一種調控植物花粉育性的方法及其應用的製作方法
2023-10-04 16:54:24 1
一種調控植物花粉育性的方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於植物基因工程和植物育種【技術領域】，具體涉及一種通過將Barnase分成N端和C端兩個片段，分別利用兩個表達時期有重疊的花粉特異啟動子驅動其在植物中的表達，從而加強Barnase表達的組織特異性、克服利用Barnase基因創建植物雄性不育系時毒性洩露問題的方法。
【專利說明】一種調控植物花粉育性的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程和植物育種【技術領域】，具體涉及一種通過將Barnase分成N端和C端兩個片段，分別利用兩個表達時期有重疊的花粉特異啟動子驅動其在植物中的表達，從而加強Barnase表達的組織特異性、克服利用Barnase基因創建植物雄性不育系時毒性洩露問題的方法。【背景技術】
[0002]雜種優勢是生物界的一種普遍現象，利用雜種優勢可以顯著提高作物產量、品質和抗性。雜交育種已經成為許多作物選育新品種的主要途徑，而作物雄性不育系的選育又是雜種優勢利用中的關鍵環節。由於利用常規育種方法選育不育系存在周期長、見效慢、對環境因素影響敏感等問題而不能滿足生產發展的需要，近年來，利用基因工程創建雄性不育系被作為最具前景的育種途徑，成為當今世界範圍內研究、開發和利用的熱點。
[0003]目前利用植物基因工程創建雄性不育的策略主要是利用花粉發育的特異啟動子驅動外源基因在植物中的表達來阻斷花粉發育過程從而達到雄性不育的目的，如利用絨氈層特異啟動子驅動Barnase基因在植物中特異表達獲得基因工程核不育系或利用反義RNA技術特異關閉雄配子體發育關鍵基因獲得基因工程核不育系等。
[0004]Barnase 是解澱粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)產生的一種胞外 RNA酶，其產物以前體形式表達，在加工、運輸過程中N端被切除約20個胺基酸，成為成熟酶，共有110個胺基酸。Barnase具有強烈的毒性，它在特定細胞中的微量表達就可以造成該細胞的死亡。1990年，Mariani等將具有特異時空表達特性的菸草花葯絨氈層特異啟動子TA29，與解澱粉芽孢桿菌的Barnase基因結合，構成嵌合基因，用根癌農桿菌介導法，將上述嵌合基因導入菸草和油菜，獲得了轉基因植物(Mariani C等,Induction of male sterility inplants by a chimaeric ribonuclease gene, Nature, 1990, 347:737_741)。結果，有相當大一部分轉基因植株花葯皺縮、不散粉、自交不能結實，但雌蕊正常，可由其它植株授粉結實；組織切片未發現絨氈層，花粉囊變形，無小孢子和花粉粒。因此，他們認為，TA29-BarnaSe嵌合基因在油菜、菸草中的特異表達，選擇性破壞了花的絨氈層，從而阻止了花粉的形成，導致雄性不育。
[0005]20年來，Barnase被導入油菜、菸草、棉花、小麥、玉米、水稻等各種作物進行了雄性不育誘導的研究。在利用Barnase創建植物雄性不育系的過程中也發現了一系列的問題，如Barnase蛋白的溫度敏感性問題、驅動其表達的花粉特異啟動子的特異性不夠或上遊有CaMV35S等強啟動子而導致的毒性洩露問題等。
[0006]針對這一問題，本發明提出了一種新的雄性不育載體的構建策略，在該策略中將Barnase分成N端和C端兩個片段,並且由兩個不同的花粉特異啟動子分別啟動Barnase兩個半分子Barnase-N和Barnase-C的表達，由於半分子Barnase-N和Barnase-C單獨存在時都不具有RNA酶的活性，因此只有在兩個啟動子都具有表達活性的花粉細胞中才同時存在Barnase-N和Barnase-C兩個半分子,而這兩個半分子可以自我組裝成具有RNA酶活性的複合體，行使RNA酶的功能，從而達到植株雄性不育的目的。本發明一方面沒有用強表達的組成型啟動子(如CaMV35S啟動子)，避免了強啟動子對Barnase基因表達特異性的影響，更好的克服了 Barnase基因的毒性洩露問題，更有效的實現了 Barnase基因在創製植物雄性不育系方面的應用。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種新的創建植物雄性不育系的方法，更具體的是提供一種在雙子葉植物中創製雄性不育系的方法，所述方法包括選取兩個花粉特異表達的啟動子，更具體的是選取兩個在雙子葉植物的花粉中特異表達的啟動子，將Barnase基因分成N端和C端，由兩個啟動子分別驅動表達。通過上述方法所獲得的構建體在轉入植株後，可以使獲得的轉基因植株實現雄性不育，並且能夠有效避免Barnase毒性洩露問題，還能避免同時轉入兩個相同的啟動子所導致的基因沉默問題。
[0008]本發明所涉及的Barnase基因蛋白，是解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)產生的一種胞外RNA酶，具有很強的細胞毒性，它在細胞中的特異性表達會造成細胞的死亡，因而被廣泛應用於植物雄性不育系的創建等領域。
[0009]在本發明中，為了解決Barnase基因毒性太大以及容易洩露，易影響植物正常的生長發育的問題，本發明將Barnase蛋白分成了 N端(1_36位胺基酸)和C端(37-110位胺基酸)兩個小肽，N端包含2個α螺旋，C端包含5個β片層。由於兩個小肽都包含RNA酶活性必需的胺基酸(N端Lys27，C端Glu73和Hisl02)，所以任何一段小肽都沒有RNA酶活性，但兩者在同時轉入到一個細胞，並同時表達出蛋白後，可以重新組合成具有RNA酶活性的複合體，該重新組 裝的蛋白複合體的RNA酶活性可以達到天然蛋白的30%左右，可以導致所表達細胞的死亡。
[0010]為了使得細菌來源的Barnase基因更好的在植物中，尤其是在雙子葉植物中表達，本發明還根據Barnase的高級結構、解澱粉芽孢桿菌密碼子的偏好性、雙子葉植物密碼子的偏好性對Barnase的核苷酸序列進行改造，同時還對決定Barnase溫度敏感性的6個重要胺基酸進行了點突變(Q16I，T17R, K20R, G65S, K66A和K108R)。改造並做完點突變的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,野生型序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011]與野生型的Barnase相比,本發明所提供的突變後的Barnase序列具有在雙子葉植物中能夠更有效的表達及溫度敏感性低(即更耐受高溫)的優點，這些優點對於利用其核糖核酸酶活性在雙子葉植物中調控花粉育性及建立雄性不育系是非常重要的。
[0012]在本發明的另一方面，發明人將分別編碼Barnase的N端和C端小肽的兩個核苷酸序列置於兩個不同的花粉特異表達啟動子的驅動下，這兩個花粉特異表達啟動子都在花粉發育的後期表達，可以實現Barnase的N端和C端兩個小肽的同時空的高效的表達，從而既達到了本發明創製雄性不育系的目的，又能克服組成型表達Barnase基因所導致的對植物正常生長發育的影響及能量的浪費，還能避免某一個花粉特異啟動子在其他組織器官中的微弱活性所導致的Barnase基因的毒性洩露問題。將含有上述表達盒的表達載體轉化植物，獲得的轉基因植物中可以實現50%的花粉無活力或活力弱，從而達到目標性調控植物花粉育性的目的。
[0013]本發明依次通過下列步驟實現:[0014](1)根據Barnase的高級結構、解澱粉芽孢桿菌密碼子的偏好性、雙子葉植物密碼子的偏好性對Barnase的核苷酸序列進行改造，同時還對決定Barnase溫度敏感性的重要胺基酸進行了點突變(Q16I，T17R, K20R, G65S, K66A和K108R)。改造並做完點突變的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，將該序列交寶生物工程(大連)有限公司合成；
[0015](2 )通過PCR方法分別擴增得到編碼Barnase N端(1-36位胺基酸)和C端(37-110位胺基酸)的核苷酸片段，連接T載體並測序確認；
[0016](3)通過PCR方法分別擴增得到兩個花粉發育晚期特異表達的啟動子PAt03g04360和PAt2g38500，連接T載體並測序確認；
[0017](4)構建植物表達載體:將編碼Barnase N端(1-36位胺基酸)和C端(37-110位胺基酸)的核苷酸片段分別置於兩個花粉發育晚期特異表達的啟動子PAt03g04360和PAt2g38500的驅動下；
[0018](5)轉化植物，具體地，優選轉化擬南芥和油菜；
[0019](6)將獲得的TO代轉基因擬南芥的花粉進行Alexander溶液染色分析。染成深藍色的為可育花粉，淺藍色的為敗育花粉。結果表明有50%花粉活力弱或無活力，從而達到目標性調控植物花粉育性的目的。
[0020]本發明所述的「啟動子」是一段位於結構基因5』端上遊區的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結合併具有轉錄起始的特異性。
[0021]本發明所述的「核苷酸序列」是核酸(DNA和RNA)中核苷酸的排列順序。許多情況下，核苷酸序列決定核酸的高級結構和生物功能，即不同序列有不同的高級結構和不同的生物功能。
[0022]本發明所述的「花粉發育晚期特異表達啟動子」是指該啟動子可以驅動目的基因在植物花粉發育晚期的花粉粒中特異表達而在植物的其它器官不表達的啟動子。
[0023]本發明所述的「植物表達載體」是指現有技術中已知的、能夠在植物細胞中恆定表達外源基因的任何一種載體，如pCAMBIA1300，pBI121等。
[0024]本發明所述的「轉化」是指現有技術中已知的、能夠將外源基因導入植物細胞或植物組織的任何一種植物轉化方法，如農桿菌介導法和基因槍等
[0025]本發明所述的「轉基因植物」是指通過基因轉移技術獲得的整合有外源基因的植物個體。通常轉化植物或轉基因植物基因組中穩定帶有外源基因的核苷酸序列，可將該外源核苷酸序列穩定地遺傳給下一代。
[0026]本發明與現有的利用Barnase創建雄性不育系的技術相比，其優勢在於只有在兩個花粉特異啟動子同時具有表達活性的細胞中，無活性的Barnase N端和C端小肽才能夠同時存在並組裝成有活性的複合體，從而有效避免了花粉特異啟動子特異性不夠時導致的雄性不育植物其他組織器官發育異常、重要農藝性狀受到影響的問題，對植物基因工程雄性不育系的創建和雜種優勢的利用都具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1是表達載體pBnSK的T-DNA區圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；NapinP表示油菜Napin基因的啟動子；RFP來自礁珊瑚的RFP基因編碼區；PAt03g04360表示擬南芥At03g04360基因的啟動子；BarW-C表示改造後的Barnase基因的C端核苷酸片段；Trbcs表示擬南芥rbcs基因的終止子；PAt2g38500表示擬南芥At2g38500基因的啟動子；BarW-N表示改造後的Barnase基因的N端核苷酸片段；Tnos表示胭脂鹼合成酶(nos)基因的終止子；Pvu II、Pst1、Bgl II、BamH1、Sma1、Kpn1、Sac1、EcoRI 和 BstPI 分別表不限制性內切酶的酶切位點。
[0028]圖2是pBnSK轉基因擬南芥和非轉基因對照植株的形態。
[0029]圖3是pBnSK轉基因擬南芥的花粉染色觀察。
[0030]圖4是pBnSK轉基因擬南芥種子的螢光觀察。A為未轉基因的擬南芥種子；B為轉基因擬南芥(7號)的種子。
【具體實施方式】
[0031]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物均由上海英駿生物技術公司合成,測序由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成，PCR試劑盒、載體構建過程中的核酸內切酶購自寶生物工程有限公司，PMD18-T連接試劑盒和T4購自寶生物工程(大連)有限公司，方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體P1300由本實驗室改造所得，基本骨架來自於CAMBIA公司的pCAMBIA1300。
[0032]實施例1.合成BarnaseW核苷酸片段
[0033]根據Barnase的高級結構、解澱粉芽孢桿菌密碼子的偏好性、雙子葉植物密碼子的偏好性對Barnase的核苷酸序列進行改造，同時還對決定Barnase溫度敏感性的重要胺基酸進行了點突變(Q16I，T17R, K20R, G65S, K66A和K108R)。改造並做完點突變的核苷酸序列如SEQ ID NO:1，命名為BarnaseW，將該序列由寶生物工程(大連)有限公司合成獲得。
[0034]實施例2.植物表達載體pBnSK的構建
[0035]設計用於擴增Pat2g38500的特異性引物:
[0036]引物1:5，-gCCCTCgAgACgATTTgTCCTggTTCAgTgCA-3，(SEQ ID NO:9)
[0037]引物2:5，-CCgagatctCATTggAgAgAgCg-3，(SEQ ID NO: 10)
[0038]以擬南芥的基因組DNA為模板，用上述引物擴增pAt2g38500，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PMD18-T，篩選陽性克隆並進行測序驗證，結果表明:所擴增序列是預期的PAt2g38500啟動子序列，如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0039]設計用於擴增BarW-N的特異性引物:
[0040]引物3:5，-CCGagatctATGGCTCAAGTG-3，(SEQ ID NO: 11)
[0041]引物4:5，-gatggtgaccttaCCATCCAAGAGCCTGAGCC-3』 (SEQ ID NO: 12)
[0042]以人工合成的BarnaseW基因為模板，用上述引物擴增BarW_N，PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PMD18-T，篩選陽性克隆並進行測序驗證，結果表明:所擴增序列是預期的BarW-N序列，如序列表中SEQ ID NO: 4所示。
[0043]設計用於擴增Tnos的特異性引物:
[0044]引物5:5，-tctggtgaccgCGTTCAAACATTTGGC-3，(SEQ ID NO: 13)
[0045]引物6:5，-CAcggtaccCCCgATCTAgTAAC-3，(SEQ ID NO: 14)
[0046]以質粒pBnSI為模板，用上述引物擴增Tnos，PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PMD18-T，篩選陽性克隆並進行測序驗證，結果表明:所擴增序列是預期的Tnos序列，如序列表中SEQ ID N0:5所示。[0047]設計用於擴增PAt3g04360的特異性引物:
[0048]引物7:5，-AATggtaccTgAgACCgTgTTCCggggT-3，(SEQ ID NO: 15)
[0049]引物8:5，-CCgAgctcATCATATTTTTTTTgTgTgg-3』 (SEQ ID NO: 16)
[0050]以擬南芥的基因組DNA為模板，用上述引物擴增PAt3g04360，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PMD18-T，篩選陽性克隆並進行測序驗證，結果表明:所擴增序列是預期的PAt3g04360啟動子序列，如序列表中SEQ ID N0:6所示。
[0051 ] 設計用於擴增BarW-C的特異性引物:
[0052]引物9:5，-tggagctcgactcgagatggttgcttctaagggaaacctc-3，(SEQ ID NO: 17)
[0053]引物10:5，-gatccatggttaCCATCCAAGAGCCTGAGCC-3』 (SEQ ID NO: 18)
[0054]以人工合成的BarnaseW基因為模板，用上述引物擴增BarW_C，PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PMD18-T，篩選陽性克隆並進行測序驗證，結果表明:所擴增序列是預期的BarW-C序列，如序列表中SEQ ID NO: 7示。
[0055]設計用於擴增Trbcs的特異性引物:
[0056]引物11:5，-CCgCCATggAgCTTTCgTTCgTATCATCg-3，(SEQ ID NO: 19)
[0057]引物12:5 ，-AgTcagctggATTgATgCATgTTgTCA-3』 (SEQ ID NO:20)
[0058]以質粒pBnSI為模板，用上述引物擴增Trbcs，PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PMD18-T，篩選陽性克隆並進行測序驗證，結果表明:所擴增序列是預期的Trbcs序列，如序列表中SEQ ID N0:8所示。
[0059]弓丨物I中序列ctcaga是XhoI的酶切位點，引物2和3中序列agatct是Bgl II的酶切位點，引物4和5中序列ggtgacc是Bstp I的酶切位點，引物6和7中序列ggtacc是KpnI的酶切位點，引物8和9中序列gagctc是SacI的酶切位點，引物10和11中序列ccatgg是NcoI的酶切位點，引物12中序列cagctg是Pvu II的酶切位點。
[0060]將上述測序驗證分別連有PAt38500、Barff-N, Tnos、PAt3g04360、Barff-C 和 Trbcs片段的PMD18-T載體，分別根據引物兩側所帶的酶切位點進行雙酶切，得到序列正確、兩端帶有相應酶切位點的上述片段。在PCAMBIA1300載體中依次連入上述片段，最終得到植物表達載體pBnSK,如圖1所示。
[0061]實施例3.農桿菌介導的擬南芥的遺傳轉化
[0062]利用電激法將植物表達載體pBnSK轉入農桿菌EHA105菌株。
[0063]用農桿菌蘸花法侵染擬南芥，暗中共培養2-3天，然後正常培養至收穫種子。在螢光顯微鏡下挑選帶紅色螢光標記的種子，並進行分子檢測以獲得轉PBnSK的擬南芥植株。
[0064]實施例4:轉基因擬南芥植株的花粉育性檢測
[0065]對通過實施例3所述方法獲得的轉基因擬南芥植株材料進行分析發現，轉基因植株和野生型對照植株之間沒有明顯的形態差異(圖2)，但轉基因植株的花粉育性與野生型相比明顯不同，這表明通過本發明所述方法獲得的PBnSK轉基因植株除花粉育性表型改變外，沒有造成任何其他組織器官的表型變異。
[0066]對上述轉pBnSK的擬南芥植株進行花粉可染率檢測，同時以野生型擬南芥的花粉作為對照。
[0067]採用的方法為:在擬南芥開花期，從轉基因擬南芥植株及其野生型對照植株各隨機抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個花葯，置於載玻片中央，滴加一滴1%的Alexander溶液(95%乙醇1OmL, 1%孔雀石綠5mL，5g苯酚，1%的酸性品紅5mL，1%的橘紅G0.5mL,冰醋酸2mL，丙三醇25mL，蒸餾水50mL)，用鑷子和解剖針釋放花粉後，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，計數可染色花粉數和花粉總數，染成深藍色的為可育花粉，淺藍色的為敗育花粉(圖3顯示了染色後的可育花粉粒和不可育花粉粒)。
[0068]分析轉基因擬南芥植株的花粉可染率，結果顯示對照野生型植株的深藍色花粉佔98.6%~100% ;而多個隨機抽取的轉基因植株中，5號、7號、14號以及26號植株正常可育花粉(深藍色)與敗育花粉(淺藍色)比例非常接近1:1，表明所構建的載體的轉基因植株可以產生等量的攜帶外源細胞毒性基因的花粉和不攜帶外源細胞毒性基因的花粉，即構建體PBnSK使轉基因株系花粉的50%失活。其中一個株系的花粉可染率實驗結果如圖3所示，該結果表明本發明所提供的載體作為整體表達在擬南芥中可以達到預期的花粉失活功能，且沒有造成轉基因植株其他組織器官的表型變異，證明barnase基因作為細胞毒性基因在花粉中發揮了預期的功能。
[0069]實施例5:轉基因擬南芥植株的螢光種子與非螢光種子分離比分析
[0070]將轉化pBnSK載體得到的轉基因擬南芥植株收穫種子後對其所結Tl代種子進行螢光與非螢光種子的分離比例調查，結果表明5號、7號、14號以及26號株系的種子均顯示出1:1的分離比，其中一個株系種子的紅色螢光分離比分析結果如圖4所示，說明本發明所提供的構建體PBnSK可以實現調控花粉育性的功能。
【權利要求】
1.一種表達盒，其特徵是含有兩個不同的花粉特異表達啟動子，每個啟動子分別與Barnase基因的N端或C端相連。
2.權利要求1所述的表達盒，其中所述的花粉特異表達啟動子的核苷酸序列分別如SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:6 所示。
3.權利要求1或2所述的表達盒，其中所述的Barnase基因的N端序列如SEQID NO:4所示，C端序列如SEQ ID N0:7所示。
4.一種DNA序列，具有在雙子葉植物中的表達偏好性，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.權利要求4所述的DNA序列，其中所述的雙子葉植物是擬南芥和油菜。
6.—種表達盒,具有權利要求4或5之任一所述的DNA序列。
7.—種調控植物花粉育性的的方法，其包括: (O構建權利要求1-3之任一所述的表達盒； (2)將步驟(1)獲得的表達盒導入植物細胞； (3)再生出轉基因植物； 其特徵在於所述轉基因植物為雄性不育。
8.權利要求7所述的方法，其中所述的表達盒包括權利要求4或5所述的DNA序列。
9.權利要求7或8所述的方法，其中所述的植物為雙子葉植物。
10.權利要求9所述的方法，其中所述的雙子葉植物為擬南芥或油菜。
【文檔編號】A01H5/00GK103740742SQ201310351540
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】劉東風, 常振儀, 盧啟清, 唐曉豔, 鄧興旺 申請人:深圳市作物分子設計育種研究院, 深圳興旺生物種業有限公司, 未名興旺系統作物設計前沿實驗室（北京）有限公司, 興旺投資有限公司