一種面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置及其控制方法與流程

2023-09-16 10:35:40 1

本發明涉及到生物材料玻璃化保存中的降/復溫領域，具體為一種面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置及其控制方法。

背景技術：

低溫保存是眾多生物材料目前唯一有效的長期保存手段，在國計民生的眾多領域都發揮著不可替代的作用。在臨床醫學領域，越來越多的疾病可以通過細胞和組織的移植而得到醫治，大規模的低溫保存則是解決這些重要生物材料臨床供應問題的重要手段。低溫保存的生物材料需要經歷從常溫至低溫的跨越，這一過程中冰晶生長是保存成功的最大障礙。玻璃化保存是一種革命性的新方法，在玻璃化保存的過程中生物樣品內不產生(或僅產生極少量)冰晶，溶液的濃度無明顯變化，過冷時間短，因此能有效避免各種因素導致的低溫損傷，相對傳統方法有原理性的突破。

為了獲得玻璃化轉變所需的超高降復溫速率，標準方法中使用細管(French Mini-straw,0.25ml)承載微量樣品並直接投入液氮(-196℃)，通過樣品與液氮間的巨大的溫差以及液氮在細管表面的汽化作用驅動樣品迅速降溫，在復溫環節，則將細管直接投入恆溫水浴(約30℃)中，以樣品和溫水間的溫差驅動樣品快速升溫。在此基礎上，Vajta等人改進了細管的結構，提出了開放式拉長細管法(Open Pulled Straw，OPS)，所得到的降溫速率大大提高。Reubinnoff也應用了這種方法首次成功進行了幹細胞玻璃化低溫保存中，後續研究對這種方法進行了持續的改進，先後出現了封口式拉長細管法(Closed Pulled Straw，CPS)、微量吸頭法(Micropipette)、Cryotop及Cryotip等方法。

無論結構如何改進，以上方法中承載樣品的各種容器在降溫或復溫過程中都會對樣品與工作液體，如製冷劑(液氮)或復溫劑(溫水)間的換熱起一定的熱阻作用。為了消除容器的影響，另一部分研究中採用了直接接觸的方式，即使得微量樣品與製冷劑或復溫劑直接接觸，實現更高的換熱效率。典型方法包電鏡網法(Electron Mmicroscope Grids，EMG)、冷環法(Cryoloop)等，分別用精細的銅網及尼龍環承載微量的細胞。近期研究中還出現一種細胞微滴法(Micro Droplet，MD)，利用微流控晶片生成包裹細胞的微滴，並直接滴入到液氮中降溫。這類方法能獲得較高的降復溫速率，但需要解決細胞的回收及直接接觸帶來的汙染問題。

總的來說，雖然玻璃化保存方法研究已經取得了一系列成果，但現有降復溫技術仍不成熟，表現在：

(1)換熱效率有限。現有的降溫方法從本質上來說都是通過樣品在液氮中的池沸騰(Pool boiling)來獲得較高的降溫速率，但池沸騰過程中會產生大量的液氮蒸汽包裹在樣品周圍，對進一步的降溫產生隔熱的作用，因此換熱係數一般較低；對復溫過程來說，現有復溫方法一般通過樣品與恆溫水浴間的溫差驅動升溫，換熱效率更低，而且隨著樣品溫度回升、溫差減小，復溫速率迅速衰減，很容易產生反玻璃化等問題；

(2)操作偶然因素影響大。將樣品浸入液氮實現降溫和投入恆溫浴實現復溫的方式，工質被動的作用於生物樣品或載體，降復溫速率難以控制，缺乏穩定性和一致性，並且無法調節。

技術實現要素：

針對上述存在的問題或不足，為了解決玻璃化保存中存在的換熱效率有限、操作偶然因素影響大等問題，本發明提供了一種面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置及其控制方法。

具體技術方案如下：

該面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置，包括高壓惰性氣體輸入端、壓力調節閥、球閥、降復溫工質容器、樣品段和儲液槽，通過導管採用串聯的方式將上述部件依次進行連接，如圖1所示。

本發明利用高壓惰性氣體作為驅動，驅動降復溫容器中的降復溫工質高速運動通過樣品段，並作用在樣品或其載體上，從而實現樣品的降復溫。

另外，使用壓力調節閥調節輸入至降復溫工質容器的高壓惰性氣體的壓強，使用球閥用於開關，控制輸入高壓惰性氣體的通斷。並可通過壓力調節閥調整驅動壓強的方式實現降復溫速率的調節。

所述高壓惰性氣體輸入端通入的高壓惰性氣體為壓強在0.1Mpa及以上的氮氣。

所述導管，其內壁為聚四氟乙烯材質，能夠耐受‐200℃低溫，外部包裹隔熱材料，隔熱材料材質為泡沫。

所述樣品段，存放需要玻璃化保存的樣品或其載體，並設有入口和出口；設有降復溫工質的流道，降復溫工質在樣品段中高速運動過程中作用在樣品上進行高強度換熱。

所述降復溫工質，包含液氮和酒精溶液，其中液氮用於降溫，酒精溶液用於復溫。

所述降復溫工質容器，儲存降復溫工質。降復溫工質容器由外部高強度外殼和內部的保溫材料組成，並帶有輸入埠和輸出埠，其中輸入埠聯通內部空間的頂層，輸出埠接通內部空間的底部，當輸入埠接通高壓惰性氣體時，降復溫工質容器中的降復溫工質在高壓作用下經輸出埠高速輸出。降復溫工質容器的輸出埠通過導管與樣品段入口相連。使用時降復溫工質不接觸降復溫工質容器的輸入埠，淹沒降復溫工質容器的輸出埠

所述壓力調節閥，調節輸入至降復溫工質容器輸入埠的高壓惰性氣體的壓強，壓力調節閥壓強調節範圍為0.1Mpa至20Mpa。

所述球閥，用於開關，控制輸入至降復溫工質容器的高壓惰性氣體的通斷。

所述儲液槽是一容器，通過導管與樣品段的出口相連，用於收集通過樣品段後的降復溫工質。

上述面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置的降復溫過程如下：

通過高壓惰性氣體驅動降復溫工質容器中的降復溫工質，使降復溫工質高速運動並作用在樣品段內的樣品或其載體上，實現樣品的超高速降復溫。

本發明利用高壓惰性氣體驅動技術，提出了一種面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置及其控制方法。該方法旨在通過高壓惰性氣體來驅動降復溫工質高速運動並作用在樣品或其載體上，作用方式變被動為主動。從而實現更高的換熱效率以及更好的過程穩定性和一致性。此外，通過調節高壓氣體的壓強，可改變工質的作用速率，從而實現降復溫速率的大範圍調節，可適應不同對象保存的需求。解決了傳統玻璃化保存降復溫工質被動方式作用於樣品引起的諸多問題。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)本發明以高壓惰性氣體作為驅動力，驅動降復溫工質來實現樣品的玻璃化保存，變現有的被動的作用方式為主動，大大提高了低溫保存的穩定性和一致性。

(2)本發明通過壓力調節閥來調整驅動壓強，可實現對樣品降復溫速率的大範圍調節。

附圖說明

圖1是本發明的結構及其控制方法示意圖；

圖2是本發明的降復溫工質容器示意圖；

圖3是實施例的示意圖；

圖4是實施例的降溫測試結果示意圖；

圖5是實施例的復溫測試結果示意圖；

附圖標記：1高壓惰性氣體輸入端，2壓力調節閥，3球閥，4降復溫工質容器，5降復溫工質，6樣品段，7儲液槽，8導管，9熱電偶，10數據採集卡，11計算機。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明做進一步的詳細說明。

如圖3所示，一種面向玻璃化保存的降復溫工質驅動裝置與控制方法示意圖，包括1高壓惰性氣體輸入端，2壓力調節閥，3球閥，4降復溫工質容器，5降復溫工質，6樣品段，7儲液槽，8導管，9熱電偶，10數據採集卡，11計算機。

本實施例使用的高壓惰性氣體為壓強在0.1Mpa及以上的氮氣。

導管8內壁為聚四氟乙烯材質，能夠耐受‐200℃低溫，外部包裹隔熱材料，隔熱材料材質為泡沫。

樣品段6存放需要玻璃化保存的樣品或其載體，樣品段有入口和出口。

降復溫工質5包含液氮和酒精溶液，其中液氮用於降溫，酒精溶液用於復溫。

E、降復溫工質容器

使用降復溫工質容器4儲存降復溫工質5。降復溫工質容器4的輸入埠聯通內部空間的頂層，輸出埠接通內部空間的底部，當輸入埠接通高壓惰性氣體時，降復溫工質容器4中的降復溫工質5在高壓作用下經輸出埠高速輸出。降復溫工質容器的輸出埠通過導管8與樣品段6入口相連。

壓力調節閥2調節輸入至降復溫工質容器4輸入埠的高壓惰性氣體的壓強，壓力調節閥壓強調節範圍為0.1Mpa至20Mpa。

球閥3控制輸入至降復溫工質容器4中高壓惰性氣體的通斷。

儲液槽7通過導管8與樣品段6出口相連。

I、溫度數據採集模塊

溫度數據採集模塊由熱電偶、數據採集卡、計算機組成，熱電偶探頭插入步驟D中樣品內，將信號傳輸至數據採集卡，並通過計算機處理輸出。

J、降復溫過程

通過高壓惰性氣體驅動降復溫工質容器4中的降復溫工質5，使降復溫工質5高速運動並作用在樣品段6內的樣品或其載體上，實現樣品的超高速降復溫。

步驟如下：

a)按上述步驟完成本發明裝置的的組裝。

b)往降復溫工質容器中添加液氮。

c)調節壓力調節閥使輸入至降復溫工質容器中的高壓惰性氣體壓強為0.1Mpa(0.2Mpa,0.3Mpa,0.4Mpa,0.5Mpa,0.6Mpa,0.7Mpa)。

d)使用溫度數據採集模塊進行溫度數據採集。

e)使用球閥控制輸入高壓惰性氣體通路，10秒後，使用球閥控制輸入高壓惰性氣體斷路，完成樣品降溫過程。

f)樣品段從裝置中取出放入液氮罐中保存。

g)取出在液氮罐中保存的樣品段，完成本發明裝置的組裝。

h)往降復溫工質容器中添加37℃85％的酒精溶液。

i)調節壓強調節裝置使高壓惰性氣體壓強為0.1Mpa(0.2Mpa,0.3Mpa,0.4Mpa,0.5Mpa,0.6Mpa,0.7Mpa)。

j)使用溫度數據採集模塊進行溫度數據採集。

k)使用球閥控制輸入高壓惰性氣體通路，10秒後，使用球閥控制輸入高壓惰性氣體斷路，完成樣品復溫過程

圖4是樣品在不同壓強下的降溫速率。圖5是樣品在不同壓強下的復溫速率。

由結果可以看出，對於降溫過程，驅高壓惰性氣體壓強的增加使得流過樣品段的液氮流速變快，強化了裝置換熱效果。當高壓惰性氣體壓強為0.1Mpa時，樣品的降溫速率降溫速率達30000℃/min，而當高壓惰性氣體壓強提高到0.6Mpa時，降溫速率約為47698℃/min,這說明了本發明可以通過實驗操作條件的控制實現大範圍調節玻璃化保存降溫速率。通過在統一實驗條件下多次重複實驗(次數≥3)，降溫速率偏差可控制在10％左右，這說明本發明在玻璃化保存降溫過程中具有穩定性和一致性。

對於復溫過程，高壓惰性氣體壓強的增加使得流過微樣品段的酒精流速變快，強化裝置換熱效果。當高壓惰性氣體壓強為0.1Mpa時，復溫速率達16438℃/min；而當高壓惰性氣體壓強提升到0.7Mpa時，復溫速率達到約47965℃/min，這說明本發明可以通過實驗操作條件的控制實現大範圍調節玻璃化保存復溫速率。通過在統一實驗條件下的多次實驗(次數≥3)，復溫速率偏差可控制在10％左右，這說明本發明在玻璃化保存復溫過程中具有穩定性和一致性。