用於用動物細胞大量生產源自外源基因的蛋白質的表達載體及其應用的製作方法

2023-09-19 23:25:45

專利名稱：用於用動物細胞大量生產源自外源基因的蛋白質的表達載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及哺乳動物細胞表達載體，該載體能使哺乳動物宿主細胞生產高水平 的源自外源基因的蛋白質。本發明的所述表達載體尤其適用於生產需要哺乳動物獨特的 糖基化和摺疊，而通過大腸桿菌或酵母作為宿主的基因重組來生產時很難具有足夠活性 的哺乳動物蛋白質。
背景技術：
已經開發了大量用於生產重組蛋白的載體，並且蛋白質的表達水平在使用細菌 例如大腸桿菌、真核微生物例如酵母和昆蟲細胞作為宿主的表達系統裡都很高。然而， 當表達哺乳動物獨特的蛋白質時，可能不會形成常規的三維結構，並且大多數時候會遇 到翻譯後修飾例如糖基化的問題。因而，需要建立使用哺乳動物細胞作為宿主的表達系 統，但是通常來說，大多數情況下表達水平很低。此外，使用重組病毒載體的表達系統 也用於比昆蟲細胞更高等的動物細胞，但是從所表達的蛋白質中移除重組病毒載體是一 個很麻煩的過程，並且病毒載體自身的危險性也是難以否認的。用哺乳動物細胞作為宿主來生產重組蛋白的實例包括組織血纖維蛋白溶酶原激 活因子(專利文獻1)、促紅細胞生成素(專利文獻2和非專利文獻1 3)、IFN- Y (非 專利文獻4)和IFN-0 (專利文獻3和非專利文獻5)。此外，還有很多關於單克隆抗體 的重組生產的報導(專利文獻4 6和非專利文獻6 8)。另外，哺乳動物細胞的高表 達載體的一個實例是pNOW/CMV-AA(專利文獻7)。用該載體表達共凝集素的生產水平 在培養4天之後達到ll.Syg/mL。但是，這些實例中的重組蛋白的生產水平都還不夠。與本申請的發明有關的現有技術文獻列舉如下。[專利文獻1]日本特開昭59-183693[專利文獻2]日本特開2002_45191[專利文獻3]日本特開平07-265084[專利文獻4]日本特開平07-67648[專利文獻5]日本特開平06-30788[專利文獻6]日本特開平06-217786[專利文獻7]日本特開平10-179169[非專利文獻l]Fermentation Bioengineering，(1989)4 p.257[非專利文獻2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1986)83 p.6465[非專利文獻3]Biotechnology，(1988)6 p.67[非專利文獻4]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1983)80 p.4564[非專利文獻5]Cytotechnology，(1990)4 p.173[非專利文獻6]Biotechnology，(1992) 10 p.169[非專利文獻7]J.Immunol.Methods，(1989) 125 p.191
4
[非專利文獻8]Biotechnology，(1992) 10 p.1455

發明內容
哺乳動物細胞，尤其是中國倉鼠卵巢細胞(下文中稱為CHO細胞)在藥物制 劑的生產中的應用，已經被證實是安全的並且現在已經成為常規技術。在使用哺乳動物 細胞來生產重組蛋白時，提高生產力對降低成本、健康成本控制等等來說都是非常重要 的。因此，通過有效基因轉移來發展用於生產具有高水平生產能力的轉化體的表達載體 是必要的。有效基因轉移對哺乳動物細胞內重組蛋白的高水平的簡易生產是必須的。有效 基因轉移是指不管克隆的選擇是否容易，獲得具有高水平生產力的克隆的概率都很高。 特別地，其是指活細胞克隆的數量相對於所有轉化的細胞在藥物選擇之後相對較小，從 而很容易選擇具有高水平生產力的克隆。其也指出現具有高水平生產力的克隆的概率足 夠高，即使生產目的蛋白質的細胞的數量很少。當可利用細胞的數量變得很大時，則需 要更長時間和更多努力用於選擇，並將導致低效率以及很可能忽略潛在的具有高水平生 產能力的克隆。高水平生產能力是指重組蛋白在通過基因轉移獲得的轉化的細胞克隆內的高表 達水平，並且這被認為主要是由於所述表達載體的特徵和性能。已經發現基因表達的水 平依賴於染色體位置而顯著不同(Annu.Rev.CellBiol.，6，page 679，1990),並且將目標 基因引入到染色體上具有高轉錄活性的區域(下稱轉錄熱點)可能會提高重組蛋白質生產 的水平。鑑於上述情況完成了本發明。本發明的一個目的是提供能使得哺乳動物宿主細 胞以高水平生產源自外源基因的蛋白質的哺乳動物細胞表達載體。本發明的另一個目的 是提供使用上述載體來生產轉化體的方法和使用上述載體生產源自外源基因的蛋白質的 方法。作為致力於解決上述問題的研究的結果，本發明人成功地開發出具有這樣的機 制的表達載體，其中質粒DNA整合進宿主細胞染色體的轉錄熱點中，並根據細胞株對藥 物(例如，新黴素、吉歐黴素或殺稻瘟菌素)的抗性來選擇細胞。轉導了的G418抗性株 的原代克隆的高生產力依賴於NPT基因表達機制，吉歐黴素抗性株的原代克隆的高表達 力依賴于吉歐黴素抗性基因表達機制，而殺稻瘟菌素抗性株的原代克隆的搞生產力依賴 於殺稻瘟菌素抗性基因表達機制。因此，本發明人通過構建能夠高水平、穩定生產蛋白 質的表達載體而完成了本發明。更具體地，本發明提供了下列[1]能夠在哺乳動物宿主細胞內高水平生產源自外源基因的蛋白質的表達載體， 其包括(a)翻譯弱化的藥物抗性基因盒，其表達通過將密碼子改為哺乳動物中最不常用 的密碼子來削弱；和(b)基因盒，其包含用於將外源基因整合進高轉錄活性啟動子和高穩定性聚腺苷 化信號之間的克隆位點；[2][1]所述的表達載體，其中[1] (a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因盒的密碼子已
5被改為在人類中最不常用的密碼子；[3][1]所述的表達載體，其中[1] (a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因盒的密碼子對 於丙氨酸已被改為GCA，對於精氨酸已被改為CGA，對於天冬醯胺已被改為AAU，對於 天冬氨酸已被改為GAU，對於半胱氨酸已被改為UGU，對於穀氨醯胺已被改為CAA， 對於穀氨酸已被改為GAA，對於甘氨酸已被改為GGU，對於組氨酸已被改為CAU，對 於亮氨酸已被改為UUA，對於賴氨酸已被改為AAA，對於脯氨酸已被改為CCA，對於苯 丙氨酸已被改為UUU，對於絲氨酸已被改為UCA，對於蘇氨酸已被改為ACU，對於酪氨 酸已被改為UAU，和/或對於纈氨酸已被改為GUA ；[4][1]所述的表達載體，其中[1] (a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因盒使用具有低 表達誘導活性的啟動子作為啟動子；[5][4]所述的表達載體，其中所使用的低活性啟動子是源自在哺乳動物細胞內幾 乎不表達的基因的啟動子，或者是增強子部分已被移除的啟動子；[6][1]所述的表達載體，其中[1] (a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因盒中的密碼子 改變區域是該基因盒全長的30%或更多；[7][1] [6]任一所述的表達載體，其中[1] (a)所述藥物抗性基因是新黴素磷酸 轉移酶基因(NTP基因)；[8]生產能夠以高水平生產源自外源基因的蛋白質並且能夠耐受新黴素的轉化體 的方法，其包括以下步驟將外源基因插入到[7]所述表達載體中，並用所述表達載體轉 化宿主細胞；[9]生產源自外源基因的蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)將外源基因到插入[7]所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；(c)在添加了新黴素的培養基中培養轉化體；和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質；[10][9]的生產方法，其中將化學成分確定的培養基(CD培養基)或向CD培養 基中添加了非動物基添加劑的培養基用於[9]的步驟(c)的培養；[11]篩選具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，其包 括如下步驟(a)將外源基因插入到[7]所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(C)在添加了新黴素的培養基中培養轉化體；[12][1] [6]任一所述的表達載體，其中[1] (a)所述藥物抗性基因是吉歐黴素抗 性基因(Zeosin1·基因)；[13]生產能夠以高水平生產源自外源基因的蛋白質並且能夠耐受吉歐黴素的轉 化體的方法，其包括以下步驟將外源基因插入到[12]所述表達載體中，並用所述表達 載體轉化宿主細胞；[14]生產源自外源基因的蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)將外源基因插入到[12]所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；
(C)在添加了吉歐黴素的培養基中培養轉化體；和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質；[15][14]的生產方法，其中將化學成分確定的培養基(CD培養基)或向CD培養 基中添加了非動物基添加劑的培養基用於[14]的步驟(c)的培養；[16]篩選具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，其包 括如下步驟(a)將外源基因插入到[12]所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(c)在添加了吉歐黴素的培養基中培養轉化體；[17][1] [6]所述的表達載體，其中[1] (a)所述藥物抗性基因是殺稻瘟菌素抗性 基因(殺稻瘟菌素基因)；[18]生產能夠以高水平生產源自外源基因的蛋白質並且能夠耐受殺稻瘟菌素的 轉化體的方法，其包括以下步驟將外源基因插入[17]所述表達載體，並用所述表達載 體轉化宿主細胞；[19]生產源自外源基因的蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)將外源基因插入到[17]所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；(c)在添加了殺稻瘟菌素的培養基中培養轉化體；和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質；[20][19]的生產方法，其中將化學成分確定的培養基(CD培養基)或向CD培養 基中添加了非動物基添加劑的培養基用於[14]的步驟(c)的培養；和[21]篩選具有生產高水平源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，其包 括如下步驟(a)將外源基因插入到[17]所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(c)在添加了殺稻瘟菌素的培養基中培養轉化體。


圖1顯示了 pNCl結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子；INRBG 兔生長激素內含子；PABGH 牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的 猿病毒40啟動子；NPT:新黴素磷酸轉移酶cDNA ； PASV 猿病毒40polyA添加信號；
和Amp1·:大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖2顯示了 pNC2結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子；INRBG 兔生長激素內含子；PABGH 牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的 猿病毒40啟動子；cdNPT 翻譯弱化的NPT基因，通過改變整個NPT核苷酸序列的密 碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和 Ampr=大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖3顯示了 pNC5結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子；INRBG 兔生長激素內含子；PABGH 牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；cd90NPT 翻譯弱化的NPT基因，通過改變NPT核苷酸序列從5』端 起90個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV:猿病毒 40polyA添加信號；和Amp1·大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖4顯示了pNC6結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子；INRBG 兔生長激素內含子；PABGH 牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的 猿病毒40啟動子；cdl80NPT 翻譯弱化的NPT基因，通過改變NPT核苷酸序列從5』 端起180個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病 毒40polyA添加信號；和Amp1·大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖5顯示了 pNC7結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子；INRBG 兔生長激素內含子；PABGH 牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的 猿病毒40啟動子；cd270NPT 翻譯弱化的NPT基因，通過改變NPT核苷酸序列從5』 端起270個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV 猿病 毒40polyA添加信號；和Amp1·大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖6顯示了 pNCl/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL:人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長 激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；NPT:新黴素磷酸轉 移酶cDNA ； PASV 猿病毒40polyA添加信號；和Amp1^:大腸桿菌中的選擇標記(氨苄 青黴素抗性)。圖7顯示了 pNC2/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL 人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長
激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；cdNPT :翻譯弱化的 NPT基因，通過改變整個NPT核苷酸序列的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而 獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴 素抗性)。圖8顯示了 pNC5/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL:人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長
激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；cd90NPT :翻譯弱化 的NPT基因，通過改變NPT核苷酸序列從5』端起90個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動 物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf :大腸桿菌 中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖9顯示了 pNC6/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL:人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長
激素基因polyA添加信號；PdSV 增強子缺失的猿病毒40啟動子；cdlSONPT 翻譯弱 化的NPT基因，通過改變NPT核苷酸序列從5』端起180個鹼基範圍內的密碼子為在哺 乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸 桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖10顯示了 pNC7/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL 人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長 激素基因polyA添加信號；PdSV 增強子缺失的猿病毒40啟動子；cd270NPT 翻譯弱化的NPT基因，通過改變NPT核苷酸序列從5』端起270個鹼基範圍內的密碼子為在哺 乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸 桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖11顯示了 pZCl結構。下列分別表示PCMV:巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；PABGH :牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強 子缺失的猿病毒40啟動子；Zeo:吉歐黴素抗性基因(Shble基因)cDNA ； PASV 猿病 毒40polyA添加信號；和Amp1·大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖12顯示了 pZC2結構。下列分別表示PCMV:巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；PABGH :牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強 子缺失的猿病毒40啟動子；cdZeo 翻譯弱化的吉歐黴素抗性基因(Shble基因)，通過 改變整個吉歐黴素抗性基因核苷酸序列的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲 得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素 抗性)。圖13顯示了 pZC5結構。下列分別表示PCMV:巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；PABGH :牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強
子缺失的猿病毒40啟動子；Cd90Zeo 翻譯弱化的吉歐黴素抗性基因(Sh ble基因)，通 過改變吉歐黴素抗性基因核苷酸序列從5』端起90個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物 中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸桿菌中 的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖14顯示了 pZC7結構。下列分別表示PCMV:巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；PABGH :牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強
子缺失的猿病毒40啟動子；cdlSOZeo:翻譯弱化的吉歐黴素抗性基因(Sh ble基因)，通 過改變吉歐黴素抗性基因核苷酸序列從5』端起180個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物 中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸桿菌中 的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖15顯示了 pZCl/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL 人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長 激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；Zeo:吉歐黴素抗性 基因(Sh ble基因)cDNA ； PASV 猿病毒40polyA添加信號；和Amp1^:大腸桿菌中的選
擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖16顯示了 pZC2/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL:人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生
長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；cdZeo:翻譯弱 化的吉歐黴素抗性基因(Sh ble基因)，通過改變整個吉歐黴素抗性基因核苷酸序列的密 碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和 Ampr=大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖17顯示了 pZC5/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL 人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長 激素基因polyA添加信號；PdSV 增強子缺失的猿病毒40啟動子；Cd90Zeo 翻譯弱
9化的吉歐黴素抗性基因(Shble基因)，通過改變吉歐黴素抗性基因核苷酸序列從5』端 起90個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV 猿病毒 40polyA添加信號；和Amp1·:大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖18顯示了 pZC7/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL 人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長 激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；cdlSOZeo :翻譯弱 化的吉歐黴素抗性基因(Shble基因)，通過改變吉歐黴素抗性基因核苷酸序列從5』端 起1800個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病 毒40polyA添加信號；和Amp1·大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖19顯示了 pBCl結構。下列分別表示PCMV:巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；PABGH :牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強 子缺失的猿病毒40啟動子；Bsd:殺稻瘟菌素抗性基因(bsd基因)cDNA ； PASV 猿病 毒40polyA添加信號；和Amp1·大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖20顯示了 pBC6結構。下列分別表示PCMV:巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；PABGH :牛生長激素基因polyA添加信號；PdSV:增強 子缺失的猿病毒40啟動子；cdl20Bsd:翻譯弱化的殺稻瘟菌素抗性基因(bsd基因)，通 過改變殺稻瘟菌素抗性基因核苷酸序列從5』端起120個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動 物中最不常用的密碼子而獲得；PASV :猿病毒40polyA添加信號；和Amf 大腸桿菌 中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖21顯示了 pBCl/hMBL結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL 人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長
激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；Bsd:殺稻瘟菌素抗 性基因(bsd基因)cDNA ； PASV 猿病毒40polyA添加信號；和Amp1^:大腸桿菌中的選 擇標記(氨苄青黴素抗性)。圖22顯示了 pBC6/hMB結構。下列分別表示PCMV 巨細胞病毒啟動子； INRBG 兔生長激素內含子；hMBL:人甘露聚糖結合凝集素cDNA ； PABGH 牛生長
激素基因polyA添加信號；PdSV:增強子缺失的猿病毒40啟動子；cdl20Bsd 翻譯弱 化的殺稻瘟菌素抗性基因(bsd基因)，通過改變殺稻瘟菌素抗性基因核苷酸序列從5』端 起120個鹼基範圍內的密碼子為在哺乳動物中最不常用的密碼子而獲得；PASV 猿病毒 40polyA添加信號；和Amp1·:大腸桿菌中的選擇標記(氨苄青黴素抗性)。
具體實施例方式本發明人通過將藥物抗性基因(NPT基因、吉歐黴素抗性基因或殺稻瘟菌素抗性 基因)的密碼子改為在哺乳動物中最不常用的密碼子從而徹底地弱化所述藥物抗性基因 的表達，即使是轉化體，在培養基中藥物的篩選(新黴素篩選(例如G418)，吉歐黴素篩 選或殺稻瘟菌素篩選)下存活也很難，除非將組合的質粒基因整合進染色體具有高表達 特性的位置。更具體的，本發明提供了用於在哺乳動物宿主細胞內誘導重組蛋白質的高水平 生產的表達載體。
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本發明的一種表達載體在骨架載體上通過下述來構建(a)翻譯弱化的藥物抗性基因盒，其表達通過將密碼子改為哺乳動物中最不常用 的密碼子來削弱；和(b)基因盒，包含用於將外源基因整合進高轉錄活性啟動子和高穩定性聚腺苷化 信號之間的克隆位點。本發明通過將藥物抗性基因的密碼子改為在哺乳動物中最不常用的密碼子，並 在藥物抗性基因盒(順反子)結構中使用具有降低的藥物抗性基因的表達誘導特性的啟 動子，從而顯著地弱化了在轉化的宿主細胞內藥物抗性基因的表達機制。在本發明中，
「基因盒」是指具有啟動子、結構基因和聚腺苷化信號(polyA)的基本構成，並通過轉錄 /翻譯而表達蛋白質的單元，它也可以包括作為插入序列的與任意這些序列相關的DNA 序列或任何可選DNA序列。本發明的藥物抗性基因盒定義為「翻譯弱化的藥物抗性基 因盒」，這是因為它們不同於僅具有弱化的啟動子的那些，特別是允許獲得將質粒基因 整合進轉錄熱點的藥物抗性株。在本發明中，所述藥物抗性基因不特別限定，但是優選 的實例包括新黴素抗性基因(新黴素磷酸轉移酶基因，NTP基因)、吉歐黴素抗性基因或 殺稻瘟菌素抗性基因。在本發明中，「哺乳動物中最不常用的密碼子」是指優選，例如，人類中最不 常用的密碼子。所述人類中最不常用的密碼子包括在文獻Kim等(Gene，199，p.293， 1997)中公開的密碼子。所述密碼子的具體實例是，對於丙氨酸為GCA，對於精氨酸為 CGA,對於天冬醯胺為AAU，對於天冬氨酸為GAU，對於半胱氨酸為UGU，對於穀氨 醯胺為CAA，對於穀氨酸為GAA，對於甘氨酸為GGU，對於組氨酸為CAU，對於亮氨 酸為UUA，對於賴氨酸為AAA，對於脯氨酸為CCA，對於苯丙氨酸為UUU，對於絲氨 酸為UCA，對於蘇氨酸為ACU，對於酪氨酸為UAU，和/或對於纈氨酸為GUA，但是 不限於此。在本發明中，「弱化表達」表示在轉錄和/或翻譯水平上減少基因表達，並且特 別是，這可以通過將密碼子改為上述「哺乳動物中最不常用的密碼子」來實現。在上述「翻譯弱化的藥物基因盒」中，密碼子被改變的區域並不特別限定，但 是優選，所述基因盒的全長的30%或更多(例如，40%或更多，50%或更多，60%或更 多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，95%或更多，或100% )的區域內的密碼子 被改變。密碼子改變區域的範圍可以通過考慮所述載體的其它條件來隨意地確定。對於上述「翻譯弱化的藥物抗性基因盒」的啟動子，可以使用來自在哺乳動物 細胞內很難表達的蛋白質基因的啟動子，或者由常規啟動子通過缺失增強子而獲得的啟 動子。更特別的，優選使用由SV40病毒抗原啟動子缺失了增強子區域的啟動子(Mol.Cell Biol., 6，p.2593，1986)，或具有相對非常低的表達特性的啟動子。質粒DNA進入宿主細胞染色體的轉錄熱點的整合可以通過根據所述藥物抗性基 因盒的特性而用新黴素(G418)、吉歐黴素、殺稻瘟菌素或其它進行選擇來完成，但是必 須對在染色體的轉錄熱點的源自外源基因的蛋白質自身的表達進行強誘導。因此，在插 入所述蛋白質基因的多克隆位點(在下文中，指MCS)中的啟動子和聚腺苷化信號(在 下文中，稱為polyA)將從具有最強力的表達誘導特性的那些之中選擇。啟動子的實例包 括人巨細胞病毒直接早期(hCMV MIE Cell, 41，p.521，1985)啟動子，人巨細胞病毒啟動子和腺病毒啟動子融合的CMV5啟動子(NucleicAcid Research，30，p.2, 2002)，和 β-肌動蛋白啟動子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，ρ.4831, 1987) ； polyA 的實例包括源
自牛生長激素的polyA序列(DNA5，p.115，1986)。本文中，含有可以插入目的蛋白質 的基因的多克隆位點的DNA片段被稱為「基因表達盒」。本發明的表達載體可以通過實施例中描述的表達載體來示例，但不限於此。另外，本發明提供了生產具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力和耐受 藥物的能力的轉化體的方法，包括如下步驟將外源基因插入上述表達載體，並用所述 表達載體轉化宿主細胞。特別的實例包括獲得具有高蛋白質生產能力的轉化體的方法，其中包括將編碼 需要表達的蛋白質的外源基因插入到本發明的表達載體的多克隆位點(在下文中，稱為 MCS)中，然後用所述表達載體通過轉染方法轉化宿主細胞(轉染方法的實例在本文中是 指包括本領域技術人員公知的方法，例如脂質體法、電穿孔法、磷酸鈣法和微注射法)， 然後通過藥物(新黴素、吉歐黴素或殺稻瘟菌素)抗性進行選擇。在本發明中，宿主細胞並不特定地限定，只要它們是適合於表達源自外源基因 的蛋白質的細胞即可，但是優選包括，例如，哺乳動物細胞，更優選中國倉鼠卵巢細胞 (CHO細胞)。很多在藥物選擇中存活的轉化的細胞已經達到了相對高的蛋白質表達水平，但 是為了從這些細胞中選擇具有更高水平的生產能力的轉化體細胞，應確定蛋白質表達的 水平。另外，本發明提供了生產源自外源基因的蛋白質的方法，包括如下步驟(a)將外源基因插入到本發明的表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；(C)在添加了藥物(新黴素、吉歐黴素或殺稻瘟菌素)的培養基中培養轉化體； 和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質；在本發明中，在上述步驟(C)中，顯示出高效率的蛋白質表達的轉化體(菌落) 能夠通過在添加了藥物(新黴素、吉歐黴素或殺稻瘟菌素)的培養基中培養來選擇。所 選擇的轉化體可以在同樣的培養基中繼續培養，或者在轉移到另一種培養基例如用於大 規模表達的培養基中後培養。在本發明中，用於培養或移植轉化體的培養基並沒有特別的限制，但是例如， 優選無血清培養基，並更優選CD培養基或添加了非動物基添加劑的CD培養基。在本發明中，當從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質的時候，所述蛋 白質可以通過本領域技術人員所公知的方法來純化(過濾、離心、柱純化等等)。所述源 自外源基因的蛋白質可以以與其它蛋白的融合蛋白的形式表達以便於純化。此外，本發明提供篩選具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體 的方法，其中包括如下步驟(a)將外源基因插入到本發明的表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(c)在添加了藥物(新黴素、吉歐黴素或殺稻瘟菌素)的培養基中培養轉化體。
說明書中所引用的所有現有技術文獻以參照的方式併入在此。[實施例]在下文中，本發明將以參考實施例的形式特別描述，但是並不局限於此。[實施例l]pNCl、pNC2、pNC5、pNC6 和 pNC7 的構建使用本領域技術人員所公知的方法，構建了本發明的載體pNCl、pNC2、 pNC5、pNC6和pNC7。骨架載體pNCl的全部核苷酸序列示於SEQ IDNO 1。pNCl 在核苷酸No.1784和No.2578之間含有野生型NPT的cDNA(圖1)。pNC2通過將pNCl的序列中的核苷酸No.1784到No.2578替換為SEQ ID NO 2而構建。pNC2的替換區域引入了翻譯弱化的NPT基因，其中NPT的全部核苷酸序列 的密碼子被改變為哺乳動物中最不常用的密碼子(圖2)。pNC5通過將pNCl的序列中的核苷酸No.1784到No.2578替換為SEQ ID NO 3 而構建。pNC5的替換區域引入了翻譯弱化的NPT基因，其中NPT的核苷酸序列從5』 端起90個鹼基範圍內的密碼子(11.3%的密碼子改變率)被改變為哺乳動物中最不常用的 密碼子(圖3)。pNC6通過將pNCl的序列中的核苷酸No.1784到No.2578替換為SEQ ID NO 4 而構建。pNC6的替換區域引入了翻譯弱化的NPT基因，其中NPT的核苷酸序列從5』 端起180個鹼基範圍內的密碼子(22.6%的密碼子改變率)被改變為哺乳動物中最不常用 的密碼子(圖4)。pNC7通過將pNCl的序列中的核苷酸No.1784到No.2578替換為SEQ ID NO 5 而構建。pNC7的替換區域引入了翻譯弱化的NPT基因，其中NPT的核苷酸序列從5』 端起270個鹼基範圍內的密碼子(34.0%的密碼子改變率)被改變為哺乳動物中最不常用 的密碼子(圖5)。[實施例2]pNCl/hMBL、pNC2/hMBL、pNC5/hMBL、pNC6/hMBL 和 pNC7/ hMBL的構建使用本領域技術人員公知的方法，將本發明的載體pNCl、pNC2、pNC5、pNC6 和pNC7中的核苷酸No.1267到No.1275用SEQ ID NO 6的編碼人甘露聚糖結合凝集素 (MBL)的cDNA(在下文中稱為hMBL)來替換，從而構建pNCl/hMBL(圖6)、pNC2/ hMBL(圖 7)、pNC5/hMBL (圖 8)、pNC6/hMBL (圖 9)禾口 pNC7/hMBL (圖 10)。[實施例3]用 pNCl/hMBL、pNC2/hMBL、pNC5/hMBL、pNC6/hMBL 和 PNC7/hMBL轉染CHO細胞，用CD培養基或添加了非動物基添加劑的CD培養基進行 G418篩選在25cm2培養瓶中用脂質體方法(使用Lipofectamine LTX ； Invitrogen)用 10μ g 的 pNCl/hMBL、pNC2/hMBL、pNC5/hMBL、pNC6/hMBL 和 pNC7/hMBL 轉染 5.0xl05CHO細胞(CHODG44細胞)。基因轉染根據生產商的說明書來進行。基因轉染 48小時之後，進行細胞計數，然後細胞在添加了 4mM的Gluta MAXtm-I (Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培養基(IS日本)中稀釋。細胞平鋪於5個96孔微滴定板中，每個 濃度為1000細胞/孔和100細胞/孔，一共10個板(960孔)，在5%二氧化碳氣體存在 下37°C培養大約3周之後，觀察到存活細胞(G418抗性克隆)。從存活細胞中任意選擇 G418 抗性克隆，與該添加 了 4mM 的 Gluta MAXtm-I (Invitrogen)的 IS CHO-CD w/ 水解液
13培養基(IS日本)一起轉移到24孔板中，培養直到細胞填滿各個孔1/3或更多。0.4mL 的每個克隆放入無菌試管並以200xg離心2分鐘。棄上清液，細胞懸浮於O.lmL新鮮培 養基(添加了 4mM 的 Gluta MAXtm-I (Invitrogen)的 IS CHO-CD w/ 水解液培養基(IS 日 本))。計數細胞之後，細胞用培養基稀釋至5.0xl05細胞/mL，然後其0.2mL轉移至新 的24孔板，在5%二氧化碳氣體存在下以37°C培養細胞72小時。然後，細胞以9300xg 離心2分鐘，收集上清液。之後，測定培養上清液中MBL的生產水平。[實施例4]pNCl/hMBL、pNC5/hMBL、pNC6/hMBL 和 pNC7/hMBL 轉染的克 隆的MBL生產水平的測定生產水平通過ELISA 來測定。96 孔板(F96MAXI SORPNunc-Immunoplate， Cat.no.442404, Nunc)用由包被緩衝液(I5InMNa2CO3, 35mM NaHCO3, 0.05% NaN3, pH9.6)稀釋的lyg/mL的抗人MBL抗體(獲贈於日本旭川醫科大學的大谷博士)在4°C 下包被16小時。用4%的Block Ace(大日本住友製藥株式會社)封閉之後，72小時培 養上清液(1/1000到1/100000稀釋)、在CHO細胞的無血清培養基IS CHO-CD w/水 解液培養基(IS日本)中的兩倍稀釋系列(0.3125到20ng/mL)的純化的人MBL(獲贈於 日本旭川醫科大學的大谷博士)或IS CHO與水解液培養基(IS日本)，以100 μ L/孔置 於平板中，將所述平板在37°C下孵育1小時。此後進一步以0.1 μ g/mL的生物素化的人 MBL單克隆抗體(獲贈於日本旭川醫科大學的大谷博士)在37°C下孵育1小時。已經 在 37°C 下孵育 30 分鐘的 VECTASTAION Elite ABC Kit STANDARD (2 滴試劑 A，2 滴試 劑B/5mL，Vector)以100 μ L/孔添加，然後在37°C下反應45分鐘。已經在室溫下孵 育30分鐘的PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB (2滴緩衝液，3滴TMB，2滴過氧化氫 /5mL，Vector)進一步以100 μ L/孔加入，在其於室溫下反應15分鐘之後，以IOOyL/孔 加入IM磷酸以終止反應。用酶標儀(Model 680，BioRad製造)測定蛋白質濃度。表1 中顯示了由ELISA方法獲得的結果，以及顯示出人MBL高生產水平的最高的三個樣品。 具有最高生產水平的克隆展現出與未改變密碼子的載體相比顯著的高生產力。[表1]G418抗性克隆中hMBL的生產
1權利要求
1.一種能夠在哺乳動物宿主細胞內高水平生產源自外源基因的蛋白質的表達載體， 其包括(a)翻譯弱化的藥物抗性基因盒，其表達通過將密碼子改為哺乳動物中最不常用的密 碼子來弱化；和(b)基因盒，其包含用於將外源基因整合進高轉錄活性啟動子和高穩定性聚腺苷化信 號之間的克隆位點。
2.權利要求1所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因 盒的密碼子已被改為在人類中最不常用的密碼子。
3.權利要求1所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因 盒的密碼子對於丙氨酸已被改為GCA，對於精氨酸已被改為CGA，對於天冬醯胺已被改 為AAU，對於天冬氨酸已被改為GAU，對於半胱氨酸已被改為UGU，對於穀氨醯胺已 被改為CAA，對於穀氨酸已被改為GAA，對於甘氨酸已被改為GGU，對於組氨酸已被 改為CAU，對於亮氨酸已被改為UUA，對於賴氨酸已被改為AAA，對於脯氨酸已被改 為CCA，對於苯丙氨酸已被改為UUU，對於絲氨酸已被改為UCA，對於蘇氨酸已被改為 ACU,對於酪氨酸已被改為UAU，和/或對於纈氨酸已被改為GUA。
4.權利要求1所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因 盒使用具有低表達誘導活性的啟動子作為啟動子。
5.權利要求4所述的表達載體，其中所使用的低活性啟動子是源自在哺乳動物細胞內 幾乎不表達的基因的啟動子，或者是增強子部分已被移除的啟動子。
6.權利要求1所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述翻譯弱化的藥物抗性基因 盒的啟動子改變區域是該基因盒全長的30%或更多。
7.權利要求1 6中任意一項所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述藥物抗性 基因是新黴素磷酸轉移酶基因(NTP基因)。
8.—種生產能夠以高水平生產源自外源基因的蛋白質並且能夠耐受新黴素的轉化體 的方法，其包括以下步驟將外源基因插入到權利要求7所述表達載體中，並用所述表 達載體轉化宿主細胞。
9.一種生產源自外源基因的蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)將外源基因插入到權利要求7所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；(c)在添加了新黴素的培養基中培養轉化體；和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質。
10.權利要求9的生產方法，其中將化學成分確定的培養基(CD培養基)或向CD培 養基中添加了非動物基添加劑的培養基用於權利要求9的步驟(c)的培養。
11.一種篩選具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，其包括 如下步驟(a)將外源基因插入到權利要求7所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(c)在添加了新黴素的培養基中培養轉化體。
12.權利要求1 6中任意一項所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述藥物抗性基因是吉歐黴素抗性基因(Zeositf基因)。
13.—種生產能夠以高水平生產源自外源基因的蛋白質並且能夠耐受吉歐黴素的轉化 體的方法，其包括以下步驟將外源基因插入到權利要求12所述表達載體中，並用所述 表達載體轉化宿主細胞。
14.一種生產源自外源基因的蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)將外源基因插入到權利要求12所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；(C)在添加了吉歐黴素的培養基中培養轉化體；和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質。
15.權利要求14的生產方法，其中將化學成分確定的培養基(CD培養基)或向CD培 養基中添加了非動物基添加劑的培養基用於權利要求14的步驟(c)的培養。
16.一種篩選具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，其包括 如下步驟(a)將外源基因插入到權利要求12所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(c)在添加了吉歐黴素的培養基中培養轉化體。
17.權利要求1 6中任意一項所述的表達載體，其中權利要求1中(a)所述藥物抗 性基因是殺稻瘟菌素抗性基因(殺稻瘟菌素基因)。
18.—種生產能夠以高水平生產源自外源基因的蛋白質並且能夠耐受殺稻瘟菌素的轉 化體的方法，其包括以下步驟將外源基因插入到權利要求17所述表達載體中，並用所 述表達載體轉化宿主細胞。
19.一種生產源自外源基因的蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)將外源基因插入到權利要求17所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；(C)在添加了殺稻瘟菌素的培養基中培養轉化體；和(d)從培養的轉化體中收集源自外源基因的蛋白質。
20.權利要求19的生產方法，其中將化學成分確定的培養基(CD培養基)或向CD培 養基中添加了非動物基添加劑的培養基用於權利要求19的步驟(c)的培養。
21.—種篩選具有高水平生產源自外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，其包括 如下步驟(a)將外源基因插入到權利要求17所述表達載體中；(b)用所述表達載體轉化宿主細胞；和(C)在添加了殺稻瘟菌素的培養基中培養轉化體。
全文摘要
本發明成功地構建了能夠在哺乳動物宿主細胞內以高水平生產源自外源基因的蛋白質的表達載體，其包含翻譯弱化的藥物抗性基因順反子，其表達通過將密碼子改為哺乳動物中最不常用的密碼子來弱化；和具有克隆位點的基因盒，該克隆位點用於將外源基因整合進高轉錄活性啟動子和高穩定性聚腺苷化信號之間。
文檔編號C12N15/00GK102016025SQ20098011456
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月27日 優先權日2008年2月27日
發明者山本啟一, 田原寬, 鈴木定彥, 鈴木祐介 申請人:國立大學法人北海道大學, 扶桑藥品工業株式會社