通過clec-6激活人抗原呈遞細胞的製作方法
2023-09-16 09:21:35 2
專利名稱：通過clec-6激活人抗原呈遞細胞的製作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及抗原呈遞和免疫細胞激活領域，具體地，涉及通 過CLEC-6 C型凝集素激活免疫細胞。
背景技術：
不限制本發明的範圍，描述與樹突細胞相關的發明背景。 樹突細胞通過提供可溶性細胞間信號繼而病原菌識別而在控制先天性 和獲得性免疫的界面中起著關鍵作用。樹突細胞的這些功能主要依賴於特定 的表面受體，"模式識別受體(PRR)"，最為典型的例子是toll樣受體(TLR)和 C型凝集素或凝集素樣受體(LLR)(l-3)。在目前的模式中，TLR的主要作用 是提醒DC以產生白細胞介素12 (IL-12)和其它炎症細胞因子以起始免疫應 答。C-型LLR作為巨噬細胞和DC中強大的抗原捕獲和攝取機制的組成部分 發揮作用(l)。然而，與TLR相比，LLR可能具有更寬泛的生物功能，包括 細胞遷移(4)、細胞間相互作用(5)。 LLR的這些多重功能可以是由於不同於 TLR, LLR能夠識別自身和非自身的事實。然而，LLR的複雜性，包括免疫 細胞中表達的眾多LLR的冗餘性，是對各個LLR的詳細功能理解的主要障 礙之一。此外，大多數這些受體的天然配體仍然沒有被鑑定出來。雖然如此， 最近研究的證據表明LLR與TLR協同在微生物感染過程中可以對激活免疫 細胞起作用(6-14)。
發明概述
本發明包括利用抗人CLEC-6單克隆抗體(mAb)以及鑑定它們的生物功 能的組合物和方法，其中這些生物功能是預期的抗CLEC-6 mAb及其替代物 的治療應用的基礎。本發明包括接觸抗原呈遞細胞，例如樹突細胞(DC),所 述細胞表達CLEC-6並在與特定的DC激活相關的攝取抗原而導致改變的體 液和細胞免疫應答中發揮作用。本發明的發明人開發並鑑定了特異的能夠激 活具有CLEC-6的細胞的試劑(agent),以及在接受這些信號的細胞中導致的 變化對免疫系統中其它細胞的影響。這些影響(單獨，或者與其它信號協同(即共激活))高度預測對特定疾病狀態的治療效果或者在接種免疫中增強的保 護性效果。
發現作為LLR成員之一 的CLEC-6單獨或與其它細胞信號協作在激活細 胞(包括DC)方面發揮功能。CLEC-6介導的細胞激活受抗CLEC-6 mAb的誘 導，因而抗人CLEC-6 mAb或其替代物在開發針對疾病的試劑中是有用的。
本發明包括用於增加表達CLEC-6的抗原呈遞細胞的抗原呈遞效力的組
進行，其中抗原呈遞細胞被激活。所述抗原^it細胞可以是分離的樹突細胞: 外周血單核細胞、單核細胞、髓樣樹突細胞及它們的組合。在一個具體實施 方案中，抗原呈遞細胞是已在體外與GM-CSF和IL-4、幹擾素a、抗原及其 組合一起培養的分離的樹突細胞、外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、髓 樣樹突細胞及這些細胞的組合。所述方法還可包括用GM-CSF和IL-4激活 抗原呈遞細胞的步驟，其中與CLEC-6特異性抗體或其片段的接觸增加抗原 呈遞細胞上的CD86和HLA-DR的表面表達。
發現可以使用本發明用CLEC-6特異性抗體或片段激活抗原呈遞細胞， 以增加抗原呈遞細月包上的CD86、 CD80和HLA-DR的表面表達。如果抗原 呈遞細胞是樹突細胞(CD)，用CLEC-6特異性抗體和GM-CSF和IL-4激活 的DC具有圖4的基因表達譜。用CLEC-6特異性抗體激活的抗原呈遞細胞 分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、 TNFa及其組合，而如果APC是樹突細 胞，則它們分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、 TNFa、 IL-12p40、 IL-la、 IL-lb及其組合。當激活已與GM-CSF和IL-4或幹擾素a接觸的樹突細胞時， CLEC-6特異性抗體或其片段以及CD40配體進一步增強對樹突細胞的激活。 當與GM-CSF和IL-4或幹擾素a以及CLEC-6特異性抗體或其片段4妻觸時， DC增加其共刺激活性。
在另一個實施方案中，可以使用本發明的方法通過經TLR9受體和 CLEC-6凝集素共激活抗原呈遞細胞來激活抗原呈遞細胞，其中所述細胞增 加細胞因子和趨化因子的產生，甚至觸發B細胞增殖。還發現在B細胞存 在下，用CLEC-6和LOX-l共激活抗原呈遞細胞，誘導B細胞免疫球蛋白 類別轉換。TLR9受體可被TLR9配體、抗TLR9抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6雜交抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6配體結合物所激活。 CLEC-6特異性抗體或其片段的例子可選自克隆12H7、 12E3、 9D5、 20H8 及它們的組合。用CLEC-6特異性抗體或其片段通過CLEC-6-受體激活的樹 突細胞也激活單核細胞、樹突細胞、外周血單核細胞、B細胞及它們的組合。
本發明的再一個實施方案包括與粘附蛋白(Cohesin) /錨定蛋白 (Dockerin)對的一半(half)結合的CLEC-6特異性抗體或其片段。CLEC-6特異性抗體或其片段可以與粘附蛋白/錨定蛋白對的一半結合，而互補性一半
(complementaryhalf)可以與抗原結合。抗原可以是分子、肽、蛋白質、核酸、 碳水化合物、脂質、細胞、病毒或其部分、細菌或其部分、真菌或其部分、 寄生蟲或其部分。在另一個實施方案中，CLEC-6特異性抗體或其片段與粘 附蛋白/錨定蛋白對的一半結合，而該對的另一半與一種或多種細胞因子結 合，所述細胞因子選自白細胞介素，轉化生長因子(TGF),成纖維細胞生長 因子(FGF)，血小板衍生生長因子(PDGF),表皮生長因子(EGF)，結締組織活 性肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生 物，B/T細胞分化因子，B/T細胞生長因子，促有絲分裂細胞因子，趨化細 胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a， IFN-卩，IFN-y， IL1, IL2, 113, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8,工9, IL10, ELll， IL12, IL13, IL14, IL15， IL16, IL17, IL18等，瘦素(leptin),肌肉生長抑制素(myostatin)， 巨噬細胞刺激蛋白，血小板衍生生長因子，TNF-a， TNF-(3, NGF, CD40L， CD137L/4畫1BBL，人淋巴毒素-卩，G-CSF， M陽CSF, GM隱CSF， PDGF， IL-la， ILl-卩，IP-10, PF4, GRO, 9E3，促紅細月包生成素，內皮抑素(endostatin)， 血管抑素(angiostatin), VEGF,包括卩轉化生長因子(例如TGF-(31、 TGF-卩2、 TGF-p3)在內的轉化生長因子(TGF)超基因家族；骨形態發生蛋白(例如 BMP-1、 BMP隱2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP隱7、 BMP-8、 BMP-9); 肝素結合生長因子(成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小 板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、 抑制素B);生長分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例如活化素A、活化 素B、活化素AB)。
本發明還包括用於將髓樣樹突細胞與漿細胞樣樹突細胞分開的方法，該 方法通過利用CLEC-6表達將表達CLEC-6的髓樣樹突細胞、B細胞或單核 細胞與不表達CLEC-6的漿細胞樣樹突細胞分離來進行。
本發明包括表達CLEC-6特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述 CLEC-6特異性抗體或其片^:激活抗原呈遞細胞表達新的表面標記物、分泌 一種或多種細胞因子或者既表達新的表面標記物又分泌一種或多種細胞因 子，所述雜交瘤例如克隆12H7、 12E3、 9D5、 20H8及其組合。抗CLEC-6 雜交瘤產生的抗體可用於增強B細胞免疫應答的方法中，通過觸發B細胞 上的CLEC-6受體以增加抗體的產生、分泌細胞因子、增加B細胞激活表面 標記物的表達及其組合。B細胞分泌IL-8、 MIP-la及其組合，和/或增加 IgM、 IgG和IgA的產生。
本發明還包括用於增強T細胞活化的方法，通過用CLEC-6特異性抗體 或其片段觸發樹突細胞上的CLEC-6受體並使T細胞與CLEC-6活化的樹突
9細胞接觸來進行，其中T細胞的活化被增強。所述T細胞可以是原初CD8 十T糹田胞，而所述樹突細胞可以與GM-CSF和IL-4、幹擾素a、抗原及其組 合相接觸。發現由CLEC-6活化的DC激活的T細胞增強T細胞分泌的IL-IO、 IL-15,和4-1BBL的表面表達，及其組合。T細胞在暴露於用抗CLEC-6特 異性抗體或其片段激活的樹突細胞時也增殖。
本發明還包括由哺乳動物細胞分泌的抗CLEC-6免疫球蛋白或其部分和 與免疫球蛋白結合的抗原。所述抗CLEC-6抗原特異性結構域可以是全長抗 體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、以及Fv片,炎、 以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段。所述抗CLEC-6抗體 還可用於製備疫苗，所述疫苗包含用CLEC-6特異性抗體或其片段活化的樹 突細胞。
本發明還包括單獨或與共激活劑 一 起結合(engage)免疫細胞上的 CLEC-6受體，組合活化抗原呈遞細胞的試劑用於治療性目的的應用；免疫 細胞上的CLEC-6結合劑用於製備疫苗的應用，該CLEC-6結合劑與或不與 激活劑一起與一種或多種抗原連^^;抗CLEC-6劑作為免疫細胞的共激活劑 用於增強通過免疫細胞上表達的除CLEC-6外的細胞表面受體引起的免疫應 答的用途；能夠通過CLEC-6受體結合併活化免疫細胞的抗CLEC-6抗體V 區序列的用途；和/或與一種或多種毒性劑連接的DC-CLEC-6結合劑用於 在已知或懷疑由經CLEC-6的免疫細胞的不適當激活導致的疾病的情況下或 在表達CLEC-6的病理(pathogenic)細胞或組織的情況下的治療性目的的用 途。
另外一個實施方案包括模塊式rAb載體，其包含CLEC-6特異性抗體結 合結構域，該結合結構域與一個或多個含有粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一 半的抗原載體結構域連接。所述抗原特異性結合結構域可包含抗體的至少一 部分和/或與粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一半構成融合蛋白的抗體的至少 一部分。在一個實施方案中，所述rAb還可包含與抗原結合的粘附蛋白-錨 定蛋白結合對的互補性一半，其中所述抗原與模塊式rAb載體形成複合物， 或者與抗原構成融合蛋白的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半。rAb的 抗原特異性結構域可以是全長抗體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab，片 段、F(ab)2片段、以及Fv片段、以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的 Fab片段。
附圖簡述
為了更完全的理解本發明的特徵和優點，現參考發明詳細以及附圖進行 說明，在附圖中
圖1A和1B顯示體內和體外培養的DC表達CLEC-6。圖1A顯示來自 正常供體的PBMC用抗CDllc、 CD14、 CD19和CD3以及抗CLEC mAb進 行染色。對各個抗體染色的細胞作門以檢測CLEC-6的表達水平。圖1B顯 示來自正常供體的單核細胞在GM-CSF存在下用IL-4 (IL-4DC)或IFNa (IFNDC)培養，並用抗CLEC-6 mAb或同型對照抗體染色。C.髓樣DC (Lin-HLA-DR+CDllc+CD123-)是用FACS分選儀從血中純化得到，並用抗 CLEC-6 mAb染色。空的和實的柱狀圖代表分別用同型對照和抗CLEC-6 mAb染色的細胞。
圖2顯示抗CLEC-6 mAb活化DC。 IFNDC (lxl5/200ul/孑L)在用不同 mAb克隆包被的培養板中培養18小時。用Luminex分析培養物上清液以測 量細胞因子和趨化因子。
圖3A和3B顯示抗CLEC-6 mAb活化DC。圖3A顯示IL-4DC (lx105/ 孔/200 ul)用抗CLEC-6刺激18小時，然後細胞用抗CD86和HLA-DR染色。 圖3B顯示用FACS分選儀從血中純化得到的髓樣DC。 mDC (lxl05"U200 ul) 用抗CLEC-6刺激18小時，然後細胞用抗CD86、 CD80和HLA-DR染色。
圖4顯示用抗CLEC-6或對照mAb刺激12小時的IL-4DC的基因表達 譜。用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA，並用2100 Bioanalyser (Agilent)進行 分#斤。用Illuminatotalprep labeling試劑盒(Ambion)製備生物素標記的cRNA 靶標，並與Sentrix Human6 BeadChips (46K轉錄本)雜交。這些孩i陣列由附 著在裝於矽片表面上蝕刻的微孔內的50mer寡聚核苷酸探針組成。用鏈黴抗 生物素-Cy3染色後，微陣列表面用Illumina製造的亞微米分辨掃描儀成像 (Beadstation 500X)。數據分析採用基因表達分析軟體程序-GeneSpring， Version 7.1 (Agilent)進4亍。
圖5A和5B顯示用抗CLEC-6激活的DC產生的細胞因子和趨化因子的 量增加。如圖1圖注所述的體外培養的IL-4DC和純化的mDC(lxl05/200ul) 在用抗CLEC-6 mAb (2 ug/孔)包被的培養板中培養18小時。用Luminex分 析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。
圖6A和6B顯示CLEC-6和CD40協同激活DC。 IL-4DC (2xl05/200 u1/ 孔)在可溶性CD40L (20 ng/ml)存在或不存在下在抗CLEC-6包被的96孔板 中培養18小時。對照mAb也進行測試。18小時後，用抗CD83染色細胞， 並用Luminex分析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。
圖7A至7C顯示DC上表達的CLEC-6導致增強的體液免疫應答。6天 的GM/IL-4 DC (5xl3/孔)在用抗CLEC-6或對照mAb包被的96孔板中培養 16-18小時，然後與用CFSE染色的lx105自體同源的CD19+B細胞在20單 位/ml IL-2和50 nM CpG存在下共培養。圖7A:第6天細胞用螢光標記抗
ii體染色。CD3+和7-AAD+細胞被作門去除(gated out)。 CD38+和CFSE-細胞用FACS分選儀純化，並進行吉姆薩染色。圖7B顯示對第13天的培養物上清液進行ELISA，以分析總IgM、 IgG和IgA。圖7C顯示在mAb包被的培養板中培養48小時的6天GM/IL-4 DC，並通過細胞內染色測定APRIL的表達水平。虛線是用對照的抗體染色的細胞。細線和粗線代表分別在用抗CLEC-6和對照mAb包被的培養板中培養的細胞。數據代表採用每次來自三個不同的正常供體的細胞所進行的兩次單獨實驗。
圖8A和8B顯示B細胞上表達的CLEC-6導致B細胞的活化和免疫球蛋白的產生。圖8A顯示CD19+ B細胞(2xl5/孔/200 ul)在mAb包被的培養板中培養16-18小時，然後用Luminex分析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。圖8B顯示lx105 CD19+ B細胞在用mAb包被的培養板中培養13天。用ELISA測量總Ig水平。數據代表採用來自三個不同的正常供體的細胞所進行的兩次單獨實驗。
圖9A至9E顯示DC上表達的CLEC-6導致增強的抗原特異性T細胞應答。圖9A顯示5xl03的6天IFNDC在用抗CLEC-6或對照mAb包被的培養板中培養16-18小時，然後與純化的同種異源T細胞進行共培養。在收集前用3[H]-胸腺嘧啶脫氧核香，1 uCi/孔進行脈沖細胞18小時。"H]-胸腺嘧啶脫氧核苷的攝取用(3計數器進行測量。圖9B顯示IL-4DC (5xl0V孔)在100nM Flu Ml肽(HLA-A2表位)(上部兩個圖形)或重組Flu Ml蛋白(下部兩個圖形)存在下在mAb包被的培養板中溫育16小時。與2xl0"屯化的自體同源CD8 T細胞共培養7天。第2天在培養物中添加20單位/ml IL-2和10單位/mlIL-7。用抗CD8和FluMl-四聚體染色細胞。圖9C顯示，IL-4DC (5xl03/孑L)在20 uM Mart-l肽(HLA-A2表位)(上部兩個圖片)或重組Mart-l蛋白(下部兩個圖片)存在下在用mAb包被的培養板中溫育16小時。與2xl04屯化的自體同源CD8 T細胞共培養10天。第2天在培養基中添加20單位/ml IL-2和10單位/ml IL-7。用抗CD8和Mart-l-四聚體染色細胞。圖9D顯示，IL-4DC用10 nM抗CLEC-6-Mart-l複合物或對照Ig-Mart-l複合物負載2小時。與2xl06純化的自體同源CD8 T細胞共培養10天。用抗CD8和Flu Ml特異性四聚體染色細胞。下部兩個圖片中的細胞用來自大腸桿菌(E. coli)的20ng/mlLPS進行刺激。圖9E顯示純化的mDC用10 nM抗CLEC-6-Flu HAl或對照Ig-Flu HAl複合物負載2小時。與2xl 06用CFSE標記的純化自體同源CD4T細胞共培養7天。用抗CD4染色細胞，並通過分析CFSE稀釋測量細胞增殖。下部兩個圖片中的細胞用來自大腸桿菌的20 ng/ml LPS進行刺激。
圖10顯示來自非人靈長類(食蟹猴)的PBMC用抗CLEC-6 mAb和細胞表面標記物的抗體染色，並用FACS分析。
12發明詳述
儘管以下詳細討論本發明的多種實施方案的製備及使用，但是應該理解本發明提供了許多可以在多種特定情況下具體實施的可應用的發明構思。本文討論的特定實施方案僅僅是說明製備和使用本發明的特定方法，而不限定本發明的範圍。
為便於理解本發明，許多術語定義如下。本文定義的術語具有與本發明相關的領域中的普通技術人員通常理解的含義。術語諸如"一個"、"一種"、"該"等不意欲僅僅指單數實體，而是包括其中特定實例可以用於例證的總的類別。本文術語用於描述本發明的特定實施方案，但是它們的用法並不限制本發明，除非在權利要求中概述的。
Dectin-l基因簇包括凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(LOX)-l 、 C型凝集素樣受體(CLEC)-1和2,以及MICL。 CLEC-1當轉染到培養細胞中時胞內表達，因此預測需要一些接頭分子用於其表面表達(M. Colonna等，Eur JImmunol 30 (2000)，第697-704頁)。然而，在它的跨膜部分不含有陽離子胺基酸。相反，在其胞質部分存在一個酪氨酸殘基，但是通過該酪氨酸的信號傳導效應是未知的。CLEC-2的胞質區包含一個DxYxxL (天冬氨酸-任意-酪氨酸-任意-任意-亮氨酸)基序，並且在轉染細胞表面表達。該基序已知可激勵有效的胞吞作用和ASGPR-1的基底外側表達，並與dectin-l的第二類酪氨酸為基礎的基序高度同源。事實上，Syk在其配體蛇毒rhodocytin (aggretin)的誘導下被募集到CLEC-2的磷酸酪氨酸(K. Suzuki-Inoue等，Blood 107(2006),第542-549頁)。該研究確認了在C型凝集素受體中獨特的單個YxxL序列的存在，其在酪氨酸磷酸化時提供Syk的停泊位點。MICL (CLEC12A)被確定為與dectin畫l和LOX-l同源的含ITIM分子(A.S. Marshall等,J BiolChem 279 P004),第14792-14802頁)。它的表達基本上局限在單核細胞、粒細胞和未成熟DC。功能上，MICL在受到刺激時募集SHP-1和2，並且用含胞質MICL的嵌合受體觀察到ITIM依賴性抑制效應(A.S. Marshall等，JBiol Chem 279 (2004)，第14792-14802頁)。然而，最近報導，在MICL連接到未成熟DC上時，觀察到改變的蛋白質酪氨酸磷酸化形式，以及p38 MAPK和ERK的絲氨S交磷酸化，而且注意到CCR7的表達和細胞因子的產生而沒有成熟標記物如CD83、 86和DC-LAMP的上調(C.H. Chen等,Blood 107(2006)、第1459-1467頁)。確實，如CCR7+共刺激低半成熟表型(costimulatkmlow semi-mature phenotype)被認為代表穩定狀態的遷移DC (L. Ohl等，Imunity21 (2004)，第279-288頁)。雖然還沒有表徵，但是CLEC9A和CLEC12B編碼基因也定位在dectin-l基因蔟中(G.D. Brown, Nat Rev Immunol 6 (2006),第33~43頁)。CLEC12B的胞質尾區含有ITIM，而CLEC9A具有ExYxxL (谷胺酸-任意-酪氨酸-任意-任意-亮氨酸)序列，其可能起到激活基序的作用。這些分子的功能仍然需要進一步研究。
Arce等，Eur. J. Immunol. (2004)鑑定並表徵了與小鼠Mcl/Clecsf8相關的人CLEC-6蛋白。人CLEC-6編碼了有215個胺基酸的II型膜糖蛋白，其屬於人4丐依賴性凝集素家族(C型凝集素)。CLEC-6的胞外區具有單個的碳水化合物識別結構域(CRD)。對CLEC-6瞬時轉染細胞的生化分析表明30kDa的糖蛋白和所述受體的交聯導致迅速內在化，提示CLEC-6是胞內受體(Arce等，2004)。不同於CLEC-1、 -2、隱9A、畫12A和-12B, CLEC隱6不含有YxxL基序或其它共有的信號傳導基序。還沒有進行研究以表徵CLEC-6的生物功能。
DC 能夠交叉呈遞蛋白抗原(Rock KL Immunol Rev. 2005Oct;207:166-83)。在體內，DC通過許多受體來攝取抗原，並呈遞I和II類形式的抗原肽。在本文中，DC凝集素作為模式識別受體有助於抗原的有效攝取以及抗原的交叉呈遞。
如本文所用，術語"模塊式rAb載體"用於描述重組抗體系統，該系統被工程化以提供不同的抗原、活化蛋白質或其它抗體以受控的模塊式方式加入單一重組單克隆抗體(mAb),在本案中，抗CLEC-6單克隆抗體。rAb可以是使用標準雜交瘤技術、重組抗體展示、人源化單克隆抗體等製備的單克隆抗體。才莫塊式rAb載體可用於，例如，(通過一種針對例如人樹突細胞受體的內在化受體的原發重組抗體)耙向多個抗原和/或抗原與活化的細胞因子至樹突細胞(DC)。；漠塊式rAb載體還可以用於以受控且確定的方式首尾相連地連接兩種不同的重組mAb。
"模塊式rAb載體"的抗原結合部分可以是一種或多種可變結構域、 一種或多種可變結構域與第一恆定結構域，Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段，同源的模塊式結合部分添加到胺基酸序列和/或與其結合。模塊式rAb載體中使用的抗體可以是任何同型或類別、亞類或者來自任何來源(動物和/或重組體)。
在一個非限制性實施例中，模塊式rAb載體#:工程化為具有一種或多種模塊式粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質結構域，用於製備在工程化的重組mAb情況下的特異且明確的蛋白質複合物。mAb是包括一種或多種來自mAb的抗原結合結構域的模塊式粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質結構域羧基的融合蛋白的一部分。粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質結構域甚至可以在翻譯後，例如使用化學交聯劑和/或二硫鍵連接。
本文使用的術語"抗原"指的是可以在該抗原的接受者中啟動體液和/或細胞免疫應答的分子。抗原可以用於本發明的兩種不同情況中作為抗體或
14rAb的其它抗原識別結構域的目標或者作為分子，該分子通過模塊式rAb載體的錨定蛋白/粘附蛋白-分子補體的一部分的rAb運送到和/或進入細胞或目標。抗原通常是引起疾病的試劑，對於該疾病，疫苗接種可能是有益的治療。當抗原被呈遞在MHC上時，該肽通常是約8到約25個胺基酸。抗原包括任何類型的生物分子，包括，例如，簡單的中間代謝物、糖、脂質和激素以及大分子諸如複合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白質。抗原的常見種類包括但不限於病毒抗原，細菌抗原，真菌抗原，原生動物及其他寄生蟲抗原，腫瘤抗原，自身免疫性疾病、過敏症和移植排斥中涉及的抗原，及其他各種抗原。模塊式rAb載體能夠運載許多活化劑，例如抗生素、抗感染藥、抗病毒藥、抗腫瘤藥、解熱藥、鎮痛藥、抗炎藥、骨質疏+〉症的治療劑、酶、細胞因子、抗凝血藥、多糖、膠原、細胞及兩種或更多前述活化劑的組合。使用本發明遞送的抗生素的實例無限制地包括四環素、氨基糖苷類、青黴素、頭孢菌素、磺胺類藥物、氯黴素琥珀酸鈉、紅黴素、萬古黴素、林可黴素、克林黴素、制黴菌素、兩性黴素B、金剛烷胺、碘苷、對氨基水楊酸、異煙肼、利福平、放線菌素D、光輝黴素、道諾黴素、阿黴素、博來黴素、長春鹼、長春新鹼、曱基苄肼、咪唑曱醯胺等等。
使用本發明遞送的抗肺瘤藥的實例無限制地包括阿黴素、柔紅菌素、紫杉醇、氨曱喋呤等等。解熱藥和鎮痛藥的實例包括阿司匹林、美林(Motrin⑧)布洛芬(Ibuprofen⑧)、萘普生、醋氨酚等等。
使用本發明遞送的抗炎藥的實例無限制地包括NSAIDS、阿司匹林、甾族化合物、地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍、雙氯芬酸鈉等等。
使用本發明遞送的治療骨質疏鬆症的治療劑和作用於骨和骨骼的其它因子的實例無限制地包括釣，阿侖膦酸鹽，骨GLa肽，曱狀旁腺激素及其活性片段，組蛋白H4相關骨形成和增殖肽及其突變體、衍生物和類似物。
使用本發明遞送的酶和酶輔因子的實例無限制地包括胰酶(pancrease)、L-天冬醯胺酶、透明質酸酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、鏈激酶、尿激酶、胰酶製劑、膠原酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、血纖維蛋白溶酶原、鏈激酶、腺苷酸環化酶、過氧化物歧化酶(SOD)等等。
因子(TGF),成纖維細胞生長因子(F:F)，血小板衍生生長因子(PDGF),表皮生長因子(EGF),結締組織活化肽(CTAP)，成骨因子及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生物。細胞因子可以是B/T細胞分化因子、B/T細胞生長因子、促有絲分裂細胞因子、趨化細胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、IFN-a、 IFN-卩、IFN畫y、 IL1 、 IL2、 IL3、 IL4、 IL5、 IL6、 IL7、 IL8、IL9、 ILIO、 ILll、 IL12、 IL13、 IL14、 IL15、 IL16、 IL17、 IL18等、瘦素、
15肌肉生長抑制素、巨噬細胞刺激蛋白、血小板衍生生長因子、TNF-a、 TNF-卩、 NGF、 CD40L、 CD137L/4-lBBL、人淋巴毒素-卩、G-CSF、 M隱CSF、 GM誦CSF、 PDGF、 IL-la、 ILl-卩、IP-IO、 PF4、 GRO、 9E3、促紅細胞生成素、內皮抑 素、血管抑素、VEGF或其任何片段或組合。其它細胞因子包括轉化生長因 子(TGF)超基因家族成員，包括卩轉化生長因子(例如TGF-pi、 TGF-P2、 TGF-卩3);骨形態發生蛋白質(例如，BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結合生長因子(例如成纖維細月包生 長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣 生長因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如， GDF-1);以及活化素(例如，活化素A、活化素B、活化素AB)。
來源諸如從哺乳動物細胞分離的，或可以合成地製備諸如通過重組DNA技 術或通過多種化學方法製備的生長因子。此外，可以使用這些因子的類似物、 片>^殳或;^汙生物，只要它們顯示天然分子的至少一些生物活性。例如，可以通 過表達位點特異性突變或其它遺傳工程技術改變的基因來製備類似物。
使用本發明遞送的抗凝血藥的實例無限制地包括華法林、肝素、水蛭素 等等。使用本發明遞送的作用於免疫系統的因子的實例無限制地包括控制炎 症和惡性贅生物的因子以及攻擊感染性微生物的因子，諸如趨化肽和緩激 肽。
病毒抗原的實例包括但不限於，例如，逆轉錄病毒抗原，諸如來自人免 疫缺陷病毒(HIV)的逆轉錄病毒抗原，諸如gag、 pol和env基因的基因產物， Nef蛋白，逆轉錄酶及其他HIV元件；肝炎病毒抗原，諸如B型肝炎病毒的 S、M和L蛋白，B型肝炎病毒和其它肝炎例如曱、乙和C型肝炎病毒的pre-S 抗原，病毒元件諸如C型肝炎病毒RNA;流感病毒抗原，諸如血球凝集素 和神經氨酸酶及其他流感病毒元件；麻滲病毒抗原，諸如麻滲病毒融合蛋白 及其他麻滲病毒元件；風滲病毒抗原，諸如蛋白El和E2及其他風滲病毒元 件；輪狀病毒抗原，諸如VP7sc及其他輪狀病毒元件；巨細胞病毒抗原，諸 如包膜糖蛋白B及其他巨細胞病毒抗原元件；呼吸道合胞體病毒抗原，諸如 RSV融合蛋白、M2蛋白及其他呼吸道合胞體病毒抗原元件；單純性皰發病 毒抗原，諸如立即早期蛋白質、糖蛋白D及其他單純性皰滲病毒抗原元件； 水痘帶狀皰滲病毒抗原，諸如gpl、 gpll及其他水痘帶狀皰滲病毒抗原元件； 日本腦炎病毒抗原，諸如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS1、 NS1-NS2A、 80% E及其他日本腦炎病毒抗原元件；狂犬病病毒抗原，諸如狂犬病糖蛋白、狂 犬病核蛋白及其他狂犬病病毒抗原元件。關於病毒抗原的其他實例，參見
16Fundamental Virology,第二版，編著Fields, B. N.和Knipe， D. M.(Raven Press, New York, 1991)。
可以使用本發明的rAb-DC/DC-抗原疫苗遞送的抗原目標包括編碼抗原 諸如病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原的基因。病毒包括微小核 jf唐4t酸病毒、冠^l夫病毒、4皮蓋病毒、黃病毒、才iM犬病毒、副粘病毒、正粘病 毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸^瓜病毒、逆轉錄病毒、乳頭瘤病毒、細小 病毒、皰滲病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和海綿狀病毒。其它病毒目標包 括流感、單純皰滲病毒1和2、麻滲、登革熱、天花、脊髓灰質炎或HIV。 病原體包括錐蟲、絛蟲、蛔蟲、蠕蟲、瘧疾。腫瘤標記物諸如胚胎抗原或前 列腺特異性抗原可以以這個方法靶向。其它實例包括HIVenv蛋白和乙型 肝炎表面抗原。根據本發明用於疫苗接種目的的載體的給予可能要求載體結 合的抗原是足夠非免疫原性的以使得轉基因能夠長期表達，對此可期望強烈 的免疫應答。在一些情況下，個體的疫苗接種可僅是不經常地需要，諸如每 年或每兩年一次，並提供對傳染物的長期免疫保護。本發明用於載體中並最 終作為抗原的生物體、過敏原及核酸和胺基酸序列的特定實例可以在美國專 利6,541,011中找到，該專利的相關部分引入本文作為參考，尤其是可以用 於本發明的匹配生物體和特定序列的表格。
用於本文公開的rAb疫苗的細菌抗原包括但不限於，例如，細菌抗原， 諸如百日咳毒素、絲狀血球凝集素、百日咳桿菌粘附素、FIM2、 FIM3、腺 香酸環化酶及其他百日咳細菌抗原元件；白喉細菌抗原，諸如白喉毒素或類 毒素及其他白喉細菌抗原元件；破傷風細菌抗原，諸如破傷風毒素或類毒素 及其他破傷風細菌抗原元件；鏈球菌細菌抗原，諸如M蛋白及其他鏈球菌 細菌抗原元件；革蘭氏陰性桿菌細菌抗原，諸如脂多糖及其他革蘭氏陰性細 菌抗原元件；結核分枝桿菌細菌抗原，諸如黴菌酸、熱休克蛋白65(HSP65)、 30 kDa主要分泌性蛋白、抗原85A及其他分枝桿菌抗原元件；幽門螺桿菌 細菌抗原元件；肺炎球菌細菌抗原，諸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多 糖及其他肺炎球菌細菌抗原元件；流感嗜血桿菌細菌抗原，諸如莢膜多糖及 其他流感嗜血桿菌細菌抗原元件；炭疽細菌抗原，諸如炭疽保護性抗原及其 他炭疽細菌抗原元件；立克次氏體細菌抗原，諸如rompA及其他立克次氏 體細菌抗原元件。本文描述的細菌抗原還包括任何其它細菌、分枝桿菌、支 原體、立克次體或衣原體抗原。部分或完整的病原體還可以是流感嗜血杆 菌；鐮狀症原蟲；腦膜炎奈瑟氏球菌；肺炎鏈球菌；淋病奈瑟氏菌；傷寒沙 門氏菌血清型；志賀氏菌；霍亂弧菌；登革熱；腦炎；日本腦炎；萊姆病； 鼠疫耶爾森氏菌；西尼羅河病毒；黃熱病；兔熱病；肝炎(病毒性；細菌性)；RSV(呼吸道合胞病毒)；HPIV1和HPIV3;腺病毒；天花；過敏物和癌症物 質。
用於本發明的組合物和方法的真菌抗原包括但不限於，例如，念珠菌屬 真菌抗原元件；組織胞漿菌屬真菌抗原，諸如熱休克蛋白60(HSP60)及其他 組織胞漿菌屬真菌抗原元件；隱球菌真菌抗原，諸如莢膜多糖及其他隱球菌 真菌抗原元件；球孢子菌真菌抗原，諸如小球體抗原及其他球孢子菌真菌抗 原元件；以及癬真菌抗原，諸如發褲菌素及其他球孢子菌真菌抗原元件。
原生動物及其他寄生蟲抗原的實例包括但不限於，例如，惡性痴原蟲抗 原，諸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、環子孢子抗原、配子母細胞/ 配子表面抗原、紅內期抗原pf 155/RESA及其他痗原蟲抗原元件；弓形體屬 抗原，諸如SAG-1、 p30及其他弓形體屬抗原元件；血吸蟲屬抗原，諸如谷 胱甘肽-S轉移酶、副肌球蛋白及其他血吸蟲屬抗原元件；利什曼原蟲主要及 其他利什曼原蟲抗原，諸如gp63、磷脂聚糖及與其相關的蛋白質及其他利什 曼原蟲抗原元件；以及克氏錐蟲抗原，諸如75-77 kDa抗原、56kDa抗原及 其他錐蟲抗原元件。
可以使用本發明的rAb靶向的抗原通常基於許多因素選擇，所述因素包 括內在化的可能性、免疫細胞特異性的水平、耙向的免疫細胞種類、免疫 細胞成熟的水平和/或活化等等。用於樹突細胞的細胞表面標記物的實例包括 但不限於，MHCI類、MHCII類、B7陽2、 CD18、 CD29、 CD31、 CD43、 CD44、 CD45、 CD54、 CD58、 CD83、 CD86、 CMRF-44、 CMRF-56、 DCIR和/或 DECTIN-1等等；而在一些情況下還缺失CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD 19、 CD20、 CD56和/或CD57。抗原呈遞細胞的細胞表 面標記物的實例包括^f旦不限於，MHCI類、MHCII類、CD40、 CD45、 B7-l、 B7-2、 IFN-y受體及IL-2受體、ICAM-1和/或Fcy受體。用於T細胞的細胞 表面標記物的實例包括但不限於，CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD20、 CDllb、 CD16、 CD45和HLA-DR。
用於遞送的細胞表面上的目標抗原包括通常來源於腫瘤組織細胞的細 胞表面、細胞質、細胞核、細胞器等的腫瘤抗原特徵性的那些抗原。用於本 發明的抗體部分的腫瘤目標的實例無限制地包括血液癌諸如白血病和淋巴 瘤；神經腫瘤諸如星形細胞瘤或惡性膠質瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭和 頸癌；胃腸腫瘤諸如胃或結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖器腫瘤如宮頸、 子宮、卵巢癌，陰道癌，睪丸癌，前列腺癌或陰莖癌；骨胂瘤；血管肺瘤； 或唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直腸、膽嚢、膽道、喉、肺和支氣管、膀胱、 腎、腦及神經系統的其他部分、曱狀腺的癌症；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋 巴瘤；多發性骨髓瘤和白血病。實例包括腫瘤蛋白，例如突變的癌基因；與腫瘤相關的病毒蛋白；以及腫瘤 粘蛋白和糖脂。抗原可以是與腫瘤相關的病毒蛋白，其可以是來自上文指出 的各類別病毒的病毒蛋白。某些抗原可以是腫瘤特徵性的(一個亞集，是腫 瘤前體細胞通常不表達的蛋白質)，或者可以是肺瘤前體細胞中通常表達的 蛋白質，但是具有腫瘤特徵性的突變。其它抗原包括具有改變的活性或亞細 胞分布的正常蛋白質的突變型變體，例如，產生腫瘤抗原的基因突變。
腫瘤抗原的特定的非限制性實例包括CEA,前列腺特異性抗原(PSA), HER-2/neu， BAGE， GAGE, MAGE 1-4、 6和12, MUC(粘蛋白)(例如MUC匿1 、 MUC-2等)，GM2和GD2神經節苷脂，ras, myc，酪氨酸酶，MART(黑色 素瘤抗原)，Pmel 17(gpl00), GnT-V內含子V序列(N-乙醯葡糖氨基轉移酶 V內含子V序列)，前列腺Capsm， PRAME(黑色素瘤抗原)，p-連環蛋白， MUM-1-B(黑色素瘤遍在突變基因產物)，GAGE(黑色素瘤抗原)l， BAGE(黑 色素瘤抗原)2-10， c-ERB2(Her2/neu), EBNA(EB病毒核抗原)1-6, gp75,人 乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7， p53,肺抗性蛋白(LRP)， Bcl-2，以及Ki-67。此 外，免疫原性分子可以是自身免疫性疾病的起始和/或進展中涉及的自身抗 原，該自身免疫性疾病的病理學主要是由於相關目標器官、組織或細胞表達 的分子特異性的抗體的活性所引起，例如SLE或MG。在這些疾病中，可能 期望將進行中的針對相關自身抗原的抗體介導的(即Th2型)免疫應答指向細 胞(即Thl型)免疫應答。或者，可能期望在沒有感染，但是疑似易感染相關 自身免疫性疾病的受試者中通過預防性誘導針對適當的自身抗原的Thl反 應來防止針對自身抗原的Th2反應的起始或降低其水平。目標自身抗原無限 制地包括(a)對於SLE, Smith蛋白、RNP核糖核蛋白、及SS-A和SS-B蛋 白；以及(b)對於MG,乙醯膽鹼受體的抗原。在一種或多種類型的自身免疫 應答中涉及的其它各種抗原的實例包括，例如，內源性激素，諸如黃體生成 素、卯泡刺激素、睪丸激素、生長激素、催乳素及其他激素。
在自身免疫疾病、過敏症和移植排斥中涉及的抗原可被用於本發明的組 合物和方法。例如，在任何一種或多種下列自身免疫疾病或障礙中涉及的抗 原可被用於本發明糖尿病(diabetes、 diabetes mellitus)，關節炎(包括類風溼 性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎)，多發性硬 化，重症肌無力，系統性紅斑狼瘉，自身免疫性甲狀腺炎，皮炎(包括特應 性皮炎和溼滲性皮炎)，銀屑病，斯耶格倫氏症候群，包括繼發於斯耶格倫 氏症候群的乾燥性角膜結膜炎，斑禿，由於節肢動物叮咬反應的過敏反應， 克羅恩氏病，口瘠性潰瘍，虹膜炎，結膜炎，角膜結膜炎，潰瘍性結腸炎， 哞喘，過敏性哮喘，皮膚紅斑狼瘡，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥滲，麻瘋
19病逆向反應，麻風結節性紅斑，自身免疫性葡萄膜炎，過敏性腦脊髓炎，急 性壞死性出血性腦病，特發性雙側累進性感覺神經性聽力喪失，再生障礙性 貧血，單純性紅細胞貧血，特發性血小板減少，多軟骨炎，韋格納氏肉芽胂 病，慢性活動型肝炎，斯-約二氏症候群，自發性口炎性腹瀉，扁平莒癬， 克羅恩氏病，格雷夫斯眼病，結節病，原發性膽汁性肝硬化，後葡萄膜炎和 間質性肺纖維化。在自身免疫性疾病中涉及的抗原的實例包括穀氨酸脫羧酶
65(GAD 65)、天然DNA、髓磷脂鹼蛋白、髓磷脂蛋白脂質蛋白、乙醯膽鹼 受體元件、曱狀腺球蛋白和促曱狀腺激素(TSH)受體。在過敏症中涉及的抗 原的實例包括花粉抗原諸如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麥草花粉 抗原，動物來源的抗原諸如灰塵蟎抗原和貓科抗原，組織相容性抗原和青黴 素及其他治療性藥物。在移植排斥中涉及的抗原的實例包括移植入移植物接 受者的移植， 抗原性元件，諸如心臟:，肺、肝臟、,胰、腎和神經的移植物
如同本文使用的，術語"表位"指的是包括與位於由病原體DNA或RNA 編碼的多種病原體多肽之任何一種中的表位相似的一級、二級或三級結構的 肽或蛋白質抗原。相似性的水平通常達到這樣的程度，即針對上述多肽的單 克隆或多克隆抗體也會與該肽或蛋白質抗原結合、反應或識別該肽或蛋白質 抗原。多種免疫測定方法可以和上述抗體一起使用，例如蛋白質印跡法、 ELISA、 RIA等，所有這些都為本領域技術人員所知。適於在疫苗中使用的 病原體表位和/或它們的功能等價物的鑑定是本發明的一部分。 一旦分離和鑑 定，可以容易地獲得功能等價物。例如，可以使用如美國專利號4,554,101 中講授的Hopp的方法，其教導根據親水性從胺基酸序列鑑定和製備表位， 該文獻引入本文作為參考。其它一些論文中描述的方法及基於其的軟體程序 也可以用於鑑定表位核心序列(參見，例如，Jameson和Wolf， 1988; Wolf 等，1988;美國專利號4,554,101)。然後可以容易地通過運用肽合成或重組 技術把這些"表位核心序列"的胺基酸序列引入肽中。
製備;注射劑，為液體溶液或懸浮液、；也可以製備適於在注射之;溶解或懸 浮於液體中的固體形式。可以把製劑乳化，包封在脂質體中。通常把活性免 疫原性成分與藥學上可接受並與活性成分相容的載體混合。
術語"藥學上可接受的載體"指的是在給予的受試者中不引起過敏反應 或其它副作用的載體。合適的藥學上可接受的載體包括，例如，水、鹽水、 磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合中的一種或多種。此外， 如果需要，疫苗可以包含少量的輔助性物質，諸如潤溼或乳化劑、pH緩沖 劑和/或增強疫苗效力的佐劑。可能有效的佐劑的實例包括但不限於氬氧化
20鋁、N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、 N-乙醯-nor-胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺、 MTP-PE和RIBI,其包含在2。/。鯊烯/Tween 80乳劑 中的三種細菌提取成分，單磷醯脂質A、海藻糖二黴菌酸酯和細胞壁骨架 (MPL+TDM+CWS)。佐劑的其它實例包括DDA (溴化二甲基雙十八烷基銨)、 弗氏完全和不完全佐劑以及QuilA。此外，免疫調節物質，諸如淋巴因子(例 如，IFN-y、 IL-2和IL-12)或合成的IFN-y誘導物(諸如聚I:C)可以和本文描 述的佐劑聯合使用。
如本發明所描述的，藥品可以包括具有單一或多拷貝的特定核苷酸序列 的棵多核苷酸，該特定核苷酸序列與存在於血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定 DNA結合位點結合。多核普酸可以編碼生物活性肽、反義RNA或核酶並以 生理學上可接受的可給藥形式提供。可來自本發明的另一種藥品以生理學上 可接受的可給藥形式包括根據本文描述的方法從患者血液或其它來源分離 的高度純化的血漿脂蛋白部分和預先結合到純化的脂蛋白部分的、包含與存 在於血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定DNA結合位點結合的單一或多拷貝的 特定核苷酸序列的多核苷酸。
另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿脂蛋 白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結合基序的 重組載脂蛋白片段，其預先結合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多 核苷酸上。另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿 脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結合基 序的重組載脂蛋白片段，其預先結合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列 的多核苷酸上。
給藥劑量在很大程度上取決於治療的受試者的體重和身體健康狀態以 及給藥途徑和治療頻率。包括預先結合到高度純化的脂蛋白部分的棵多核苷 酸的藥物組合物可以按1嗎到1 mg多核苷酸和1 )ig到100 mg蛋白質的量 給藥。
rAb和rAb複合物給予患者可以遵循用於化學療法給藥的一般方案，如 果有的話，考慮載體的毒性。預料根據需要重複治療周期。還考慮，多種標 準治療以及外科幹預可以與所述的基因治療聯合施用。
在考慮基因治療臨床應用的情況下，需要製備複合物作為適於目的應用 的藥物組合物。通常這需要製備基本上不含熱原以及任何其它對人或動物有 害的雜質的藥物組合物。通常還期望使用適當的鹽和緩沖液以使複合物穩定 和允許複合物被目標細胞糹聶取。
本發明的水性組合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在藥學上 可接受的載體或水介質中。這些組合物也可以稱作接種物。用於藥物活性物
21質的介質和試劑的使用在本領域中為大家所熟知。任何常規介質或試劑除非 與活性成分不相容，否則其在治療組合物中的使用被考慮。補充性活性成分 也可以加入組合物中。本發明的組合物可以包4舌典型的藥物製劑。也可以在 甘油、液體聚乙二醇及其混合物中和在油類中製備分散體。在通常的儲存和 使用條件下，這些製劑包含防腐劑以防止微生物的生長。
疾病狀態。取決於要治療的特定疾病，根據本發明的治療組合物的給予 可以經任何常規途徑進行，只要經該途徑可達到目標組織以使最大化遞送抗 原到位點來達到最大的(或在一些情況下最小的)免疫應答。通常可以經原位、
皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射給藥。遞送的其它部位包括口、 鼻、頰、直腸、陰道或局部的。局部給藥對於皮膚癌的治療可能是特別有益 的。所述組合物通常作為包括生理學上可接受的載體、緩衝液或其它賦形劑 的藥學上可接受的組合物給藥。
本發明的疫苗或治療組合物可以經注射胃腸外例如皮下或肌內妾會予。適 於其它給藥方式的另外的製劑包括栓劑，以及在一些情況下口服製劑或適於 分配的製劑如氣霧劑。對於口服製劑，使用佐劑的T細胞亞型操作，抗原包 裝或添加單獨的細胞因子到多種製劑中產生具有最佳化免疫應答的改良口 服疫苗。對於栓劑，常規的粘合劑和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或 甘油三脂；這些栓劑可以由包含0.5%到10%，優選1%-2%範圍內的活性成 分的混合物形成。口服製劑包括通常使用的賦形劑，例如藥物級的甘露糖醇、 乳糖、澱粉硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳S臾鎂等。這些組合物釆取溶液、 懸浮液、片劑、丸劑、膠嚢、緩釋製劑或散劑的形式並且包含10%-95%的活 性成分，優選25-70%。
本發明的編碼抗原的核酸可以作為中性的或鹽的形式配製入疫苗或治 療組合物中。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成的)，其 為與無機酸例如鹽酸或磷酸或與有機酸諸如醋酸、草酸、酒石酸、馬來酸等 形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以源自於無機鹼例如氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氫氧化銨、氫氧化4丐或氫氧化鐵和有機鹼諸如異丙胺、三曱胺、2-乙氨 基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
疫苗或治療組合物以與給藥製劑相容的方式，以及以預防和/或治療有效 的量給予。要給予的量取決於要治療的受試者，包括例如受試者的免疫系統 對合成抗體的容量，以及期望保護或治療的程度。合適的劑量範圍為每次疫 苗接種具有約幾百微克級的活性成分，範圍為約0.1 mg到1000mg，諸如約 1 mg到300 mg的範圍，以及優選約10 mg到50 mg的範圍。合適的初始給 藥和強化注射方案也是變化的，但是典型的是初始給藥然後是後續的接種或 其他給藥。給藥要求的活性成分的精確量取決於醫師的判斷且可能為每個受試者所特有。本領域技術人員清楚，本發明的核酸分子或融合多肽的治療有 效量尤其取決於給藥方案，給藥抗原的單位劑量，核酸分子或融合多肽是否 和其它治療劑聯合給藥，接受者的免疫狀態和健康狀態，以及特定核酸分子 或融合多肽的治療活性。
組合物可以以單一劑量方案或以多次劑量方案提供。多次劑量方案中疫 苗接種的初始時程可以包括，例如1-10個單獨的劑量，隨後在以維持和或
加強免疫應答要求的後續時間間隔給予其它劑量，例如在l-4個月給予第二 劑量，以及如果需要在數月之後給予後續劑量。需要每隔l-5年，通常3年 的定期加強劑量來維持需要的保護性免疫水平。免疫時程可以繼之以與 ESAT6或ST-CF共培養的外周血淋巴細胞(PBL)的體外增殖測定，以及測量 致敏淋巴細胞釋放的IFN-y水平。可以使用常規的標記物諸如放射性同位素、 酶、螢光標記物等進行測定。這些技術為本領域技術人員所知並且可以在美 國專利號3,791,932、 4,174,384和3,949,064中找到,這些文獻的相關部分通 過引用併入本文。
模塊式rAb載體和/或結合的rAb載體-(粘附蛋白/錨定蛋白和/或錨定 蛋白-粘附蛋白)-抗原複合物(rAb-DC/DC-抗原疫苗)可以以 一種或多種"單位 劑量"提供，這取決於是否使用核酸載體，最終純化的蛋白質，或使用的最 終的疫苗形式。把單位劑量定義為包含計算以產生與該治療組合物給藥即適 當的途徑和治療方式相關的期望反應的預定量的治療組合物。給藥量以及特 定的途徑和製劑在臨床領域技術人員的範圍之內。還可以評估待治療的受試 者，尤其是，受試者免疫系統的狀態和需要的保護。單位劑量不需要以單一 注射給藥，而是可以包括經設定的一段時間內的連續輸注。本發明的單位劑 量可以方便地用DNA/kg(或蛋白質/Kg)體重來描述，以約0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25、 0.5、 1、 10、 50、 100、 1,000或更多mg/DNA或蛋白質/kg體重 的範圍給藥。同樣地，遞送的rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以從約0.2到約 8.0mg/kg體重變化。因此，在特定實施方案中，可以把0.4mg、 0.5 mg、 0.8 mg、 1.0 mg、 1.5 mg、 2.0 mg、 2.5 mg、 3.0 mg、 4.0 mg、 5.0 mg、 5.5 mg、 6.0 mg、6.5 mg、 7.0 mg和7.5 mg的疫苗遞送到個體體內。給藥的rAb-DC/DC-抗原疫苗的劑量在很大程度上取決於治療的受試者的體重和身體健康狀態 以及給藥途徑和治療頻率。包括預先結合到脂質體或病毒遞送載體上的棵多 核苷酸的藥物組合物可以按從l嗎到lmg多核普酸到lpg到100mg蛋白質 的量給藥。因此，特定組合物可以包括在約1昭、5 pg、 10 jig、 20昭、30嗎、 40(xg、 50(ig、 60|ig、 70嗎、80嗎、100嗎、150 (ig、 200昭、250嗎、500 嗎、600昭、700 )ig、 800嗎、900 (ig或1,000 jig之間的多核苷酸或蛋白質， 該多核苷酸或蛋白質獨立地與1 pg、 5pg、 lOjxg、 20jig、 3.0 pg、 40jig、 50
23(ig、 60 fig、 70 (ig、 80嗎、100 (ig、 150昭、200昭、250嗎、500 pg、 600 [ig、 700嗎、800 |ig、 900嗎、1 mg、 1.5 mg、 5 mg、 10 mg、 20 mg、 30 mg、 40 mg、 50mg、 60mg、 70 mg、 80 mg、 90 mg或100 mg載體結合。
在體外細胞系統中測試本發明，該體外細胞系統測量Flu抗原耙向的樹 突細胞對人Flu特異性T細胞的免疫刺激。本文顯示的結果證明在該系統中 單獨使用無效的抗原劑量下這些抗原特異性細胞的特異性擴增。
本發明還可以用於製備模塊式rAb載體，該模塊式rAb載體例如是與來 自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B腸毒素的保護性抗原複合的重組人源化 mAb(抗特異性人樹突細胞受體)。該實體的潛在市場是所有軍事人員的疫苗 接種和儲備待用給大居民點服藥以應對任何與這些試劑相關的生物威脅的
興趣的工業包括製藥和生物技術工業。
本發明包括包含疫苗的組合物和方法，其特異性靶向(遞送)抗原至抗原 呈遞細胞(APC)以引發針對該抗原的有效且廣泛的免疫應答。這些組合物i秀 發針對衍生所述抗原的活性劑(病原體或癌症)的保護性或治療性免疫應答。 此外，本發明產生了這樣的試劑，其直接或與其他試劑一起通過它們與在抗 原呈遞細胞上表達的CLEC-6受體的特異性結合而具有治療性作用。
才才津牛和方法
抗體和四聚體-用於DC和B細胞表面染色的抗體(Ab)，包括同型對照 Ab，購自BD Biosciences (CA)。用於ELISA的Ab購自Bethyl (TX)。抗-BLyS 和抗-APRIL來自PeproTech (NJ)。四聚體HLA-A承0201-GILGFVFTL (Flu Ml) 和HLA-A*0201-ELAGIGILTV (Mart-1)購自Beckman Coulter (CA)。
細胞和培養物-來自正常供體的單核細胞(lxlO"ml)在含有GM-CSF (100 ng/ml)和IL-4 (50 ng/ml) (R&D, CA)的Cellgenics (France)培養液中培養。 對於第3天和第6天的DC，分別在第1天和第3天將相同量的細胞因子添 加到培養液中。B細胞用陰性分離試劑盒(BD)純化。CD4和CD8 T細胞用 包被抗CD4或CD8的磁珠(Milteniy， CA)純化。使用PercollTM梯度(GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)通過密度梯度離心從血沉棕黃層中 分離PBMC。對於DC活化，將lx105 DC在用mAb包被的96孔平板中培 養16-18h。在碳酸鹽緩衝液pH 9.4中的mAb (l-2嗎/孑L)在37。C下培養至少 3h。收集培養物上清液，細胞因子/趨化因子通過Luminex(Biorad， CA)測定。 對於基因分析，DC在mAb包被的平板中培養8h。在一些實驗中，將可溶 性50 ng/ml CD40L (R&D， CA)或50 nM CpG (InVivogen， CA)添加到培養液 中。在DC和B細胞共培養中，將重懸在含有10% FCS和抗生素的RPMI1640
24(Biosource， CA)中的5xl03 DC首先在mAb包被的平板中培養至少6h，然 後加入lx 105用CFSE (Molecular Probes, OR)標記的純化自體B細胞。在一 些實驗中，DC用5 moi (感染複數)熱滅活流感病毒(A/PR/8 H1N1)脈衝攻擊 2h，然後與B細胞混合。對於DC和T細胞共培養，將5xl03 DC與lx105 純化的自體CD8 T細胞或者混合的同種異體T細胞一起培養。在培養的最 後18h，用1(iCi/孔s[H]-胸普脈衝攻擊同種異體T細胞，然後通過用|3-計數 儀(Wallac, MN)測定cpm。以5xl05 PBMC/孔在mAb包被的平板中培養。 分別在第10天和第7天，通過用抗CD8和四聚體染色細胞來測定Mart-l和 Flu Ml特異性CD8 T細胞的頻率。將10 fiM的Mart-l肽(ELAGIGILTV)和 20 nM的含Mart-l肽的重組蛋白(參見下文)添加到DC和CD8 T細胞培養物 中。將20 nM純化的重組Flu Ml蛋白(參見下文)加到PBMC培養物中。
單克隆抗體-通過常規技術製備小鼠mAb。簡而言之，用含有Ribi佐 劑的20嗎受體胞外結構域.hlgGFc融合蛋白對6周齡的BALB/c小鼠進行i.p. 免疫，然後在第10天和第15天，用20昭抗原進行加強免疫。3個月後， 在取出脾臟的前3天，再對小鼠加強免疫。或者，在30天至40天的期間內， 每3-4天用在Ribi佐劑中的l-10jag抗原注射小鼠足墊。在最後加強免疫後 的3-4天，收集引流的淋巴結，將來自脾臟或淋巴結細胞的B細胞與 SP2/0-Ag 14細胞融合。對雜交瘤上清液進行篩選，與單獨的融合伴侶或與 鹼性磷酸酶融合的受體胞外結構域(15)相比，分析受體胞外結構域融合蛋白 的Ab。然後在FACS中使用用編碼全長受體cDNA的表達質粒瞬時轉染的 293F細胞對陽性孔進行篩選。被選的雜交瘤是在CELLine瓶(Intergra， CA) 中克隆和擴增的單個細胞。雜交瘤上清液與等體積的1.5 M甘氨酸、3 M NaCl、 lxPBS, pH7.8混合，並用MabSelect樹脂滾動。用結合i爰衝液洗滌 樹脂，並用0.1 M甘氨酸，pH2.7洗脫。接著用2MTris中和，用PBS透析 mAb。
ELISA -進行夾心ELISA來測量總IgM、 IgG和IgA以及flu特異性免 疫球蛋白(Ig)。含有已知量的Ig的標準人血清(Bethyl)和人AB血清分別用作 總Ig和flu特異性Ig的標準。樣本中的Flu特異性Ab滴度，單位被確定為 具有相同的光密度的AB血清的稀釋係數。用ELISA試劑盒(Bender MedSystem, CA)測定BAFF和BLyS的量。
RNA純化和基因分析-用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA，並用2100 Bioanalyser (Agilent)分片斤。生物素才示i己的cRNA草巴標用Illumina totalprep標 記試劑盒(Ambion)製備並雜交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的轉錄本) 上。這些微陣列由附著在3pm珠上的50mer寡核苷酸探針組成，所述珠固 定在矽片表面上蝕刻的微孔中。用鏈黴抗生物素-Cy3染色後，用Illumina(Beadstation 500X)生產的亞微米分辨掃描儀成像。用基因表達分析軟體程序 GeneSpring, Version 7.1 (Agilent)進4亍悽t氺居分牙斤。
重組Flu Ml和MART-1蛋白的表達和純化-用PCR擴增流感病毒 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) Ml基因的ORF，同時加入起始密碼 子遠端的Nhe I位點以及終止密碼子遠端的Not I位點。將消化片段克隆到 pET-28b(+) (Novagen)中，並在Ml ORF讀框內插入His6標籤，從而編碼 His.Flu Ml蛋白質。編碼插入在Nco I和Nhe I之間的來自熱纖梭菌(C. Aenwoce〃wm)(未公開)的N端169個殘基粘附蛋白結構域的pET28b(+)衍生 物表達Coh.His 。為表達粘附蛋白-Flex-hMART-l-肽A-His ,序列
(SEQ ID NO.: 1) ( 編 碼
DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGE FCRYPSHWRP (SEQ ID NO.: 2)-帶陰影的殘基是免疫顯性的HLA-A2-限制 性肽，而該肽周圍帶下劃線的殘基來自MART-l)被插入到上述載體的Nhe I 位點和Xho I位點之間。蛋白在大腸桿菌菌抹BL21(DE3) (Novagen)或者T7 Express (NEB)中表達，這些菌抹在37。C下在LB中培養，以卡那黴素抗性 (40(ig/ml)選擇，並以200轉/分鐘搖瓶直至生長到對數中期，同時添加120 mg/L IPTG。 3h後，通過離心收集細胞，保存在-80。C下。將來自每1L發 酵物中的大腸桿菌細胞重懸在30 ml含有0.1 ml蛋白酶抑制劑Cocktail II (Calbiochem, CA)的冰冷的50 mM Tris， 1 mM EDTA pH 8.0 (緩衝液B)中。 在水上超聲處理細胞2次，每次5分鐘，設定值為18 (Fisher Sonic Dismembrator 60)，其中有5分鐘靜止期，然後在4°C下以17,000 r.p.m. (Sorvall SA-600)離心20分鐘。為了純化His.Flu Ml,使50 ml細胞裂解物上清液部 分通過5 ml Q瓊脂糖珠，將6.25 ml 160 mM Tris、 40 mM咪唑、4 M NaCl pH 7.9添加到Q瓊脂糖流動液中。將其以4 ml/分鐘速度上樣到5 ml帶有Ni++ 的ffiTrap螯合HP柱上。結合柱的蛋白質用20 mM NaP04 , 300 mM NaCl pH 7.6(緩沖液D)洗滌，接著用100mMH3COONapH4.0再洗滌一次。結合的 蛋白質用100mMH3COONapH4.0洗脫。合併峰值餾分，以4ml/分鐘的速 度上樣到用100 mM H3COONa pH 5.5平衡的5 ml HiTrap S柱上，用平衡緩 衝液洗滌，接著用在50 mM NaP04 pH 5.5中的梯度為0-1 M的NaCl洗脫。 合併用約500 mM NaCl洗脫的峰值餾分。為了純化Coh.Flu Ml.His，如上所 述將來自2L培養物的細胞裂解。離心後，將2.5 ml Triton29 XI14加到上清
26液中，在水上培育5分鐘。在25。C下再溫育5分鐘後，在25。C下進行離心， 從Triton XI14中分離上清液。重複提取操作，將上清液通過5ml的Q瓊脂 糖珠，在Q瓊脂糖流動液中添加6.25 ml 160 mM Tris、40 mM咪唑、4 M NaCl pH7.9。如上所述，用1^++螯合的層析柱純化蛋白質，並用在緩衝液D中的 0-500 mM 。米唑洗脫。
抗CLEC-6 mAb的L和H可變區對應的具體序列-本發明包含如下所 示相應於抗CLEC-6單克隆抗體的具體胺基酸序列，所述抗體是治療性或<呆 護性產品的期望組分(在例如人源化重組抗體情況下)。下面是嵌合小鼠V區 (下劃線)-人C區(粗體)重組抗體中的所述序列。 rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6一9B9.2G12—Kv-V-hlgGK畫C] DIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASODISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSI
VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.:3) rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6—9B9.2G12一Hv-LV-hlgG4H畫C]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VL(JSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEV(JF鼎YVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
(SEQ ID NO.:4)。
本發明包括V區序列和相關序列的用途，該相關序列由本領域熟練技術 人員修飾以例如增強對CLEC-6的親和性和/或被整合到人V區閱讀框序列 中以工程化入表達載體中以指導能夠結合到抗原呈遞細胞上的CLEC-6的蛋 白形式的表達。圖7E顯示用於例如臨床前體外分析的工程化形式)。此外， 本發明中公開的(或者使用用於本文公開的獨特生物學的相似方法和篩選 獲得的)其它mAb可以通過相似的方式(最初通過PCR克隆和測序小鼠雜交 瘤V區)以導入編碼相似的重組抗體(rAb)的表達載體中。這種抗CLEC-6 V 區可進一步由本領域熟練技術人員"人源化"(即鼠-特異性結合序列移植到人 V區閱讀框序列中)以使治療性rAb的潛在的免疫反應性最小化。
工程化重組抗CLEC-6重組抗體-抗原融合蛋白(rAb.抗原)是有效的體 外原型疫苗-可用不同的蛋白編碼序列，如與H鏈編碼序列框內融合，來
27構建表達載體。例如，抗原如流感病毒HA5、流感病毒M1、 HIV gag或來 自癌抗原的免疫顯性肽、或者細胞因子之後可表達為rAb.抗原或rAb.細胞因 子融合蛋白，其在本發明的情況下，可具有利用抗CLEC-6V區序列以將抗 原或細胞因子(或毒素)直接帶到具有CLEC-6的抗原呈遞細胞的表面的用 處。這可以允許例如抗原的內在化-有時與受體的激活以及之後的啟動治療
i構思的疫苗可以採用如下所示的！^鏈^體i碼序列。上述圖7E顯示用於 臨床前體外分析的rAb的一個實例
rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6—9B9.2G12 (下劃線)—Hv-LV-hlgG4H-C (粗體) -Flex-FluHAl-l-(斜體)6xHis]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VL(JSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
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VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDT
丄《渭&4虹皿FHHHHHH (SEQ ID NO. :5)
rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC—6—9B9.2G12—(下劃線)Hv-LV-hIgG4H-C-(粗體) Flex-FluHA5-l-(斜體)6xHis]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSOEDPEV(JF而YVDGVEVHN
AKTKPREE(JFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
28VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW(JEGNVFSCSVMHEALHNHYTC KSLSLSLGKASDT
五CPOmS7W LKL4HHHHHH (SEQ ID NO.:6)
rAB-pIRES2[mAnti—hCLEC_6—9B9.2G12—(下劃線)Hv-LV-hlgG4H-C (粗體) -錨定蛋白(斜體)]
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLC SSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS(JEDPEV(3FNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWCJEGNVFSCSVMHEALHNHYTCJKSLSLSLGKASiVS
K/i 孤ZLP/ (SEQ ID NO.: 7)
與基於抗CLEC-6重組抗體的原型疫苗的構建相關的方法 嵌合小鼠/人mAb的cDNA克隆和表達-從雜交瘤細胞製備總RNA (RNeasy試劑盒，Qiagen)，並用於cDNA合成和PCR (SMART RACE試劑 盒，BD Biosciences),採用提供的5'引物和基因特異性3'引物 mlgGK ， 5 ，ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3 ， (SEQ ID NO. :8); mlgG入，5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3， (SEQ ID NO. :9); mlgGl, 5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3' (SEQ ID NO. :10); mlgG2a， 5,ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3， (SEQ ID NO.:l 1), 以及 mlgG2b ， 5 ， ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3 ， (SEQ ID NO. :12)。
對PCR產物進行克隆(pCR2.1 TA試劑盒，Invitrogen)，並通過DNA測 序表徵。用來自小鼠H和L鏈V區cDNA的序列，採用特異性引物以進行 PCR擴增信號肽和V區，同時插入側翼限制性位點以克隆到編碼下遊人IgGK 或IgG4H區的表達載體中。表達嵌合mVK-hlgK的載體通過擴增由Xho I和 Not I位點側翼的殘基401-731 (gi|63101937|),並將其插入到pIRES2-DsRed2
29(BD Biosciences)的Xho I - Not I間隔中來構建。使用PCR擴增mAb Vk區， 從起始密碼子開始，附加Nhe I或Spe I位點，接著是CACC，然後是編碼 區(例如，gi|76779294|的殘基126)，並附加Xho I位點。然後將PCR片段克 隆到上述載體的Nhe I - Not I間隔中。採用mSLAM前導區(leader)的嵌合 mVK-hlgK 載 體 通 過 將 序 列
5,ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcg tacggattaattaagggcccactcgag3， (SEQ ID NO.:13)插入到上述載體的Nhe I - Xho I間隔中來構建。使用PCR擴增預期成熟N末端密碼子(用SignalP 3.0 Server 確定)(Bendtsen, Nielsen等，2004)和mVK區的末端(如上所定義)之間的間隔， 並附加5'tegtacgga3，。用Bsi WI和Xho I酶切的片段插入到上述載體的相應 位點中。對照hlgK序列相應別49257887|殘基26-85和gil21669402l殘基 67-709。對照hlgG4H載體相應gill9684072l的殘基12-1473，具有S229P和 L236E取代，其穩定二硫鍵並消除殘基FcR結合(Reddy, Kinney等，2000)， 插入到pIRES2-DsRed2載體的Bgl II和Not I位點之間，同時添加序列 5'gctagctgattaattaa3， (SEQ ID NO.:14)代替終止密碼子。採用PCR擴增mAb 的VH區，從起始密碼子開始，附力。CACC，接著是BglII位點，然後是編 碼gi卩9684072l的殘基473。將PCR片段克隆到上述載體的Bgl II - Apa I間 隔中。採用mSLAM前導區的嵌合mVH-hlgG4序列的載體通過將下述序列 5，ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcg tacggattaattaagggccc3， (SEQ ID NO.:15)插入到上述載體的Nhe I - Apa I間隔 中來構建。使用PCR擴增預期成熟N末端密碼子和mVH區的末端之間的 間隔區，通過附加5'tcgtacgga3，。將用Bsi WI和Apa I酶切的片段插入到上 述載體相應的位點中。
將不同抗原編碼序列插入到H鏈載體的Nhe I - Pac I - Not I間隔中，該 抗原編碼序列兩側為近端Nhe I位點和終止密碼子後的遠端Not I位點。Flu HA1-1由近端為5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3'序歹寸(Nhe I 位點，然後為編碼cipA粘附蛋白-粘附蛋白接頭殘基)和遠端為 5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'序歹'J(編碼His6、終止密碼子和Not I位點) 的曱型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34(HlNl))紅細胞凝集素gi|216931681殘基 82-1025 (C982T改變)編碼。Flu HA5-1由結合有與Flu HA1-1相同序列的 gil50296052l曱型流感病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))紅細胞凝集素殘基 49-990編碼。Doc由具有近端Nhe I位點和遠端Not I位點的gi|40671|celD 殘基 1923-2150 編碼 。PSA 由具有近端序列 5'gctagcgatac犯c3g犯cctgc犯c3cctec犯c3Cctgt犯c^c3ccg3C33c犯c3cttctegcgc3' (SEQ ID NO.: 16) (Nhe I位點和cipA間隔區)和遠端Not I位點的gi|34784812|
30前歹'J腺特異性抗原殘基 101-832 編碼。Flu M1-PEP 由 5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcga acgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc3' (SEQ ID NO.: 17)糹扁石馬。這個 以及所有其他肽編碼序列通過具有適於克隆入Nhe I和Not I限制性H鏈載
來-生。總是使用優選的人密碼子，除了限制性位點需要加入或在CipA間 隔區序列中的情況。
採用L鏈和H鏈構建體各 2.5 iig和上述的方案，在5ml瞬時轉染物中 檢測rAb表達構建體的生產水平。用抗hlgG ELISA (親和純化的山羊抗人 IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch)分析上清液。在該方案的^r測中，分泌 的rAb產生不依賴於H鏈和L鏈載體濃度，各DNA濃度在~ 2倍的範圍內 (即系統是DNA飽和的)。
本發明包括新的抗人CLEC-6劑的研發、鑑定和應用，以及它們用於揭 示作為本發明以及預想的應用的基礎的新生物學。總而言之，開發了新的抗 CLEC-6單克隆抗體(mAb)，並用於揭示與存在於抗原呈遞細胞上的該細胞 表面受體相關的先前未知的生物學。該新的生物學高度預期激活該受體的抗 CLEC-6活性劑用於各種治療型和保護性應用的用途。下述數據強有力地支 持了最初的預期，並闡述了將本文揭示的發現轉化成臨床應用的途徑。
針對人CLEC-6高親和力單克隆抗體的開發-製備受體胞外結構 域.hlgG (人IgGlFc)和AP (人胎盤鹼性磷酸酶)融合蛋白，以分別用於小鼠免 疫和mAb篩選。DCIR胞外結構域.IgG的表達構建體以前已描述(15)，並利 用小鼠SLAM (mSLAM)信號肽引導分泌(16)。製備類似的hDCIR胞外結構 域.AP表達載體，用PCR擴增AP殘基133-1581 (gb|BC009647|),並添加近 端閱讀框內Xho I位點和遠端TGA終止密碼子和Not I位點。用該Xho I — Not I片段代替上述DCIR胞外結構域.IgG載體中的IgG編碼序列。在相同的Ig 和AP載體系列中的CLEC-6胞外結構域構建體含有編碼CLEC-6 (bp 317-838, g"37577120l插入片段。釆用FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen)，根據產商操作方案(在1.3 ml Fectin試劑/L轉染物中1 mg總質 粒DNA)製備CLEC-6融合蛋白。為產生rAb,等量的編碼H和L鏈的載體 進行共轉染。將轉染細胞培養3天，收集培養物上清液，添加新鮮的培養基 繼續培養2天。通過過濾澄清合併的上清液。受體胞外結構域.MgG的純化 釆用HiTrap蛋白A親和層析，用0.1 M甘氨酸pH 2.7洗脫，然後用PBS進 行透析。rAb (之後將描述的重組抗體)用HiTrap MabSelectTM柱作類似地純 化。小鼠mAb通過常規細胞融合技術製備。簡而言之，6周齡BALB/c小鼠 用20 jig受體胞外結構域.hlgGFc融合蛋白和Ribi佐劑腹膜內注射免疫，然後在10天和15天後用20 (ig抗原強化免疫。3月後，在取出小鼠脾臟前3 天再次強化免疫。或者，在足墊中每隔3-4天用在Ribi佐劑中的1-10昭抗 原對小鼠進行注射，持續30-40天。在最後強化免疫後的3-4天，收集引流 的淋巴結。採用常規技術將來自脾臟或淋巴結細胞的B細胞與SP2/OAg 14 細胞(17)融合。與單獨的融合伴倡比較，或與AP融合的受體胞外結構域(15) 比較，用ELISA篩選雜交瘤上清液中針對受體胞外結構域融合蛋白的抗體。 陽性孔然後使用編碼全長受體cDNA的表達質粒瞬時轉染的293F細胞，用 FACS進行篩選。選擇出的雜交瘤是單細胞克隆，適應無血清培養基，並在 CELLine瓶(Intergra)中擴增。雜交瘤上清液與等體積的1.5 M甘氨酸，3 M NaCl, lxPBS， pH7.8混合，並用MabSelect樹脂混勻。用結合緩衝液洗滌 所述樹指，並用0.1M甘氨酸，pH2.7洗脫。然後用2MTris進行中和，用 PBS透析mAb。
採用直接或間接ELISA鑑定純化的抗CLEC-6單克隆抗體用ELISA 檢測雜交瘤克隆的幾種抗CLEC mAb的相對親和性(即CLEC-6.Ig蛋白固定 到^f鼓量滴定板表面，以一系列劑量滴定檢測抗體結合CLEC-6.Ig的能力(用 抗小鼠IgG.HRP結合物試劑進行檢測))。各圖片分別是mAb對CLEC-6.Ig 蛋白的反應性(A和D); mAb對MgGFc蛋白的反應性(B和E)以及mAb對 CLEC-6.鹼性磷酸酶融合蛋白的反應性(C和F)。在後種情況中，mAb被滴定 板結合(通過抗小鼠IgG試劑)並且結合恆量的在溶液中的CLEC-6.AP。結果 表明抗CLEC-6 mAb與CLEC-6胞外結構域具有高度親和性的特異反應。
鑑定純化的抗CLEC-6單克隆抗體FACS對表達全長CLEC-6的293細 胞通過FACS進行幾種抗CLEC-6 mAb的相對親和性的4全測(即不同濃度 的CLEC-6.mAb與表達CLEC-6的293F細胞一起溫育；洗滌後，用PE衍生 的抗小鼠IgG試劑染色；結果是用染色的不表達CLEC-6的293F細胞進行 校正的平均螢光強度)。所示的所有4種mAb特異性地染色含CLEC-6細胞， 染色能力的等級次序是12H7~12E3>9D5〉20H8。
體內和體外培養DC表達CLEC-6 -用FACS測定來自正常供體的 PBMC上的CLEC-6的表達水平。如圖la所示，抗原呈遞細胞，包括CDllc十 DC、 CD14+單核細胞以及CD19+B細胞，表達CLEC-6。然而，CD3+T細 胞不表達CLEC-6。 CD56+ NK也不表達CLEC-6 (數據沒有顯示)。還測定體 外培養的DC以及純化的血髓樣DC (mDC)和漿細胞樣DC (pDC)上的 CLEC-6表達水平。圖lb中的數據表明IL-4DC和IFNDC均表達顯著水平 的CLEC-6。體外培養的DC上的CLEC-6表達水平是顯著的，因此可以利 用這些細胞進行實驗以揭示CLEC-6的功能。mDC也表達高水平的CLEC-6, 但pDC不表達CLEC-6 (數據沒有顯示)。後一觀察結果尤其重要，因為它們
32適用於直接從血中分離的細胞，並表明CLEC-6並不是所有DC類型中均存 在-因此表明通過CLCE-6的生物學可針對特定的DC類型，而已知這些特定 的DC類型具有不同的免疫功能。
選擇能夠激活DC的抗CLEC-6 mAb -分離了 12種不同的產生小鼠抗 人CLEC-6 mAb雜交瘤克隆，並檢測所產生的mAb的激活DC的能力，通 過測量DC表型和DC分泌的細胞因子和趨化因子來檢測。圖2中的悽史據顯 示可以鑑定激活DC的mAb的實例。在4種抗CLEC-6 mAb中，Ab49可以 激活DC,並誘導DC產生顯著量的分泌性IL-6、 MIP-la、 MCP-l、 IP-10以 及TNFa。這些抗CLEC-6 mAb也刺激DC產生IL-12p40 、 IL-1 a以及IL-1 b (數 據沒有顯示)。其它3種抗CLEC-6 mAb也激活DC,並且各mAb刺激DC 產生不同水平的細胞因子和趨化因子。
這些數據表明只有某些高親和性的抗CLEC-6 mAb才能激活人DC -這 是以前不為所知的生物學。這種引發DC分泌細胞因子的能力表明這種抗 CLEC-6劑可在體內影響免疫應答。
通過CLEC-6信號傳導激活DC細胞表面標記物-DC是決定免疫應答 結果的主要免疫細胞，即免疫誘導或耐受依賴於它們是否被激活(18)。本研 究中製備的某些抗CLEC-6 mAb可激活在體外培養的IFNDC (圖2)，還檢測 了 CLEC-6在激活不同的DC亞型(IL-4DC和血mDC. IL-4DC)中的作用。 IL-4DC用抗CLEC-6 mAb進行刺激，圖3a中的數據表明通過CLEC-6的信 號傳導激活IL-4DC，導致細胞表面標記物CD86和HLA-DR的增強表達。 抗CLEC-6 mAb也激活體內DC -純化的mDC用抗CLEC-6刺激18小時， 然後細胞用抗CD86、 CD80和HLA-DR染色。如圖3b所示，抗CLEC-6 mAb 激活mDC而使CD86、 CD80和HLA-DR的表達水平增加。圖3A和3B中 的數據表明由特異性抗CLEC-6 mAb激活DC，包括上調已知在DC功能中 重要的細胞表面分子。
通過CLEC-6的信號傳導特異性激活DC基因-同樣地，用抗CLEC-6 mAb刺激的DC的多種基因的表達水平增加，包括共刺激分子以及趨化因子 和細胞因子相關基因(圖4)。與通過其它凝集素，包括DC-ASGPR和LOX-1 的信號傳導(數據未顯示)相比，抗CLEC-6 mAb以獨特的方式激活DC,表 明通過CLEC-6激活的DC導致獨特的體液和細胞免疫應答。
通過CLEC-6的信號激活不同DC亞型中的基因-當用抗CLEC-6mAb 刺激時，體外培養的IL-4DC和mDC均產生顯著增加量的分泌性IL-12p40、 MCP-l和IL-8。在用抗CLEC-6 mAb刺激的DC的培養物上清液中也觀察到 其它細胞因子和趨化因子，包括TNFa、 IL-6、 MIP-la、 IL-la和IL-lb的水 平增加(數據未顯示)。這些細胞因子已知是免疫應答的關鍵介質，而發現特異性抗CLEC-6活性劑激發它們的產生為這些試劑可能的治療性應用提供支 持。
通過CLEC-6的信號傳導增強通過CD40的信號傳導-通過CLEC-6的 信號與通過CD40的信號協同用於增強DC的激活(圖6)。在CD40-CD40L 相互作用中CLEC-6結合導致顯著增加的細胞表面CD83的表達(圖6A)和分 泌性IL-12p70和IL-12p40的產生(圖6B)。其它細胞因子和趨化因子，包括 TNFa、 IL-6、 MCP-1、 MIP-la、 IL-la和IL-lb也顯著增加(數據未顯示)。這 是重要的，因為CLEC-6可以作為體內DC激活的共刺激分子。總而言之， 從圖1到圖6提供的數據證明通過CLEC-6的信號傳導可以激活DC,且 CLEC-6作為DC激活的有效共刺激分子。
通過CLEC-6刺激的DC誘導強的體液免疫應答-DC通過提供T-依賴 型和T-非依賴型B細胞反應的信號(20-23)並轉移抗原至B細胞(24、 25)而在 體液免疫應答中起著重要作用。除DC外，經TLR9的信號傳導作為第三級 信號是有效B細胞反應所必需的(26、 27)。因此，我們測試了在TLR9配體
用抗CLEC-6 mAb進行刺激，然後與純化^B細胞共培養。如圖7a所示， 與在CpG存在下用對照mAb刺激的DC相比，用抗CLEC-6 mAb激活的 DC導致顯著增強的B細胞增殖(經CFSE稀釋測定)和漿細胞分化 (CD38+CD2(T細胞群增加)。CD38+CD2(T B細胞具有漿細胞的典型形態，但 不表達CD138(數據未顯示)。大多數增殖細胞不表達CCR2、 CCR4、 CCR6 或CCR7 (數據未顯示)。
用ELISA測定產生的總免疫球蛋白(Ig)的量(圖7b)。抗CLEC-6與針對 其他凝集素LOX-l和DC-ASGPR的mAb進4亍比較。與圖7a中的數據一致， B細胞與用抗CLEC-6激活的DC —起培養顯著增加了總IgM、 IgG和IgA 的產生。用抗L0X-1刺激的DC導致B細胞產生類似水平的IgM、 IgG和 IgA。但與用抗CLEC-6和抗LOX-l mAb刺激的DC不同，用抗DC-ASGPR mAb刺激的DC導致IgG和IgA的量顯著降低，表明通過CLEC-6和LOX-l 的信號傳導誘導B細胞免疫球蛋白類別轉換。除總Ig外，由LOX-l觸發激 活的DC比用對照mAb刺激的DC對產生流感病毒特異性IgM、 IgG和IgA 更強烈(數據未顯示)。
抗CLEC-6激活的DC導致增強的B細胞應答的機制涉及增殖誘導配體 (APRIL)。 DC產生的B淋巴細胞刺激蛋白(BLyS, BAFF)和APRIL是重要的 分子，DC通過它們能夠直接調控人B細胞的增殖和功能(28-31)。圖7C中 的數據表明通過CLEC-6刺激的DC增加胞內APRIL和分泌性APRIL的表
34達水平，但不增加表達BLyS (數據未顯示)。測量在混合培養物中的B細胞 上的BLyS和APRIL受體的表達水平，但是沒有顯著差異(數據未顯示)。
抗CLEC-6mAb直接影響人B細胞-CD19+B細胞表達CLEC-6 (圖1), 表明CLEC-6在B細胞生物學中的作用。圖8a的凝:據顯示觸發B細J包上的 CLEC-6導致分泌性IL-8和MIP-la的產生增加，表明CLEC-6也對B細胞 激活起作用。相對於對照mAb，除IL-8和MIP-la夕卜，用抗CLEC-6 mAb 剌激B細胞時也觀察到IL-6和TNFa輕微增加(數據未顯示)。抗CLEC-6 mAb 激活的B細胞分泌的總IgG、 IgM和IgA的量增加(圖8b)。
這些觀察結果證明了在上述抗CLEC-6活性劑對B細胞生物學的間接影 響(即經DC發揮作用)的研究中CLEC-6的直接作用。總而言之，這些數據 揭示體內給予所述活性劑將刺激抗體的產生的高度可能性-例如作為疫苗
的佐劑，或者(如下所示)作為直接載體用於將抗原靶向DC和其它抗原呈遞 細胞以引發有效的抗原特異性抗體反應。
T細胞應答中的CLEC-6的作用-經CLEC-6刺激的DC表達的共刺激 分子的水平增強和產生的細胞因子和趨化因子的量增加(圖1、 2和3),表明 CLEC-6在細胞免疫應答以及體液免疫應答中發揮著作用。這通過混合淋巴 細胞反應(MLR)來測定。純化的同種異源T細胞的增殖被用CLEC-6特異性 的mAb激活的DC顯著增強(圖9a)。
通過CLEC-6激活的DC,在用Flu Ml的HLA-A2抗原表位(圖9B上部 的兩個圖片)以及重組FluMl蛋白(圖9B下部的兩個圖片)脈衝刺激DC時， 還導致增強的Flu Ml特異性CD8 T細胞應答，這表明用抗CLEC-6激活的 DC增強了蛋白抗原的交叉呈遞。對於治療性應用例如疫苗，如果通過 CLEC-6的信號傳導導致DC對原始CD8 T細胞致敏(priming)和交叉致敏的 能力發生改變將是有益的。實際上，圖9C的數據顯示用抗CLEC-6mAb激 活的DC導致Mart-l特異性CD8 T細胞致^:的顯著增強(圖9C上部兩個圖 片)以及交叉致敏的顯著增強(圖9C下部兩個圖片)。總而言之，圖9A、 B和 C的數據表明CLEC-6在增強DC功能，引起抗原特異性CD8 T細胞應答的 增強中起著重要作用。
為了確認CLEC-6在疫苗中的潛在用途，抗CLEC-6 rAb-抗原複合物與 對照rAb-抗原複合物在抗原特異性CD8 T細胞應答方面進行比較。用10 nM rAb-Mart-l融合蛋白負載IFNDC，並且與自體同源CD8 T細胞進行共培養 10天。然後用抗CD8和Mart-l四聚體染色細胞。圖9d的凝:據顯示抗CLEC-6 rAb-抗原相對於對照而言誘導了顯著增強的Mart-l特異性CD8 T細胞應答 (圖9D上部兩個圖片)。圖9D下部兩個圖片的數據是在20 ng/ml LPS (來自 大腸桿菌)存在下獲得的數據。為了進一步測試抗CLEC-6 rAb用於疫苗應用
35的用途，mDC用抗CLEC-6-Flu HA1複合體或對照rAb-Flu HA1複合體負載。 純化的自體同源CD4 T細胞共培養7天，然後通過CFSE稀釋測定HAl-特 異性CD4T細胞增殖。如圖9E(上部兩個圖片)所示，抗CLEC-6rAb HA1比 對照rAb-HAl誘導了更大的HAl-特異性CD4 T細胞增殖。圖9E下部兩個 圖片中的數據是在20 ng/ml LPS (來自大腸桿菌)存在下獲得的數據，該LPS 掩蓋了 CLEC-6特異性作用。
下面顯示的數據作為採用抗CLEC-6抗原複合物用於疫苗接種目的的臨 床前驗證。總之，它們表明這些原型疫苗能夠將抗原導向靶標DC,並且設 想與通過結合CLEC-6的相關激活一起以攝取、加工以及呈遞給特異性記憶 和原初T細胞，並且引起它們的後續擴增。僅僅這種性質足以引發抗原特異 性細胞應答，其是癌症疫苗(殺死癌症細胞)或病毒疫苗(清除感染細胞)的關 鍵組成部分。而且，HA1-特異性D4的擴增表明抗CLEC-6原型疫苗使T細 胞群類型擴增，這是激發抗原-特異性體液(抗體)應答的關鍵。上述數據顯示 抗CLEC-6活性劑對Ig類別轉換的作用進一步增強了這些疫苗的高度潛在的 獨特特性。
非人靈長類動物體內DC表達CLEC-6-為檢測非人靈長類動物(食蟹猴) 的血DC是否對抗人CLEC-6 mAb有反應，用抗CLEC-6 mAb和針對其它細 胞標記物CD3、CD14、CDllc、CD27、CD56和CD16的抗體來染色猴PBMC。 圖10中的數據表明CD14和CD1 lc+細胞^皮抗L0X-1 mAb染色。然而，CD3+、 CD16+、 CD27+和CD56+細胞不表達CLEC隱6。
這些數據是重要的，因為驗證了猴作為本發明預期的各種治療性抗 CLEC-6活性劑的效果和安全性的臨床前研究的相關模型。
考慮任何本說明書中討論的實施方案可通過本發明的任何方法、試劑 盒、試劑或組合物實現，反之亦然。此外，本發明的組合物可用於完成本發 明的方法。
應理解，本文描述的特定實施方案以例證的方式顯示而不作為本發明的 限制。不背離本發明的範圍的前提下，可以在多種實施方案中使用本發明的 基本特徵。本領域技術人員將識別或僅使用常規實驗能夠確定本文描述的特 定操作的許多等價物。這樣的等價物被認為是在本發明的範圍之內並被權利 要求書所覆蓋。
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詞語"一"當和術語"包括"、"包含"、"含有"在權利要求書和/或說明 書中一起使用時可以表示"一個(種)"，但是也與"一個(種)或多個(種)"、"至少
36一個(種)"和"一個(種)或一個(種)以上"的意思一致。在權利要求書中術語"或" 的使用用於表示"和/或"，除非儘管公開的內容支持指代唯一的替換物以及" 和/或"的定義，但是權利要求書中明確指出指的是唯一的替換物或替換物是 相互排斥的。貫穿本申請，術語"大約"用於表示數值包括裝置、使用來測定 該值的方法的固有誤差變異，或存在於研究受試者之中的變化。
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權利要求
1.一種用於增加表達CLEC-6的抗原呈遞細胞的抗原呈遞效力的方法，所述方法包括使所述抗原呈遞細胞與抗CLEC-6特異性抗體或其片段接觸，其中所述抗原呈遞細胞被激活。
2. 根據權利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括分離的樹突細胞、外周血單核細胞、單核細胞、髓樣樹突細胞及其組合。
3. 根據權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括已在體外與GM-CSF和IL-4、幹擾素a、抗原及其組合一起培養的如下細胞分離的樹突細胞、外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、髓樣樹突細胞及其組合。
4. 根據權利要求1的方法，進一步包括用GM-CSF和IL-4激活所述抗原呈遞細胞的步驟，其中與CLEC-6特異性抗體或其片段接觸增加抗原呈遞細胞上的CD86和HLA-DR的表面表達。
5. 根據權利要求1的方法，進一步包括用CLEC-6特異性抗體或其片段激活所述抗原呈遞細胞的步驟，該激活增加抗原呈遞細胞上的CD86、CD80和HLA-DR的表面表達。
6. 根據權利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細胞是樹突細胞，所述樹突細胞由CLEC-6特異性抗體以及GM-CSF和IL-4激活而具有圖4的基因表達語。
7. 根據權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞由CLEC-6特異性抗體激活而分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、 TNFa及其組合。
8. 根據權利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細胞是樹突細胞，所述樹突細胞由CLEC-6特異性抗體激活而分泌IL-6、 MIP-la、 MCP-1、 IP-IO、TNFa、 IL-12p40、 IL-la、 IL-lb及其組合。
9. 根據權利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突細胞已與GM-CSF和IL-4或幹擾素a、 CLEC-6特異性抗體或其片段和CD40配體接觸以增強該樹突細胞的激活。
10. 根據權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突細胞已與GM-CSF和IL-4或幹擾素a和CLEC-6特異性抗體或其片段接觸，增強了該樹突細胞的共刺激活性。
11. 根據權利要求1的方法，進一步包括共激活所述抗原呈遞細胞的步驟，該激活通過TLR9受體進行，其中所述細胞增加細胞因子和趨化因子的產生。
12. 根據權利要求l的方法，進一步包括共激活所述抗原呈遞細胞的步驟，其通過用GM-CSF、 IL-4和TLR9受體配體激活所述細胞來進行，其中所述樹突細胞觸發B細胞增殖。
13. 根據權利要求l的方法，進一步包括共激活所述抗原呈遞細胞的步驟，其通過在B細胞存在下用CLEC-6和LOX-l激活所述細胞來進^",其中所述抗原呈遞細胞誘導B細胞免疫球蛋白類別轉換。
14. 根據權利要求l的方法，進一步包括共激活所述抗原呈遞細胞的步驟，該激活使用TLR9配體、抗TLR9抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6雜交抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6配體結合物中至少之一通過TLR9受體來進行。
15. 根據權利要求1的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段選自克隆12H7、 12E3、 9D5、 20H8及其組合。
16. 根據權利要求l的方法，其中用CLEC-6特異性抗體或其片段通過CLEC-6-受體激活的樹突細胞激活單核細胞、樹突細胞、外周血單核細胞、B細胞及其組合。
17. 根據權利要求l的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對的 一 半結合。
18. 根據權利要求1的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對的一半結合，而互補性一半與抗原結合。
19. 根據權利要求1的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/粘附蛋白對的一半結合，而互補性一半與抗原結合，所述抗原選自分子、肽、蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、細胞、病毒或其部分、細菌或其部分、真菌或其部分、寄生蟲或其部分。
20. 根據權利要求l的方法，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對的一半結合，而該對的另一半與一種或多種細胞因子結合，所述細胞因子選自白細胞介素，轉化生長因子(TGF),成纖維細胞生長因子(FGF),血小板衍生生長因子(PDGF),表皮生長因子(EGF),結締組織活性肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生物，B/T細胞分化因子，B/T細胞生長因子，促有絲分裂細胞因子，趨化細胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a， IFN-(5， IFN-y，IU, IL2, IU, IL4, IL5， IL6, IL7, IL8， IL9， EL10, ILll， IL12， IU3,IL14， IL15， IL16， IL17， IL18等,瘦素，肌肉生長抑制素，巨噬細胞刺激蛋白，血小板衍生生長因子，TNF-a， TNF-卩，NGF， CD40L， CD137L/4-lBBL，人淋巴毒素-卩，G-CSF, M-CSF, GM隱CSF, PDGF， IL-la, ILl-p， IP畫IO，PF4， GRO， 9E3，促紅細胞生成素，內皮抑素、血管抑素、VEGF，包括卩轉化生長因子(例如TGF-pi、 TGF-p2、 TGF-(33)在內的轉化生長因子(TGF)超基因家族；骨形態發生蛋白(例如BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結合生長因子(成纖維細胞生長因子(FGF)，表皮生長因子(EGF)，血小板衍生生長因子(PDGF),胰島素樣生長因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。
21. —種用於將髓樣樹突細胞與漿細胞樣樹突細胞分開的方法，所述方法包括利用CLEC-6表達將表達CLEC-6的髓樣樹突細胞、B細胞或單核細胞與不表達CLEC-6的漿細胞樣樹突細胞分離。
22. 表達CLEC-6特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述CLEC-6特種細胞因子或既表達新的表面標記物又分泌一種或多種細胞因子。
23. 根據權利要求22的雜交瘤，其中所述雜交瘤選自克隆12H7、 12E3、9D5、 20H8及其組合。
24. —種用於增強B細胞免疫應答的方法，所述方法包括觸發B細胞上的CLEC-6受體，以增加抗體產生、分泌細胞因子、增加B細胞活化表面標記物的表達及其組合。
25. 4艮據權利要求24的方法，其中所迷B細胞分泌IL-8、 MIP-la和其組合。
26. 根據權利要求24的方法，其中所述B細胞增加IgM、 IgG和IgA的產生。
27. —種用於增強T細胞活化的方法，所述方法包括用CLEC-6特異性 抗體或其片段觸發樹突細胞上的CLEC-6受體，並使T細胞與CLEC-6活化 的樹突細胞接觸，其中T細胞的活化被增強。
28. 根據權利要求27的方法，其中所述T細胞是原初CD8+T細胞。
29. 根據權利要求27的方法，其中所述樹突細胞進一步與GM-CSF和 IL-4、幹擾素a、抗原及其組合接觸。
30. 根據權利要求27的方法，其中所述T細胞增加IL-IO、 IL-15的分泌。
31. 根據權利要求27的方法，其中所述T細胞增加4-1BBL的表面表達。
32. 根據權利要求27的方法，其中所述T細胞在暴露於用抗CLEC-6 抗體或其片段激活的樹突細胞時增殖。
33. 由哺乳動物細胞分泌的抗CLEC-6免疫球蛋白或其部分和與所述免 疫球蛋白結合的抗原。
34. 根據權利要求33的免疫球蛋白，其中所述抗原特異性結構域包括全 長抗體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段， 以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段。
35. —種疫苗，其包含由CLEC-6特異性抗體或其片段激活的樹突細胞。
36. 根據權利要求35的疫苗，其中所述疫苗選自SEQIDNO: 1-7。
37. —種模塊式rAb載體，其包含CLEC-6特異性抗體結合結構域，該 結合結構域與一種或多種包含粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一半的抗原載體 結構域連接。
38. 根據權利要求37的rAb,其中所述抗原特異性結合結構域包含抗體 的至少一部分。
39. 根據權利要求37的rAb,其中所述抗原特異性結合結構域包含與粘 附蛋白-錨定蛋白結合對的 一半構成融合蛋白的抗體的至少一部分。
40. 根據權利要求37的rAb,其還包含與抗原結合的粘附蛋白-錨定蛋 白結合對的互補性一半，所述抗原與模塊式rAb載體形成複合物。
41. 根據權利要求37的rAb，其還包含與抗原構成融合蛋白的粘附蛋白 -錨定蛋白結合對的互補性一半。
42. 根據權利要求37的rAb，其中所述抗原特異性結構域包括全長抗體、 抗體可變區結構域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、Fv片段，以及Fabc 片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段。
43. 單獨或與共激活劑一起結合免疫細胞上的CLEC-6受體，組合激活 抗原呈遞細胞的試劑用於治療性應用的用途。
44. 免疫細胞上的CLEC-6結合劑用於製備疫苗的用途，所述CLEC-6 結合劑與或不與激活劑 一起與 一種或多種抗原連接。
45. 抗CLEC-6劑作為免疫細胞的共激活劑用於增強免疫應答的用途， 該免疫應答是通過免疫細胞上表達的除CLEC-6外的細胞表面受體引起的。
46. 能夠通過CLEC-6受體結合併激活免疫細胞的抗CLEC-6抗體V區 序列的用途。
47. 與一種或多種毒性劑連接的CLEC-6結合劑用於治療性目的的用 途，該治療性目的是處在已知或懷疑由經CLEC-6的免疫細胞的不適當激活 導致的疾病的情況下或在表達CLEC-6的病理細胞或組織的情況下。
全文摘要
本發明包括利用新的抗CLEC-6抗體及其片段用於調控免疫細胞的活性的組合物和方法。
文檔編號C07K17/14GK101668777SQ200880013398
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月22日 優先權日2007年2月23日
發明者G·祖拉夫斯基, J·F·班徹羅, S·吳, S·祖拉夫斯基, 李大鵬 申請人:貝勒研究院