一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法
2023-09-16 08:04:10 1
專利名稱：一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物製劑領域，尤其涉及一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法。
背景技術：
噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)是一種具有寄生特性的弧形或杆形細菌，菌體大小為0. 2 0. 5微米X 0. 8 1. 2微米，是養殖水體環境致病菌滋生的天然生物控制因子，能夠有效地控制養殖水體的化學耗氧量以及硫化物和氨氮的含量，對開拓水產動物病害生物防治新途徑具有重要的意義。目前我國市售的噬菌蛭弧菌製劑的劑型較少，主要以水劑和凍乾粉劑為主，但菌含量不穩定，保藏期短，質量也參差不齊。因此，針對目前噬菌蛭弧菌製劑保藏期短、菌含量不穩定的缺陷，迫切需要開發新型優質的噬菌蛭弧菌製劑，以提高噬菌蛭弧菌對水產動物病害防治與水質改良效果。
發明內容
為了克服現有噬菌蛭弧菌製劑含量不穩定，保藏期短，質量也參差不齊的缺陷，本發明提供一種新型優質的噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法，以克服現有缺陷，提高噬菌蛭弧菌對水產動物病害防治與水質改良效果。實現本發明效果的技術方案如下
提供一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑，所述的製劑以沸石粉作為賦形載體。所述的粉狀製劑成品水分含量為0. 5%_3%，水分含量優選為1%。本發明還提供一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑製備方法，包括如下步驟
1)大腸桿菌DH5α菌懸液的製備
將大腸桿菌DH5ci接種於ρΗ7. 2的普通營養肉湯中，搖床振蕩培養後，離心洗滌，製成濃度為2. OX IO8 —2. 0X IO12個/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸液；
2)噬菌蛭弧菌培養液的製備
取-70°C甘油保藏的終濃度為2. OX 103--2. OX IO6個/ml的噬菌蛭弧菌，接種於沸石粉含量為8-12%的普通營養肉湯中，同時加入0. 5% 一3%。的大腸桿菌5 α菌懸液，搖床振蕩培養，直至噬菌蛭弧菌的活菌含量為IX IO6— IX IO12個/ml ；
3)噴霧乾燥法製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑
將步驟2)中所得的活菌含量IX IO6— IX IO12個/ml的噬菌蛭弧菌培養液，在漩渦振蕩儀上充分混合均勻，用噴霧乾燥儀加工成水分含量為0. 5%-3%的製劑。上述製備方法的優選例如下
步驟1)中所述的大腸桿菌DH5 α菌懸液濃度優選為2. OX IOki個/ml。步驟2)中所述的中甘油保藏的噬菌蛭弧菌終濃度優選為2. OX IO4個/ml ；所述的大腸桿菌5 α菌懸液加入量優選為1%。；所述的噬菌蛭弧菌的活菌含量優選為IX IO8個/ ml ；
步驟3)中所述的製劑水分含量優選為1%。
上述製備方法的步驟3)，更優選為所述的噴霧乾燥儀加工設置參數為風量顯示 100%，進風溫度100°C，出風溫度40°C -50°c，進料量20-35 ml/h，通針頻率5 s ；噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度100°C。上述製備方法的又一優選例，包括如下步驟
1)大腸桿菌DH5CI菌懸液的製備在無菌條件下將試管斜面培養基上保存的大腸桿菌 DH5a接種於pH7. 2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養24 h後於3000 轉/min離心20 min,用無菌生理鹽水洗滌3次，製成2. 0 X IO10個/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸液；
2)噬菌蛭弧菌培養液的製備取_70°C甘油保藏的終濃度為2.OX IO4個/ml的噬菌蛭弧菌接種於100ml pH7. 2，沸石粉含量為10%的10倍稀釋的普通營養肉湯中，同時加入100 μ 1大腸桿菌5 α菌懸液，於30°C、150轉/min條件下搖床振蕩培養直至噬菌蛭弧菌的活菌含量>106個/ml，於4°C冰箱保存；
3)噴霧乾燥法製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑將4°C冰箱保存的、活菌含量>106個/ml的噬菌蛭弧菌培養液在漩渦振蕩儀上充分混合均勻，打開鼓風機，緊接著打開噴霧乾燥儀、蠕動泵和通針泵，設置參數為風量顯示100%，進風溫度100°C，出風溫度46°C，進料量25 ml/ h，通針頻率5s ；噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度100°C，蠕動泵將噬菌蛭弧菌培養液傳送到噴霧器，粉狀噬菌蛭弧菌製劑則通過旋風分離器收集，並測得水分含量為1%，於30°C恆溫箱中保存。本發明以噬菌蛭弧菌為研究對象，採用噴霧乾燥技術製備了粉狀噬菌蛭弧菌製劑，並進一步觀察了粉狀噬菌蛭弧菌製劑中噬菌蛭弧菌的形態與活菌數量的變化，提供了一種新型優質的噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法。固定化技術是以物理或化學的手段將游離微生物定位或限制在一個特定的空間， 使其保持活性，可以被反覆利用。固定化微生物的密度高、活性強、反應速度快，而且流失少，與利用游離微生物處理廢水相比，具有明顯的優越性。微生物固定化的主要技術有載體結合法、交聯法和包埋法。研究表明，噬菌蛭弧菌具有載體吸附能力，這種吸附能力有利於減輕外界環境不良因素對其造成的影響，增強其在養殖環境中的生存能力，因此選用載體結合法對噬菌蛭弧菌進行固定化，然後通過噴霧乾燥技術製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑。沸石在我國分布廣、儲量大，較易開採，是一種架狀結構的具有許多排列整齊的晶穴和孔道的鋁矽鹽礦物，含有鈣、鎂、磷、鉀、鈉、錳等20多種常量和微量元素，具有比表面積大和吸附能力強的特點。研究表明，鈣、鎂離子有助於噬菌蛭弧菌的吸附作用，並且對噬菌蛭弧菌一宿主系統具有穩定作用，而且載體上積聚的大量細菌也可以滿足噬菌蛭弧菌生長的宿主菌需求，從而能夠促進其生長與長期保藏。此外，沸石粉對淨化水產養殖水質、促進水產動物生長發育、預防疾病以及提高經濟經濟效益等重要意義。本發明以一株噬菌蛭弧菌BDF-H16為發明測試研究對象，利用沸石粉作為賦形載體。本發明的測試實驗結果表明利用沸石粉作為賦形載體，粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌的含量均可保持在5. OOXlO4個/g 3. 85 X IO5個/g，顯著高於溫崇慶等(溫崇慶，薛明，張金燕，等.水產養殖用蛭弧菌類生物製劑的檢測[J].水產學報，2009，33 (2) 326-333.)報導的8個企業生產的噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑的有效活菌含量，而且運輸更方便，保存更簡易。此外，本實驗製備的粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑保藏期可達500天以上，與黃文等(黃文，楊莉.噬菌蛭弧菌Bd-9五種保藏方法的比較研究.大連水產學院學報，2002，17 (4):341-344.)報導的在實驗室條件下採用-20°C甘油和4°C普通營養肉湯保藏法對噬菌蛭弧菌的保藏效果相當，但較-20°C甘油和4°C普通營養肉湯保藏法操作更簡便，保藏條件更寬鬆。因此，以沸石粉作為賦形載體，利用噴霧乾燥技術製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑是目前一種優良的生產工藝與保藏方法。本發明提供的噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法，能增強噬菌蛭弧菌在養殖環境中的生存能力，從而能夠促進其生長與長期保藏，提高噬菌蛭弧菌製劑對水產動物病害防治與水質改良效果，對開拓水產動物病害生物防治新途徑具有重要的意義。本發明以一株噬菌蛭弧菌BDF-H16為發明測試研究對象，並不表示本發明的技術方案局限於該菌株。本發明的技術文案同樣適用於用其它的噬菌蛭弧菌菌種製備相同用途的粉狀製劑。
圖1粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的形態。圖2不同時間條件下粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的數量。
具體實施例方式應當理解，下面實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照製造廠商所建議的步驟和條件。本發明涉及的材料來源如下
噬菌蛭弧菌BDF-H16，購於農業部漁業動植物病原庫；大腸桿菌DH5 α，購於天根生物基因技術有限公司。沸石粉、普通營養肉湯、瓊脂條和無菌生理鹽水，購於上海國藥集團化學試劑有限公司；ρΗ7. 2沸石粉含量為10%的10倍稀釋的普通營養肉湯、ρΗ7. 2的普通營養肉湯、自來水雙層瓊脂平板，底層瓊脂濃度1. 5%，上層軟瓊脂濃度0. 6%，均在1 X IO5 Pa高壓溼熱滅菌 20 min後備用；溫控搖床，購於美國Thermo Forma公司；生化培養箱，購於上海一恒生物科技有限公司；全自動滅菌鍋和高速離心機，購於日本三洋公司；漩渦振蕩儀，購於上海淇特分析儀器有限公司；小型噴霧乾燥儀SY-6000，購於上海世遠生物設備工程有限公司。實施例一
大腸桿菌DH5ci菌懸液的製備
在無菌條件下將試管斜面培養基上保存的大腸桿菌DH5 α接種於ρΗ7. 2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養24 h後於3000轉/min離心20 min，用無菌生理鹽水洗滌3次，製成2. 0 X IO10個/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸液。實施例二
噬菌蛭弧菌BDF-H16培養液的製備
取_70°C甘油保藏的終濃度為2. OX IO4個/ml的噬菌蛭弧菌BDF-H16接種於IOOml PH7.2沸石粉含量為10%的10倍稀釋的普通營養肉湯中，同時加入100 μ 1大腸桿菌5α菌懸液，於30°C、150轉/min條件下搖床振蕩培養直至噬菌蛭弧菌BDF-H16的活菌含量>106 個/ml，於4°C冰箱保存。實施例三
噴霧乾燥法製備粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑
將4°C冰箱保存的、活菌含量>106個/ml的噬菌蛭弧菌BDF-H16培養液在漩渦振蕩儀上充分混合均勻，打開鼓風機，緊接著打開噴霧乾燥儀、蠕動泵和通針泵，設置參數為風量顯示100%，進風溫度100°C，出風溫度46°C，進料量25 ml/h，通針頻率5 S。噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h。氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度100°C，蠕動泵將噬菌蛭弧菌BDF-H16培養液傳送到噴霧器，粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑則通過旋風分離器收集，並測得水分含量為1%，於30°C恆溫箱中保存。通過下面的試驗驗證本發明的發明效果試驗實施例一
粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的形態觀察將製備的粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑進行固定，然後於掃描電鏡下對噬菌蛭弧菌 BDF-H16的形態進行觀察。在掃描電鏡下，粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的形態見圖 1。試驗結果表明，以沸石粉作為賦形載體，噬菌蛭弧菌BDF-H16為杆狀，大小約為0. 2 0. 5微米X0. 8 1. 2微米，端生鞭毛，吸附在沸石粉顆粒上，或者吸附在吸附於沸石粉顆粒上的大腸桿菌DH5a上。試驗實施例二
粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16在不同存放時間時活菌含量的變
化
將粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑在製備後0天、15天、30天、60天、70天、140天、350 天、500天取樣，採用自來水雙層瓊脂平板法(曹海鵬，楊先樂，錢云云，鄧璐.異育銀鯽腸道蛭弧菌的分離及其生物學特性的研究.微生物學通報，2007，34 (1):52-56.)，檢測粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的活菌含量。粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16活菌含量的穩定性
粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的保藏效果見圖2。不同時間條件下粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的數量。試驗結果表明，粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中噬菌蛭弧菌BDF-H16的初始活菌含量為1. 73 X IO5個/g，在存放 60天時達到最高，為3. 85 X IO5個/g;在存放500天時達到最低，為5. 00 X IO4個/g，雖然較初始活菌含量降低了 71%，但粉狀噬菌蛭弧菌BDF-H16製劑中的噬菌蛭弧菌BDF-H16仍具有明顯的噬菌斑。在整個試驗保存時期內，噬菌蛭弧菌BDF-H16的活菌含量保持在不低於 5. 00 X IO4 個/g。
權利要求
1.一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑，其特徵在於，所述的製劑以沸石粉作為賦形載體。
2.如權利要求1所述的粉狀噬菌蛭弧菌製劑，其特徵在於，所述的粉狀製劑成品水分含量為0. 5%-3%。
3.如權利要求2所述的粉狀噬菌蛭弧菌製劑，其特徵在於，所述的粉狀製劑成品水分含量為1%。
4.一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑製備方法，包括如下步驟1)大腸桿菌DH5ci菌懸液的製備將大腸桿菌DH5ci接種於pH7. 2的普通營養肉湯中，搖床振蕩培養後，離心洗滌，製成濃度為2. OX IO8 —2. 0X IO12個/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸液；2)噬菌蛭弧菌培養液的製備取-70°C甘油保藏的終濃度為2. OX 103--2. OX IO6個/ml的噬菌蛭弧菌，接種於沸石粉含量為8-12%的普通營養肉湯中，同時加入0. 5% 一3%。的大腸桿菌5 α菌懸液，搖床振蕩培養，直至噬菌蛭弧菌的活菌含量為IX IO6— IX IO12個/ml ；3)噴霧乾燥法製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑將步驟2)中所得的活菌含量IX IO6— IX IO12個/ml的噬菌蛭弧菌培養液，在漩渦振蕩儀上充分混合均勻，用噴霧乾燥儀加工成水分含量為0. 5%-3%的製劑。
5.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，步驟1)中，所述的大腸桿菌DH5α菌懸液濃度為2. OX IOltl個/ml。
6.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中所述的中甘油保藏的噬菌蛭弧菌終濃度為2. OX IO4個/ml ；所述的大腸桿菌5 α菌懸液加入量為1%。;所述的噬菌蛭弧菌的活菌含量為IXlO8個/ml。
7.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，步驟3)中所述的製劑水分含量為1%。
8.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，步驟3)中所述的噴霧乾燥儀加工設置參數為風量顯示100%，進風溫度100°C，出風溫度40°C-50°C，進料量20-35 ml/h，通針頻率5 s;噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度 100°C。
9.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟1)大腸桿菌DH5ci菌懸液的製備在無菌條件下將試管斜面培養基上保存的大腸桿菌 DH5a接種於pH7. 2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養24 h後於3000 轉/min離心20 min,用無菌生理鹽水洗滌3次，製成2. 0 X IO10個/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸液；2)噬菌蛭弧菌培養液的製備取_70°C甘油保藏的終濃度為2.OX IO4個/ml的噬菌蛭弧菌接種於100ml pH7. 2，沸石粉含量為10%的10倍稀釋的普通營養肉湯中，同時加入100 μ 1大腸桿菌5 α菌懸液，於30°C、150轉/min條件下搖床振蕩培養直至噬菌蛭弧菌的活菌含量>106個/ml，於4°C冰箱保存；3)噴霧乾燥法製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑將4°C冰箱保存的、活菌含量>106個/ml的噬菌蛭弧菌培養液在漩渦振蕩儀上充分混合均勻，打開鼓風機，緊接著打開噴霧乾燥儀、蠕動泵和通針泵，設置參數為風量顯示100%，進風溫度100°C，出風溫度46°C，進料量25 ml/ h，通針頻率5s ；噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度100°C，蠕動泵將噬菌蛭弧菌培養液傳送到噴霧器，粉狀噬菌蛭弧菌製劑則通過旋風分離器收集，並測得水分含量為1%，於30°c恆溫箱中保存。
全文摘要
本發明公開了一種粉狀噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法。 克服了目前噬菌蛭弧菌製劑保藏期短、菌含量不穩定的缺陷。本發明以沸石粉作為賦形載體，利用噴霧乾燥技術製備粉狀噬菌蛭弧菌製劑。本發明提供的噬菌蛭弧菌製劑及其製備方法，能增強噬菌蛭弧菌在養殖環境中的生存能力，從而能夠促進其生長與長期保藏，提高噬菌蛭弧菌製劑對水產動物病害防治與水質改良效果，對開拓水產動物病害生物防治新途徑具有重要的意義。
文檔編號C12N1/20GK102217655SQ20111008816
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者何珊, 衛若鵬, 呂利群, 曹海鵬, 楊先樂 申請人:上海海洋大學