基於易錯pcr技術提高內切葡聚糖酶的活性的方法
2023-09-16 08:13:05 2
專利名稱：基於易錯pcr技術提高內切葡聚糖酶的活性的方法
技術領域：
本發明提供一種基於易錯PCR技術提高內切葡聚糖酶的活性的方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
資源和環境問題是人類在21世紀面臨的最主要的挑戰。而纖維素是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。纖維素這一巨大可再生資源的有效利用對解決環境汙染、食品短缺、能源危機具有重大現實意義，利用微生物產生的纖維素酶來分解和轉化纖維素則是纖維素利用的有效途徑。但目前纖維素酶的高成本和低酶活，影響了纖維素酶的工業化生產和廣泛應用。因此通過基因工程和蛋白質工程技術對內切葡聚糖酶進行改造具有重要的科學和實用價值。芽孢桿菌能產生中性或偏鹼性內切葡聚糖酶，它不同於以往絕大多數的真菌產生的酸性內切葡聚糖酶，能夠應用於棉紡織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中，對其的研究是目前的熱點。然而，自然界篩選出來的菌株都有酶活較低，且表達量不太穩定。易錯PCR技術是定向進化研究最早採用的一種構建基因文庫的方法。首次提出易錯PCR是Leimg等人。易錯PCR是指通過改變PCR的反應條件，如調整反應體系中4種 dNTP的濃度、增加Mg2+的濃度、加入Mn2+或使用低保真度Taq酶等，使鹼基在一定程度上隨機錯配而引入多點突變，構建突變庫，篩選出所需的突變體。易錯PCR的關鍵是控制DNA的突變頻率。如果DNA的突變頻率太高，產生的絕大多數酶將失去活性；如果突變頻率太低， 野生型的背景太高，樣品的多樣性則較少。對於每一 DNA序列來說，合理的鹼基突變數是 1-3個。理想的鹼基置換率和易錯PCR的最佳條件則依賴於隨機突變的目標DNA片段的片段長度。在該方法中，遺傳變化只發生在單一分子內部，所以屬於無性進化。由於它較為費力、 耗時，一般多用於較小基因片段(< 800bp)的改造。在通常情況下，經一輪的易錯PCR、定向篩選，很難獲得令人滿意的結果，由此發展出了連續易錯PCR(Sequential error-prone PCR)，該方法是將一次PCR擴增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續反覆進行隨機誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產生重要的有益突變。
發明內容
本發明的目的是針對目前鹼性內切葡聚糖酶酶活低、難以滿足工業生產需要的缺點，對來源於枯草芽孢桿菌的內切葡聚糖酶基因進行定向進化，篩選出酶活顯著提高的突變體，為內切葡聚糖酶工業應用奠定基礎。本發明的具體實施步驟如下1、獲得突變內切葡聚糖酶基因(1)接種一環含有pMD19-T_Cen質粒的大腸桿菌DH5 α於IOmL LB (Amp)液體培養基中37°C培養過夜，使用質粒提取試劑盒按說明提取pMD19-T-Cen質粒。提取的質粒通過 Bgl II，Sph I雙酶切對其進行檢測，檢測正確後作為易錯PCR的模板。(2)調整反應參數和反應體系，通過引物
Pl :5』 -TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3，P2 :5』 TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3』進行易錯PCR。反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳，使用純化試劑盒對易錯PCR產物進行純化回收。2、內切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構建(1)將回收的易錯PCR突變的內切葡聚糖酶基因庫經EcoR I，NotI雙酶切後，連入同樣經過EcoR I，NotI雙酶切的含有T71ac啟動子和氨苄青黴素抗性基因的表達載體 pET-32a(+)中。(2)大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞的製備方法為將E. coli BL21劃線接種LB 平板，37°C培養直至長出單菌落；挑取一個單菌落，接種至含有IOmL LB培養基的50mL三角瓶中，37°C，170rpm培養過夜；將上述培養液按接種量接種到50mL LB液體培養基中， 37°C，170rpm振蕩培養1. 5-2小時；將培養後的菌液置冰浴中，使培養物冷卻到0°C，IOmin 後轉移到無菌的50mL離心管中，40C，4300rpm離心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL無菌預冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液重新懸浮菌體，4°C，4300rpm離心8min，去掉上清液； 向管中加入2mL無菌預冷的0. ImoVLCaCl2溶液重新懸浮菌體；(3)取一支裝有100 μ L Ε. coli BL21感受態細胞，置冰浴中解凍；將過夜連接產物全部加入到上述Ep管中，並用加樣器輕輕混合均勻；將Ep管冰浴30min ；將Ep管放入 42°C恆溫水浴中熱擊90-120秒；迅速將Ep管置冰浴中靜置5min ；向Ep管中加入800 μ L LB液體培養基置37°C搖床培養60min，使細菌復甦並表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因；取培養後的菌液200 μ L用玻棒塗布在LB (Amp)平板上，將平板置37°C恆溫培養箱培養直至液體被吸收後，將平板倒置繼續培養12-1 後直至單個菌落出現，即為含有突變內切葡聚糖酶基因Cerfp的突變體庫。3、高酶活菌株的篩選(1)將LB(Amp)平板上長出的菌落(構建好的突變體庫，平板上每個菌落就是一個克隆子)一一對應轉入LB (Amp)平板和LB (Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，轉板後將平板置37°C恆溫培養箱培養，LB(Amp)平板培養他後取出放入4°C冰箱保存，LB(Amp, IPTG、 CMC-Na)平板繼續培養36h，然後採用剛果紅染色法觀察水解圈的大小，同時每個平板分別以原始菌和不含有內切葡聚糖酶基因的空載體作為陽性和陰性對照。看水解圈的大小篩選出目的菌株，再對應從氨苄青黴素平板上找出目的克隆菌株。(2)將初步篩選得到的酶活性提高的陽性克隆子接種IOmL LB(Amp)液體培養基，37°C、170rpm培養過夜，再以的接種量接種到20mL LB(Amp)液體培養基中，37°C， 170rpm振搖培養至對數生長期(0D值0. 6 0. 8)，補加終濃度為lmmol/L的IPTG誘導培養4 他，破碎細胞測其上清液酶活。4、高酶活菌株突變基因的分析復篩出來的酶活提高的菌株用質粒提取試劑盒提取質粒後轉入大腸桿菌DH5 α， 用質粒提取試劑盒提取質粒，酶切驗證導入基因的正確性，並挑取陽性菌株送^witrogen 公司測序。對測序結果進行分析，找出突變鹼基位點和胺基酸位點，並對催化結構域三級結構進行預測和比較。SDS-PAGE分析表達量的變化。本發明利用易錯PCR技術和常規的突變體庫構建技術，對來源於枯草芽孢桿菌的內切葡聚糖酶基因進行體外定向進化，並在大腸桿菌中構建突變體庫，篩選出一株酶活顯著提高的菌株，為鹼性內切葡聚糖酶的工業應用奠定了基礎。
圖la :pMD19-T-Cen質粒酶切電泳檢測泳道2、3依次為，Bgl Il.Sph I雙酶切後回收的pMD19-T載體，目的基因片段；圖Ib 易錯PCR擴增產物電泳檢測泳道1為易錯PCR後回收的目的基因片段。圖2 易錯PCR產物、pET32a(+)質粒酶切電泳檢測泳道1_2依次為易錯PCR產物雙酶切後回收，pET32a(+)質粒雙酶切後回收；圖3 :目的克隆菌株8號為原始菌株，12號為篩選出來的突變菌株；圖如突變菌株質粒酶切電泳檢測泳道1、2依次為，EcoR I、NotI，雙酶切，EcoR I單酶切；圖4b 突變前後核苷酸序列比對突變位點用黑色方框標出圖如突變前後胺基酸序列比對突變位點用黑色方框標出圖4d 突變酶和原始酶三級結構比對突變酶212位天冬氨酸(ASP)突變為纈氨酸(VAL)圖如=SDS-PAGE分析泳道1，2，3，4依次為轉入pET3h(+)空質粒不含內切葡聚糖酶基因的BL21菌株破壁產物，原始酶，突變酶。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步闡述，但實施例不限制本發明的保護範圍。下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括1、菌株和質粒；大腸桿菌DH5a和BL21 (DE3)均為本實驗室保存，含Cen基因的克隆載體 pMD19-T-Cen由本實驗室構建，大腸桿菌表達載體ρΕΤ3^ι(+)購自hvitrogen公司，內切葡聚糖酶大腸桿菌工程菌PET-C36 (原始酶表達菌株)由本實驗室構建。2、化學試劑和酶製劑；Bgl II>Sph I>EcoR I、Not I、氨苄青黴素、T4 DNA Ligase^Taq DNA Polymerase、 dNTP購自Takara Biotechnology, DNA Maker購自天根生化科技有限公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自OMEGA。NaCl、Na0H、HCl、K2HPO4 · 3H20、KH2P04、MgCl2、MnCl2、冰乙酸、蛋白腖、酵母抽提物、 葡萄糖、瓊脂粉、甘油、瓊脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍R250、丙烯醯胺、甲叉雙丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N』 N』 -四甲基乙二胺(TEMED)等。3、引物合成；本發明涉及的引物由hvitrogen公司合成。下述實施例中常規的基因操作方法參照《分子克隆實驗指南》(第三版)。實施例1 突變內切葡聚糖酶基因的獲得；(一 )實驗方法
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1、突變模板的準備接種一環含有pMD19-T_Cen質粒的大腸桿菌DH5 α於IOmL LB (Amp)液體培養基中37°C培養過夜，使用質粒提取試劑盒按說明提取pMD19-T-Cen質粒。提取的質粒通過 BglII, Sph I雙酶切對其進行檢測，檢測正確後作為易錯PCR的模板。2、易錯PCR方法易錯PCR 體系中 Mg2+ 濃度為 7mmol/L，Mn2+ 濃度為 0. lmmol/L ；dCTP, dTTP 和 dATP， dGTP的比例為5 1。加樣完畢後混勻，然後進入PCR循環。3、易錯PCR突變，以pMD19-T-Cen質粒作為模板，以Pl :5，TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3，禾口P2 :5』 -FAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3'作為引物進行易錯PCR，得到長度為1.4Kb左右的內切葡聚糖酶基因擴增產物。 PCR反應參數為94°C預變性％iin，94°C變性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環後，72°C延伸lOmin。反應結束後，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠純化試劑盒對易錯PCR產物進行純化回收，取1 μ L回收產物進行瓊脂糖電泳檢測其含量。(二)實驗結果1、培養含pMD19-T-Cen質粒的大腸桿菌DH5a並提取質粒，通過Bgl II，Sph I雙酶切對其進行了檢測，證明該質粒含有內切葡聚糖酶基因，可以作為內切葡聚糖酶定向進化的模板(圖la)。2、PCR循環完成後，進行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠純化試劑盒對易錯PCR產物進行純化回收，瓊脂糖凝膠電泳鑑定回收產物，得到大小約為1.4Kb的片段，此片段即為經易錯PCR突變後得到的內切葡聚糖酶基因(圖lb)。實施例2 內切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構建(一 )實驗方法1、突變內切葡聚糖酶基因pET_32a(+)表達載體的構建1)質粒載體pET_32a(+)的準備pET-32a(+)帶有T71ac啟動子和氨苄青黴素抗性基因，培養含有pET_32a (+)質粒的大腸桿菌DH5ci於IOmL LB (Amp)液體培養基中37°C培養過夜，使用質粒提取試劑盒按說明書提取pET-32a(+)質粒。2)易錯PCR產物、pET-32a (+)質粒的雙酶切處理分別取上述易錯PCR產物(內切葡聚糖酶基因)、pET_32a(+)質粒進行EcoR I、 Not I雙酶切，酶切方法如下
IOxH buffer5μ LBSA5μ L
EcoR I1 μ L
權利要求
1.基於易錯PCR技術提高內切葡聚糖酶的活性的方法，其特徵在於，包含以下步驟 Al，獲得突變內切葡聚糖酶基因；突變模板的準備接種一環含有pMD19-T-Cen(構建載體酶切位點為Bgl II,Sph I)質粒的大腸桿菌DH5ci於IOmL LB (Amp)液體培養基中37 °C 培養過夜，使用質粒提取試劑盒按說明提取pMD19-T-Cen質粒；提取的質粒通過Bgl II， Sph I雙酶切對其進行檢測，檢測正確後作為易錯PCR的模板；通過引物Pl :5』-TAATCCAAC CCGGAATTCGCAGAGACAAAMCGCCAGTAGC-3，P2 5，-TAGGMAGGAAAMAGCGGCCGCCTMTTTGGTTCTG TTCCCCAAA-3』進行易錯PCR ；反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳，使用純化試劑盒對易錯PCR 產物進行純化回收；A2，內切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構建；將步驟Al回收的所述易錯PCR產物經 EcoR I、NotI雙酶切後，連接入經過同樣EcoR I、NotI雙酶切的含有T71ac啟動子和氨苄青黴素抗性基因的表達載體pET-32a(+)中；使用化學熱擊轉化的方法，將含有突變的內切葡聚糖酶基因庫的表達載體質粒轉入大腸桿菌BL21(DE!3)感受態細胞，塗布至LB(Amp)平板，即得構建好的突變體庫；A3，高酶活菌株的篩選；將LB (Amp)平板上長出的菌落一一對應轉入的LB (Amp)平板和 LB (Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，轉板後將平板置37°C恆溫培養箱培養，LB (Amp)平板培養他後取出放入4°C冰箱保存，LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板繼續培養36h，然後採用剛果紅染色法觀察水解圈的大小，同時每個平板分別以原始菌和不含有內切葡聚糖酶基因的空載體作為陽性和陰性對照；根據水解圈的大小篩選出目的菌株，再對應從LB(Amp)平板上找出目的克隆菌株；初篩出來的陽性克隆子，通過擴大誘導培養，破壁後測定酶活。A4，高酶活菌株突變基因的分析復篩出來的酶活提高的菌株用質粒提取試劑盒提取質粒後轉入大腸桿菌DH5 α，用質粒提取試劑盒提取質粒，酶切驗證導入基因的正確性，並挑取陽性菌株送hvitrogen公司測序；對測序結果進行分析，找出突變鹼基位點和胺基酸位點，並對催化結構域三級結構進行預測和比較；SDS-PAGE分析表達量的變化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟Al中的PCR反應參數為94°C 預變性％iin，94°C變性lmin，5rC退火lmin，72°C延伸2min，30個循環後，72°C延伸10min。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟A2中的酶切方法如下
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟A2中的大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞的製備方法為將E. coli BL21劃線接種LB平板，37°C培養直至長出單菌落；挑取一個單菌落，接種至含有IOmL LB培養基的50mL三角瓶中，37°C，170rpm培養過夜；將上述培養液按1 %接種量接種到50mL LB液體培養基中，37°C，170rpm振蕩培養1. 5-2小時；將培養後的菌液置冰浴中，使培養物冷卻到0°C，IOmin後轉移到無菌的50mL離心管中，4°C， 4300rpm離心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL無菌預冷的0. lmol/L CaC12_MgC12溶液重新懸浮菌體，4°C，4300rpm離心8min，去掉上清液；向管中加入2mL無菌預冷的0. Imol/ LCaCl2溶液重新懸浮菌體，得到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟A2中所述化學熱擊轉化的方法為取一支裝有100 μ L Ε. coli BL21感受態細胞的Ep管，置冰浴中解凍；將所述過夜連接產物全部加入到上述Ep管中，並用加樣器輕輕混合均勻；將Ep管冰浴30min ；將Ep管放入 42°C恆溫水浴中熱擊90-120秒；迅速將Ep管置冰浴中靜置5min ；向Ep管中加入800 μ L LB液體培養基置37°C搖床培養60min，使細菌復甦並表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因；取培養後的菌液200 μ L用玻棒塗布在LB (Amp)平板上，將平板置37°C恆溫培養箱培養直至液體被吸收後，將平板倒置繼續培養12-1 後直至單個菌落出現，即為含有突變內切葡聚糖酶基因Cerfp的突變體庫。
全文摘要
本發明公開了基於易錯PCR技術提高內切葡聚糖酶的活性的方法，包括以下步驟A1，獲得突變內切葡聚糖酶基因；A2，內切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構建；A3，高酶活菌株的篩選；A4，高酶活菌株突變基因的分析；實現了對來源於枯草芽孢桿菌C-36的內切葡聚糖酶基因進行體外定向進化，並在大腸桿菌中構建突變體庫，篩選出一株酶活顯著提高的菌株，為鹼性內切葡聚糖酶的工業應用奠定了基礎。
文檔編號C12N1/21GK102206659SQ20111008910
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月11日 優先權日2011年4月11日
發明者吳琦, 姚友旭, 廖 燕, 李春梅, 李雨霏, 阮景軍, 陳惠 申請人:四川農業大學