCTTTGG AGCAGGAAAC TACCATTTAG TGGATGAAAA CTTCGATCCT 1440TTACCTGATT ATTGGCTATC TCTTCTGTTC AAGAAATTGG TGGGCACCAA GGTGTTAATG 1500GCAAGCGTGC AAGGTTCAAA GAGAAGGAAG CTTCGAGTAT ACCTTCATTG CACAAACACT 1560GACAATCCAA GGTATAAAGA AGGAGATTTA ACTCTGTATG CCATAAACCT CCATAACGTC 1620ACCAAGTACT TGCGGTTACC CTATCCTTTT TCTAACAAGC AAGTGGATAA ATACCTTCTA 1680AGACCTTTGG GACCTCATGG ATTACTTTCC AAATCTGTCC AACTCAATGG TCTAACTCTA 1740AAGATGGTGG ATGATCAAAC CTTGCCACCT TTAATGGAAA AACCTCTCCG GCCAGGAAGT 1800TCACTGGGCT TGCCAGCTTT CTCATATAGT TTTTTTGTGA TAAGAAATGC CAAAGTTGCT 1860GCTTGCATCT GAAAATAAAA TATACTAGTC CTGACACTG 1899(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度592(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Glu Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Arg Arg Asn Gly Ala Glu5 10 15Glu Arg Arg Lys Gly Arg Trp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg20 25 30Ala Leu Asp Ser Pro Leu Arg Gly Ser Trp Arg Gly Glu Gln Pro35 40 45Gly Glu Pro Lys Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro50 55 60Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro65 70 75Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu80 85 90Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe95 100 105Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe110 115 120Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly125 130 135Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe140 145 150Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser155 160 165Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser170 175 180Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr185 190 195Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys200 205 210Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe215 220 225Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu230 235 240Leu Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu245 250 255Leu Leu Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu260 265 270Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe275 280 285Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys290 295 300Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro305 310 315Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser320 325 330Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His335 340 345His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu350 355 360Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser ser Val Gln Lys Val365 370 375Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu380 385 390Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu Ser395 400 405Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu410 415 420Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Mer Arg Gln Val Phe Phe425 430 435Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu440 445 450Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr455 460 465Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu470 475 480Arg Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys485 490 495Glu Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr500 505 510Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp515 520 525Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Lcu Ser Lys530 535 540Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln545 550 555Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser560 565 570Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn575 580 585Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile590 592(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度1899(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO15GGG3AAA GCG AGC AAG GAA GTA GGA GAG AGC CGG GCA GGC GGG GCG GGG 48TTG GAT TGG GAG CAG TGG GAG GGA TGC AGA AGA GGA GTG GGA GGG 93ATG GAG GGC GCA GTG GGA GGG GTG AGG AGG CGT AAC GGG GCG GAG 138Met Glu Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Arg Arg Asn Gly Ala Glu5 10 15GAA AGG AGA AAA GGG CGC TGG GGC TCG GCG GGA GGA AGT GCT AGA 183Glu Arg Arg Lys Gly Arg Trp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg20 25 30GCT CTC GAC TCT CCG CTG CGC GGC AGC TGG CGG GGG GAG CAG CCA 228Ala Leu Asp Ser Pro Leu Arg Gly Ser Trp Arg Gly Glu Gln Pro35 40 45GGT GAG CCC AAG ATG CTG CTG CGC TCG AAG CCT GCG CTG CCG CCG 273Gly Glu Pro Lys Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro50 55 60CCG CTG ATG CTG CTG CTC CTG GGG CCG CTG GGT CCC CTc TCC CCT 318Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro65 70 75GGC GCC CTG CCC CGA CCT GCG CAA GCA CAG GAC GTc GTG GAC CTG 363Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu80 85 90GAC TTc TTC ACC CAG GAG CCG CTG CAC CTG GTG AGC CCC TCG TTC 408Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe95 100 105CTG TCC GTC ACC ATT GAC GCC AAC CTG GCC ACG GAC CCG CGG TTC 453Leu Ser yal Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe110 115 120CTC ATC CTC CTG GGT TCT CCA AAG CTT CGT ACC TTG GCC AGA GGC 498Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly125 130 135TTG TCT CCT GCG TAC CTG AGG TTT GGT GGC ACC AAG ACA GAC TTC 543Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe140 145 150CTA ATT TTC GAT CCC AAG AAG GAA TCA ACC TTT GAA GAG AGA AGT 588Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser155 160 165TAC TGG CAA TCT CAA GTC AAC CAG GAT ATT TGC AAA TAT GGA TCC 633Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser170 175 180ATC CCT CCT GAT GTG GAG GAG AAG TTA CGG TTG GAA TGG CCC TAC 678Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr185 190 195CAG GAG CAA TTG CTA CTC CGA GAA CAC TAC CAG AAA AAG TTC AAG 723Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys200 205 210AAC AGC ACC TAC TCA AGA AGC TCT GTA GAT GTG CTA TAC ACT TTT 768Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe215 220 225GCA AAC TGC TCA GGA CTG GAC TTG ATC TTT GGC CTA AAT GCG TTA 813Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu230 235 240TTA AGA ACA GCA GAT TTG GAG TGG AAC AGT TCT AAT GCT CAG TTG 858Leu Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu245 250 255CTC CTG GAC TAC TGC TCT TCC AAG GGG TAT AAC ATT TCT TGG GAA 903Leu Leu Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu260 265 270CTA GGC AAT GAA CCT AAC AGT TTC CTT AAG AAG GCT GAT ATT TTC 948Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe275 280 285ATC AAT GGG TCG CAG TTA GGA GAA GAT TAT ATT CAA TTG CAT AAA 993Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys290 295 300CTT CTA AGA AAG TCC ACC TTC AAA AAT GCA AAA GTC TAT GGT CCT 1038Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro305 310 315GAT GTT GGT CAG CCT CGA AGA AAG ACG GCT AAG ATG CTG AAG AGC 1083Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser320 325 330TTC CTG AAG GCT GGT GGA GAA GTG ATT GAT TCA GTT ACA TGG CAT 1128Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His335 340 345CAC TAC TAT TTG AAT GGA CGG ACT GCT ACC AGG GAA GAT TTT CTA 1173His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu350 355 360AAC CCT GAT GTA TTG GAC ATT TTT ATT TCA TCT GTG CAA AAA GTT 1218Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val Gln Lys Val365 370 375TTC CAG GTG GTT GAG AGC ACC AGG CCT GGC AAG AAG GTC TGG TTA 1263Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu380 385 390GGA GAA ACA AGC TCT GCA TAT GGA GGC GGA GCG CCC TTG CTA TCC 1308Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu Ser395 400 405GAC ACC TTT GCA GCT GGC TTT ATG TGG CTG GAT AAA TTG GGC CTG 1353Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu410 415 420TCA GCC CGA ATG GGA ATA gAA GTG GTG ATG AGG CAA GTA TTC TTT 1398Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe425 430 435GGA GCA GGA AAC TAC CAT TTA GTG GAT GAA AAC TTC GAT CCT TTA 1443Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu440 445 450CCT GAT TAT TGG CTA TCT CTT CTG TTC AAG AAA TTG GTG GGC ACC 1488Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr455 460 465AAG GTG TTA ATG GCA AGC GTG CAA GGT TCA AAG AGA AGG AAG CTT 1533Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu470 475 480CGA GTA TAC CTT CAT TGC ACA AAC ACT GAC AAT CCA AGG TAT AAA 1578Arg Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys485 490 495GAA GGA GAT TTA ACT CTG TAT GCC ATA AAC CTC CAT CAC GTC ACC 1623Glu Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr500 505 510AAG TAC TTG CGG TTA CCC TAT CCT TTT TCT AAC AAG CAA GTG GAT 1668Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp515 520 525AAA TAC CTT CTA AGA CCT TTG GGA CCT CAT GGA TTA CTT TCC AAA 1713Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys530 535 540TCT GTC CAA CTC AAT GGT CTA ACT CTA AAG ATG GTG GAT GAT CAA 1758Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln545 550 555ACC TTG CCA CCT TTA ATG GAA AAA CCT CTC CGG CCA GGA AGT TCA 1803Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly ser Ser560 565 570CTG GGC TTG CCA GCT TTC TCA TAT AGT TTT TTT GTG ATA AGA AAT 1848Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn575 580 585GCC AAA GTT GCT GCT TGC ATC TGA AAA TAA AAT ATA CTA GTC CTG 1893Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile590 592ACA CTG 1899(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度594(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO16ATTACTATAG GGCACGCGTG GTCGACGGCC CGGGCTGGTA TTGTCTTAAT GAGAAGTTGA 60TAAAGAATTT TGGGTGGTTG ATCTCTTTCC AGCTGCAGTT TAGCGTATGC TGAGGCCAGA 120TTTTTTCAGG CAAAAGTAAA ATACCTGAGA AACTGCCTGG CCAGAGGACA ATCAGATTTT 180GGCTGGCTCA AGTGACAAGC AAGTGTTTAT AAGCTAGATG GGAGAGGAAG GGATGAATAC 240TCCATTGGAG GCTTTACTCG AGGGTCAGAG GGATACCCGG CGCCATCAGA ATGGGATCTG 300GGAGTCGGAA ACGCTGGGTT CCCACGAGAG CGCGCAGAAC ACGTGCGTCA GGAAGCCTGG 360TCCGGGATGC CCAGCGCTGC TCCCCGGGCG CTCCTCCCCG GGCGCTCCTC CCCAGGCCTC 420CCGGGCGCTT GGATCCCGGC CATCTCCGCA CCCTTCAAGT GGGTGTGGGT GATTTCGTAA 480GTGAACGTGA CCGCCACCGG GGGGAAAGCG AGCAAGGAAG TAGGAGAGAG CCGGGCAGGC 540GGGGCGGGGT TGGATTGGGA GCAGTGGGAG GGATGCAGAA GAGGAGTGGG AGGG 594(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO17CCCCAGGAGC AGCAGCATCA G 21(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO18AGGCTTCGAG CGCAGCAGCA T 21(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO19GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO20ACTATAGGGC ACGCGTGGT 19(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO21CTTGGGCTCA CCTGGCTGCT C 21(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO22AGCTCTGTAG ATGTGCTATA CAC 23(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度22
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO23GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 2權利要求
1.包含編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
2.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
3.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9的核苷酸63-721。
4.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸如SEQ IDNO9或13中所示。
5.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9或13的區段，該區段編碼具所述類肝素酶催化活性的所述多肽。
6.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多肽包含如SEQ IDNO10或14中所示的胺基酸序列。
7.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區段，該區段具有所述類肝素酶催化活性。
8.權利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列選自雙鏈DNA、單鏈DNA或者RNA。
9.包含與編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸鏈至少一部分互補的多核苷酸序列的單鏈多核苷酸片段。
10.權利要求9的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9或13的至少一部分。
11.包含編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的載體。
12.權利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
13.權利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9的核苷酸63-721。
14.權利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列是SEQ ID NO9或13中所示序列。
15.權利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9或13的區段，該區段編碼具所述類肝素酶催化活性的所述多肽。
16.權利要求11的載體，其中所述多肽包含如SEQ ID NO10或14中所示的胺基酸序列。
17.權利要求11的載體，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區段，該區段具有所述類肝素酶催化活性。
18.權利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列選自雙鏈DNA、單鏈DNA或者RNA。
19.一種包含外源多核苷酸片段的宿主細胞，其中所述外源多核苷酸片段包含編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列。
20.權利要求19的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
21.權利要求19的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9的核苷酸63-721。
22.權利要求19的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列是SEQ IDNO9或13中所示序列。
23.權利要求19的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9或13的區段，該區段編碼具所述類肝素酶催化活性的所述多肽。
24.權利要求19的宿主細胞，其中所述多肽包含如SEQ ID NO10或14中所示的胺基酸序列。
25.權利要求19的宿主細胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區段，該區段具有所述類肝素酶催化活性。
26.權利要求19的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列選自雙鏈DNA、單鏈DNA或者RNA。
27.一種表達重組類肝素酶的宿主細胞。
28.包含具類肝素酶催化活性的多肽的重組蛋白。
29.權利要求28的重組蛋白，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區段。
30.包含能與SEQ ID NO9的核苷酸1-721雜交的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
31.如SEQ ID NO9或13中所示的多核苷酸序列。
32.與SEQ ID NO10或13同源的多核苷酸序列。
33.如SEQ ID NO10或14中所示的胺基酸序列。
34.與SEQ ID NO10或14同源的胺基酸序列。
35.一種包含具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的藥物組合物。
36.一種包含過量表達類肝素酶催化活性的細胞的類肝素酶過量表達系統。
37.調節肝素結合性生長因子、對肝素結合性生長因子和細胞因子的細胞應答、與血漿脂蛋白的細胞相互作用、對病毒、原生動物和細菌感染的細胞易感性或者神經變性斑分解的調節子，其中包含具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分。
38.包括含有具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的醫療裝置的醫療設備。
39.權利要求11的載體，其中所述載體是杆狀病毒載體。
40.權利要求19的宿主細胞，其中所述細胞是昆蟲細胞。
41.權利要求27的宿主細胞，其中所述細胞是昆蟲細胞。
42.鑑定鋪展的染色體中含人類肝素酶基因的染色體區的方法，包括以下步驟(a)將鋪展的染色體與編碼類肝素酶的標記多核苷酸探針雜交；(b)洗滌鋪展的染色體，從而除去過剩的未雜交探針；(c)搜尋與所述雜交的標記多核苷酸探針相關的信號，其中探測到的信號指示含人類肝素酶基因的染色體區。
全文摘要
編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸,包括該多核苷酸的載體,表達類肝素酶的轉導細胞和具類肝素酶活性的重組蛋白。
文檔編號A61M15/00GK1272886SQ98809759
公開日2000年11月8日 申請日期1998年8月31日 優先權日1997年9月2日
發明者I·佩克, I·弗羅達夫斯基, E·菲斯坦因 申請人:洞察策略與營銷有限公司, 哈達斯特醫療研究服務和開發有限公司