Mva用於治療前列腺癌的用途的製作方法

2023-09-16 06:21:25

專利名稱：Mva用於治療前列腺癌的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用編碼腫瘤相關抗原(特別是前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸 性磷酸酶(PAP))的MVA病毒來預防和治療癌症(特別是前列腺癌)。
背景技術：
改良痘苗安卡拉(ModifiedVaccinia Ankara, MVA)病毒與痘苗病毒(vaccinia virus)，即痘病毒科(Poxviridae)中的正痘病毒屬(Orthopoxvirus)的一個成員有關。 MVA是通過痘苗病毒安卡拉株(CVA)在雞胚成纖維細胞上連續傳516代生成的(參見綜述 Mayr, A. , et al. Infection 3:6-14(1975))。作為這些長期傳代的結果，所得MVA病毒的 基因組中刪除了其基因組序列的約31kb，而且因此記載為在複製方面宿主細胞高度受限於 鳥類細胞(Meyer, H. et al.，J. Gen. Virol. 72 :1031_1038 (1991))。在多種動物模型中顯示 了所得 MVA 是顯著無毒力的(Mayr，Α. & Danner，K.，Dev. Biol. Stand. 41 :225_34 (1978))。 另外，已經在臨床試驗中作為針對人天花病來免疫的疫苗測試了此MVA株(Mayr etal., Zbl. Bakt. Hyg. I，Abt. Org. B 167 :375_390 (1987) ；Stickl et al.，Dtsch. med. Wschr. 99 2386-2392(1974))。這些研究涉及120，000人以上，包括高風險患者，而且證明了，與基於 痘苗的疫苗相比，MVA具有降低的毒力或傳染性，同時它誘導優良的、特異性的免疫應答。在 隨後的幾十年裡，MVA被改造成用作病毒載體(用於重組基因表達)或重組疫苗(Sutter， G.et al. , Vaccine 12:1032-40(1994))。儘管Mayr等人在二十世紀七十年代裡證明了 MVA在人和哺乳動物中是高度減 毒和無毒力的，某些調查人員報告了 MVA在哺乳動物和人細胞系中不是完全減毒的，因為 在這些細胞中可存在殘餘複製(Blanchard et al.，J GenVirol 79:1159-1167(1998); Carroll & Moss, Virology 238 :198_211(1997) ；Altenberger，U. S. Pat. No. 5，185，146 ； Ambrosini et al. ,J Neurosci Res 55(5) :569 (1999))。假設這些出版物中報告的結果是 用MVA的各種已知株獲得的，因為所使用的病毒在它們的特性方面，特別是在它們在各種 細胞系中的生長行為方面是本質上不同的。出於各種原因，包括與在人類中使用有關的安 全考慮，此類殘餘複製是不希望有的。具有增強的安全性特徵、用於開發更安全的產品(諸如疫苗或藥品)的MVA株已 有記載。參見U. S. Pat. Nos. 6，761，893和6，193，752。此類株能夠在非人細胞和細胞系中， 尤其在雞胚成纖維細胞(CEF)中生殖性複製，但是不能在已知容許已知痘苗株複製的某些 人細胞系中生殖性複製。這些細胞系包括人角質形成細胞細胞系HaCat (Boukamp et al. J Cell Biol 106(3) :761_71 (1988))、人子宮頸腺癌細胞系 HeLa(ATCC No. CCL-2)、人胚腎 細胞系 293(ECACC No. 85120602)、和人骨骨肉瘤細胞系 143B(ECACC No. 91112502)。此類 病毒株也不能在體內生殖性複製，例如在某些小鼠品系中，諸如轉基因小鼠模型AGR 129 中，該模型是重度免疫受損的且對複製型病毒高度易感的。參見U. S. Pat. Nos. 6，761，893。 一種這樣的MVA株及其衍生物和重組體，稱作「MVA-BN 」，已有記載。參見U. S. Pat. Nos. 6，761，893 和 6，193，752。MVA和MVA-BN 已經各自被改造成用作病毒載體(用於重組基因表達)或重組疫苗。參見例如 Sutter，G. et al. , Vaccine 12 1032-40 (1994) ；U. S. Pat. Nos. 6，761，893 和 6，193，752。癌症相關疾病是全世界死亡率和發病率的一項首要原因。例如，僅在美國，估計 六個人中有一個罹患前列腺癌。此外，屍檢研究顯示已知顯著比例的男性人群早在30歲 就攜帶該疾病，儘管處於其最早的非惡性階段。參見例如Taichman et al. , JCI 117(9) 2351-2361 (2007) ；Webster et al.，J. Clin. Oncol. 23 :8262_8269 (2005)。癌症免疫療 法的新近辦法包括疫苗接種腫瘤相關抗原。在某些情況中，此類辦法包括使用投遞系統 來促進宿主對腫瘤相關抗原的免疫應答。此類投遞系統包括重組病毒載體，以及基於細 胞的療法。參見例如 Harrop et al. , Front. Biosci. 11 804-817 (2006) ；Arlen et al.， Semin. Oncol. 32 549-555 (2005) ；Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(suppl. 2) 14567-14571 (2004)。MVA已經在轉移性結腸直腸癌、轉移性腎癌和激素不應性前列腺癌患 者的臨床試驗中用作5T4癌胚抗原的疫苗佐劑。Amato，RJ.，Expert Opin. Biol. Ther. 7 (9) 1463-1469(2007)。在已經的腫瘤相關抗原中有前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶 (PAP)。參見例如 Taichman et al.，JCI 117(9) 2351-2361 (2007) ；Webster et al.， J. Clin. Oncol. 23 =8262-8269(2005)。PSA是由前列腺生成的，而且以升高的量見於具有 前列腺癌、良性前列腺增生、或前列腺感染或炎症的男性的血液中。PSA已經被鑑定為癌症 治療的由細胞介導的免疫療法辦法的靶物。參見例如McNeel，D. G.，Curr. Opin. Urol. 17 175-181 (2007) ；Nelson W. G.，Curr. Opin. Urol. 17 157-167 (2007)。PAP 是一種在血液中 測量到的酶，其水平在具有已經侵入或轉移別處的前列腺癌的患者中升高。除非腫瘤已經 或是經由局限性侵入或是經由遠距離轉移而擴散到解剖學上的前列腺囊以外，否則PAP不 會升高。因此，正在數項人疫苗試驗中作為靶抗原調查這種前列腺腫瘤抗原，其中一些試 驗獲得了臨床好處的證據。參見例如 McNeel, D. G.，Curr. Opin. Urol. 17 :175_181 (2007)； Waeckerle-Men et al. ,Cancer Immunol. Immunother. 66 811-821 (2006) ；Machlenkin et al. Cancer Immunol Immunother. 56(2) :217_226(2007)。已經使用重組痘苗病毒、純化的PAP、DNA疫苗、和加載有抗原的樹突細胞生成了 含有 PAP 的疫苗。Valone et al. , The Cancer Journal 7 :Suppl2 :S53_61 (2001) ；Fong et al.，J Immunol. 2001 Dec 15 ；167(12) :7150_6 ；Fong etal.，J. Immunol. 159(7) 3113-7(1997) Johnson et al. ,Vaccine 24(3) :293_303(2006) Johnson et al. ,Cancer Immunol Immunother. 56 (6) :885_95 (2007)。在一項研究中，當將經 PAP-GM-CSF 脈衝的樹 突細胞注射入大鼠中時，沒有檢測到針對PAP的抗體(Valone et al. at S55)。在另一項研 究中，施用含有編碼大鼠PAP或人PAP的基因的重組痘苗病毒不生成可測量的針對大鼠或 人PAP的抗體應答(Fong et al. (1997)at 3116-7)。在另一項研究中，在用hPAP蛋白質免 疫的動物的血清中以及在接受編碼人PAP痘苗病毒疫苗接種、接著接受hPAP蛋白質作為強 化免疫接種的動物中能檢測到PAP特異性IgG，但是在用編碼人PAP的痘苗病毒免疫兩次的 動物中檢測不到(Johnson et al. (2007)at 890)。主動癌症免疫療法依賴在癌症患者中對針對腫瘤細胞的免疫應答的誘導。對針對 廣泛腫瘤相關抗原(TAA)的適應性免疫的體液和細胞這兩種成分的誘導及伴隨的對先天 性免疫的成分的激活對於主動免疫療法產品的最大效能是至關重要的。具體而言，認為1型或Thl型適應性免疫(其以對生成抗原特異性IFN γ的細胞毒性T細胞(CD8T細胞)的 誘導為特徵)對於抗癌症免疫療法是重要的。儘管新近在癌症治療中獲得了進展，然而前列腺癌仍然是美國癌症患者死亡的第 二位首要原因。如此，需要這樣的治療性辦法，該方法通過靶向腫瘤生長和轉移的多個方面 來更好地減輕該疾病。紫杉烷(諸如帕利他塞和多西他塞)已經作為化療用於癌症患者。參見例 如 Tannock et al.，N. Engl. J. Med. 351 1502-1512 (2004)。使用紫杉烷的化療已經 與不同的腫瘤疫苗治療組合，導致各種結果。參見Chu et al. , J. Immunotherapy 29: 367-380(2006) ；Machiels et al. , Cancer Res. 61 3689-3697(2001) ；Prell et al., Cancer Immunol. Immunother. 55 1285-1293 (2006) ；Arlen etal., Clinical Breast Cancer 7:176-179(2006)；及Arlen et al. ,Clinical Cancer Res. 12 1260-1269 (2006)。 關於癌症疫苗與化療的組合的綜述參見Chong et al.，Expert Opin. Phamacother. 6 1-8(2005) ；Emens et al.，Endocrine-Related Cancer 12 1-17 (2005)；及 McNeel，D. G.， Curr. Opin. Urol. 17 175-181 (2007)。如上所述，本領域需要用於癌症治療的試劑和方法。發明概述本發明涵蓋用於預防癌症和治療癌症(包括原發性腫瘤和癌症轉移)患者的方 法、試劑、和試劑盒。本發明涵蓋一種用於治療人類癌症患者的方法，包括對患者施用一種重組MVA，其 編碼包含人前列腺特異性抗原(PSA)抗原的多肽和包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的 多肽。在一個實施方案中，所述MVA是MVA-BN。在一個實施方案中，所述MVA病毒包含核苷 酸序列SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2。在一個實施方案中，所述PSA抗原和所述PAP抗原插 入在MVA基因間區014L/015L中。在某些實施方案中，所述癌症是前列腺癌或前列腺癌轉 移。在一個實施方案中，所述重組MVA是在破壞腫瘤劑量的紫杉烷之前施用的。在一 個實施方案中，所述重組MVA是在破壞腫瘤劑量的紫杉烷的同時施用的。在一個實施方案 中，所述重組MVA是在破壞腫瘤劑量的紫杉烷之後施用的。在優選的實施方案中，所述紫杉 烷是多西他塞或帕利他塞。本發明涵蓋一種用於預防前列腺癌的試劑盒，包括重組MVA，其編碼包含人PSA 抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及在檢測到前列腺癌之前施用所述重組MVA的指令。本發明涵蓋用於治療前列腺癌的試劑盒，包括一種重組MVA，其編碼包含人PSA 抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及對前列腺癌患者施用所述重組MVA的指令。本發明涵蓋用於治療癌症患者的試劑盒，包括一種重組MVA，其編碼包含人PSA 抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及在用破壞腫瘤劑量的紫杉烷處理之前、同時、或之 後施用所述重組MVA的指令。本發明涵蓋一種重組MVA病毒，其表達包含人PAP抗原的多肽。在一個實施方案 中，所述MVA病毒包含SEQ ID NO :2。在一個實施方案中，所述MVA是MVA-BN。本發明涵蓋一種重組MVA病毒，其表達包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原 的多肽。在一個實施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ IDNO :1。在一個實施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO :2。在一個實施方案中，所述MVA是MVA-BN。本發明涵蓋一種免疫原性組合物，包含一種重組MVA病毒，其編碼包含人PAP抗原 的多肽，其中所述免疫原性組合物在對宿主施用時誘導針對PAP的B細胞和T細胞免疫應答。本發明涵蓋一種免疫原性組合物，包含一種重組MVA病毒，其編碼包含人PAP抗原 的多肽，其中所述免疫原性組合物在對宿主施用時誘導針對PAP的抗體。在一個實施方案 中，所述MVA病毒包含SEQ ID NO :2。本發明涵蓋一種免疫原性組合物，包含一種重組MVA病毒，其編碼包含人PSA抗原 的多肽和包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性組合物在對宿主施用時誘導針對PSA 和PAP的B細胞和T細胞免疫應答。附圖簡述圖IA-B。MVA-BN 基因組的示意圖。IA顯示的是MVA-BN 基因組中六個 刪除位點的位置陰影區段和字母(A至0)鑑別HindIII限制酶消化片段，而且在箭頭上顯 示了在MVA-BN 中所缺少的CVA序列的位置和大小。IB顯示的是HindIII限制性片段 (字母A至0)和用於生成MVA-BN-PRO的IGR014L/015L位點。圖2。MVA-BN-PRO病毒的示意概觀。MVA-BN 基因組圖(HindIII限制圖，由 字母A至0表示)，粗繪在基因間區014L/015L中克隆的重組插入物PSA和PAP基因，各自 在牛痘病毒ATI啟動子(ATI)的控制下。圖3A-B。與MVA-BN-PRO —起溫育的CT26細胞培養物的上清液中的PAP (A)和 PSA(B)檢測。用MVA-BN-PRO(正方形)或MVA-BN (三角形)以所示感染複數(MOI) 感染密度為6 X IO5個細胞每孔(黑色正方形和三角形)或6E4細胞每孔(灰色正方形)的 CT26細胞。24小時後，收穫細胞上清液，並分別通過PAP酶測定法和PSA ELISA來測量PAP 和PSA蛋白質水平。圖4A-B。用MVA-BN-PRO處理的小鼠中的抗PSA (A)和抗PAP (B)抗體應答。用 MVA-BN-PRO (白色正方形)或MVA-BN (黑色正方形)免疫動物三次(第1天、第15 天和第29天)。在處理前、第14天、第28天、和第42天收集血液樣品。滴度為0. D.值比 背景(來自用TBS處理的動物的、相同稀釋度的血清)高至少2倍的最後稀釋度的倒數值。 顯示為零的滴度在所測試的最低血清稀釋度(1 50)呈陰性。 圖5A-B。用MVA-BN-PRO處理的小鼠中的抗PSA和抗PAP T細胞應答。將來自用 MVA-BN-PRO免疫的動物(A)和TBS對照動物(B)的脾細胞與所示濃度的來自PAP (灰色正 方形)、PSA(白色正方形)或HER2 (黑色正方形)序列的OPL —起溫育。使用ImmimoSpot 分選儀對指示IFN-Y生成T細胞的斑點計數。為每一個所測試的OPL濃度呈現了來自一 式三份孔的均值和標準偏差。圖6A-B。⑶4和⑶8T細胞對由MVA_BN_PR0介導的T細胞應答的貢獻。用 MVA-BN-PRO免疫動物四次(第1天、第15天、第29天、和第49天)，並在最後一次處理後 六天收集脾細胞，將消減了 CD8的脾細胞(A)和消減了 CD4的脾細胞(B)與所示濃度的來 自PAP(灰色正方形)、PSA(白色正方形)或HER2(黑色正方形)序列的OPL—起溫育。所 述分析是如圖5所述進行的。圖7A-F。用MVA-BN-PRO處理的小鼠中對腫瘤生長的預防。以3周時間間隔以所示TCID50的、在TBS中稀釋的病毒處理動物3次。第三次處理後六周，用IXlO5個表達PSA 的E5腫瘤細胞皮內攻擊動物。使用測徑器每周兩次測量腫瘤生長。如下計算腫瘤體積 (Lxff2)/20 7A至7E:為每個處理組報告了各小鼠中的腫瘤生長。7F:為所有處理組報告了 腫瘤大小均值和標準偏差。圖8。用MVA-BN-PRO處理的小鼠中對腫瘤生長的預防。兩項分開的實驗中第29 天測量的比較。以2周時間間隔(灰色符號)用2X IO6TCID5tl的、在TBS中稀釋的所示病 毒處理動物三次。最後一次處理後兩周，用IX IO5個表達PSA的E5腫瘤細胞皮內攻擊動 物。使用測徑器每周兩次測量腫瘤生長。如下計算腫瘤體積(LxW2)/2。點顯示了每隻動 物在腫瘤植入後第29天的腫瘤體積。來自圖7所述分開的實驗的匹配組的數據以黑色符 號呈現，供比較用。這裡報告的這兩項實驗是在相似條件下進行的，除了處理時間間隔的長 度(3周對2周時間間隔)和腫瘤細胞植入時間(第三次處理後六周對兩周)。圖9A-F。用MVA-BN-PRO處理的小鼠中對腫瘤生長的治療性遏制。BALB/c小鼠 (每組10隻動物)在第1天用E6細胞(id注射IX IO5個細胞)攻擊，並在第1天、第8天、 和第 15 天用 TBS(E)、MVA-BN (5X IO6 或 5X IO7TCID50 ；A 和 B)、或 MVA_BN_PR0(5X IO6 或5X IO7TCID5tl ；C和D)皮下處理。在第22天處死小鼠。小圖A-E顯示了各小鼠的腫瘤大 小。小圖F中描繪了每個組的腫瘤大小平均值和標準偏差。使用測徑器每周兩次測量腫瘤 生長。如下計算腫瘤體積(LxW2)/2。誤差棒代表標準偏差(SD)。

圖10。用MVA-BN-PRO處理的小鼠中對PAP陽性腫瘤生長的遏制。BALB/c小鼠 (每組10隻動物)在第1天用CT26-PAP (靜脈內注射5 X IO5個細胞)攻擊，並在第4天用 TBS、MVA-BN(5 X IO7TCID50)、或 MVA_BN_PR0(2X IO6 和 5 X IO7TCID50)腹膜內處理。在第 14 天處死小鼠，並對它們的肺稱重。數據點代表各小鼠的肺重量。水平棒指示每個組的肺重 量均值。圖11。BALB/c或C57BL/6小鼠中誘導的抗PSA和抗PAP抗體應答。在第1天、第 15天、和第29天用5 X IO7TCID50的MVA-BN-PRO免疫雄性BALB/c和C57BL/6小鼠(每組5 只動物)。在第42天收集血液樣品，並對通過ELISA合併血清的連續稀釋液分析抗PSA或 抗PAP IgG的存在。滴度作為O.D.值比背景(定義為來自用TBS處理的動物的、相同稀 釋度的血清)高至少2倍的最後稀釋度的倒數值來計算。滴度低於所測試的最低稀釋度 (< 125)的血清的數據點是任意放置在χ軸上的，出於繪圖目的，將χ軸放置在比測定法的 第一稀釋度(62. 5)低一個稀釋度。圖12。用MVA-BN-PRO處理的患者中的T細胞應答。在處理前(基礎)或 MVA-BN-PRO處理後(TC3)收集來自患者J-D-1001血液的PBMC。將細胞與圖上所示濃度的 PSA蛋白質、PSA交疊肽文庫(0PL)、PAP蛋白質、PAP0PL、自腫瘤相關抗原(TAA)衍生的MHC I型和II型肽集合或MVA-BN —起溫育40小時。通過測量所分泌的IFN- γ的ELISpot來測 定T細胞激活。對於每種刺激條件，結果表述成均值IFN-γ斑點形成細胞(SFC)每2Χ105 個PBMC。SFC值是自一式四份孔的均值減去背景而得來的。發明詳述在一組體外和體內測定法中測試了表達人PSA和PAP抗原的重組 MVA (MVA-BN-PRO)。分別使用PSA檢測試劑盒和磷酸酶活性功能測定法評估了這兩種由 MVA-BN-PRO編碼的前列腺特異性抗原(PSA和PAP)在與MVA-BN-PRO —起溫育的真核細胞中的表達。使用ELISA和ELISpot測定法來監測用MVA-BN-PRO處理的小鼠中對抗PSA和 抗PAP抗體及T細胞免疫應答的誘導。在PSA腫瘤模型中在預防設置和治療設置兩者中評 估了 MVA-BN-PRO的抗腫瘤活性。這些研究證明了(i)在體外細胞對MVA-BN-PRO的攝取導致PAP和PSA兩者以 相似的量表達；(ii)用MVA-BN-PRO處理小鼠導致抗PSA和抗PAP體液免疫應答及Thl細 胞免疫應答；(iii)用MVA-BN-PRO處理小鼠在預防和治療兩種設置中都抑制PSA(+)腫瘤 生長；(iv)用MVA-BN-PRO處理小鼠在治療設置中抑制PAP(+)腫瘤生長；(ν)在人體中， MVA-BN-PRO處理提高抗PSA T細胞和抗PAP T細胞兩者的水平；及(vi)MVA-BN-PRO處理 在人體中導致針對其它腫瘤抗原的T細胞應答的擴散。如此，MVA-BN-PRO通過觸發抗原特 異性體液應答和細胞Thl型應答而激活免疫系統，這在體內導致針對表達PSA和PAP的腫 瘤的顯著治療活性。因此，MVA-BN-PRO是人類中前列腺癌免疫療法的有吸引力的疫苗候選 物。MVA-BN-PRO是能夠誘導保護性抗腫瘤免疫力的有力免疫原，其在預防設置中預防 腫瘤生長且還遏制已建立的腫瘤的生長。MVA-BN-PRO的預防性和治療性抗腫瘤活性是由抗 PSA特異性適應性免疫應答介導的。然而，適應性免疫應答是針對由MVA-BN-PRO編碼的前 列腺特異性抗原，PSA和PAP誘導的。伴隨的對針對多種腫瘤抗原的適應性應答的激活使 得MVA-BN-PRO能夠更高效地抗擊腫瘤和提高成功治療癌症患者的潛力。在一個實施方案中，本發明涵蓋重組MVA病毒用於前列腺癌治療的意圖。所述 重組MVA是通過將異源序列插入MVA病毒中而生成的。在本發明的實踐中有用且已經依 照布達佩斯條約的要求保藏的MVA病毒株的例子有MVA 572(1994年1月27日保藏於歐 洲動物細胞培養物保藏中心(EuropeanCollection of Animal Cell Cultures, ECACC), Salisbury (UK)，保藏號 ECACC94012707)和 MVA 575(2000 年 12 月 7 日保藏於 ECACC 00120707)。別的例示性菌株有MVA-BN (2000年8月30日保藏於歐洲細胞培養物保 藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，編號 V00083008)及其衍生物。雖然MVA-BN 由於其較高的安全性(複製能力較低)是優選的，但是所有MVA 都適合於本發明。依照本發明的一個實施方案，所述MVA株是MVA-BN 及其衍生物。參 見PCT/EP01/13628，通過述及收入本文。在某些實施方案中，重組MVA表達腫瘤相關抗原。在一個實施方案中，腫瘤相關抗 原是PSA。在一個實施方案中，腫瘤相關抗原是PAP。在一個優選的實施方案中，所述MVA 表達兩種腫瘤相關抗原，優選PSA和PAP抗原。在一個實施方案中，所述兩種腫瘤相關抗原 包含核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。在一個實施方案中，所述兩種腫瘤相關抗 原是自包含核苷酸序列SEQ ID NO 3的盒表達的。在其它實施方案中，所述腫瘤相關抗原被修飾成包括一種或多種外來Th表位。如 本文所述，此類癌症免疫治療劑對於預防和/或治療癌症(包括癌症轉移)是有用的。本 發明容許將此類藥劑用於人和其它哺乳動物的引發/強化疫苗接種方案，包括免疫受損的 患者；而且包括體液和細胞這兩種免疫應答，諸如在先前存在的Th2環境中誘導Thl免疫應答。術語「多肽」指兩個或更多個通過肽鍵或經修飾肽鍵而彼此連接的胺基酸的聚合 物。所述胺基酸可以是天然存在的以及非天然存在的，或者是天然存在胺基酸的化學類似物。該術語還指蛋白質，即如下的功能性生物分子，其包含至少一條多肽；當包含至少兩條 多肽時，這些可形成複合物，是共價連接的，或者可以是非共價連接的。蛋白質中的多肽可 以是糖基化的和/或脂化的(lapidated)和/或包含輔基。在人細胞系諸如細胞系HaCAT (Boukamp et al. 1988，J Cell Biol 106(3) 761-71)或HeLa中術語「不能生殖性複製」在本申請中如WO 02/42480中所定義的那樣使 用。如此，在細胞系中「不能生殖性複製」的病毒為在所述細胞系中顯示不到1的擴增速率 的病毒。病毒的「擴增速率」指自受感染細胞生成的病毒(輸出)對最初首先用於感染該細 胞的量(輸入)的比。輸出和輸入之間的比「1」定義如下的擴增狀態，其中自受感染細胞生 成的病毒的量與最初用於感染該細胞的量相同。依照本發明的一個實施方案，在人細胞系 中「不能生殖性複製」的病毒可以在上述人細胞系HeL^HaCat和143B任一中具有1. 0(平 均值)或更低、或甚至0.8 (平均值)或更低的擴增速率。在某些實施方案中，所述MVA是於2000年8月30日以編號V00083008保藏於 歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)且記載於U. S. Pat. Nos. 6，761，893和6，193，752的 MVA-BN 。如那些專利出版物中所記載的，MVA-BN 不在細胞系293、143B、HeLa和 HaCat中生殖性複製。具體而言，MVA-BN 在人胚腎細胞系293中展現出0.05-0.2 的複製速率。在人骨骨肉瘤細胞系143B中，MVA-BN 展現出0.0-0.6的複製速率。 MVA-BN 在人子宮頸腺癌細胞系HeLa中展現出0. 04-0. 8的複製速率，而在人角質形成 細胞細胞系HaCat中展現出0. 02-0. 8的複製速率。MVA-BN 在非洲綠猴腎細胞(CVl ATCC No. CCL-70)中具有0. 01-0. 06的複製速率。MVA-BN 的擴增速率在雞胚成纖維細胞(CEF 原代培養物)中超出1，如 U. S. Pat. Nos. 6，761，893和6，193，752中所記載的。所述病毒能在CEF原代培養物中容易 地繁殖和擴增，速率超出500。在某些實施方案中，重組MVA是MVA-BN 的衍生物。此類「衍生物」包括展現 與保藏株(ECACC No. V00083008)本質上相同的複製特徵但在其基因組的一個或多個部分 中展現差異的病毒。「衍生物」不必衍生自MVA-BN 。與所述保藏病毒具有相同「複製特 徵」的病毒為與保藏株以相似的擴增速率在CEF細胞和細胞系HeL^HaCat和143B中複製； 且在體內顯示相似的複製特徵(如例如在AGR129轉基因小鼠模型中所測定的)的病毒。本發明涵蓋具有MVA-BN的下列兩種特性中的一項或兩項的MVA病毒-能夠在雞胚成纖維細胞(CEF)中生殖性複製，但是不能在人角質形成細胞細 胞系(HaCaT)、人胚腎細胞系(293)、人骨骨肉瘤細胞系(143B)、和人子宮頸腺癌細胞系 (HeLa)中生殖性複製；和-不能在能夠生成成熟B和T細胞且因此是重度免疫受損的且對複製型病毒高度 易感的小鼠模型中複製。在某些實施方案中，所述MVA是含有與所述痘苗病毒異源的別的核苷酸序列的重 組痘苗病毒。在某些此類實施方案中，所述異源序列編碼誘導免疫系統產生應答的表位。如 此，在某些實施方案中，使用所述重組MVA來針對包含所述表位的蛋白質或藥劑進行疫苗 接種。在一個優選的實施方案中，所述表位是腫瘤相關抗原，優選PSA或PAP。在一個實施 方案中，所述PSA抗原包含序列SEQ ID NO :1。在一個實施方案中，所述PAP抗原包含序列 SEQ IDNO :2。
在某些實施方案中，將異源核酸序列插入病毒基因組的非必需區域中。在某 些那些實施方案中，將異源核酸序列插入在MVA基因組的天然存在刪除位點處，如PCT/ EP96/02926中所記載的。用於將異源序列插入痘病毒基因組中的方法是本領域技術人 員已知的。在某些實施方案中，將異源核酸序列插入在MVA基因組的基因間區中，如以公 布的美國專利申請20050244428中所記載的。在一個實施方案中，所述基因間區是IGR 014L/015L。在某些實施方案中，藥物組合物包含一種或多種藥學可接受的和/或批准的載 體、添加劑、抗生素、防腐劑、佐劑、稀釋劑和/或穩定劑。此類添加劑包括例如但不限於水、 鹽水、甘油、乙醇、溼潤劑或乳化劑、和PH緩衝物質。例示性的載體典型地是大的、緩慢代謝 的分子，諸如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、脂質聚集物、諸 如此類。為了製備疫苗，可以將MVA轉變成生理學可接受形式。在某些實施方案中，此類 製備基於在製備用於針對天花疫苗接種的痘病毒疫苗中的經驗，如例如Stickl，H. et al.， Dtsch. med. Wschr. 99 2386-2392 (1974)中所記載的。下文是一種例示性的製備。將純化的病毒以在IOmM Tris、HOmMNaCl，pH7. 4中配 製成5X 108TCID5(1/ml的滴度保存於_80°C。為了製備疫苗彈，在安瓿(優選玻璃安瓿)中 在存在2%蛋白腖和人清蛋白的情況中在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中凍幹例如IO2-IO8個 病毒顆粒。或者，可以通過逐步、冷凍-乾燥配製劑中的病毒來製備疫苗彈。在某些實施方 案中，所述配製劑含有別的添加劑，諸如甘露醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷 酮、或其它添加劑，諸如包括但不限於適合於體內施用的抗氧化劑或惰性氣體、穩定劑或重 組蛋白質(例如人血清清蛋白)。然後將所述安瓿密封，而且可以於合適的溫度(例如在 4°C和室溫之間)保存數月。然而，只要沒有需要，所述安瓿優選保存於低於-20°C的穩定。在涉及疫苗接種或治療的各種實施方案中，將凍乾物在0. 1-0. 5ml水溶液(優選 生理鹽水或Tris緩衝液)中溶解，並系統或局部施用，即通過胃腸外、皮下、靜脈內、肌肉 內、鼻內、皮內、或熟練從業人員已知的任何其它施用途徑。施用模式、劑量、和施用次數的 優化在本領域技術人員的能力和知識之內。在某些實施方案中，減毒痘苗病毒株對於在免疫受損的動物(例如受SIV感染的 猴(CD4 < 400/μ 1血液))或免疫受損的人中誘導免疫應答是有用的。術語「免疫受損的」 描述只展現不完全的免疫應答或在針對傳染劑的防禦中具有降低的效率的個體的免疫系 統狀態。某些例示性腫瘤相關抗原在某些實施方案中，在受試者中誘導針對細胞相關多肽抗原的免疫應答。在某些 此類實施方案中，細胞相關多肽抗原是腫瘤相關抗原。在某些實施方案中，細胞相關多肽抗原是腫瘤相關抗原以外的自身蛋白質抗原 (其涉及多種病理學過程)、或病毒抗原、或自細胞內寄生物或細菌衍生的抗原。在某些情 況中，此類病原體相關抗原常常是相對較弱的免疫原(例如來自分支桿菌(諸如結核分支 桿菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口麻風分支桿菌(Mycobacterium leprae)以及來自 原生動物(諸如瘧原蟲(Plasmodiumspp.)的抗原)。眾多腫瘤相關抗原是本領域已知的。例示性的腫瘤相關抗原包括但不限於5種 α-還原酶、甲胎蛋白、AM-1、APC、April、BAGE, β-聯蛋白、Bcll2、bcr-abl、CA-125、 CASP-8/FLICE、組織蛋白酶、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33 CD35、CD44、CD45、CD46、 CD5、CD52、CD55、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、Cox-2、DCC、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、 法尼基轉移酶、FGF8b、FGF8a、FLK-1/KDR、葉酸受體、G250、GAGE家族、胃泌素17、胃泌素 釋放激素、GD2/GD3/GM2、GnRH, GnTV, GPl、gpl00/Pmell7、gp-100_in4、gpl5、gp75/TRP_l、 hCG、類肝素酶(h印aranse)、Her2/neu、HMTV, Hsp70、hTERT、IGFRl、IL-13R、iNOS、Ki67、 KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、MAGE 家族、mammaglobin、MAP17、melan-A/ MART-U mesothelin、MIC A/B、MT-MMPs、粘蛋白、NY-ESO-l、骨粘連蛋白、pl5、P170/MDR1、 p53、p97/ 黑素運鐵蛋白、PAI-I、PDGF, uPA、PRAME, probasin、progenipoientin、PSA、 PAP、PSM、RAGE-I、Rb、RCASl、SART-I、SSX 家族、STAT3、STn、TAG-72、TGF- α、TGF-β、胸腺 素-β -15,TNF- α、TPl、TRP-2、酪氨酸酶、VEGF、ZAG、pl6INK4、和穀胱甘肽-S-轉移酶。前列 腺癌中的腫瘤相關抗原的具體例子包括但不限於PSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PAP、 和前列腺幹細胞抗原(PSCA)。PSA 禾口 PAP 抗原本發明涵蓋PSA和PAP抗原，其是PSA和PAP的全長或片段。優選的是，所述PSA 和PAP抗原是人的。在另一個實施方案中，所述PSA和/或PAP是大鼠或小鼠的。在一個 優選的實施方案中，所述PSA和PAP抗原分別由核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2編碼。在一個實施方案中，所述PAP抗原是PAP片段。優選的片段包含人PAP的 胺基酸 181-95、112-120、133-152、155-163、173-192、199-213、228-242、248-257、 299-307、或 308-322。參見 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006) ；Klyushnenkova et al. ,Prostate67(10) 1019-28(2007) ；Matsueda et al.，Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005) ；Harada et al.，Oncol Rep. 12(3) 601-7(2004) ；Machlenkin et al.，CancerRes. 65(14) :6435_6442 (2005)；及 McNeel et al. ,Cancer Res. 61(13) :5161_7 (2001)，通過述及收入本文。在一個實施方案中，所述多肽 包含這些表位之一。在其它實施方案中，所述多肽包含這些表位中的2、3、4、5、6、7、8、9、或 10種。本發明明確涵蓋這些表位的每一種可能組合。在某些實施方案中，所述PAP片段包含人PAP的25、50、75、100、125、150、175、200、 225、250、275、300、325、或375個連續胺基酸。可以使用本領域公知測定法對PAP片段測定 表位的保留。參見例如Klyushnenkova etal. ,Prostate 67(10) 1019-28(2007) ；Matsueda et al. , Clin Cancer Res. 11(19 Ptl) :6933_43 (2005)，通過述及收入本文。可以通過PCR或其它常規分子生物學技術來生成編碼這些片段的DNA。在一個實施方案中，所述PSA抗原是PSA片段。優選的片段包含人PSA的氨基 酸 16-24 或 154-163。參見 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006) ；Matsueda et al. ,Clin Cancer Res. 11(19 Ptl) :6933_43 (2005)，通過 述及收入本文。在一個實施方案中，所述多肽包含這些表位之一。在其它實施方案中，所述 多肽包含這兩種表位。可以使用本領域公知測定法(諸如表位掃描)對PSA片段測定表位的保留。在某 些實施方案中，所述？34片段包含人？5々的25、50、75、100、125、150、175、200、225、或250個連續胺基酸。可以通過PCR或其它常規分子生物學技術來生成編碼這些片段的DNA。可以通過本領域公知方法來生成各種經修飾的PAP和PSA多肽抗原和方法。例如， 可使用 U. S. Pat. No. 7，005，498 和 U. S. Pat. Pub. Nos. 2004/0141958 和 2006/0008465 中記 載的方法，通過述及收入本文。應當考慮下列參數1.已知的和預測的CTL表位；2.與相關蛋白質的同源性；3.半胱氨酸殘基的保守性；4.預測的環、α -螺旋和β -片層結構；5.潛在的N-糖基化位點；6.對暴露的和埋藏的胺基酸殘基的預測；7.結構域組織。與其它相關蛋白質具有高度同源性的區域對於「總體」三級結構及因此對於抗體 識別有可能在結構上是重要的，而具有低同源性的區域有可能能改變，結果只是結構的局 部改變。半胱氨酸殘基常常涉及分子內二硫橋形成，而且如此涉及三級結構，不應當改變。 預測形成α-螺旋或β-片層結構的區域應當避免作為外來表位的插入點，因為認為這些 區域涉及蛋白質摺疊。若想要蛋白質甘露糖基化，則應當考慮潛在的N-糖基化位點。(根據它們的疏水性特性)預測在分子內部的區域優選應當保留，因為它們可涉 及摺疊。相反，溶劑暴露區能充當用於插入模型TH表位Ρ2和Ρ30的候選位置。最後，由於其對蛋白質結構和功能的相關性，應當考慮蛋白質的結構域排布 (organization)0通過免疫動物(諸如小鼠)以測定修飾對體液和細胞免疫應答的影響，可以測定 修飾PSA和PAP的效果。經過修飾的腫瘤相關抗原在某些實施方案中，細胞相關多肽抗原是經過修飾的，使得在與APC表面上的MHC I型分子結合而呈遞時，針對呈遞表位的細胞的CTL應答得到誘導，所述表位衍生自所述細 胞表面上的多肽抗原。在某些此類實施方案中，至少一種第一外來Th表位在被呈現時與APC 表面上的MHC II型分子結合。在某些此類實施方案中，細胞相關抗原是腫瘤相關抗原。
能夠呈遞表位的例示性APC包括樹突細胞和巨噬細胞。別的例示性APC包括任何 胞飲或吞噬APC，其能夠同時呈遞1)結合至MHC I型分子的CTL表位和2)結合至MHC II 型分子的Th表位。 在某些實施方案中，對PSA和/或PAP進行修飾，使得在對受試者施用後，主要與 PSA和/或PAP起反應的多克隆抗體得到引發。此類抗體能攻擊和消除腫瘤細胞以及預防 轉移細胞發展成轉移。這種抗腫瘤效應的效應器機制會是經由補體和抗體依賴性細胞的細 胞毒性介導的。另外，所誘導的抗體還能經由抑制受體的生長因子依賴性寡_ 二聚化和內 在化來抑制癌細胞生長。在某些實施方案中，此類經修飾PSA和/或PAP多肽抗原能誘導針對已知的和/或預測的、由腫瘤細胞展示的PSA和/或PAP表位的CTL應答。在一個優 選的實施方案中，所述PSA和PAP抗原誘導針對這些抗原的B細胞和T細胞應答。在某些實施方案中，經修飾的PSA和/或PAP多肽抗原包含細胞相關多肽抗原的 CTL表位和變異，其中所述變異包含外來Th表位的至少一種CTL表位。包含至少一種CTL 表位的某些此類經修飾PSA和/或PAP多肽抗原和包含外來Th表位的至少一種CTL表位 的變異及其生成方法記載於 U. S. Pat. No. 7，005, 498 和 U. S. Pat. Pub. Nos. 2004/0141958 和 2006/0008465 ο在某些實施方案中，外來Th本文是天然存在的「混雜」T細胞表位。此類混雜T細 胞表位在動物物種或動物群體的大比例的個體中是有活性的。在某些實施方案中，疫苗包 含此類混雜T細胞表位。在某些此類實施方案中，混雜T細胞表位的使用降低對同一疫苗 中有很大數目的不同CTL表位的需要。例示性的混雜T細胞表位包括但不限於來自破傷風 毒素(包括但不限於P2和P30表位(Panina-Bordignon et al.，1989))、白喉毒素、流感病 毒血凝素(HA)、和鐮狀瘧原蟲(P. falciparum) CS抗原的表位。別的混雜T細胞表位包括能夠結合大比例的由不同HLA-DR編碼的HLA-DR分 子的肽。參見例如 WO 98/23635 (Frazer IH et al.，assigned to TheUniversity of Queensland) ；Southwood S et.al, J.Immunol. 160 3363-3373(1998) ；Sinigaglia F et al. , Nature 336 778780 (1988) ；Rammensee HG et al. , Immunogenetics 41(4) 178-228(1995) ；Chicz RM et al.，J.Exp. Med 178 :27_47(1993) ；Hammer J et al.，Cell 74 197-203 (1993)；及 Falk K et al. , Immunogenetics 39:230-242(1994)。後一篇參考 文獻還涉及HLA-DQ和-DP配體。這些參考文獻中所列出的所有表位作為如本文所描述的 候選天然表位是相關的，正如與這些共享共同基序的表位。在某些其它實施方案中，所述混雜T細胞表位是人工T細胞表位，其能夠結合 大比例的單元型(haplotype)。在某些此類實施方案中，所述人工T細胞表位是泛DR表 位月太(「PADRE」)，如 WO 95/07707 和相應的論文 Alexander J et al. , Immunity 1 751-761(1994)中所記載的。重組MVA本發明涵蓋表達包含PAP抗原的多肽的重組MVA病毒。優選的是，MVA病毒表達人 PAP抗原。在一個實施方案中，所述MVA病毒表達大鼠或小鼠PAP抗原。在一個實施方案 中，MVA病毒編碼全長PAP抗原。在一個優選的實施方案中，所述MVA包含核苷酸序列SEQ ID NO :2。在另一個實施方案中，所述MVA編碼PAP片段。可以使用本領域公知測定法對PAP 片段測定表位的保留。參見例如Klyushnenkova et al.，Prostate67 (10) 1019-28 (2007)； Matsueda et al.，Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005) ；Machlenkin et al.， Cancer Res. 65(14) :6435_6442 (2005)，通過述及收入本文。在某些實施方案中，所述PAP 片段包含人 PAP 的 25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、或 375 個連續 胺基酸。在優選的實施方案中，所述MVA編碼包含人PAP胺基酸81-95、112-120、 133-152、155-163、173-192、199-213、228-242、248-257、299-307、或 308-322 的多肽。 參 見 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006)；Klyushnenkova et al. ,Prostate 67(10) 1019-28 (2007) ；Matsueda et al. ,Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005) ；Harada et al.，Oncol Rep. 12(3) :601_7(2004)； Machlenkin et al. , Cancer Res. 65(14) 6435-6442(2005)；及 McNeel et al. , Cancer Res. 61 (13) :5161-7 (2001)，通過述及收入本文。在一個實施方案中，所述多肽包含這些表 位之一。在其它實施方案中，所述多肽包含這些表位中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10種。本發 明明確涵蓋這些表位的每一種可能組合。本發明涵蓋表達包含PSA抗原的多肽的重組MVA病毒和表達包含PSA抗原的多肽 及包含PAP抗原的多肽的重組MVA病毒。優選的是，MVA病毒表達人PSA抗原。在一個實 施方案中，所述MVA病毒表達大鼠或小鼠PSA抗原。在一個實施方案中，MVA病毒編碼全長 PSA抗原。在一個優選的實施方案中，所述MVA包含核苷酸序列SEQ ID NO :1。在另一個實施方案中，所述MVA編碼PSA片段。可以使用本領域公知測定法對PSA 片段測定表位的保留。在某些實施方案中，所述PSA片段包含人PSA的25、50、75、100、125、 150、175、200、225、或250個連續胺基酸。在優選的實施方案中，所述MVA編碼包含人PSA胺基酸16_24或154-163的多 月太。參見 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006)； Matsueda et al. ,Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005)，通過述及收入本文。在 一個實施方案中，所述多肽包含這些表位之一。在其它實施方案中，所述多肽包含這兩種表 位。所述重組MVA病毒可以在免疫原性組合物中使用，用於在對宿主施用時誘導針對 PAP和/或PSA的B細胞和T細胞免疫應答。在一個優選的實施方案中，所述免疫原性組合 物在對宿主施用時誘導針對PAP和/或PSA的抗體。所述免疫原性組合物可含有佐劑、稀 釋劑和/或穩定劑。此類添加劑包括例如但不限於水、鹽水、甘油、乙醇、溼潤劑或乳化齊U、 和PH緩衝物質。在一個實施方案中，所述MVA是MVA-BN 。在一個非限制性實施方案中，如下構建包含腫瘤相關抗原的重組MVA，例如 MVA-BN-PR0，其編碼PSA和PAP兩種抗原。最初的病毒原種是使用允許複製的細胞類型 (例如CEF細胞)在細胞培養物中通過重組生成的。將細胞既用減毒的痘苗病毒(例如 MVA-BN )接種，又用編碼腫瘤相關抗原(例如PSA或PAP)序列和病毒基因組側翼區 的重組質粒(例如PBN217)轉染。在一個非限制性實施方案中，所述質粒PBN217含有也在 MVA-BN 中存在的序列(014L和015L可讀框)。將所述PSA和PAP cDNA序列插入在所 述MVA-BN 序列之間，以容許重組入MVA-BN 病毒基因組中。在某些實施方案中，所 述質粒還含有包含一種或多種選擇基因的選擇盒，以容許在CEF細胞中選擇重組構建物。同時感染和轉染培養物容許在病毒基因組和重組質粒之間發生同源重組。然後分 離攜帶插入物的病毒，表徵，並製備病毒原種。在某些實施方案中，在沒有選擇的情況中在 CEF細胞培養物中將病毒傳代，以容許編碼選擇基因(例如gpt和紅色螢光蛋白(RFP))的 區域丟失。治療方法具有由過表達腫瘤相關抗原(諸如PSA和/或PAP)的細胞介導的癌症的患者可 以用編碼一種或多種此類抗原的重組MVA來治療。在一個優選的實施方案中，所述MVA是MVA-BN 。在一個特別優選的實施方案中，所述MVA編碼包含核苷酸序列SEQ ID NO 1 的多肽和包含核苷酸序列SEQ ID NO 2的第二多肽。所述癌症優選是前列腺癌。在一個實施方案中，所述癌症是轉移性前列腺癌。所述 癌症患者可以是任何哺乳動物，包括小鼠或大鼠。優選的是，所述癌症患者是靈長類動物， 最優選是人。所述編碼一種或多種腫瘤相關抗原(例如PSA或PAP)的重組MVA可以系統或局 部施用，即通過胃腸外、皮下、靜脈內、肌肉內、鼻內、皮內、或熟練從業人員已知的任何其它 施用途徑。在一個實施方案中，給患者施用IO5-IOiciTCID5ci的所述重組MVA。優選的是，給患 者施用IO7-IOiciTCID5ci的所述重組MVA。最優選的是，給患者施用IO8-IOiciTCID5ci的所述重 組MVA。最優選的是，給患者施用IO8-IO9或IO9-IOiciTCID5ci的所述重組MVA。優選的是，以 1 X 108、2X 108、或4X IO8TCID50的劑量給患者施用所述重組MVA。可以一次性地或在多個時間施用所述重組MVA。在某些實施方案中，所述重組MVA 施用兩次、三次、四次、或五次。優選的是，所述重組MVA給予三次。最優選的是，以四周時 間間隔給予三次。各施用之間的間隔優選是1-4周、1-8周、1-16周、和1-52周。在一個實 施方案中，所述重組MVA在第0天施用，並在第8天和第15天再次施用。在一個優選的實 施方案中，為後續施用擴大劑量。在一個特別優選的實施方案中，以四周時間間隔給予三次1X108、2X108、和 4X IO8TCID50 0給予多劑重組MVA的基本原理基於小鼠中顯示強化處理顯著提高抗PSA和 抗PAP免疫應答的臨床前免疫原性數據。考慮到人中的巨大免疫學多態性，給予三劑或更 多劑能確保每一名個體都能達到最大免疫應答。在一個實施方案中，抗PSA和/或抗PAP抗體應答。在一個實施方案中，用重組 MVA處理誘導抗PSA和/或抗PAP T細胞免疫應答。在一個實施方案中，用重組MVA處理誘 導抗PSA和/或抗PAP抗體及T細胞免疫應答。在一個實施方案中，用重組MVA處理誘導針對其它腫瘤抗原的T細胞應答的擴散。在一個實施方案中，用重組MVA處理在預防性和/或治療性設置中抑制PSA (+)腫 瘤生長。在一個實施方案中，用重組MVA處理在預防性和/或治療性設置中抑制PAP⑴腫 瘤生長。在一個實施方案中，用重組MVA處理在預防性和/或治療性設置中抑制PSA⑴和 PAP(+)腫瘤生長。與細胞毒劑的組合療法具有由過表達腫瘤相關抗原(諸如PSA和/或PAP)的細胞介導的癌症的患者可 以通過編碼一種或多種此類抗原的重組MVA與紫杉烷的組合來治療。在亞破壞腫瘤劑量展 現免疫調控活性的細胞毒劑對疫苗效能會是有益的。在破壞腫瘤劑量(高劑量)時，這些 藥劑在重組MVA處理同時、之前、或之後的使用可優於任一單獨的處理。在一個實施方案中，所述紫杉烷是多西他塞(docetaxel)。在另一個實施方案中， 所述紫杉烷是帕利他塞(paclitaxel)。所述紫杉烷優選以一個破壞腫瘤劑量施用。一個 「破壞腫瘤劑量」的多西他塞是至少50mg/m2。優選的是，所述破壞腫瘤劑量的多西他塞是 75-100mg/m2，其對應於大約25_33mg/kg的劑量。一個「破壞腫瘤劑量」的帕利他塞是至少 90mg/m2。優選的是，所述破壞腫瘤劑量的帕利他塞是135-175mg/m2。一個「亞破壞腫瘤劑量」的紫杉烷是低於破壞腫瘤劑量的劑量。所述紫杉烷可以通過熟練技術人員已知的任何 手段來施用，例如靜脈內。在一個實施方案中，所述紫杉烷和編碼包含前列腺腫瘤特異性抗原的多肽的MVA 是同時施用的。在一個實施方案中，所述紫杉烷是在所述重組MVA之前施用的。在一個實施方案 中，所述重組MVA是在所述紫杉烷施用的6個月內施用的。在某些實施方案中，所述重組 MVA是在所述紫杉烷後3個月內、2個月內、或1個月內施用的。在一個實施方案中，所述重 組MVA是在所述紫杉烷後21天內施用的。在一個實施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉 烷後14天內施用的。在一個實施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉烷後7天內施用的。 通常，所述重組MVA是在用所述紫杉烷處理後至少2天施用的。在一個實施方案中，所述紫杉烷是在所述重組MVA之後施用的。通常，所述重組 MVA是在用所述紫杉烷處理前至少1周施用的。在一個實施方案中，所述重組MVA是在所 述紫杉烷前不到2年施用的。在某些實施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉烷前不到1 年、不到6個月、或不到3個月施用的。在一個實施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉烷 前1-26周施用的。在一個實施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉烷前1-9周施用的。在 一個實施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉烷前1-3周施用的。在某些實施方案中，所述紫杉烷是在所述重組MVA之前及之後施用的。在其它實 施方案中，所述重組MVA是在所述紫杉烷之前及之後施用的。所述重組MVA和所述紫杉烷 的施用可以是單次施用或多次施用。例如，所述施用可相隔1、2、3、4、5、或6周。試劑盒本發明涵蓋包含重組MVA的試劑盒。所述重組MVA可以裝在管形瓶或容器中。在 一個實施方案中，所述重組MVA編碼PAP抗原。在一個實施方案中，所述重組MVA編碼包含 PSA抗原的多肽。在一個實施方案中，所述重組MVA編碼包含PSA抗原的多肽和包含PAP抗 原的多肽。在各種實施方案中，用於疫苗接種的試劑盒在第一管形瓶或容器中裝有用於第 一次疫苗接種(「引發」)的重組MVA且在第二或第三管形瓶或容器中裝有用於第二或第三 疫苗接種(「強化」)的重組MVA。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和為預防前列腺癌而施用所述重 組MVA的指令。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和在檢測到一種或多種前 列腺腫瘤相關標誌物升高後為預防前列腺癌而施用所述重組MVA的指令。在一個優選的實 施方案中，所述指令可指示在確定循環中的PSA水平升高後為預防前列腺癌而要施用所述 MVA。在一個實施方案中，所述指令可指示為預防前列腺癌而要對30歲以上的男性患者施 用所述MVA。在一個實施方案中，所述指令可指示為預防前列腺癌而要對30歲以上、40歲 以下的男性患者施用所述MVA。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和在40歲 後為預防前列腺癌而施用所述重組MVA的指令。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和為預防前列腺癌轉移而施用所 述重組MVA的指令。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和在檢測到前列腺腫 瘤細胞相關標誌物升高後為預防前列腺癌轉移而施用所述重組MVA的指令。在一個優選的 實施方案中，所述指令可指示在確定循環中的PSA水平升高後、儘管沒有可檢測的原發瘤 的情況下，為預防前列腺癌轉移而施用所述MVA。在一個實施方案中，所述指令可指示為預防前列腺癌轉移而要對30歲以上的男性患者施用所述MVA。在一個實施方案中，所述指令 可指示為預防前列腺癌轉移而要對30歲以上、40歲以下的男性患者施用所述MVA。在一個 實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和為預防前列腺癌轉移而在40歲後施用所述重組 MVA的指令。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和為治療前列腺癌而施用所述重 組MVA的指令。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和在檢測到一種或多種前 列腺腫瘤相關標誌物升高後為治療前列腺癌而施用所述重組MVA的指令。在一個優選的實 施方案中，所述指令可指示在確定循環中的PSA水平升高後為治療前列腺癌而要施用所述 MVA。在一個實施方案中，所述指令可指示為治療前列腺癌而要對30歲以上的男性患者施 用所述MVA。在一個實施方案中，所述指令可指示為治療前列腺癌而要對30歲以上、40歲 以下的男性患者施用MVA。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和為治療前列腺 癌而在40歲後施用所述重組MVA的指令。在一個實施方案中，所述試劑盒可裝有重組MVA和在施用破壞腫瘤劑量的紫杉烷 前施用所述重組MVA的指令。所述指令可指示要在紫杉烷施用前6個月和1周之間的任何 時間點施用所述MVA。在優選的實施方案中，所述指令指示要在紫杉烷施用前3個月和1 周、六周和1周、1個月和1周、3周和1周、及2周和1周之間的任何時間點施用所述MVA。 在一個實施方案中，所述指令可指示要在紫杉烷施用前1周和0天之間的任何時間點施用 所述MVA。所述試劑盒也可裝有重組MVA和在施用破壞腫瘤劑量的紫杉烷的同時施用所述 重組MVA的指令。所述試劑盒也可裝有重組MVA和在施用破壞腫瘤劑量的紫杉烷後施用所述重組 MVA的指令。所述指令可指示要在紫杉烷施用後1天和6個月之間的任何時間點施用所述 MVA。在優選的實施方案中，所述指令指示要在紫杉烷施用後2天和1周、2天和2周、2天 和3周、2天和1個月、2天和2個月、及2天和3個月、及2天和6個月之間的任何時間點 施用所述MVA。在一個實施方案中，所述指令可指示要在紫杉烷施用後0和2天之間的任何 時間點施用所述MVA。下文給出了實施例和參考文獻以更為詳細地例示本發明，但是本發明的範圍不受 這些實施例限制。所例示的論文中熟練技術人員想到的任何變化意圖落在本發明的範圍 內。此外，參考所引用的參考文獻能最徹底地理解說明書，通過述及將它們都完整收入本 文。
實施例實施例1 :MVA-BN-PR0的構建和對受感染細胞中蛋白質表達的分析為了開發前列腺癌疫苗，生成了編碼人前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷 酸酶(PAP)的重組痘苗病毒載體，MVA-BN-PR0。重組痘苗病毒載體MVA-BN-PRO衍生自高度 減毒的痘苗病毒株MVA-BN (改良痘苗病毒安卡拉一 Bavarian Nordic)。MVA-BN 高度適應了原代雞胚成纖維細胞(CEF)細胞，而且不在人細胞中生殖性複製。在人細胞中， 病毒基因表達，但是不生成感染性病毒。基因的起源
使用例行分子生物學技術，自購自ClonteCh(產品目錄編號6410801)的人前列腺 總RNA轉錄(逆轉錄)PSA基因和PAP cDNA。PSA是由前列腺生成的前列腺特異性抗原，而 且以升高的量見於具有前列腺癌、良性前列腺增生、或前列腺感染或炎症的男性的血液中。 PSA已經被鑑定為由細胞介導的免疫療法辦法的靶物。PAP (前列腺酸性磷酸酶)是一種在 血液中測量到的酶，其水平在具有已經侵入或轉移別處的前列腺癌的患者中升高。除非腫 瘤已經擴散到解剖學上的前列腺囊以外，否則PAP不會升高。因此，當前在數項人疫苗試驗 中作為靶抗原調查這種前列腺腫瘤抗原，其中一些試驗獲得了臨床好處的證據。所得擴增的PSA和PAP cDNA的序列據證實與那些已發表的序列匹配。也就是說， 下文顯示了 PSA cDNA(例如GenBank M26663. 1 GI =618463 ；同義詞激肽釋放酶3 ；KLK3 ； 786bp 等)和 PAP cDNA 基因的序列(GenBankM34840. 1 GI 189620 ；同義詞PAP，ACP3, ACP-3 ；ACPP ； 116Ibp)。人PSA cDNA序列(與GenBank序列M26663. 1具有99%同一性；粗體位於第48 位、第54位和第237位的三處沉默核苷酸替換，其不改變胺基酸序列)ATGTGGGTCCCGGTTGTCTTCCTCACCCTGTCCGTGACGTGGATTGGCGCTGCGCCCCTCATCCTGTCT CGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGT CTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGC TGGGTCGGCACAG1CTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCCCACACCCGCTC TACGATATGAGCCTCCTGAAGAATCGATTCCTCAGGCCAGGTGATGACTCCAGCCACGACCTCATGCTGCTCCGCCT GTCAGAGCCTGCCGAGCTCACGGATGCTGTGAAGGTCATGGACCTGCCCACCCAGGAGCCAGCACTGGGGACCACCT GCTACGCCTCAGGCTGGGGCAGCATTGAACCAGAGGAGTTCTTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGTGTGGACCTCCAT GTTATTTCCAATGACGTGTGTGCGCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGAC AGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGGTGTGCTTCAAGGTATCACGTCAT GGGGCAGTGAACCATGTGCCCTGCCCGAAAGGCCTTCCCTGTACACCAAGGTGGTGCATTACCGGAAGTGGATCAAG GACACCATCGTGGCCAACCCCTGA(SEQ ID NO 1)人PSA的胺基酸序列為MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCS⑶SGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO :3)。人PAP cDNA 序列(與 GenBank 序列 M34840. 1 具有 100% 同一性) ATGAGAGCTGCACCCCTCCTCCTGGCCAGGGCAGCAAGCCTTAGCCTTGGCTTCTTGTTTCTGCTTTTT TTCTGGCTAGACCGAAGTGTACTAGCCAAGGAGTTGAAGTTTGTGACTTTGGTGTTTCGGCATGGAGACCGAAGTCC CATTGACACCTTTCCCACTGACCCCATAAAGGAATCCTCATGGCCACAAGGATTTGGCCAACTCACCCAGCTGGGCA TGGAGCAGCATTATGAACTTGGAGAGTATATAAGAAAGAGATATAGAAAATTCTTGAATGAGTCCTATAAACATGAA CAGGTTTATATTCGAAGCACAGACGTTGACCGGACTTTGATGAGTGCTATGACAAACCTGGCAGCCCTGTTTCCCCCAGAAGGTGTCAGCATCTGGAATCCTATCCTACTCTGGCAGCCCATCCCGGTGCACACAGTTCCTCTTTCTGAAGATC AGTTGCTATACCTGCCTTTCAGGAACTGCCCTCGTTTTCAAGAACTTGAGAGTGAGACTTTGAAATCAGAGGAATTC CAGAAGAGGCTGCACCCTTATAAGGATTTTATAGCTACCTTGGGAAAACTTTCAGGATTACATGGCCAGGACCTTTT TGGAATTTGGAGTAAAGTCTACGACCCTTTATATTGTGAGAGTGTTCACAATTTCACTTTACCCTCCTGGGCCACTG AGGACACCATGACTAAGTTGAGAGAATTGTCAGAATTGTCCCTCCTGTCCCTCTATGGAATTCACAAGCAGAAAGAG AAATCTAGGCTCCAAGGGGGTGTCCTGGTCAATGAAATCCTCAATCACATGAAGAGAGCAACTCAGATACCAAGCTA CAAAAAACTTATCATGTATTCTGCGCATGACACTACTGTGAGTGGCCTACAGATGGCGCTAGATGTTTACAACGGAC TCCTTCCTCCCTATGCTTCTTGCCACTTGACGGAATTGTACTTTGAGAAGGGGGAGTACTTTGTGGAGATGTACTAT CGGAATGAGACGCAGCACGAGCCGTATCCCCTCATGCTACCTGGCTGCAGCCCTAGCTGTCCTCTGGAGAGGTTTGC TGAGCTGGTTGGCCCTGTGATCCCTCAAGACTGGTCCACGGAGTGTATGACCACAAACAGCCATCAAGGTACTGAGG ACAGTACAGATTAG(SEQ ID NO:2)人PAP的胺基酸序列為MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLAKELKFVTLVFRHGDRSPIDTFPTDPIKESSWPQGFGQLTQLGMEQHYELGEYIRKRYRKFLNESYKHEQVYIRSTDVDRTLMSAMTNLAALFPPEGVSIffNPILLffQPIPVHTVPLSEDQLLYLPFRNCPRFQELESETLKSEEFQKRLHPYKDFIATLGKLSGLHGQDLFGIWSKVYDPLYCESV HNFTLPSWATEDTMTKLRELSELSLLSLYGIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMYSAHDTTVSGLQMALDVYNGLLPPYASCHLTELYFEKGEYFVEMYYRNETQHEPYPLMLPGCSPSCPLERFAELVGPVIPQDWSTECMTTNSHQGTEDSTD(SEQ ID NO 4) 啟動子的起源牛痘病毒的A型包涵體啟動子(ATI)，一種晚期啟動子(下文所示)，以合成方式 在pBluescript KS+質粒(Stratagene)中生成，切出並插入在PAP序列和PSA序列兩種的 前面。因此，PSA和PAP蛋白質應當與其它晚期基因一起表達，在DNA複製之後。ATI啟動子的序列5' -GTTTTGAATAAAATTTTTTTATAATAAATC(SEQ ID NO 5)PSA/PAP-MVA-BN重組質粒的構建為了將外來基因插入MVA-BN 基因組中，可以使用靶向MVA-BMgS因組的 特定區域，即刪除位點或基因間(非編碼)區的中間重組質粒。中間pBNX128質粒含有來自014L和015L可讀框(ORF)之間基因間(非編碼)區 (IGR)的側翼區域的MVA DNA序列。可以將序列(例如PSA和PAPcDNA)插入在這些側翼序 列之間。然後，當質粒和MVA-BN 兩者在同一CEF細胞中存在時，014L/015L側翼序列介 導同源重組，介導質粒序列插入到MVA-BN 基因組的014L/015L基因間區中(圖1A-B)。所插入序列中選擇盒的存在容許對重組MVA-BN 病毒的正選擇。MVA-BN-PRO 的牛成同時感染和轉染培養物容許在病毒基因組和重組質粒之間發生同源重組。在選擇 性條件下的多次噬斑純化後獲得了含有PSA和PAP編碼區和選擇盒的重組痘苗載體，命名 為MVA-mBm06A。在擴增和非選擇性條件下進一步噬斑純化後，分離缺少選擇盒的重組痘苗 病毒 MVA-BN-PRO。製備缺少選擇盒的經噬斑純化的病毒MVA-BN-PR0。此類製備涉及十二(12)次傳 代，包括四(4)次噬斑純化。通過DNA測序和PCR分析來驗證MVA-BN-PRO原種中啟動子-PSA-啟動子-PAP序 列的存在和親本MVA-BN 病毒的缺失，並施用嵌套PCR來驗證選擇盒(gpt和RFP基因) 的缺失。圖2顯示了 MVA-BN-PRO基因組的簡化示意圖。實施例2 用MVA-BN-PRO處理的細胞中的PSA和PAP共表達在體外與MVA-BN-PRO —起溫育的細胞中證明了由MVA_BN_PR0編碼的兩種前列腺 特異性抗原(即人PSA和人PAP)的同時表達。將CT26，一種化學誘發的BALB/c小鼠結腸直 腸癌(Brattain et al. ,Cancer Research 40,2142-2146(1980))的培養物與 MVA-BN-PRO 一起溫育，並對上清液分析重組PSA和PAP的存在。使用基於ELISA的PSA診斷試劑盒測量 PSA,該試劑盒例行用於篩選人血清樣品(人PSA ELISA試劑盒，Anogen, Ontario, Canada ； PSA檢測範圍2-80ng/mL)。使用磷酸鹽活性的比色測定法(酸性磷酸酶測定法；PAP檢 測濃度4-40ng/mL)經由其酶特性直接測量PAP。在以範圍1-100的感染複數(MOI)添加 MVA-BN-PRO後24小時收集的同一培養物上清液的等分試樣中評估PSA和PAP。如圖3所示，這兩種抗原都能在與MVA-BN-PRO —起溫育的細胞的上清液中檢測 到。培養物中生成的重組PSA和PAP的量取決於實驗中所使用的MVA-BN-PRO的量(MOI) 和細胞的數目。相反，在單獨的培養基中或與MOI匹配的MVA-BN —起溫育的對照培養 物的上清液中檢測不到PSA或指示PAP的磷酸酶活性。使用每種測定法的參照標準圖計算的PSA和PAP滴度揭示了與MVA-BN-PRO —起 溫育的細胞生成相似量的這兩種抗原。事實上，當以IX IO5個細胞每孔接種CT26並以MOI 10與MVA-BN-PRO —起溫育48小時時，在培養物上清液中測量到1043ng/mL PSA和209ng/ mL PAP。PSA和PAP序列插入MVA-BN 基因組的同一區域中，而且它們的表達是由位於 每種序列上遊的ATI啟動子獨立驅動的。這種插入物構造表現出賦予這兩種重組抗原的最 佳表達以適當的環境。總之，這些數據顯示了MVA-BN 代表了用於多種轉基因抗原(像 PSA和PAP)的優良平衡的和伴隨的表達的適當遞送媒介。實施例3 用MVA-BN-PRO處理的小鼠中對抗PAP和抗PSA免疫應答的誘導在BALB/c小鼠中評估用MVA_BN_PR0處理後對抗PSA和抗PAP免疫應答的誘導。 在這些研究中，評估了範圍為2X106至5X107TCID50的多種劑量的MVA-BN-PRO。在每次 處理前一天和最後一次處理後兩周收集血液樣品，並通過ELISA分析體液應答。最後一次 處理後收集脾細胞，並通過ELISpot分析細胞應答。對抗PSA和抗PAP抗體應答的誘導在第1天、第15天和第29天(q2周x3)用5X 107TCID50的MVA_BN_PR0皮下處 理BALB/c小鼠(每組5隻動物)。用MVA-BN 或配製緩衝液(TBS)處理對照動物。在
21處理前、第14天、第28天、和第42天收集血液樣品。然後合併來自每個測試組小鼠的血 清，並通過ELISA來分析。使用商品化的純化的蛋白質(Meridian Life Sciences, Inc., Saco, ΜΕ)作為包被到微量滴定板的孔上的靶抗原來評估對抗PSA和抗PAP抗體應答的誘 導。如圖4A和4B所示，在用MVA-BN-PRO處理的小鼠中檢測到抗PSA和抗PAP抗體應答。 檢測到抗PSA抗體滴度要求施用至少兩次，而且滴度在第三次MVA-BN-PRO處理後升高。一 般而言，針對PAP的抗體應答是更加適度的，因為滴度總是低於那些針對PSA所誘導的。所 觀察到的針對PAP的低抗體應答可能是由於此蛋白質的弱B細胞抗原性特性。對抗PSA和抗PAP T細胞應答的誘導在第1 天、第 15 天、第 31 天(q2 周 x3)用對照(TBS)、2X IO6 或 5X 107TCID50 的 MVA-BN-PRO皮下處理BALB/c小鼠(每組5隻動物)。在最後一次免疫接種後5天收集脾， 並合併來自每個測試組的細胞懸浮液供分析用。通過測量體外抗原特異性再刺激後IFNy 生成的ELISpot來評估對T細胞應答的誘導。分開使用覆蓋全長PSA或PAP胺基酸序列的 和有11聚物交疊(OPL)的15聚物肽的文庫來進行再刺激。如圖5所示，在用PAP和PSA 兩種OPL再刺激後來自MVA-BN-PRO處理組的脾細胞中檢測到抗原特異性T細胞應答，然而 自人HER-2ecd序列衍生的對照OPL沒有效果(圖5A)。當用PSA、PAP或HER-20PL再刺激 細胞時，在用MVA-BN (數據未顯示)或TBS處理的組(圖5)的小鼠中沒有檢測到T 細胞應答。這些數據指示MVA-BN-PRO是有力的T細胞誘導物，因為無需離體擴增就能在脾 細胞中直接檢測到顯著數目的抗原特異性T細胞。在體外再刺激脾細胞之前消減T細胞子集群體後，檢查CD4輔助T細胞和CD8細 胞毒性T細胞對小鼠中用MVA-BN-PRO處理後誘導的抗PAP和PSA T細胞應答的貢獻。如 圖6所示，在用PSA或PAP OPL再刺激後在消減了⑶4和消減了⑶8的這兩種T細胞子集 中都檢測到T細胞應答。總之，這些研究顯示了用MVA-BN-PRO重複處理小鼠誘導寬的針對兩種TAA的抗原 特異性適應性免疫應答，其涉及抗體及⑶4和⑶8 二者效應器細胞亞型。正如所預期的，抗 體應答主要針對PSA，而PAP (已知的弱B細胞免疫原)只觸發適度的抗體應答。因為PSA 和PAP本質上以抗原呈遞分子/肽複合物的形式作為T細胞靶物呈現在腫瘤細胞表面上， 所以對免疫系統的細胞成分的激活是MVA-BN-PRO效能的一項關鍵要求。在用所有所測試 的MVA-BN-PRO劑量處理的動物中誘導了針對這兩種TAA的強⑶4和⑶8 T細胞應答。因 此，MVA-BN-PRO具有介導對在其表面上呈遞PSA和/或PAP肽的腫瘤細胞的消除的潛力。實施例4 用MVA-BN-PRO處理的小鼠中的抗腫瘤活性在預防性以及治療性癌症腫瘤模型中評估了 MVA-BN-PRO影響小鼠中PSA陽性腫 瘤細胞生長的能力。數據顯示了 MVA-BN-PRO在這兩種設置中都能抑制腫瘤生長。還有， MVA-BN-PRO能夠在治療性癌症腫瘤模型中抑制小鼠中PAP陽性腫瘤細胞生長。用MVA-BN-PRO處理後對保護性抗原特異性適應性免疫力的誘導(預防性設置)使用移植的E5細胞作為前列腺癌模型來評估MVA-BN-PRO預防腫瘤生長的能 力。E5 是 RM11，即一種鼠前列腺腫瘤細胞系(Elzey et al.，Int. J Cancerl5 ；94(6) 842-9(2001))的亞克隆，是用編碼人PSA基因的重組DNA轉染RMll後獲得的。在此效 能研究中，如上所述用MVA-BN-PRO免疫小鼠，即用TBS、MVA-BN (5 X IO7TCID50)或 MVA-BN-PR0(2X 106、1X IO7或5X IO7TCID50)以3周時間間隔免疫三次。然後通過在最後一次處理後六周皮內注射IXlO5個E5細胞來用腫瘤考驗小鼠。此後每周兩次觀察腫瘤生 長，並測量生長中的實體瘤的大小。如圖7C至7E所示，用所有劑量的MVA-BN-PRO預處理的動物中的腫瘤生長比TBS 對照組的腫瘤(圖7A)慢，而且在研究結束時(第29天)對於所有所測試的劑量，>50% 的小鼠仍然沒有腫瘤。相反，早在腫瘤攻擊後第12天在TBS對照組中100%的小鼠中檢測 到可測量的腫瘤。在那天，在來自所有MVA-BN-PRO處理組的僅20%的小鼠中檢測到可測量 的腫瘤。在所有MVA-BN-PRO處理組和TBS對照組之間在自第12天起、貫穿整個研究的所 有時間點，腫瘤大小均值的差異是統計學顯著的(圖7F)。與TBS對照組相似，早在腫瘤考驗前第12天在幾乎每一隻用MVA-BN 處理的 小鼠(90% )中檢測到可測量的腫瘤(圖7B)。然而，在研究結束時，MVA-BN 處理組中 的2隻小鼠(20%)沒有腫瘤(第29天；一隻小鼠貫穿整個研究仍然沒有腫瘤，而且在其它 小鼠中發生腫瘤消退)。還有，直到第22天，MVA-BN 處理組中的腫瘤生長比TBS對照 組的腫瘤慢，而且這兩組之間腫瘤大小均值在兩個時間點達到統計學顯著差異(第19天， P = 0. 034和第22天，P = 0. 019)。用MVA-BN 處理的小鼠中腫瘤生長的遲滯只是暫時 的，因為在所有其它時間點在用TBS和MVA-BN 處理的小鼠中觀察到相似的腫瘤大小均 值(圖7F)。在重複實驗中證實了上文所述由MVA-BN-PRO介導的抗腫瘤活性，其中用以2周時 間間隔2X IO6TCID5tl的MVA-BN-PRO處理小鼠，然後在處理後兩周用腫瘤細胞攻擊。圖8顯 示了腫瘤植入後第29天的數據，以及來自圖7的、植入後同一天的匹配數據。在這兩項實 驗中在用MVA-BN-PRO處理的小鼠中觀察到可比的腫瘤生長遲滯。此外，在MVA-BN-PRO和 TBS處理組之間以及在MVA-BN-PRO和MVA-BN 處理組之間達到腫瘤大小均值的統計學 顯著差異(分別為ρ = 0. 03和ρ = 0. 021)。在重複實驗(數據未顯示)中沒有檢測到圖 7中早期時間點時觀察到的MVA-BN 的暫時效果。這些數據顯示了用MVA-BN-PRO處理 小鼠誘導抗原特異性適應性免疫應答和免疫記憶建立。當隨後兩至六周後用腫瘤細胞攻擊 小鼠時，喚起免疫記憶，並抑制腫瘤細胞生長。用MVA-BN-PRO處理後對腫瘤的遏制(治療性設置)使用移植的E6細胞作為前列腺癌模型來評估MVA-BN-PRO遏制已建立腫瘤的能 力。E6是RM11，即一種鼠前列腺腫瘤細胞系(Elzey et al. ,2001)的亞克隆，是用編碼人 PSA基因的重組DNA轉染RMll後獲得的。E6是比上文所述預防性設置中所使用的E5低的 PSA生成者。通過皮內注射1 X IO5個E6細胞並在同一天、然後在第8天和第15天用TBS、 MVA-BN 或MVA-BN-PR0(5X IO6或5X IO7TCID5tl)處理來用腫瘤攻擊小鼠。此後每周兩 次觀察腫瘤生長，並測量皮膚下的實體瘤大小。如圖9所示，用MVA-BN-PRO處理的動物中的腫瘤(圖9C和9D)生長顯著比用 MVA-BN (圖9A和9B)或TBS (圖9E)處理的動物中的腫瘤慢。在這兩個MVA-BN-PRO 處理組中，在50%的動物中觀察到腫瘤大小穩定或消退。圖9F顯示了組間腫瘤大小均值的 差異。用5X IO6TCID5(1MVA-BN-PRO處理的動物和TBS或MVA-BN 處理對照組之間平均腫 瘤體積有統計學顯著差異(分別為ρ = 0. 014和P = 0. 032)，而5 X 107TCID50MVA-BN-PR0處 理組和TBS對照組之間沒有達到統計學顯著性(ρ = 0. 07)。這些數據顯示了用MVA-BN-PRO處理小鼠在治療性背景中抑制小鼠中前列腺腫瘤生長。使用穩定表達人PAP的CT26細胞在實驗性肺轉移模型中評估MVA_BN_PR0還遏制 已建立的、表達PAP的腫瘤的能力。CT26是化學誘發的BALB/c小鼠的結腸直腸癌(Brattain et al.，1980)。在此模型中，將CT26-PAP細胞靜脈內注射入BALB/c小鼠中，並在腫瘤結生 長之處的肺中評估腫瘤負荷。在第1天用靜脈內注射的CT26-PAP(5X105)細胞攻擊小鼠， 並在第 4 天用單次注射 TBS、MVA-BN(5 X IO7TCID50)或 MVA-BN-PR0 (2 X IO6 和 5 X IO7TCID50) 腹膜內處理。然後在第14天處死小鼠，並對它們的肺稱重。如圖10所示，用5X IO7TCID5tl 的MVA-BN-PRO處理的小鼠中的腫瘤負荷顯著低於對照小鼠中的(ρ < 0. 024)；這種抗腫瘤 活性是劑量依賴性的，因為較低劑量的MVA-BN-PRO沒有效果。此外，這種抗腫瘤活性最有 可能是由PAP特異性免疫應答介導的，因為對照和MVA-BN處理組的小鼠中的腫瘤負荷沒有 變化。這些數據證明了用MVA-BN-PRO處理小鼠抑制小鼠中已建立的PAP陽性腫瘤生長。 如此，由MVA-BN-PRO編碼的PSA和PAP這兩種前列腺抗原對能夠遏制PSA或PAP陽性腫瘤 生長的保護性免疫應答的誘導有貢獻。實施例5 =MVA-BN-PRO跨越單元型限制的免疫原性免疫應答源自抗原衍生表位與免疫感受態細胞上多態性抗原呈遞分子的相互作 用。MVA-BN-PRO中有兩種腫瘤抗原的一個好處在於它們潛在增加能與各種單元型的抗原呈 遞分子相互作用的腫瘤抗原衍生表位的數目。因此，預期MVA-BN-PRO在比含有單一抗原的 疫苗更寬的單元型範圍的個體中會是有免疫原性的。在臨床前模型中使用具有不同單元型 的動物評估了這種可能性。在此實施例中，改良實施例1中所描述的載體，將ATI啟動子用 早期/晚期合成啟動子替換(Ps ;Chakrabarti S,Sisler JR，和Moss B,BioTechniques23 1094-1097 (1997年12月))。因此，PSA和PAP蛋白質應當與其它早期和晚期基因一起貫 穿整個MVA感染期表達。Ps啟動子的序列5' -AAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAT (SEQ ID NO 6)在第1天、第15天、和第29天用5 X IO7TCID50的MVA-BN-PRO免疫雄性BALB/c和 C57BL/6小鼠(每組5隻動物)。在第42天收集血液樣品，並如實施例3所述通過ELISA 對合併血清的連續稀釋液分析抗PSA或抗PAP IgG的存在。如圖11所示，只在來自BALB/ c小鼠的血清中檢測到高滴度的抗PSA抗體。相反，雖然在來自這兩種小鼠品系的血清中都 測量到抗PAP抗體滴度，但是在來自C57BL/6小鼠的血清中檢測到更高的抗PAP抗體滴度。 此數據強調了針對特異性抗原的免疫應答的單元型聯繫且支持MVA-BN-PRO中有多種腫瘤 抗原應當在具有不同單元型的更寬範圍的個體中提供有效免疫力的想法。實施例6 =MVA-BN-PRO在人中的安全性和免疫原性當前正在研究MVA-BN-PRO對前列腺癌患者的治療。在本申請的時候，4名患者接 受1-3次1E8TCID50的MVA-BN-PRO處理，沒有報告不良反應。通過比較處理前後針對PSA 和PAP的T細胞應答，評估了 MVA-BN-PRO在這些患者之一中的免疫原性。使用ELISpot測 定法測定患者外周血單個核細胞(PBMC)中抗原特異性伽馬乾擾素(IFN-γ)分泌T細胞的 存在。在處理前(基礎)和第三次用IO8TCID5tl的MVA-BN-PRO皮下疫苗接種(TC3)後2周 測定應答。將MATIS-10%培養基(RPMI，Click氏培養基，10%人AB血清、0. 5M 2-β-巰基乙醇、和2%青黴素/鏈黴素)中的患者PBMC(2X IO5)轉移至用10 μ g/mL抗人IFN-γ捕 捉抗體(Mabtech，克隆MAb 1D1K，產品目錄編號3420-3)預包被的Multiscreen 96孔PVDF 板(Millipore，產品目錄編號 MSIPS4510)的水合孔。隨後，用 PSA(5 μ g/mL) (Biodesign 產品目錄編號A86878H)、自PSA全長序列衍生的63種15聚物肽的11聚物交疊文庫(OPL) (63 μ M，每種肽 1 μ Μ)、ΡΑΡ(1 μ g/mL) (Biodesign 產品目錄編號 A81277H)、自 PAP 全長序 列衍生的94種15聚物肽的11聚物0PL(94y M，每種肽1 μ M)、自10種前列腺癌腫瘤相 關抗原(TAA)衍生的44種MHC I型肽的集合(44 μ Μ,每種肽1 μ Μ)、自5種前列腺癌TAA 衍生的15種15種MHC II型肽的集合(15 μ Μ,每種肽1 μ Μ)、或MVA(Bavarian Nordic, MVA-BN-PR0D05A06-C)(感染複數(MOI)為 10)刺激 PBMC。63種PSA OPL肽的序列
MWVPVVFLTLSVTWI(SEQIDNO3的氨基_H-15)
VVFLTLSVTffIGAAP(SEQIDNO3的氨基_I δ-L9)
TLSVTffIGAAPLILS(SEQIDNO3的氨基_ι 9-⑶
TffIGAAPLILSRIVG(SEQIDNO3的氨基_I 13--27)
AAPLILSRIVGGffEC(SEQIDNO3的氨基_I 17--31)
ILSRIVGGffECEKHS(SEQIDNO3的氨基_121--35)
IVGGffECEKHSQPffQ(SEQIDNO3的氨基_125--39)
WECEKHSQPffQVLVA(SEQIDNO3的氨基_129--43)
KHSQPffQVLVASRGR(SEQIDNO3的氨基_133--47)
PffQVLVASRGRAVCG(SEQIDNO3的氨基_137--51)
LVASRGRAVCGGVLV(SEQIDNO3的氨基_141--55)
RGRAVCGGVLVHPQff(SEQIDNO3的氨基_145--59)
VCGGVLVHPQffVLTA(SEQIDNO3的氨基_149--63)
VLVHPQffVLTAAHCI(SEQIDNO3的氨基_153--67)
PQffVLTAAHCIRNKS(SEQIDNO3的氨基_157--71)
LTAAHCIRNKSVILL(SEQIDNO3的氨基_161--75)
HCIRNKSVILLGRHS(SEQIDNO3的氨基_|65--79)
NKSVILLGRHSLFHP(SEQIDNO3的氨基_169--83)
ILLGRHSLFHPEDTG(SEQIDNO3的氨基_173--87)
RHSLFHPEDTGQVFQ(SEQIDNO3的氨基_177--91)
FHPEDTGQVFQVSHS(SEQIDNO3的氨基_181--95)
DTGQVFQVSHSFPHP(SEQIDNO3的氨基_185--99)
VFQVSHSFPHPLYDM(SEQIDNO3的氨基_189--103)
SHSFPHPLYDMSLLK(SEQIDNO3的氨基_193--107)
PHPLYDMSLLKNRFL(SEQIDNO3的氨基_197--111)
YDMSLLKNRFLRP⑶(SEQIDNO3的氨基_I 101-115)
LLKNRFLRPO)DSSH(SEQIDNO3的氨基_I 105-119)
RFLRPGDDSSHDLML(SEQIDNO3的氨基_I 109-123)
PGDDSSHDLMLLRLS(SEQIDNO3的氨基_I 113-127)
GFLFLLFFffLDRSVLSEQIDNO 4的氨基畫g17-31)
LLFFffLDRSVLAKELSEQIDNO 4的氨基畫g21-35)
WLDRSVLAKELKFVTSEQIDNO 4的氨基畫g25-39)
SVLAKELKFVTLVFRSEQIDNO 4的氨基畫g29-43)
KELKFVTLVFRHGDRSEQIDNO 4的氨基畫g33-47)
FVTLVFRHGDRSPIDSEQIDNO 4的氨基畫137-51)
VFRHGDRSPIDTFPTSEQIDNO 4的氨基畫141-55)
GDRSPIDTFPTDPIKSEQIDNO 4的氨基畫g45-59)
PIDTFPTDPIKESSffSEQIDNO 4的氨基畫g49-63)
FPTDPIKESSffPQGFSEQIDNO 4的氨基畫g53-67)
PIKESSffPQGFGQLTSEQIDNO 4的氨基畫157-71)
SSffPQGFGQLTQLGMSEQIDNO 4的氨基畫161-75)
QGFGQLTQLGMEQHYSEQIDNO 4的氨基畫g65-79)
QLTQLGMEQHYELGESEQIDNO 4的氨基畫g69-83)
LGMEQHYELGEYIRKSEQIDNO 4的氨基畫g74-87)
QHYELGEYIRKRYRKSEQIDNO 4的氨基畫177-91)
LGEYIRKRYRKFLNESEQIDNO 4的氨基畫181-95)
IRKRYRKFLNESYKHSEQIDNO 4的氨基畫g85-99)
YRKFLNESYKHEQVYSEQIDNO 4的氨基畫189-103)
LNESYKHEQVYIRSTSEQIDNO 4的氨基畫193-107)
YKHEQVYIRSTDVDRSEQIDNO 4的氨基畫197-111)
QVYIRSTDVDRTLMSSEQIDNO 4的氨基畫g101-115)
RSTDVDRTLMSAMTNSEQIDNO 4的氨基畫g105-119)
VDRTLMSAMTNLAALSEQIDNO 4的氨基畫g109-123)
LMSAMTNLAALFPPESEQIDNO 4的氨基畫g113-127)
MTNLAALFPPEGVSISEQIDNO 4的氨基畫g117-131)
AALFPPEGVSIffNPISEQIDNO 4的氨基畫g121-135)
PPEGVSIffNPILLffQSEQIDNO 4的氨基畫g125-139)
VSIWNPILLWQPIPVSEQIDNO 4的氨基畫g129-143)
NPILLWQPIPVHTVPSEQIDNO 4的氨基畫g133-147)
LWQPIPVHTVPLSEDSEQIDNO 4的氨基畫g137-151)
IPVHTVPLSEDQLLYSEQIDNO 4的氨基畫g141-155)
TVPLSEDQLLYLPFRSEQIDNO 4的氨基畫g145-159)
SEDQLLYLPFRNCPRSEQIDNO 4的氨基畫g149-163)
LLYLPFRNCPRFQELSEQIDNO 4的氨基畫g153-167)
PFRNCPRFQELESETSEQIDNO 4的氨基畫g157-171)
CPRFQELESETLKSESEQIDNO 4的氨基畫g161-175)
QELESETLKSEEFQKSEQIDNO 4的氨基畫g165-179)
SETLKSEEFQKRLHPSEQIDNO 4的氨基畫g169-183)
KSEEFQKRLHPYKDFSEQIDNO 4的氨基畫g 173--187)
FQKRLHPYKDFIATLSEQIDNO 4的氨基畫g 177--191)
LHPYKDFIATLGKLSSEQIDNO 4的氨基畫g 181--195)
KDFIATLGKLSGLHGSEQIDNO 4的氨基畫g 185--199)
ATLGKLSGLHGQDLFSEQIDNO 4的氨基畫g 189--203)
KLSGLHGQDLFGIffSSEQIDNO 4的氨基畫g 193--207)
LHGQDLFGIffSKVYDSEQIDNO 4的氨基畫g 197--211)
DLFGIffSKVYDPLYCSEQIDNO 4的氨基畫1201--215)
IffSKVYDPLYCESVHSEQIDNO 4的氨基畫g 205--219)
VYDPLYCESVHNFTLSEQIDNO 4的氨基畫g 209--223)
LYCESVHNFTLPSffASEQIDNO 4的氨基畫1213--227)
SVHNFTLPSffATEDTSEQIDNO 4的氨基畫1217--231)
FTLPSffATEDTMTKLSEQIDNO 4的氨基畫1221--235)
SffATEDTMTKLRELSSEQIDNO 4的氨基畫g 225--239)
EDTMTKLRELSELSLSEQIDNO 4的氨基畫g 229--243)
TKLRELSELSLLSLYSEQIDNO 4的氨基畫1 234--247)
ELSELSLLSLYGIHKSEQIDNO 4的氨基畫1 237--251)
LSLLSLYGIHKQKEKSEQIDNO 4的氨基畫1241--255)
SLYGIHKQKEKSRLQSEQIDNO 4的氨基畫g 245--259)
IHKQKEKSRLQGGVLSEQIDNO 4的氨基畫g 249--263)
KEKSRLQGGVLVNEISEQIDNO 4的氨基畫g 253--267)
RLQGGVLVNEILNHMSEQIDNO 4的氨基畫1 257--271)
GVLVNEILNHMKRATSEQIDNO 4的氨基畫1261--275)
NEILNHMKRATQIPSSEQIDNO 4的氨基畫g 265--279)
NHMKRATQIPSYKKLSEQIDNO 4的氨基畫g 269--283)
RATQIPSYKKLIMYSSEQIDNO 4的氨基畫1 274--287)
IPSYKKLIMYSAHDTSEQIDNO 4的氨基畫1 277--291)
KKLIMYSAHDTTVSGSEQIDNO 4的氨基畫1281--295)
MYSAHDTTVSGLQMASEQIDNO 4的氨基畫g 285--299)
HDTTVSGLQMALDVYSEQIDNO 4的氨基畫g 289--303)
VSGLQMALDVYNGLLSEQIDNO 4的氨基畫g 293--307)
QMALDVYNGLLPPYASEQIDNO 4的氨基畫1 297--311)
DVYNGLLPPYASCHLSEQIDNO 4的氨基畫1301--315)
GLLPPYASCHLTELYSEQIDNO 4的氨基畫g 305--319)
PYASCHLTELYFEKGSEQIDNO 4的氨基畫g 309--323)
CHLTELYFEKGEYFVSEQIDNO 4的氨基畫1313--327)
ELYFEKGEYFVEMYYSEQIDNO 4的氨基畫1317--331)
EKGEYFVEMYYRNETSEQIDNO 4的氨基畫1321--335)
YFVEMYYRNETQHEPSEQIDNO 4的氨基畫g 325--339)
76-84DYYVGKKNI(SEQ ID NO8的胺基酸76-84)
108-116ALLPALGLL(SEQ ID NO8的胺基酸108-116)
109-117LLPALGLLL(SEQ ID NO8的胺基酸109-117)
115-123LLLffGPGQ(SEQ ID NO 8的胺基酸115-123)
STEAPl
86-94FLYTLLREV (SEQ ID NO 9 的胺基酸86-94)
102-116HQQYFYKIPILVINK(SEQ ID NO 9 的胺基酸 102-
262-270LLLGTIHAL(SEQ ID NO 9 的胺基酸262-270)
292-300MIAVFLPIV(SEQ ID NO 9 的胺基酸292-300)
PTHrp
42-51QLLHDKGKS(SEQ ID NO10的氨基_142-51)
59-68FLHHLIAEIH(SEQ ID NO10的胺基酸 59-68)
59-65FLHHLIA (SEQ ID NO 10 的胺基酸 59-65)
165-173TSTTSLELD(SEQ ID NO10的氨基_I 165-173)
TARP
4-13FPPSPLFFFL(SEQ ID NO11的胺基酸4-13)
27-35FVFLRNFSL(SEQ ID NO11的氨基_I 27-35)
29-37FLRNFSLML(SEQ ID NO11的氨基_I 29-37)
Prostein
31-39CLAAGITYV(SEQ ID NO12)
Eph
58-66IMNDMPIYM(SEQ ID NO13)
550-558VLAGVGFFI(SEQ ID NO14)
存活素
96-104LTLGEFLKL(SEQ ID NO15)
hTERT
973-981KLFGVLRLK(SEQ ID NO 16)
HER2
665-673WLGWFGI (SEQ ID NO 17)
15種TAA MHC II型的序列及相應的TAA和在TAA序列中的位置
激肽釋放酶4
125-139SVSESDTIRSISIAS(SEQ ID NO 18)
155-169LLANGRMPTVLQCVN(SEQ ID NO 19)
160-174RMPTVLQCVNVSVVS(SEQ ID NO 20)
組蛋白H4
14-28GAKRHRKVLRDNIQG (SEQ ID NO 21 的胺基酸 14-28)
KRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR(SEQ ID NO21的氨
16-39基酸16-39)
31-45TKPAIRRLARRGGVK (SEQ ID NO 21 的胺基酸 31-45)
49-63LIYEETRGVLKVFLE (SEQ ID NO :21 的胺基酸 49-63)TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG (SEQ ID NO 21 的氨71-94基酸 71-94)TARP1-14MQMFPPSPLFFFLQ (SEQ ID N0:11)14-27QLLKQSSRRLEHTF(SEQIDN0:11)ENAH(bMena)502-510TMNGSKSPV(SEQ ID NO 22)PSMATGNFSTQKVKMHIHS (SEQ ID NO -J 的胺基酸334-348334-348)NYTLRVDCTPLMYSL (SEQ ID NO -J 的胺基酸459-473459-473)YRHVIYAPSSHNKYA (SEQ ID NO -J 的胺基酸687-701687-701)RQIYVAAFTVQAAAE (SEQ ID NO -J 的胺基酸730-744730-744)於37°C、5% CO2溫育40小時後，用1 μ g/mL生物素化抗人IFN- γ抗體(Mabtech，
克隆MAb 7-B6-1，產品目錄編號3420-6)，接著添加1/5000稀釋的鏈黴親合素-鹼性磷 酸酶(BD Pharmingen，產品目錄編號554065)來檢測IFN-γ分泌。用Vector Blue底 物(Vector Lab Inc.，產品目錄編號SK-5300)對ELISpot板顯色，並用自動斑點閱讀儀 (Cellular Technology Ltd. ImmunoSpot S3B 分析儀和 CTL ImmunoSpot 4. 0 專業軟體) 對斑點計數。如圖12所示，在患者J-D-1001中在MVA-BN-PRO處理前檢測到先前存在的針 對PSA的T細胞應答。抗PSA T細胞在處理後顯著增加，而抗PAP T細胞只在處理後檢測 到。此數據指示MVA-BN-PRO在人中是有免疫原性的，而且同時誘導抗PSA和抗PAP這兩種 應答是能實現的。MVA-BN-PRO處理還導致針對載體MVA-BN的強T細胞應答。最重要的是， MVA-BN-PRO處理還導致針對其它腫瘤抗原的T細胞應答的擴散，正如用TAA MHC I和II肽 集合刺激的T細胞生成IFN- γ所例證的。這指示由MVA-BN-PRO誘導的免疫應答導致對腫 瘤細胞的殺傷，接著是針對其它腫瘤抗原的抗腫瘤應答的放大。抗原擴散是對抗腫瘤保護 性免疫力的誘導中的重要事件，因為它防止腫瘤逃避由疫苗誘導的應答。因此，MVA-BN-PRO 在人中介導針對兩種腫瘤抗原的免疫應答的能力是提供有效免疫療法的特性。
權利要求
一種用於治療人類癌症患者的方法，包括對患者施用一種重組MVA，其編碼包含人前列腺特異性抗原(PSA)抗原的多肽和包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽。
2.權利要求1的方法，其中所述MVA是MVA-BN。
3.權利要求1的方法，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO :1和SEQ ID NO2。
4.權利要求1的方法，其中所述PSA抗原和所述PAP抗原插入在MVA基因間區 014L/015L 中。
5.權利要求1的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
6.權利要求1的方法，其中所述癌症是前列腺癌轉移。
7.權利要求1的方法，其中所述重組MVA是在破壞腫瘤劑量的紫杉烷之前施用的。
8.權利要求1的方法，其中所述重組MVA是在破壞腫瘤劑量的紫杉烷的同時施用的。
9.權利要求1的方法，其中所述重組MVA是在破壞腫瘤劑量的紫杉烷之後施用的。
10.權利要求7的方法，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。
11.權利要求9的方法，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。
12.一種用於預防前列腺癌的試劑盒，包括(a)一種重組MVA，其編碼包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及(b)在檢測到前列腺癌之前施用所述重組MVA的指令。
13.一種用於治療前列腺癌的試劑盒，包括(a)一種重組MVA，其編碼包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及(b)對前列腺癌患者施用所述重組MVA的指令。
14.一種用於治療癌症患者的試劑盒，包括(a)一種重組MVA，其編碼包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及(b)在用破壞腫瘤劑量的紫杉烷處理之前、同時、或之後施用所述重組MVA的指令。
15.一種重組MVA病毒，其表達包含人PAP抗原的多肽。
16.權利要求15的重組MVA病毒，其中所述MVA病毒包含SEQID NO :2。
17.權利要求15的重組MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。
18.一種重組MVA病毒，其表達包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽。
19.權利要求18的重組MVA病毒，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQIDNO :1。
20.權利要求18的重組MVA病毒，其中所述MVA病毒包含SEQID NO :2。
21.權利要求18的重組MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。
22.一種免疫原性組合物，包含一種重組MVA病毒，其編碼包含人PAP抗原的多肽，其中 所述免疫原性組合物在對宿主施用時誘導針對PAP的B細胞和T細胞免疫應答。
23.一種免疫原性組合物，包含一種重組MVA病毒，其編碼包含人PAP抗原的多肽，其中 所述免疫原性組合物在對宿主施用時誘導針對PAP的抗體。
24.權利要求23的重組MVA病毒，其中所述MVA病毒包含SEQID NO :2。
25.一種免疫原性組合物，包含一種重組MVA病毒，其編碼包含人PSA抗原的多肽和包 含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性組合物在對宿主施用時誘導針對PSA和PAP的B 細胞和T細胞免疫應答。
26.一種用於誘導針對PAP的B細胞和T細胞免疫應答的方法，包括對患者施用引發劑量的重組MVA，該重組MVA編碼包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽，及施用一個或 多個強化劑量的重組MVA，該重組MVA編碼包含PAP抗原的多肽。
27.權利要求26的方法，其中對患者施用IXIO8TCID5ci的引發劑量及2XIO8和 4 X IO8TCID50的兩個強化劑量。
28.權利要求27的方法，其中所述強化劑量是在所述引發劑量之後四周和八周時給予的。
全文摘要
本發明涉及用於使用編碼腫瘤相關抗原(諸如PSA和PAP)的重組MVA病毒來預防和治療癌症的組合物、試劑盒、和方法。重組MVA病毒能誘導B和T細胞應答。所述重組MVA病毒可以在紫杉烷之前、同時、或之後施用。
文檔編號A61K39/00GK101888853SQ200880119351
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月16日 優先權日2007年10月18日
發明者斯蒂法尼·曼德爾, 法特瑪·勒格蘭德, 瑞安·B·朗特裡, 阿蘭·德爾凱爾, 雷納·勞斯 申請人:Bn免疫療法股份有限公司