一種果糖基轉移酶及其基因、其分泌型表達載體和應用的製作方法
2023-09-15 19:21:35 1
一種果糖基轉移酶及其基因、其分泌型表達載體和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種果糖基轉移酶，所述果糖基轉移酶由SEQ ID NO：2的胺基酸序列組成；還公開了編碼該果糖基轉移酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的表達載體，轉化體，以及應用所述果糖基轉移酶基因生產果糖基轉移酶的方法，構建的工程菌搖瓶發酵酶活最高可達508U/ml，是原始菌株酶活的約41倍。本發明還涉及所述果糖基轉移酶在製備蔗果低聚糖中的應用以及利用所述果糖基轉移酶製備蔗果低聚糖的方法。
【專利說明】一種果糖基轉移酶及其基因、其分泌型表達載體和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種果糖基轉移酶，其果糖基轉移酶基因及其分泌型表達載體和應 用，屬於遺傳工程領域。
【背景技術】
[0002] 低聚果糖（FOS)又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，是指在果糖基轉移酶的作用 下，通過轉移果糖基作用生成蔗果三糖，蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。蔗果低聚糖是一 種非還原性糖，具有難消化性、不致齲齒、雙岐桿菌增殖作用及水溶性食用纖維等獨特的生 理活性。
[0003] 果糖基轉移酶（fructosyltransferase，EC2. 4. L 9)，屬於糖苷酶32家族。果糖 基轉移酶廣泛的存在於生物界，不同微生物來源的果糖基轉移酶性質不同。微生物果糖基 轉移酶作用於蔗糖，進行分子內轉移果糖基反應生成F0S。其中黑麴黴來源的果糖基轉移酶 是工業上主要用微生物來源的酶源。
[0004] 隨著分子生物學的發展，果糖基轉移酶分子生物學始於上世紀九十年代，1995年， 第1個果糖基轉移酶的基因得到克隆。其後，不同物種的果糖基轉移酶基因得到研究。其中 對絲狀真菌果糖基轉移酶的研究較多，並對一些編碼果糖基轉移酶的基因進行了克隆。到 目前為止文獻報導不太多。
[0005] 畢赤酵母表達系統具有表達量高、生產成本低、產物可分泌到胞外和易於後續修 飾等優點，利用畢赤酵母表達的蛋白已有上百種。畢赤酵母近年來已成為倍受青睞的外源 蛋白表達系統。
[0006] 本研究室從黑麴黴中克隆得到黑麴黴果糖基轉移酶基因（fts，全長基因）， 構建了 pET22b-cFTS，pET22b-cFTSW質粒並轉化大腸桿菌BL21，並構建pGAPZA-cFTS， pGAPZ a A-cFTSW質粒，線性化後電轉化畢赤酵母菌株GS115,得到陽性克隆搖瓶發酵48h， 測定培養液上清果糖基轉移酶（主要在胞外，少量在胞內）酶活力最高為508U / ml。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種新型的果糖基轉移酶基因，以得到高表達 果糖基轉移酶的工程菌株，例如畢赤酵母菌株，從而得到大量的果糖基轉移酶。
[0008] 本發明人在黑麴黴10(CGMCC3. 316,購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC，中國北京朝陽區大屯路中科院微生物研究所，100101))中克隆得到一種 新型基因，其編碼的蛋白具有果糖基轉移酶活性。經測序鑑定該基因的基因組核苷酸序列 為SEQ ID NO :1，cDNA序列為SEQ ID NO :3,編碼胺基酸序列為SEQ ID NO :2的蛋白，該蛋 白具有果糖基轉移酶活性，為一種果糖基轉移酶。本發明人進一步檢索發現，該基因序列在 GenBank中沒有登記，屬於一種新基因發現。在此基礎上，本發明人進一步在大腸桿菌和酵 母菌中表達該基因，對其進行功能驗證，從而完成了本發明。
[0009] 本發明人將編碼上述果糖基轉移酶的核苷酸序列克隆到表達載體中構建重組表 達載體。其中所用的表達載體例如，但不限於，分泌型表達載體，包括，但不限於，pET-22b， pGAPZA或pGAPZ α A，這些載體均可從試劑公司購買得到。
[0010] 具體而言，本發明人將從黑麴黴10中克隆的編碼果糖基轉移酶的核苷酸序列按 照常規分子克隆方法克隆到商購的pET-22b，pGAPZA或pGAPZ a A載體中，構建了重組表達 載體 pET22b-cFTS，pET22b-cFTSW，pGAPZA-cFTS 和 pGAPZ a A-cFTSW。其中 pET22b-cFTS 和 pET22b-cFTSW用於在大腸桿菌中進行表達，pGAPZA-cFTS和pGAPZ α A-cFTSW用於在酵母菌 中進行表達。表達後可以獲得具有果糖基轉移酶活性的酶蛋白，將其稱為果糖基轉移酶。 [0011] 在優選的實施方案中，提供一種製備果糖基轉移酶的方法，所述方法包括下述步 驟：
[0012] (1)克隆或合成編碼SEQ ID NO :2所示的蛋白的核苷酸序列，並將其克隆到適當 的表達載體中，構建含有編碼SEQ ID NO :2所示的蛋白的核苷酸序列的重組表達載體；
[0013] (2)將步驟（1)得到的重組表達載體轉入適當的宿主細胞中，進行培養，表達SEQ ID NO :2所示的蛋白。
[0014] 本領域技術人員應該理解，上述方法還包括純化步驟，純化得到較高純度的果糖 基轉移酶。
[0015] 本領域技術人員應該理解，選擇分泌型載體來構建表達本發明的果糖基轉移酶的 重組表達載體，目的是使目標蛋白分泌到培養物上清中，而不是形成包涵體，從而得到的培 養物上清液本身就具有理想的果糖基轉移酶活性，並且可以經過簡單的純化步驟即可得到 具有果糖基轉移酶活性的目標蛋白，而不要經過變性純化和復性的複雜過程。
[0016] 本領域技術人員應該理解，當提及本發明的"果糖基轉移酶"時，該術語除了包括 由SEQ ID NO :2的胺基酸序列組成的蛋白之外，還包括由SEQ ID NO :2的胺基酸序列經過 一個或多個胺基酸取代、缺失或插入而得到的具有與SEQ ID NO :2的胺基酸序列相同或相 似的果糖基轉移酶活性的蛋白。
[0017] 因此，本發明提供下述：
[0018] L 一種果糖基轉移酶，其為：
[0019] (1)由SEQ ID NO :2的胺基酸序列組成的蛋白；或
[0020] (2)由SEQ ID NO : 2的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸取代、缺失或插入而得 到的具有與SEQ ID NO :2的胺基酸序列相同或相似的果糖基轉移酶活性的蛋白。
[0021] 2.編碼第1項所述的果糖基轉移酶的多核苷酸序列。
[0022] 3.根據第2項所述的多核苷酸序列，其為如下⑴或⑵所示：
[0023] (I) SEQ ID NO :1或3或4所示的核苷酸序列；
[0024] (2)在嚴格條件下與（1)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有果糖基轉移酶活性的 蛋白質的核苷酸序列。
[0025] 4.含有第2或3項所述的編碼果糖基轉移酶的多核苷酸序列的重組表達載體。
[0026] 5.根據第4項所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體為分泌型載體。
[0027] 6.根據第4項所述的表達載體，其中所用的表達載體選自pET_22b，pGAPZA或 pGAPZ a A0
[0028] 7.含有第2項所述的編碼果糖基轉移酶的多核苷酸序列或第4項所述的重組表達 載體的重組宿主細胞。
[0029] 8.根據第7項所述的重組宿主細胞，所述重組宿主細胞為轉基因細胞系或基因工 程菌，例如，重組的大腸桿菌或畢赤酵母。
[0030] 9.第2項所述的編碼果糖基轉移酶的多核苷酸序列，第4項所述的重組表達載體 或第7或8項所述的重組宿主細胞在果糖基轉移酶製劑生產中的應用。
[0031] 10. -種製備第1項所述的果糖基轉移酶的方法，所述方法包括下述步驟：培養第 7或8項所述的重組宿主細胞，得到第1項所述的果糖基轉移酶。
[0032] 11.第1項所述的果糖基轉移酶在製備蔗果低聚糖中的應用，所述應用包括：以蔗 糖為底物，在反應體系中加入第1項所述的果糖基轉移酶或第7或8項所述的重組宿主細 胞的培養物上清液，酶反應後得到蔗果低聚糖，所述蔗果低聚糖包括蔗果三糖、蔗果四糖及 蔗果五糖及其混合物。
[0033] 12. -種製備蔗果低聚糖的方法，所述方法包括：以蔗糖為底物，在反應體系中加 入第1項所述的果糖基轉移酶或第7或8項所述的重組宿主細胞的培養物上清液，酶反應 後得到蔗果低聚糖，所述蔗果低聚糖包括蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034] 從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特徵和優點將更明顯，其中：
[0035] 圖1顯示（A)重組表達載體pET22b-cFTS的物理圖譜；(B)重組表達載體 pET22b-cFTSW的物理圖譜；
[0036] 圖2顯示（A)重組表達載體pGAPZA-cFTS的物理圖譜；(B)重組表達載體 pGAPZ a A-cFTSW的物理圖譜；
[0037] 圖3顯示轉糖基產物的HPLC圖譜（G，葡萄糖；S，蔗糖；GF2,蔗果三糖；GF3,蔗果四 糖）。
[0038] 序列說明
[0039] SEQ ID NO :1果糖基轉移酶基因組DNA序列，其由1941個鹼基組成，該序列 中含有1個內含子，為5'端的第1767位到1820位
[0040] SEQ ID NO :2果糖基轉移酶推導的胺基酸序列，由628個胺基酸殘基組成，自 氮端第1 一15位胺基酸殘基是N端信號膚序列
[0041] SEQ ID NO :3果糖基轉移酶的cDNA鹼基序列，具有N端信號肽序列，由1887 個鹼基組成，簡稱cFTS
[0042] SEQ ID NO :4 cFTSW序列，即去掉了 15個胺基酸的N端信號肽序列且不包含 最後的終止密碼子的核苷酸序列
[0043] SEQ ID NO :5果糖基轉移酶的N端信號肽序列
【具體實施方式】
[0044] 下面參照具體的實施例進一步描述本發明，但是本領域技術人員應該理解，本發 明並不限於這些具體的實施例。
[0045] 以下通過實施例來進一步闡述本發明，所描述的實施例是示例性的，僅用於解釋 本發明，而不能解釋為對本發明的限制。下列實施例中未註明具體條件的試驗方法，除非另 有說明，本發明的實施例將採用本領域技術人員的能力範圍之內的分子生物學等領域的傳 統技術。另外，除非另有說明，在本文中，核酸以5'至3'的方向從左向右書寫，胺基酸序列 則以氨基端到羧基端的方向從左到右書寫。基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件 進行操作。
[0046] 具體步驟如下：
[0047] (1)克隆果糖基轉移酶基因；
[0048] (2)構建含有果糖基轉移酶基因的表達載體；
[0049] (3)表達載體轉化受體菌；
[0050] 所述表達載體為分泌型載體，優選為pET_22b (購自Novagen)，pGAPZA或 pGAPZ a A (這兩種載體購自Invitrogen)。
[0051] 所述受體菌為大腸桿菌（E. coli BL21)或畢赤酵母。
[0052] (4)培養轉化的受體菌，得到果糖基轉移酶。
[0053] 果糖基轉移酶酶活測定方法：
[0054] 參照王立梅等（2006,食品與生物技術學報25(2))取適當稀釋的粗酶液0. 5ml與 25 %的蔗糖溶液（在0. IM pH5. 0磷酸-檸檬酸鹽緩衝液中配製）2ml混合均勻，45 °C下酶 解1小時，100°C煮沸15分鐘終止酶解反應。果糖基轉移酶活通過測定酶解過程中所釋放 出的葡萄糖（G)和還原糖（R)的含量，按照下式計算酶解過程中所產生的果糖量（F)和被 轉移的果糖（Fe)量。
[0055] F=R-G
[0056] Fc=G-F=2G-R
[0057] 在相同條件下，以加入失活酶液的蔗糖溶液作為對照。在上述條件下，以每分鐘轉 移1 μ mol果糖所需的酶量為一個果糖轉移酶活力單位。
[0058] 材料和試劑：
[0059] 所用限制性內切酶，PCR試劑購自NEB公司；RNA提取及反轉錄試劑盒購自 Promega公司；T4DNA連接酶，DNA Marker等購於寶生物公司；pEASY-B載體，大腸桿菌感受 態細胞DH5 a，BL21，PCR純化試劑盒購自全式金，引物購於華大基因，DNA及質粒提取試劑 盒購於天根生物；電轉移購自Bio-Rad公司；YPD、以及YPD-Zeocin均按照Invitrogen公司 操作手冊配製；其他試劑均為國內外購買的分析純試劑。
[0060] 實施例1 :黑麴黴果糖基轉移酶基因的克隆
[0061] 提取黑麴黴10(CGMCC3. 316,購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（CGMCC，中國北京朝陽區大屯路中科院微生物研究所，100101))基因組DNA。設計引物進 行PCR反應，得到黑麴黴果糖基轉移酶全基因編碼序列（FTS)，其中所用的引物序列如下：
[0062] sense primer ：
[0063] 5，-TAGGCGGATCCCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3，
[0064] anti-sense primer ：
[0065] 5' -AGGGCGGA ATTCTTA AGACTGACGATCCGGC-3;
[0066] 提取黑麴黴10總RNA，並反轉錄成cDNA。設計引物進行PCR反應，得到黑麴黴果 糖基轉移酶cDNA編碼序列（cFTS，為SEQ ID NO :3)，所用的引物序列如下同果糖基轉移酶 DNA引物序列。
[0067] pET22b_cFTS 載體的構建
[0068] 所用的引物序列同果糖基轉移酶DNA序列引物。
[0069] 用BamH I和EcoR I雙酶切擴增的果糖基轉移酶cDNA序列（SEQ ID NO :3)與 pET22b (購自Novagen)。經酶切的目的片段與載體pET22b用T4DNA連接酶連接過夜，熱激 法轉化大腸感受態細胞，挑選陽性菌株提取質粒即得到重組質粒pET22b-cFTS。
[0070] 實施例2 :pET22b-cFTSW載體的構建
[0071] 引物序列如下：
[0072] cff s-p 11 ：
[0073] 5' -CTCGGAATTCAGCCTCTCCTTCCATGCAGAC-3'
[0074] cffs-p2w ：
[0075] 5, -TAGCGGCCGCAGACTGACGATCCGGCCAAG-3，
[0076] 將利用上述引物擴增得到的果糖基轉移酶核苷酸序列命名為cFTSW，其序列見SEQ ID NO :4。
[0077] cFTSW(SEQ ID NO :4)與 cFTS(SEQ ID NO :3)的區別如下：
[0078] cFTS是包含本身信號肽（蛋白胺基酸序列的前十五個胺基酸）的cDNA序列，由 1887個鹼基組成；cFTSW是不包含自身信號肽的cDNA序列，由1839個鹼基（不包含最後的 終止子）組成。
[0079] 用EcoR I和Not I雙酶切擴增的cFTSW序列（SEQ ID NO :4)與載體pET22b (購 自Novagen)。經酶切的目的片段與載體pET22b用T4DNA連接酶連接過夜，熱激法轉化大腸 感受態細胞，挑選陽性菌株提取質粒即得到重組質粒pET22b-cFTSW。
[0080] 實施例3 :pGAPZA-cFTS載體的構建
[0081] 引物序列如下：
[0082] ffs-pl ：
[0083] 5，-CTCGGAATTCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3'
[0084] cffs-p2 ：
[0085] 5，-TAGCGGCCGCTTAAGACTGACGATCCGGC-3，
[0086] 高保真Tag酶擴增果糖基轉移酶cDNA序列（SEQ ID NO :3)，同時擴培含有pGAPZA 質粒（購自Invitrogen)大腸桿菌菌株並提取pGAPZA質粒。EcoR I和Not I雙酶切擴 增的果糖基轉移酶cDNA序列（SEQ ID NO :3)與載體pGAPZA，T4DNA連接酶過夜連接經酶 切的目的片段與載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑選陽性菌株提取質粒即得到重組質粒 pGAPZA-cFTS。
[0087] 實施例4 :pGAPZ a A- cFTSW載體的構建
[0088] 所用的引物如下：
[0089] cffs-pl ：
[0090] 5; -CTCGGAATTCGCCTCTCCTTCCATGCAGAC-3;
[0091] cffs-p2w ：
[0092] 5，-TAGCGGCCGCAGACTGACGATCCGGCCAAG-3，
[0093] 高保真Tag酶擴增不含自身信號肽序列的果糖基轉移酶cDNA序列（cFTSW，SEQ ID NO :4)，同時擴培含有pGAPZa A質粒（購自Invitrogen)的大腸桿菌菌株並提質粒。EcoR I和Not I雙酶切擴增的cFTSW序列與pGAPZ a A，T4DNA連接酶過夜連接經酶切的目的片段 與載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑選陽性菌株提取質粒即得到重組質粒pGAPZA-cFTSW。
[0094] 實施例 5 :pET22b-cFTS、pET22b-cFTSW 重組子轉化
[0095] 重組的陽性菌株擴培後提取質粒，熱激轉化大腸桿菌BL21表達菌株。
[0096] 實施例 6 :pGAPZA_cFTS、pGAPZ a A-cFTSW 重組子轉化
[0097] 重組的陽性菌株擴培後提取質粒，用BspH I單酶切為線性質粒，總量為5 - IOug 進行電轉，轉入畢赤酵母GS115感受態細胞（畢赤酵母GS115購自Invitrogen，其感受態細 胞按照常規方法製備）。電轉儀設置為電壓1500v，電容25uF，電阻200 Ω。
[0098] 實施例7 :重組子的篩選及分子驗證
[0099] 熱激轉化大腸桿菌BL21後加入400ul LB培養基，37°C復甦後塗布氨苄濃度為 IOOug / ml的LB平板。以長出的單菌落為模板，以基因特異引物進行PCR反應，得到相應 大小條帶即確定為陽性菌株。
[0100] 電轉化畢赤酵母GS115後加入Iml山梨醇溶液，30°C復甦後塗布Zeocin濃度為 IOOug / ml的Yro平板，長出的單菌落接種Yro液體培養基培養，取上清液測定果糖基轉移 酶活性，抗生素 Zeocin篩選的陽性畢赤酵母菌落的培養上清液均檢測到果糖基轉移酶活 性，由於各菌株表達果糖基轉移酶的能力有差別，可以選取果糖基轉移酶活性高的工程菌 株用於進一步的研究。
[0101] 實施例8 :PET22b-cFTS、pET22b-cFTSW重組子陽性菌株搖瓶發酵
[0102] 挑取陽性菌株單菌落，5ml試管培養過夜。取Iml到50ml LB三角瓶中， 37°C，250rpm，搖菌2. 5-3h，置於冰上5分鐘，（菌體溶度為0D6000. 6-0. 8)加入IOmM IPTG50-100ul誘導，25°C，震蕩培養。每隔一段時間取樣測酶活（即，取培養物上清測酶 活），24小時後酶活力達到I. 68U / ml。
[0103] 實施例9 :PGAPZA-cFTS、pGAPZ a A-cFTSW重組子陽性菌株搖瓶發酵
[0104] 參考Invitrogen公司操作手冊，挑取陽性菌株單菌落接種至5ml YH)培養基中， 28°C，250rpm搖床培養過夜，按1-4%的比例轉接到50ml YH)培養基三角瓶中，相同條件培 養，每隔12小時，取樣測酶活（S卩，取培養物上清測酶活），培養48小時後，胞外酶活達到最 高，為 508U / ml。
[0105] 實施例10 :酵母工程菌產果糖基轉移酶的酶解產物分析
[0106] 以25%蔗糖為底物，果糖基轉移酶含量為8單位每克蔗糖，pH5. 0,45°C下反應，每 隔一段時間（例如，反應後20分鐘，2小時，12小時，24小時）取適量反應混合物進行產物 分析。HPLC分析表明，產物中首先出現的蔗果三糖（GF2)，蔗果四糖（GF3)，最後是蔗果五 糖。反應液中果寡糖最高佔總質量的58%。圖3顯示轉糖基產物的HPLC圖譜，圖譜數據與 反應液中果寡糖最高佔總質量的58%相一致，該HPLC圖譜中沒有顯示鹿果五糖，反應延長 可出現蔗果五糖。
[0107] 應該理解，儘管參考其示例性的實施方案，已經對本發明進行具體地顯示和描述， 但是本領域的普通技術人員應該理解，在不背離由權利要求書所定義的本發明的精神和範 圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。
【權利要求】
1. 一種果糖基轉移酶，其為： (1) 由SEQ ID NO :2的胺基酸序列組成的蛋白；或 (2) 由SEQ ID NO :2的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸取代、缺失或插入而得到的 具有與SEQ ID NO :2的胺基酸序列相同或相似的果糖基轉移酶活性的蛋白。
2. 編碼權利要求1所述的果糖基轉移酶的多核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的多核苷酸序列，其為如下（1)或（2)所示： (1) SEQ ID NO :1或3或4所示的核苷酸序列； (2) 在嚴格條件下與（1)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有果糖基轉移酶活性的蛋白 質的核苷酸序列。
4. 含有權利要求2或3所述的編碼果糖基轉移酶的多核苷酸序列的重組表達載體。
5. 根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體為分泌型載體。
6. 根據權利要求4所述的表達載體，其中所用的表達載體選自pET-22b，pGAPZA或 pGAPZ a A〇
7. 含有權利要求2所述的編碼果糖基轉移酶的多核苷酸序列或權利要求4所述的重組 表達載體的重組宿主細胞。
8. 根據權利要求7所述的重組宿主細胞，所述重組宿主細胞為轉基因細胞系或基因工 程菌，例如，重組的大腸桿菌或畢赤酵母。
9. 權利要求2所述的編碼果糖基轉移酶的多核苷酸序列，權利要求4所述的重組表達 載體或權利要求7或8所述的重組宿主細胞在果糖基轉移酶製劑生產中的應用。
10. -種製備權利要求1所述的果糖基轉移酶的方法，所述方法包括下述步驟：培養權 利要求7或8所述的重組宿主細胞，得到權利要求1所述的果糖基轉移酶。
【文檔編號】C12N15/63GK104419688SQ201310392334
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】張國青, 鈔亞鵬, 楊敬, 錢世鈞, 石家驥 申請人:中國科學院微生物研究所