可編程的寡核苷酸微陣列的製作方法

2023-09-16 14:36:05 1

專利名稱：可編程的寡核苷酸微陣列的製作方法
可編程的寡核苷酸微陣列
背景技術：
核酸的定量測試在基礎生物學研究以及在諸如臨床微生物學領域中都非常重要。 二十世紀九十年代中期已開發了實時聚合酶鏈反應(實時PCR)方法，通過提供樣本中任 意靶DNA的拷貝數的可靠、準確的定量測量以改善最初的PCR方法。在實時PCR中，將僅 在結合到靶DNA時才具有活性的螢光探針加入到PCR緩衝液中。這些螢光探針是DNA單 鏈，其中間部分具有與靶DNA互補的核苷 酸序列。在該中間部分的任意一端，是彼此互補的 延伸核苷酸序列，以致於未結合的探針可自我摺疊成髮夾構型。該螢光探針在其一端具有 螢光分子，在另一端具有螢光淬滅分子。未結合的摺疊探針具有相互鄰近的發螢光分子和 淬滅分子，因此當未結合的探針被照射時，沒有螢光發出。然而，當螢光探針結合到它的靶 DNA上時，它是展開的，發螢光和淬滅分子相互隔開。當用合適波長的光照射結合的探針時， 螢光分子就發出螢光。通過給特定靶DNA提供足夠的螢光探針，並在PCR的每個階段測量 結合的探針的螢光，即可以測得反應每個階段的擴增子的數量。這樣的測試方法可用於非 常精確地確定初始樣本中的DNA拷貝數，因為擴增子的數量達到預定臨界值的分部循環數 (fractional number of cycles)與初始樣本中的拷貝數的對數之間呈直線關係。


參照以下解釋本發明的實施方式的說明和附圖，將能更好地理解這些實施方式。 附圖中圖1所示為解鏈溫度(Tm)-探針_擴增子複合物比例的曲線圖；圖2所示為在PCR過程的起始階段，能夠以漸消波(evanescentwave)檢測微陣列 PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒(cartridge)的截面視圖；圖3所示為利用PCR過程的第一組靶核酸探針的雜交溫度(Thl)，在退火和延伸階 段末期，能夠以漸消波檢測微陣列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖4所示為在第一組靶核酸探針的PCR過程的變性階段，能夠以漸消波檢測微陣 列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖5所示為在第一組靶核酸探針的PCR過程的檢測階段，能夠以漸消波檢測微陣 列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖6所示為利用PCR過程的第二組靶核酸探針的雜交溫度(Th2)，在退火和/或 延伸階段末期，能夠以漸消波檢測微陣列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視 圖；圖7所示為在第二組靶核酸探針的PCR過程的變性階段，能夠以漸消波檢測微陣 列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖8所示為在第二組靶核酸探針的PCR過程的檢測階段，表現漸消波檢測微陣列 PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖9所示為利用PCR過程的第三組靶核酸探針的雜交溫度(Th3)，在退火和/或 延伸階段末期，能夠以漸消波檢測微陣列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖10所示為在第三組靶核酸探針的PCR過程的變性階段，能夠以漸消波檢測微陣 列PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖；圖11所示為在第三組靶核酸探針的PCR過程的檢測階段，表現漸消波檢測微陣列 PCR過程中的螢光標記擴增子的反應盒的截面視圖。定義本文中所使用的某些術語具有如下含義。本說明書中使用的所有其它術語和短語 具有本領域的技術人員理解的一般含義。這種一般含義可參考技術詞典得知，如Hawley's Condensed Chemical Dictionary 第 11版，Sax禾口 Lewis, VanNostrand Reinhold, New York, N. Y.，1987，以及 The Merck Index，第 11 版，Merck&Co.，Rahway N. J. 1989。本文使用的術語「和/或」是指任意一個項目、項目的任意組合，或者與該項目相 關的所有項目。本文使用的單數形式「一」可包括複數形式，除非上下文清楚地指明不包括。因此， 例如，一種製劑可包括多個這樣的製劑，從而化合物X的製劑可包括化合物X的多種製劑。本文使用的術語「約」是指特定數值的10%的變化範圍，例如，約50%的變化範圍 是45-55%。對於整數範圍，該術語「約」可包括大於和小於所述整數的1或2個整數。本文使用的術語「擴增子」是指聚合酶鏈反應(PCR)的產物。擴增子是利用擴增 技術(如帶有兩個引物的雙鏈DNA)合成的DNA片段。例如，擴增子可包括用螢光分子在5』 端標記的引物。本文使用的術語「陣列」和「微陣列」是指元件(即實體)在材料或裝置中的排列。 換句話說，術語「陣列」是指底物上的兩個或多個測定區域的有序排列(如排和列)。本文使用的術語「互補的」或「互補性」的使用涉及按照鹼基配對原則相關聯的多 核苷酸(即核苷酸序列)。本文使用的術語「臨界角」是指大於發生全內反射角度的入射角。本文使用的術語「漸消的」是指隨距離呈指數衰減的近場駐波。如在光學中所用， 當正弦波以大於臨界角的角度從界面上發生內反射從而發生全內反射時，漸消波產生。本文使用的術語「雜交」是指互補核酸的配對。本文使用的術語「Th」是指「雜交溫度」。該雜交溫度通常比核酸的Tm(解鏈溫度) 低約10°c。本文使用的術語「核酸分子」是指含有包括但不限於DNA或RNA分子的任意核酸。 該術語包括諸如含有DNA和RNA的任何已知的鹼基類似物的序列。本文所使用的術語「聚 合酶鏈反應」 (PCR)是指美國專利4，683，195,4, 683，202和4，965，188公開的K. B. Mullis 的方法。本文使用的術語「DNA聚合酶」是指在發生作用時具有高於40°C的最佳溫度的熱 穩定DNA聚合酶。本文使用的術語「引物」是指能夠在合適條件下作為模板引導DNA合成的起始位 點作用的單鏈多核苷酸。本文使用的術語「探針」是指能夠通過一種或多種化學鍵結合到互補序列的靶核 酸的核酸，其通常是通過互補的鹼基配對且通常是通過氫鍵形成，從而形成雙股結構。探針結合或雜交到「探針結合位點」。可以利用可檢測的標籤對探針進行標記，以容易地檢測探針，尤其是當探針與其互補靶鏈雜交的時候。結合到探針的標籤可包括本領域已知的多種 不同標籤的任意一種，例如，該標籤可通過化學或物理方式檢測。能結合到探針的標籤可包 括如螢光和冷光材料。探針在大小上可顯著變化。一些探針相對短。通常，探針的長度至少 是7-15個核苷酸。其它探針的長度至少是20、30或40個核苷酸。有些探針的長度更長， 至少是100、150、200或更多個核苷酸的長度。探針的長度也可以是落入前述範圍內的任意 的特定長度。本文使用的術語「底物」是指能夠支持相關測試要素(如測定區域、細胞、測試化 合物等)的材料。例如，在一些實施方式中，底物可包括平面(即2維)玻璃、金屬、合成物、 塑料、矽石或其它生物兼容或不起生物反應(或起生物反應)的組合物。所述底物通常是 扁平的，但也可呈現多種替代表面構型。也可以選擇底物和其表面以提供合適的光吸收性 能。例如，所述底物可以是聚合的Langmuir Blodgett膜、功能化玻璃、玻璃、石英、Si、Ge、 GaAs、GaP、Si02、SiN4、改性矽、或任意一種寬範圍內的凝膠或聚合物，例如(聚)四氟乙烯、 (聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯等聚烯烴，或者其組合。本文使用的術語「靶核酸」是指待檢測病原體固有的多核苷酸。該多核苷酸是包 括例如DNA/RNA、線粒體DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA以及質粒DNA的遺傳材料。本文使用的術語「靶核酸探針」是指與靶核酸互補的多核苷酸。本文使用的術語「Tm」是指「解鏈溫度」。解鏈溫度是在該溫度下雙鏈核酸分子的 總量半數解離成單鏈的溫度。計算核酸Tm的公式在本領域內是公知的(參見Anderson和 Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization(1985))。 對於固定的寡核苷酸探針，一般地Tm (°C ) = 2 (腺苷和胸苷殘基的數量)+4 (鳥苷和胞核嘧 啶殘基的數量)。
具體實施例方式本發明提供一種能夠實時、同時、定量測量來自樣品中一種或多種病原體的多個 靶核酸的方法、裝置和系統。在一個實施方式中，利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增樣本中的靶核酸。PCR是一種 擴增脫氧核糖核酸(DNA)的一個或多個鏈的公知方法。通過將靶核酸置於緩衝液中開始 PCR，所述緩衝液含有核苷酸腺苷(ATP)、胸苷(TTP)、胞嘧啶(CTP)以及鳥苷(GTP)(統稱 dNTPs)、DNA聚合酶和引物。引物是DNA短鏈，具有與待擴增的靶核酸互補的序列。引物啟 動靶核酸的複製。在一個實施方式中，靶核酸引物可在5』端用螢光分子進行螢光標記。在另一個 實施方式中，靶核酸引物之一可在5』端用螢光分子進行螢光標記。在另一個實施方式中， dNTPs被螢光標記。PCR過程具有三個主要步驟變性、退火和延伸。在變性步驟中，混合物被加熱到 94°C (攝氏度)，在該點，靶DNA分開成為單鏈。混合物被迅速冷卻。當溫度下降到約60°C， 退火步驟發生，其中可被螢光標記的引物雜交或結合到靶核酸上的它們的互補序列。延伸 步驟可以在約60°C下，或者可升溫到72-78°C的範圍進行。在這個步驟中，DNA聚合酶利用 溶液中的dNTPs延伸退火的引物，並形成被稱為擴增子的DNA新鏈，所述引物可被螢光標記。混合物再次簡單地被加熱到約94°C，以將新形成的雙螺旋鏈分開成單鏈的核酸，其開始 PCR過程的另一輪循環。隨著PCR過程每個循環，起始靶核酸的拷貝數大致上加倍。對於靶核酸的實時定量分析，多種使用漸消波檢測技術的方法已被公開，包括例 如，Xu(美國專利申請公開文本2006/0088844)描述的技術，以及2007年11月05日申請 的申請號為PCT/CN2007/003124，題為「寡核苷酸微陣列的定量方法」的PCT專利申請中描 述的技術。在一個實施方式中，PCR緩衝液還含有螢光標記引物，即具有與其結合的螢光染料 分子的引物，從而一旦每個PCR循環完成，產生的擴增子被螢光標記。靶核酸的擴增子利用 已知作為靶核酸探針的DNA探針鏈定位。靶核酸探針具有與靶核酸同樣互補的核苷酸序 列。靶核酸探針以熟知的二維圖案固定到底物表面上，所述底物表面形成含有PCR成分的 反應小室的一部分。在PCR過程的退火和延伸階段，靶擴增子雜交到其相應的靶核酸探針。用合適波 長的光的漸消波照射雜交的螢光標記擴增子，以激活螢光標記引物或螢光標記dNTPs的熒 光染料分子。在經固定靶核酸探針的底物表面進入反應小室後，該漸消波的能量呈指數衰 減，其有效穿透範圍約300nm。這意味著漸消波能穿透足夠遠以進入反應小室內，以激活與 那些靶核酸探針雜交的螢光標記擴增子，但是它不激活反應小室主體內的溶液中的螢光標 記分子(如螢光標記引物或螢光標記dNTPs)。通過監測底物表面上的各個位置處的螢光的 強度，可檢測相應靶核酸的擴增子的當前豐度。這可在PCR進行的過程中實時地完成。所 述結果用於以類似於實時PCR計算的方式，獲得初始樣本中的特定靶鏈豐度的定量測量。在另一實施方式中，靶核酸探針被設計為與從選自細菌、病毒、真菌和原生動物的 病原體中分離出的多核苷酸互補。在又一實施方式中，靶核酸探針被設計為與從以下病原 體中分離的多核苷酸的特定區域互補立克次氏體(Rickettsia)、衣原體(Chlamydia)、 支原體(Mycoplasma)、螺旋體(Spirochete)、鏈球菌(Streptococcus)、沙門氏菌 (Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、單核細胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)、 腦膜炎奈瑟菌(N.meningitides)、大腸桿菌(E. coli)、流感嗜血桿菌(H. influenzae)、伯 氏疏螺旋體(B. burgdorferi)、細螺旋體(L印tospira)、變形桿菌(Proteus)、厭氧桿菌 (Anaerobacter)、結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、腸球菌(Enterococcus)、脊髓灰質炎 __ 1 M (H. poliovirus 1)、] __ 71 M (H. enterovirus 71)、] __ 70 (H. enterovirus 70)、艾柯病毒2型(H. echovirus 2)、艾柯病毒4型(H. echovirus 4)、艾柯病毒6型 (H. echovirus 6)、艾柯病毒 9 型(H. echovirus 9)、艾柯病毒 11 型(H. echovirus 11)、 艾柯病毒12型(H. echovirus 12)、艾柯病毒26型(H. echovirus26)、柯薩基病毒A13型 (H. coxsackievirus A13)、柯薩基病毒 A15 型(H. coxsackievirus A15)、柯薩基病毒 A18 型(H. coxsackievirusA18)、柯薩基病毒 A20 型(H. coxsackievirus A20)、柯薩基病毒 A21 型(H. coxsackievirus A21)、柯薩基病毒 B3—A 型(H. coxsackievirus B3—A)、柯薩基病毒 B3-C 型(H. coxsackievirus B3-C)、HSV-1 及 HSV-2。在一個實施方式中，PCR使用的探針包括選自SEQ ID NO :1_9(表1)的寡核苷酸
權利要求
一種分析靶核酸的定量方法，其包括在底物上表面的獨立區域內固定兩組或更多組靶核酸探針；在每組的雜交溫度下將一個或多個螢光標記靶擴增子獨立退火至每組靶核酸探針；在每組的雜交溫度下獨立激活來自與每組靶核酸探針雜交的一個或多個螢光標記靶擴增子的螢光應答；在每組靶核酸探針的雜交溫度下獨立檢測用於一個或多個靶核酸定量分析的各螢光應答；其中，各螢光應答的獨立激活是通過利用預定波長的漸消波。
2.根據權利要求1所述的定量方法，其特徵在於，所述每組靶核酸探針包括具有相互 溫度差異在10%以內的雜交溫度的一個或多個靶核酸探針。
3.根據權利要求1所述的定量方法，其特徵在於，所述每組的雜交溫度是每組中一個 或多個靶核酸探針的雜交溫度的平均值。
4.根據權利要求1所述的定量方法，其特徵在於，所述退火發生於聚合酶鏈反應過程中。
5.根據權利要求4所述的定量方法，其特徵在於，所述各螢光應答的檢測發生於聚合 酶鏈反應的退火步驟或延伸步驟中。
6.根據權利要求5所述的定量方法，其特徵在於，所述聚合酶鏈反應是實時聚合酶鏈 反應。
7.根據權利要求1所述的定量方法，其特徵在於，所述底物包括選自矽石、塑料、玻璃、 石英玻璃、陶瓷、橡膠、金屬、聚合物、雜交膜或它們的組合的材料。
8.根據權利要求2所述的定量方法，其特徵在於，利用微陣列印表機將一個或多個靶 核酸探針列印並固定到底物上。
9.根據權利要求8所述的定量方法，其特徵在於，所述底物用選自矽烷、抗生物素蛋 白、聚L-賴氨酸、鏈黴親和素、多糖、硫醇或它們的組合的試劑進行化學修飾。
10.根據權利要求1所述的定量方法，其特徵在於，每組靶核酸探針包括一個或多個靶 核酸探針。
11.根據權利要求1所述的定量方法，其特徵在於，所述一個或多個靶核酸從一種或多 種病原體得到，其中一種或多種病原體為病毒、細菌、古生菌、真菌、原生動物、支原體、朊病 毒、寄生有機物或它們的組合。
12.根據權利要求11所述的定量方法，其特徵在於，所述一種或多種病原體為立克次 氏體、衣原體、支原體、螺旋體、鏈球菌、葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、 大腸桿菌、流感嗜血桿菌、伯氏疏螺旋體、細螺旋體、變形桿菌、厭氧桿菌、沙門氏菌、結核分 枝桿菌、腸球菌、脊髓灰質炎病毒、腸病毒、柯薩基病毒、HSV-l、HSV-2，或它們的組合。
13.一種定量分析靶核酸的裝置，其包括底物，其具有上、下表面和大於水的折射係數的折射係數；實質上與底物上表面接觸的緩衝液，所述緩衝液能夠支持多個擴增反應和多個核苷酸 雜交反應，並包含一種或多種螢光標記引物、一種或多種任選的螢光標記dNTPs和一種或 多種靶核酸；在底物上表面的獨立區域和緩衝液中的兩組或更多組靶核酸探針，其中每組靶核酸探針包括一個或多個靶核酸探針，且其中每組靶核酸探針包含具有等同雜交溫度的一個或多 個靶核酸探針；其中，每組靶核酸探針中的一個或多個靶核酸探針具有與靶核酸的核苷酸序列相應或 互補的核苷酸序列；光線，具有選定波長以激活一個或多個螢光標記靶擴增子，以選定角度入射到底物和 緩衝液之間的界面，以便漸消波傳播進入緩衝液；檢測器，其能夠檢測由一個或多個螢光標記靶擴增子發射的螢光。
14.根據權利要求13所述的裝置，其特徵在於，還包括能夠使緩衝液溫度循環的加熱 元件，由此使多個擴增反應成為可能。
15.根據權利要求13所述的裝置，其特徵在於，所述多個核苷酸雜交反應是實時聚合 酶鏈反應。
16.根據權利要求13所述的裝置，其特徵在於，所述檢測器是可移動的，並能夠順序檢 測由與兩組或更多組靶核酸探針結合的一個或多個螢光標記靶擴增子發射的螢光。
17.根據權利要求13所述的裝置，其特徵在於，底物是可移動的，並能夠被檢測器順序 定位。
18.—種進行定量聚合酶鏈反應分析的系統，所述系統包括包括固定在底物上表面不同區域內的多組靶核酸探針的DNA微陣列，其中每組靶核酸 探針包含具有等同雜交溫度的一個或多個靶核酸探針；與DNA微陣列進行熱交流的熱循環儀；提供輸出信號的至少一個檢測器；其中所述至少一個光敏檢測器能夠檢測由一個或多 個螢光標記靶擴增子發射的螢光；至少一個光源，其中所述光源定位為從其發射的光經過DNA微陣列到所述至少一個光 敏檢測器；分析來自檢測器的輸出信號和確定表示聚合酶鏈反應分析的定量螢光信息的工具。
19.根據權利要求17所述的系統，其特徵在於，可對所述DNA微陣列、熱循環儀、至少一 個檢測器、至少一個光源和分析輸出信號的工具進行編程，以在檢測過程中相互協作。
20.根據權利要求17所述的系統，其特徵在於，所述熱循環儀包括加熱元件和冷卻元 件，或同時用於加熱和冷卻的一個元件。
全文摘要
本發明提供DNA微陣列的可編程探針設計和檢測方法。設計與靶DNA互補的DNA探針並依據最佳雜交溫度歸類到組。探針按組排列並固定到DNA微陣列的底物表面。控制系統、成像系統和溫度控制系統可編程為在檢測過程中相互協作。該設計提高了平行分析系統的檢測能力。
文檔編號C12Q1/68GK101946006SQ200780102357
公開日2011年1月12日 申請日期2007年12月24日 優先權日2007年12月24日
發明者H·廖, W·王, Z·H·孫 申請人:霍尼韋爾國際公司