單純皰疹病毒和重組病毒及宿主細胞及其藥物組合物的製作方法

2023-09-19 21:12:30 2

專利名稱：：單純皰疹病毒和重組病毒及宿主細胞及其藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明是關於一種病毒、以該病毒作為載體的重組病毒、包括所述病毒和/或所述重組病毒的宿主細胞，以及包括所述病毒和/或所述重組病毒的藥物組合物。具體地說，本發明是關於一種單純皰疹病毒、以該病毒作為載體的重組病毒、包括所述病毒和/或所述重組病毒的宿主細胞，以及包括所述病毒和/或所述重組病毒的藥物組合物。
背景技術：
：單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)呈球形，完整病毒由核心、衣殼、被膜(Tegument)和囊膜組成。病毒核心含有雙鏈DNA，纏繞成纖絲巻軸。衣殼呈二十面體對稱，直徑為100納米左右，由162個殼微粒組成。衣殼外由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質雙層囊膜。包括囊膜的病毒直徑為150-200納米。單純皰疹病毒包括I型單純皰疹病毒(HerpesSimplexVirusTypeI,HSV-l)以及II型單純皰疹病毒。HSV的基因組DNA通過共價連接的長節段(L)和短節段(S)組成，在每個節段的末端含有反向重複序歹[J(invertterminalrepeat,TR)禾口內部重複序歹U(internalrepeat,IR)。病毒在侵入宿主細胞後，線狀DNA就可以通過兩端的TR連接形成環狀，在宿主細胞核內的病毒基因組以級聯反應的方式表達病毒蛋白，根據基因表達的時間順序不同，將HSV基因分為立即早期基因(a)、早期基因(P)和晚期基因(Y)。立即早期基因(immediateearlyphase,IE)進入宿主細胞的能夠迅速得到表達，該基因的表達產物為能夠對病毒的複製進行調控的感染細胞多肽(infectedcellpolypeptides,ICP)。HSV進入宿主細胞後最先表達，例如編碼感染細胞多肽a22、a27的立即早期基因促進單純皰疹病毒在宿主細胞中的增殖。因此單純皰疹病毒的立即早期基因編碼的感染細胞多肽在宿主細胞中的表達豐度決定了病毒在宿主細胞中的增殖速度。由於單純皰疹病毒能以人類細胞作為宿主細胞，並且能夠感染的人類細胞類型廣、發生意外增殖可以用抗皰疹藥物阻止、裂解期和潛伏期都不整合宿主細胞基因組插入突變危險小，因此，單純皰疹病毒已經用於腫瘤或神經系統退行性疾病的基因治療。例如，I型單純皰疹病毒F株HSV1716用於腦膠質瘤的治療(參見"HSV1716injectionintothebrainadjacenttotumourfollowingsurgicalresectionofhigh-gradeglioma:safetydataandlong-termsurvival",S.Harrow等人，GeneTherapy,11,1648-1658,2004);I型單純皰疹病毒17+株感染腫瘤細胞，通過該病毒的裂解性複製溶解腫瘤細胞而治療癌症。然而，感染不同人種的I型單純皰疹病毒基因組具有明顯不同的限制性內切酶分解模式，即存在限制性片段長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)(參見"Quantitativeanalysisofgenomicpolymorphismofherpessimplexvirustype1strainsfromsixcountries:studiesofmolecularevolutionandmolecularepidemiologyofthevirus，，,H.Sakaoka等人，JournalofGeneralVirology,Vol75,513-527，1994)，單純皰疹病毒17+株從白色人種中分離，因此，感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株用於對黃色人種進行基因治療時，存在病毒感染率低、在宿主細胞中增殖速度慢的缺點。
發明內容本發明的第一個目的是克服現有技術的單純皰疹病毒用於黃色人種基因治療時病毒感染率低、在宿主細胞中增殖速度慢的缺點，提供一種單純皰疹病毒，該病毒用於黃色人種基因治療時，病毒感染率高、在宿主細胞中複製增殖速度快。本發明的第二個目的是提供以上述病毒作為載體的重組病毒。本發明的第三個目的是提供包括上述病毒和/或上述重組病毒的宿主細胞。本發明的第四個目的是提供一種包括上述病毒和/或上述重組病毒的藥物組合物。本發明的發明人針對感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株用於對黃色人種進行基因治療時，存在病毒感染率低、在宿主細胞中複製增殖速度慢的缺點，從成年中國人口角皰疹中分離出單純皰疹病毒(分類命名為單純皰疹病毒i型，拉丁文學名為//^t^&'w/7/exWn^^;e/，於2006年6月14曰保藏至位於北京市海澱區中關村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.1736)，並對該病毒進行了基因組全序列測定和分析，確定了該臨床分離株與I型單純皰疹病毒17+株在編碼感染細胞多肽的立即早期基因方面存在的差異。本發明提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒侵入宿主細胞內表達感染細胞多肽，其中，所述感染細胞多肽包括一種具有促進病毒增殖功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:N0.3所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l或SEQID:NO.3所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的促進病毒增殖功能不變的胺基酸序列中的一種或幾種。本發明還提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒具有編碼感染細胞多肽的立即早期基因，其中，所述感染細胞多肽為本發明所述的感染細胞多肽。本發明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其中，所述作為載體的病毒為本發明所述的單純皰疹病毒。本發明還提供了一種感染有病毒的宿主細胞，其中，所述病毒為上述的病毒和/或上述的重組病毒。本發明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括上述的病毒和/或上述的重組病毒。本發明提供了一種分離自黃色人種的單純皰疹病毒，該病毒對於黃色人種宿主細胞的特異性侵染率高，複製速度快，因此可以直接用於侵染並溶解黃色人種的腫瘤細胞，也可以作為載體攜帶基因藥物至黃色人種細胞內進行基因治療。此外與現有的I型單純皰疹病毒17+株相比，本發明病毒用於其他人種多發腫瘤細胞時，對腫瘤細胞的溶解能力更強。本發明涉及的單純皰疹病毒的分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學名為//wpey57wp/exWn^/，於2006年6月14日保藏至位於北京市海澱區中關村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.1736。圖1為本發明病毒的電子顯微鏡照片(放大52000倍)；圖2為正常人乳腺癌細胞系MCF—7培養96小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)；圖3為培養MCF—7細胞48小時後，按病毒活性顆粒/細胞數的比值(MOI)為0.1轉染本發明病毒後再培養48小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)；圖4為本發明病毒對人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的藥效照片；圖5為本發明病毒對結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的曲線。具體實施方式本發明提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒侵入宿主細胞內表達感染細胞多肽，其中，所述感染細胞多肽包括一種具有促進病毒增殖功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:N0.3所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l或SEQID:NO.3所示的胺基酸序列進行--個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的促進病毒增殖功能不變的胺基酸序列中的一種或幾種。所述立即早期基因(immediateearlyphase,IE)指病毒進入宿主細胞就立即利用宿主細胞表達(一般在l小時內)的基因，立即早期基因編碼的感染細胞多肽在宿主細胞中的表達豐度決定了病毒在宿主細胞中的增殖速度。由於本發明的單純皰疹病毒立早基因表達產物感染細胞多肽，例如SEQID:NO.l所示的感染細胞多肽a22、SEQID:NO.3所示的a27，與野生型單純皰疹病毒17+相比發生了變異，因此在宿主細胞尤其是黃色人種細胞中的表達豐度高，因而使病毒在的增殖速度明顯加快。組成蛋白質的20種胺基酸殘基，按照側鏈極性可以分成四類1、非極性的胺基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Tip)和脯氨酸(Pro);2、極性不帶電荷的胺基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、穀氨醯胺(Gln)和酪氨酸(Tyr);3、帶正電荷的胺基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His);4、帶負電荷的胺基酸天冬氨酸(Asp)和穀氨酸(Glu)(參見"生物化學"(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質中如果發生同屬一個類別的胺基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質結構域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水囊袋結構的作用)沒有改變，因此對蛋白質的立體結構並不會產生影響，因此仍然可以實現蛋白的功能。例如，本領域技術人員公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser禾卩Asn、Ala禾口Val、Ser禾口Gly、丁yr禾卩Phe、Ala禾口pro、Lys禾口Arg、Asp禾口Asn、Leu和Ile、Leu禾BVal、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會影響蛋白的立體結構和功能。所述同屬一個類別的胺基酸殘基取代可以發生在上感染細胞多肽的任意一個胺基酸殘基位置上。相反，不同類別的胺基酸殘基發生取代，會使蛋白的結構發生變化，功能出現差異。例如與單純皰疹病毒17+比較，本發明單純皰疹病毒的感染細胞多肽的鹼基發生了不同類別的取代(如單純皰疹病毒17+感染細胞多肽a22的第34位胺基酸殘基為絲氨酸，而本發明單純皰疹病毒的感染細胞多肽a22的第34位胺基酸殘基為丙氨酸)，結果本發明的單純皰疹病毒更易感染黃色人種。對所述SEQID:NO.l進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒增殖功能不變的胺基酸序列可以選自SEQID:NO.l中第34位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.l中第102位為絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.l中第281位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.l中第351位為精氨酸或組氨酸的胺基酸序列和SEQID:NO.l中第360位為賴氨酸或組氨酸的胺基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.3進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒增殖功能不變的氮基酸序列可以選自SEQID:NO.3中第36位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第178位為賴氨酸或精氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第179位為賴氨酸或組氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第180位為賴氨酸或組氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第181位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第206位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第383位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列中的一種或幾種。本發明所述胺基酸序列優選為SEQID:NO.l所示的胺基酸序列和/或SEQID:N0.3所示的胺基酸序列。更優選所述胺基酸序列為SEQID:NO.l所示的胺基酸序列和SEQID:NO.3所示的胺基酸序列。單純皰疹病毒的囊膜表面含有病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM);由於單純皰疹病毒對宿主細胞的感染能力還與該病毒囊膜糖蛋白的立體結構有關，即囊膜糖蛋白的立體結構與宿主細胞的相應耙標(例如細胞表面受體)越吻合，則能夠進入宿主細胞的病毒越多，更能促進病毒侵染宿主細胞。因此更優選所述病毒還包括一種具有促進病毒侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，即一種與黃色人種細胞表面受體更為吻合的囊膜蛋白的胺基酸序列。所述胺基酸序列選自SEQID:N0.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列、SEQID:NO.ll所示的胺基酸序列、SEQID:N0.13所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:N0.5、SEQID:N0.7、SEQID:N0.9、SEQID:NO.ll或SEQID:NO.13所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的促進病毒侵染宿主細胞功能不變的胺基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.5所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒侵染宿主細胞功能不變的胺基酸序列可以選自SEQID-N0.5中第79位為絲氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、酪氨酸或甘氨酸的胺基酸序列。對所述SEQID:NO.7所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒侵染宿主細胞功能不變的胺基酸序列可以為SEQID:NO.7中第201位為穀氨酸的胺基酸序列和/或SEQID:NO.7中第295位為賴氨酸或精氨酸的胺基酸序列。對所述SEQID:N0.9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒侵染宿主細胞功能不變的胺基酸序列可以為SEQID:N0.9中第369位為賴氨酸或精氨酸的胺基酸序列。對所述SEQID:NO.ll所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒侵染宿主細胞功能不變的胺基酸序列可以選自SEQID:NO.ll中第3位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第86位為天冬氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第116位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第118位為天冬氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第130位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第151位為甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第153位為天冬氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第162位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第164位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第208位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列和第236位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.13所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的促進病毒侵染宿主細胞功能不變的胺基酸序列可以為SEQID:NO.13中第440位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列和/或SEQID:NO.13中第446位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列。進一步優選所述病毒還包括一種具有促進病毒侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:N0.7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列、SEQID:NO.ll所示的胺基酸序列和SEQID:N0.13所示的胺基酸序列中的一種或幾種。本發明還提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒具有編碼感染細胞多肽的立即早期基因，其中，所述感染細胞多肽為本發明所述的感染細胞多肽。本領域公知，組成蛋白質的20種不同的胺基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種胺基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由於遺傳密碼子的簡併性，決定一個胺基酸的密碼子大多不止一個，三聯體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變胺基酸的組成，因此編碼相同蛋白的核苷酸序列可以不同。本領域人員根據公知的密碼子表，從本發明公開的胺基酸序列，以及由所述胺基酸序列得到的促進病毒增殖功能不變的胺基酸序列，完全可以推導出能夠編碼它們的核苷酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核苷酸序列，應用到重組技術以及基因治療當中，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發明範圍內。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過修改本發明提供的核酸序列，得到與本發明所述感染細胞多肽功能一致的胺基酸序列。優選所述立即早期基因包括一種編碼具有促進病毒增殖功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:NO，4所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:N0.2或SEQID:N0.4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對所述SEQID:N0.2所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.2中第102位為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或鳥嘌呤(G)的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第306位為A、T或胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第570位為G的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第612位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第652位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第654位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0,2中第729位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第843位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1053位為G的核苷酸序列和SEQID:NO.2中第1080位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.4中第108位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第465位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第519位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第534位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第535位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第537位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第540位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第588位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第618位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:N0.4中第1149位為A、T或G的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。所述編碼感染細胞多肽的立即早期基因中，所述感染細胞多肽更優選為SEQID:NO.l所示的胺基酸序列和/或SEQID:NO.3所示的胺基酸序列的感染細胞多肽。進一步優選所述核苷酸序列為SEQID:NO.2所示的核苷酸序列和/或SEQID:NO.4所示的核苷酸序列。更進一步優選所述核苷酸序列為SEQID:NO.2所示的核苷酸序列和SEQID:NO.4所示的核苷酸序列。更優選所述病毒還包括一種編碼具有促進病毒侵染宿主細胞功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.IO所示的核苷酸序列、SEQID:N0.12所示的核苷酸序列、SEQID:N0.14所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:NO,6、SEQID:N0.8、SEQID:NO.IO、SEQID:N0.12或SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對所述SEQID:N0.6所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.6中第144位為胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第183位為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)的核苷酸序列、SEQID:NO,6中第186位為A、G或T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第210位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第219位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第237位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第865位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第867位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1161位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1410位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO,6中第1513位為A的核苷酸序列、SEQID-NO.6中第1515位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第2095位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第2097位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第2196位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第2530位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第2532位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.6中第2562位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.8所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.8中第120位為G、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第177位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第267位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第597位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第865位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第867位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第1059位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:N0.8中第1149位為T、G或C的核苷酸序列和SEQID:N0.8中第1368位為T、G或C的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.10中第75位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第90位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第822位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第870位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第948位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第963位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1095位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1099位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1101位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1105位為A的核苷酸序列和SEQID:NO.10中第1107位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.12所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.12中第9位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第108位為A的核苷酸序列、SEQID:NO，12中第228位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第258位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第261位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第270位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第327位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第336位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第345位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第348位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第351位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第354位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第390位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第396位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第430位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第432位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:N0.12中第453位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第459位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第472位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第474位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第486位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第492位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第501位為A、T或C的核苷酸序歹U、SEQID:NO.12中第624位為A、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.12中第708位為A、T或G的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.14所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.14中第27位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第136位為T的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第138位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第315位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NCU4中第489位為G的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第609位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第618位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第643位為A的核苷酸序歹U、SEQID:NO.14中第645位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第728位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第762位為T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第784位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第786位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第954位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第966位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第1320位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第1338位為T的核苷酸序列和SEQID:NO.14中第1344位為A的核苷酸序列中的一種或幾種。進一步優選所述病毒還包括一種編碼具有促進病毒侵染宿主細胞功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.IO所示的核苷酸序列、SEQID:N0.12所示的核苷酸序列和SEQID:N0.14所示的核苷酸序列中的一種或幾種。最優選所述病毒的核苷酸序列與NCBI中ID:NC—001806的I型單純皰疹病毒17+的核苷酸序列具有99.5%的同源性，二者的差別如表l所示。表1中的"變異位置"為ID:NC—001806的I型單純皰疹病毒17+的全序列核苷酸的鹼基編號。1tableseeoriginaldocumentpage19續表1tableseeoriginaldocumentpage19續表ltableseeoriginaldocumentpage19續表ltableseeoriginaldocumentpage19續表ltableseeoriginaldocumentpage19續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表1tableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23tableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表1tableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表1tableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表1tableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表1tableseeoriginaldocumentpage27續表ltableseeoriginaldocumentpage27續表ltableseeoriginaldocumentpage27本發明單純皰疹病毒不僅在侵染黃色人種宿主細胞的能力方面增強，而且用於其他人種多發腫瘤細胞時，對腫瘤細胞的溶解能力更強。本發明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其中，所述作為載體的病毒選自本發明的單純皰疹病毒。本發明的單純皰疹病毒不僅可以單獨作用裂解殺傷腫瘤細胞，而且還可以作為載體通過傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細胞。單純皰疹病毒可以插入40-50千鹼基(kb)的外源片段("基因治療進展及其在心血管疾病中的應用"，華軍益等人，心血管病學進展，2000年，第21巻，第4期，第211-214頁)，因此作為載體的本發明單純皰疹病毒可以攜帶0.1-50kb的目的基因，優選攜帶10-40kb的目的基因。所述目的基因可以為抗腫瘤活性的基因，例如編碼前體藥物激活蛋白的基因、編碼腫瘤抑制蛋白的基因、編碼細胞凋亡因子(pro-叩optoticfactors)前體的基因和編碼免疫刺激蛋白的基因中的一種或幾種。所述免疫刺激蛋白可以為自身具有細胞毒性的蛋白、能夠刺激/增強抗腫瘤免疫應答的蛋白。當然本發明的病毒也可以用來將一種或幾種目的基因傳遞至需要其表達的細胞內，該細胞可以是非腫瘤細胞例如神經細胞，所述一種或幾種目的基因可以為編碼改變對疼痛刺激應答或緩解慢性疼痛的多肽的基因，所述多肽例如能夠隔絕例如神經生長因子、其它疼痛調節神經營養因子、神經營養因子樣分子的蛋白，物質P以及其它神經肽。所述一種或幾種目的基因也可以為編碼能夠刺激變性性疾病中損傷神經再生長或防止神經進一步變性的多肽的基因。所述目的基因還可以包括調控序列，例如所述一種或幾種目的基因表達的啟動子、終止子和增強子。所述目的基因也可以包括標記基因(例如，編碼e-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白或其它螢光蛋白的基因)或其產物調節其它基因表達的基因。所述目的基因除可以是DNA夕卜，還可以是mRNA、tRNA或rRNA，還可以包括通常與轉錄序列相關的相關轉錄調控序列，例如轉錄終止信號、聚腺苷酸化位點和下遊增強子元件。本發明還提供了一種感染有病毒的宿主細胞，其中，所述病毒為本發明的單純皰疹病毒和/或本發明的重組病毒。本領域人員公知，單純皰疹病毒需要在宿主細胞內完成其生活史，因此病毒的傳代增殖以及活化需要在宿主細胞中進行。而在體外感染有本發明單純皰疹病毒和/或本發明重組病毒的宿主細胞，也可以作為基因治療的藥物導入體內。所述宿主細胞可以是各種能夠培養本發明病毒和/或本發明重組病毒的宿主細胞，例如非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)、原代兔腎細胞、雞胚細胞、羊膜細胞、人宮頸癌細胞(Hela細胞)以及人胚肺二倍體成纖維細胞(WI-38細胞)。本發明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發明的單純皰疹病毒和/或本發明的重組病毒。本發明的單純皰疹病毒可以單獨使用裂解殺傷腫瘤細胞；還可以作為載體製備重組病毒，所述重組病毒單獨使用通過傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細胞。本發明的單純皰疹病毒和本發明的重組病毒也可以同時使用。本發明的單純皰疹病毒、本發明的重組病毒以及它們的混合物都還可以包括藥物可接受的載體或賦形劑，以藥物組合物的形式使用。所述藥物接受的載體或賦形劑指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料，例如，包括但不限於鹽水、緩衝鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適於胃腸外、舌下、腦池內、陰道內、直腸內、頰內、腫瘤內或表皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、關節內注射和輸注。適於胃腸外給藥的藥物組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配製的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、內二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤溼劑、乳化劑、保護劑和分散劑佐劑，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。優選加入等滲劑如糖類、氯化鈉。表皮給藥包括在皮膚、黏膜上以及在肺和眼表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。直腸或陰道給藥的組合物優選為栓劑，它可以通過將本發明的載體與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合製備，所述賦形劑或載體在室溫為固態，在體溫下為液態，因此在直腸或陰道腔內熔化並釋放出活性化合物。優選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的載體和本發明所述的病毒和/或重組病毒，每毫升所述注射液中含有102-101空斑形成數的所述病毒和/或重組病毒。所述藥學上可接受的載體為pH值為4.0-9.0的磷酸緩衝液。所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為0.01-30重量％，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。使用所述注射液進行時，給予的病毒量範圍為103-101空斑形成數(pfll)、優選105-108pfu、更優選106-108pfu。當注射本發明所述藥用組合物時，注射用量可以為本領域常用的劑量，至多500微升、一般1-200微升、優選1-10微升;但是根據所述腫瘤和接種部位，也可以使用至多10毫升的劑量。因為本領域技術人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量僅作為參考。所述劑量可以根據各種參數、尤其根據待治療患者的年齡、體重和病症、疾病或病症的嚴重程度以及給藥途徑來確定。此外，對於癌症患者優選的給藥途徑是直接注射到腫瘤內。本發明所述藥物組合物注射液也可以系統給藥，也可以將本發明的藥物組合物注射液注射到為腫瘤供血的血管內給藥。最優選給藥途逕取決於所述腫瘤的位置和大小。下面結合實施例進一步說明本發明，除非特別說明本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。實施例1本實施例說明本發明單純皰疹病毒的分離。(1)病毒的採集成年中國男性，37歲，漢族，多次口角皰疹反覆發作病史，無其他疾病，呈典型I型單純皰疹病毒復發感染臨床表現——口角周圍出現皰疹樣水泡兩天後取樣。取15毫升的無菌離心管，盛有3毫升無菌的含100微克/毫升卡那黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS)，所述緩衝液中含有9克/升的NaCl、0.21克/升的KH2P04以及0.97克/升的Na2HP04.12H20;用無菌棉籤擠壓皰疹樣水皰至淡黃色分泌物流出，然後用棉籤蘸取該分泌物，將所得棉籤帶有分泌物的一端在上述PBS緩衝液中涮洗10秒鐘。取出棉籤，用滅菌微量加樣器將所得含有分泌物的緩衝液吹吸均勻。(2)病毒的接種、培養和純化用含10X胎牛血清的DMEM培養基，在六孔細胞培養板上以5乂105個細胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)(美國ATCC)，37匸下在5%<:02培養箱中培養24小時，至每孔Vero細胞長滿80X。然後在無菌環境下，向上述六孔細胞培養板的每孔中加入200微升的(1)得到含有分泌物的PBS緩衝液(採樣後l小時完成接種)。繼續在5XC02培養箱中37"C下培養24小時後，在無菌環境下，在光學顯微鏡下以100倍的放大倍數觀察Vero細胞，發現病毒噬斑；用滅菌微量加樣器吸取單個的病毒噬斑10微升，將10微升吸取的液體混入100微升的DMEM培養基中，並用微量加樣器將所得含有病毒的DMEM培養基吹吸均勻。在無菌環境下，向另外一個長滿80XVero細胞的六孔細胞培養板的每孔中加入上述得到含有純化病毒的DMEM培養基，感染該Vero細胞。在5%002培養箱中37'C下培養獲得純化的本發明單純皰疹病毒。(3)病毒的生物學特性分析.如圖1所示，52000倍電鏡下觀察到(2)純化的病毒具有典型的單純皰疹病毒形態衣殼呈二十面體對稱，直徑為100納米左右。衣殼外由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質雙層囊膜，包括囊膜的病毒直徑為150至200納米。此外發明人委託杭州華大基因公司還對(2)純化的病毒進行了全基因組測序，測序結果如上述表l所示，所得病毒與NCBI中編號為ID:NC_001806的1型單純皰疹病毒17+的序列同源性為99.5%。本發明的發明人對得到的全基因組序列進行了分析，得到如SEQID:N0.2以及SEQID:N0.4所示的編碼感染細胞多肽的立即早期基因的核苷酸序列，並由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.l(感染細胞多肽a22)以及SEQID:NO.3(感染細胞多肽a27)。通過與ID:NC一001806的相應基因比對，發現(2)得到的純化病毒的立即早期基因存在變異。此外還得到了如SEQID:N0.6、SEQID:N0.8、SEQID:NO.IO、SEQID:NCU2，以及SEQID:N0.14所示的編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列，並由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.5(病毒糖蛋白B)、SEQID:NO.7(病毒糖蛋白C)、SEQID:NO.9(病毒糖蛋白D)、SEQID:NO.ll(病毒糖蛋白G)，以及SEQID:NO.13(病毒糖蛋白M)所示的囊膜蛋白的胺基酸序列。通過與ID:NC—001806的相應基因比對，發現(2)得到的純化病毒的編碼囊膜蛋白的基因也存在變異。實施例2本實施例說明本發明的單純皰疹病毒黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)的溶解能力。(1)單純皰疹病毒滴度的測定用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在六孔細胞培養板上以5X105個細胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)，37"C下在5XC02培養箱中培養24小時，至每孔Vero細胞長滿80%備用。無菌條件下，收集實施例1培養有本發明單純皰疹病毒的Vero細胞培養物的上清培養液，用不含血清的DMEM培養基分別梯度稀釋成1X102倍液、1X10M咅液、1X104倍液、1X105倍液、1X16倍液以及1X17倍液，每種稀釋液各100微升。無菌條件下，棄去上述六孔細胞培養板上培養好的Vero細胞培養物中含10X胎牛血清的DMEM培養基，然後每孔加入上述稀釋用的不含血清的DMEM培養基1毫升，接著將上述製得的六種濃度的病毒稀釋液分別加入6個孔中，每孔100微升。轉染有病毒的Vero細胞六孔培養板置於5XC02培養箱中37"C下培養1小時，無菌條件下棄去孔中的培養基，每孔中加入2毫升羧甲基纖維素培養基(將羧甲基纖維素粉末與PBS溶液按照重量體積比2:125混合後，在4。C冰箱保存12小時，溶解完全後121.3t:滅菌30分鐘，無菌條件下，將所得無菌1.6重量體積％的羧甲基纖維素PBS溶液與含10%FBS的DMEM按體積1:2混合製得)。置於5%(:02培養箱中37。C下培養48小時後，棄去培養液，用PBS溶液將細胞潤洗2次，棄去PBS溶液，加入2毫升含有0.1體積°/。的戊二醛(美國Sigma)的PBS溶液，25'C下放置10分鐘。再次將細胞用PBS溶液潤洗兩次，棄去PBS溶液，加入1毫升0.1重量體積％的結晶紫溶液(用20體積％乙醇作為溶劑配製)，25"下放置10分鐘。用純淨水潤洗細胞兩次，用吸水紙擦乾六孔板背面的水，將六孔板置於100倍光學顯微鏡下觀察，計數空斑。計算得出每毫升病毒原液形成的空斑數為5X107，即病毒原液的滴度為5乂107病毒空斑形成單位/毫升(pfli/ml)。(2)人鼻咽癌細胞的培養37i:下在5%C02培養箱中用6毫升含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養接種在25平方釐米的培養瓶中的CNE-1細胞(購自中科院上海細胞研究所)48小時，用放大100倍的倒置顯微鏡CNE-1細胞處於對數生長期。無菌條件下，加入0.25%的胰蛋白酶1毫升，在37'C下消化所述處於對數生長期的CNE-1細胞5分鐘。用倒置顯微鏡觀察CNE-1細胞在培養基溶液中游離後，加入新鮮培養基稀釋成1乂104個/毫升的細胞懸液，微量進樣器吹打均勻後加入96孔板中，每孔加IOO微升細胞懸液，在37"C、5%032培養箱中繼續培養24小時。(3)病毒的轉染以及人鼻咽癌細胞存活率的測定用己知滴度的步驟(O的單純皰疹病毒原液，按照步驟(1)的方法以感染複數(multiplicityofinfection,MOI)為0.1轉染上述培養的CNE-1細胞。其中對照孔加入與病毒原液等體積的含P/。小牛血清DMEM培養基。對照孔CNE-1細胞和被轉染的CNE-1細胞都在37"下5%(302培養箱中培養，並分別在轉染後24小時、48小時和72小時用MTT法(具體方法記載在"測定細胞存活和增殖的MTT方法的建立"，鄭永唐等人，免疫學雜誌，1992年，第8巻，第4期，第266-269頁)測定細胞存活率。用DG-3022型酶聯免疫儀(華東電子管廠製造)在570納米下測定OD值，細胞存活率由下式計算細胞存活率=(轉染孔光吸收值/對照孔光吸收值)xioo%。細胞存活率的測試結果見表2。對比例1本對比例說明現有技術的單純皰疹病毒對黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)的溶解能力。按照實施例2的方法，以相同病毒滴度的單純皰疹病毒17+轉染黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)(購自中科院上海細胞研究所)，在同樣的條件下培養轉染的CNE-1細胞，並按照實施例2的方法測定CNE-1細胞的存活率，測定結果見表2。2tableseeoriginaldocumentpage34從表2可以看出，轉染本發明單純皰疹病毒的CNE-1細胞的存活率大大低於轉染現有技術單純皰疹病毒17+的CNE-1細胞的存活率，而CNE-1細胞為典型的黃色人種多發人鼻咽癌的腫瘤細胞，說明本發明的病毒，相對於現有技術的單純皰疹病毒17+而言，特異性對黃色人種的腫瘤細胞的溶解能力更強。實施例3本實施例說明本發明的單純皰疹病毒對一般腫瘤細胞的溶解能力。按照實施例2的方法，用本發明的單純皰疹病毒分別在兩種不同的感染複數(MOI-O.l和MOI-l)下轉染人乳腺癌細胞MCF-7、人結腸癌細胞HT-29和人肺腺癌細胞A549(軍事醫學科學院第二研究所)，並測試轉染後不同時間點腫瘤細胞的存活數，結果如表3所示。對比例2本對比例說明現有技術的單純皰疹病毒17+對一般腫瘤細胞的溶解能力。按照實施例2的方法，用單純皰疹病毒17+分別在兩種不同的感染複數(MOI-0.1和MOI-l)下轉染人乳腺癌細胞系MCF-7、人結腸癌細胞系HT-29和人肺腺癌細胞系A549，並測試轉染後不同時間點腫瘤細胞的存活數，結果如表3所示。表3tableseeoriginaldocumentpage35從表3可以看出，無論在低感染複數(MOI=0.1)還是高感染複數(MOI=l)的情況下，轉染本發明單純皰疹病毒24小時的三種腫瘤細胞系的存活率都大大低於轉染現有技術單純皰疹病毒17+的三種腫瘤細胞系的存活率，說明本發明的病毒對一般腫瘤細胞的溶解能力也好於現有技術的單純皰疹病毒17+。此外，圖2展示了正常人乳腺癌細胞系MCF—7培養96小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)，細胞結構完整，密集生長排列；圖3展示了培養MCF—7細胞48小時後，按病毒活性顆粒/細胞數的比值(MOI)為0.1轉染本發明病毒後再培養48小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)，多數細胞結構遭到破壞，細胞數目大大減少。從兩張照片對比可以看出，本發明的單純皰疹病毒對一般腫瘤細胞都具有很強的溶解能力。實施例4本實施例說明含有本發明病毒的藥物組合物具有溶瘤作用。(1)注射液的配製將按照表4所示的劑量分別配製一組磷酸鹽緩衝液，12rC下滅菌60分鐘。在無菌條件下，以0.45微米的微孔濾膜過濾實施例2的步驟(1)己知滴度的單純皰疹病毒原液，去除細胞碎片，收集濾液至無菌離心管中，8000轉/分離心1小時，棄去上清，按照表4所示的病毒滴度，將所得病毒沉澱分散在上述高溫滅菌後的磷酸緩衝液中，即得本發明注射液。表4tableseeoriginaldocumentpage36本實施例中，陰性對照藥物為不含病毒的滅菌磷酸緩衝液；陽性對照藥物為注射用環磷醯胺(CTX)，批號050202，規格200毫克/支，上海華聯製藥有限公司生產。(2)細胞水平藥效學實驗按照實施例2的方法，以感染複數M0I-1的病毒注射液感染黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)。結果如表5所示。表5tableseeoriginaldocumentpage37從表5可以看出，本發明的注射液對黃色人種多發的CNE-1細胞具有顯著的殺傷作用，陽性對照藥能在24小時內殺死腫瘤細胞，但是陽性對照藥對正常細胞的毒性也很大。(3)人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長的抑制作用藥效學實驗人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤購自中國醫學科學院藥物研究所，Balb/c裸鼠，4-6周齡，16-20克，雌性，購自中國醫學科學院實驗動物中心。傳代荷瘤鼠皮下腫瘤生長至直徑約2-3釐米時，無菌條件下取出瘤塊，按照每克腫瘤組織3-4毫升生理鹽水的比例，製成腫瘤細胞勻漿，給予每隻小鼠右前肢腋部皮下接種0.2毫升；或者將瘤塊切割成1立方釐米的小瘤塊，用套管針接種到裸鼠右側腋部皮下。待各組動物接種的腫瘤生長到動物體表能觀察到約0.6釐米X0.6釐米的腫塊時，隨機分9組(本發明配方7組、陽性對照組、陰性對照組)，每組7隻開始用步驟(1)的本發明病毒注射液以及陽性對照藥物、陰性對照藥物給藥。於第1天、第4天和第7天瘤內注射，注射容積為100微升。本發明病毒的給藥劑量為2.5X107pfU/kg，陽性對照藥為環磷醯胺，陽性對照藥的給藥劑量為100mg/kg，陰性對照藥為與本發明病毒注射液等體積的磷酸緩衝液。最後一次給藥後，每周稱體重，測定動物體表能觀察到的腫瘤體積，繼續觀察2周左右，腫瘤體積變化曲線見圖5，然後頸部脫臼處死動物，剝離取出瘤塊稱重，可得出腫瘤抑制率-iooy。x本發明病毒注射液組或陽性對照藥組平均瘤塊重量/陰性對照藥平均瘤塊重量，結果見表6。圖4為陰性對照藥(第一行)、陽性對照藥(第二行)，本發明病毒配方2注射液(第三行)所取出的瘤塊照片，空白位置的小鼠死亡。表6病毒注射液陰性對照陽性對照配方1配方2配方配方4配方配方6配方7平均瘤塊重量(克)0.740.400.590.510.670.620.580.610.61腫瘤抑制率(％)-4621321017221818死亡率(％)0300000000從表6和圖4、圖5可以看出，本發明對人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長有明顯的抑制作用，本發明組的抑制率範圍為28.0%-77.0%，雖然陽性對照藥的抑制率對腫瘤的抑制作用也很明顯，但是陽性對照藥的死亡率很高，因而本發明的病毒注射液更安全。SEQUENCELISTING北京奧源和力生物技術有限公司單純皰疹病毒和重組病毒及宿主細胞及其藥物組合物I71980YH14PatentInversion3.41420PRT單純皰疹病毒I型(HerpesSimplexVirusTypeI)1MetAlaAsplieSerProGlyAlaPheAlaProCysValLysAlaArg151015ArgProAlaLeuArgSerProProLeuGlyThrArgLysArgLysArg202530ProAlaArgProLeuSerSerGluSerGluValGluSerAspThrAla354045LeuGluSerGluValGluSerGluThrAlaSerAspSerThrGluSer505560GlyAspGinAspGluAlaProArglieGlyGlyArgArgAlaProArg65707580ArgLeuGlyGlyArgPhePheLeu85GlyThrGluThrAspThrSerVal100AspTrpSerTyrAspAspliePro115120AspMetSerAlaGluSerThrThr9095SerAspAspProAspAspThrSer105110ProArgProLysArgAlaArgVal125AsnLeuArgLeuThrSerSerProAspArgArgAspGlyValliePhe130135140ProLysMetGlyArgValArgSerThrArgGluThrGinProArgAla145150155160ProThrProSerAlaProSerProAsnAlaMetLeuArgArgSerVal165170175ArgGinAlaGinArgArgSerSerAlaArgTrpThrProGluLeuGly180185'190TyrMetArgGinCyslieAsnGinLeuPheArgValLeuArgYalAla195200205ArgAspProHisGlySerAlaAsnArgLeuArgHisLeulieArgAsp210215220CysTyrLeuMetGlyTyrCysArgAlaArgLeuAlaProArgThrTrp225230235240CysArgLeuLeuGinValSerGlyGlyThrTrpGlyMetHisLeuArg245250255AsnThrlieArgGluValGluAlaArgPheAspAlaThrAlaGluPro260265270ValCysLysLeuProCysLeuGluAlaArgArgTyrGlyProGluCys275280285AspLeuSerAsnLeuGlulieHisLeuSerAlaThrSerAspAspGlu290295300lieSerAspAlaThrAspLeuGluAlaAlaGlySerAspHisThrLeu305310315320AlaSerGinSerAspThrGluAspAlaProSerProValThrLeuGlu325330335ThrProGluProArgGlySerLeuAlaValArgLeuGluAspLysPhe340345350GlyGluPheAspTrpThrProArgGluGlySerGinProTrpLeuSer355360365AlaValValAlaAspThrSerSerValGluArgProGlyProSerAsp370375380SerGlyAlaGlyArgAlaAlaGluAspArgLysCysLeuAspGlyCys385390395400ArgLysMetArgPheSerThrAlaCysProTyrProCysSerAspThr405410415PheLeuArgPro420<210〉2<211〉1264<212〉腿單純皰疹病毒I型(HerpesSi即lexVirusTypeI)2atggccgacatttccccaggcgcttttgcgccttgtgtaaaagcgcggcgtcccgctctc60cgatccccgcccctgggcacgcgcaagcgcaagcgccctgcccgccccctctcatcggag120tctgaggtagaatccgatacagccttggagtctgaggtcgaatccgagacagcatcggat180tcgaccgagtctggggaccaggatgaagccccccgcatcggtggccgtagggccccccgg240aggcttggggggcggttttttctggacatgtcggcggaatccaccacggggacggaaacg300gatacgtcggtgtcggacgaccccgacgacacgtccgactggtcttatgacgacattccc360ccacgacccaagcgggcccgggtaaacctgcggctcacgagctctcccgatcggcgggat420g鵬ttatttttcctaagatggggcgggtccggtctacccgggaaacgcagccccgggcc化Occcaccccgtcggccccaagcccaaatgcaatgctacggcgctcggtgcgccaggcccag540郷cggagcagcgcacgatggacccccgaactgggctacatgcgccagtgtatcaatcag600ctgtttcgggtacctgcgggtcgcccgggacccccacggcagtgccaaccgctctgcgcc660acctgatacgcgactgttacctgatgggatactgccgagcccgtctggccccgcgcacgt720ggtgccgcttgctgcaggtgtccggcggaactggggcatgcacctgcgcaacaccatacg780ggaggtggaggctcgattcgacgccaccgcggaacccgtgtgcaagcttccttgtttgga柳ggccagacggtacggcccggagtgtgatcttagtaatctcgagattcatctcagcgcgac900aagcgatgatgaaatctccgatgccaccgatctggaggccgccggttcggaccacacgct960cgcgtcccagtccgacacggaggatgccccctcccccgttacgctggaaaccccagaacc1020ccgcgggtccctcgctgtgcgtctggaggataagtttggggagtttgactggaccccccg1080腳gggctcccagccctggctgtctgcggtcgtggccgataccagctccgtggaacgccc1140gggcccatccgattctggggcgggtcgcgccgcagaagaccgcaagtgtctggacggctg1200ccggaaaatgcgcttctccaccgcctgcccctatccgtgcagcgacacgtttctccggcc1260gtga12643512PRT<213〉單純皰疹病毒I型(He卬esSimplexVirusTypeI)<400〉3MetAlaThrAsplieAspMetLeulieAspLeuGlyLeuAspLeuSerAspSerAspLeuAspGluAspProProGluProAlaGluSerArgArg202530AspAspLeuAlaSerAspSerSerGlyGluCysSerSerSerAspGlu354045AspMetGluAspProHisGlyGluAspGlyProGluProlieLeuAsp505560AlaAlaArgProAlaValArgProSerArgProGluAspProGyVa)65707580ProSerThrGinThrProArgProThrGluArgGinGlyProAsnAsp859095ProGinProAlaProHisSerValTrpSerArgLeuGlyAlaArgArg100105110ProSerCysSerProGluGinHisGlyGlyLysValAlaArgLeuGin115120125ProProProThrLysAlaGinProAlaArgGlyGlyArgArgGlyArg130135140ArgArgGlyArgGlyArgGlyGlyProGlyAlaAlaAspGlyLeuSer145150155160AspProArgArgArgAlaProArgThrAsnArgAsnProGlyGlyPro165170175ArgHisArgGlyGlyTrpThrAspGlyProGlyAlaProHisGlyGlu180185190AlaTrpArgGlySerGluGinProAspProProGlyGlyProArgThr195200205ArgGlyValArgGinAlaProProProLeuMetThrLeuAlalieAla210215220ProProProAlaAspProArgAlaProAlaProGluArgLysAlaPro225230235240AlaAlaAspThrlieAspAlaThrThrArgLeuValLeuArgSerlie245250255SerGluArgAlaAlaValAspArglieSerGluSerPheGlyArgSer260265270AlaGinValMetHisAspProPheGlyGlyGinProPheProAlaAla275280285AsnSerProTrpAlaProValLeuAlaGlyGinGlyGlyProPheAsp290295300AlaGluThrArgArgValSerTrpGluThrLeuValAlaHisGlyPro.305310315320SerLeuTyrArgThrPheAlaGlyAsnProArgAlaAlaSerThrAla325330335LysAlaMetArgAspCysValLeuArgGinGluAsnPhelieGluAla340345350LeuAlaSerAlaAspGluThrLeuAlaTrpCysLysMetCyslieHis355360365HisAsnLeuProLeuArgProGinAspProlielieGlyThrAlaAla370375380AlaValLeuAspAsnLeuAlaThrArgLeuArgProPheLeuGinCys385390395400TyrLeuLysAlaArgGlyLeuCysGlyLeuAspGluLeuCysSerArg405410415ArgArgLeuAlaAsplieLysAsplieAlaSerPheValPheVallie420425430LeuAlaArgLeuAlaAsnArgValGluArgGlyValAlaGlulieAsp435440445TyrAlaThrLeuGlyValGlyValGlyGluLysMetHisPheTyrLeu450455460ProGlyAlaCysMetAlaGlyLeulieGlulieLeuAspThrHisArg465470475480GinGluCysSerSerArgValCysGluLeuThrAlaSerHislieVal485490495AlaProProTyrValHisGlyLysTyrPheTyrCysAsnSerLeuPhe50050551041539單純皰疹病毒(HerpesSimplexVirusTypeI)4atggcgactgacattgatatgctaattgacctcggcctggacctctccgacagcgatctg60gacgaggacccccccgagccggcgg柳gccgccgcgacgacctggcatcggacagcagc120ggggagtgttcctcgtcggacgaggacatggaagacccccacgg卿ggacggaccggag180ccgatactcgacgccgctcgcccggcggtccgcccgtctcgtcc柳agaccccggcgta240cccagcacccagacgcctcgtccgacggagcggc郷gccccaacgatcctcaaccagcg300ccccacagtgtgtggtcgcgcctcggggcccggcgaccgtcttgctcccccgagcagcac360gggggcaaggtggcccgcctCC33CCCCC3ccgaccaaagcccagcctgcccgcggcgga420cgccgtgggcgtcgcaggggtcggggtcgcggtggtcccggggccgccgatggtttgtcg480gacccccgccggcgtgcccccagaaccaatcgcaacccggggggaccccgccaccggggc540gggtggacggacggccccggcgccccccatggcgaggcgtggcgcggaagtgagcagccc600gacccacccggaggcccgcggacacggggcgtgcgccaagC3CCCCCCCCgctaatgacg660ctggcgattgcccccccgcccgcggacccccgcgccccggccccggagcgaa鄉cgccc720gccgccgacaccatcgacgccaccacgcggttggtcctgcgctccatctccgagcgcgcg780gcggtcgaccgcatcagcgagagctttggccgcagcgcacaggtcatgcacgaccccttt840ggggggcagccgtttcccgccgcgaatagc鵬ccctttgacgccgagaccagacgggtcagcctctatcgcacttttgccggcaatcctgactgcgtgctgcgccaagaaaatttcatcgcgtggtgcaagatgtgcatccaccacaacgggacggccgcggctgtgctggataacctctacctgaaggcgcg鄉cctgtgcggcctggacattaaggacattgcatccttcgtgt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