單克隆抗體的拮抗活性的調節方法
2023-09-19 21:21:20
專利名稱：單克隆抗體的拮抗活性的調節方法
技術領域：
本發明涉及抗體工程化領域，並且更特別地，涉及篩選抗體和/或調節抗體的激動/拮抗活性的方法。更特別地，本發明涉及通過遺傳工程化調節單克隆抗體或其二價功能化片段或衍生物的拮抗活性的方法。本發明還涉及用於這種調節方法的多肽和所獲得的抗體。
背景技術：
術語「一種抗體」、「多種抗體」或「免疫球蛋白」以最寬意思互換使用，並且包括單克隆抗體(例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們呈現出所需的生物活性)。更特別地，這樣的分子由糖蛋白組成，所述糖蛋白包含通過二硫鍵鏈間連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈。每個重鏈由重鏈可變區(或結構域)(在此縮寫為HCVR 或VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CHI、CH2和CH3組成。每個輕鏈由輕鏈可變區(在此縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可以進一步細分成超可變性區，稱為互補性決定區(CDR)，穿插有具更保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，以以下順序從氨基端排列至羧基端FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和典型補體系統的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重鏈可以分成三個功能區Fd區、鉸鏈區、Fc區(可結晶片段)，其通過柔性鉸鏈區來連接。Fd區包含VH和CHl結構域，並且結合輕鏈，形成Fab-抗原結合片段。Fc片段負責免疫球蛋白效應物功能，其包括，例如，補體固定和結合至效應物細胞的同源Fc受體。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白類別中發現的鉸鏈區作為柔性間隔物，使Fab 部分在相對於Fc區的空間中自由移動。與恆定區相反，鉸鏈結構域在結構上是多變的，在免疫球蛋白類別和亞類中的序列和長度都有變化。根據結晶研究，免疫球蛋白鉸鏈區可以在結構和功能上進一步細分成三個區上鉸鏈、核心和下鉸鏈(Shin等，Immunological Reviews 130:87,1992)。上鉸鏈包括從CHl 羧基端至限制運動的鉸鏈中第一個殘基的胺基酸，通常為兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵的第一個半胱氨酸殘基。上鉸鏈區的長度與抗體的片段柔性相關。核心鉸鏈區含有重鏈間二硫橋鍵。下鉸鏈區連接CH2結構域的氨基端，並包括CH2結構域中的殘基。人IgGl的核心鉸鏈區含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通過二硫鍵形成二聚化時，形成環八肽，認為這作為樞軸，由此給予柔性。由免疫球蛋白鉸鏈區多肽序列的結構和柔性產生的構象變化可能影響抗體Fc部分的效應物功能。通常，對於鼠來源的單克隆抗體或其功能性片段的製備，可能參考特別在手冊「抗體，，中描述的技術(Harlow 禾口 Lane，Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp. 726,1988)或 Kohler和Milstein所述的從雜交瘤的製備技術(Nature, 256 =495-497,1975) 然後，例如，單克隆抗體可以在親和性柱上純化，在柱上之前已經固定了目標受體或其含有所述單克隆抗體特異性識別的表位的片段之一。更特別地，所述單克隆抗體可以通過蛋白A和/或G的色譜來純化，接著進行或不進行針對消除殘餘蛋白汙染物以及DNA和LPS的離子交換色譜，本質上接著進行或不進行kpharose凝膠上的排阻色譜，以消除由於二聚體或其他多聚體的存在引起的潛在聚集物。在甚至更優選的方式中，同時或連續使用這些技術的全部。
發明內容
根據本發明的抗體的功能性片段，特別用來表示抗體片段，如Fv、SCFv(SC表示單鏈)、Fab、F(ab，)2、Fab\ scFv-Fc片段或二抗，或其半衰期已經通過化學修飾提高的任何片段，化學修飾如添加聚(烷撐)甘醇，如聚(乙烯)甘醇(「PEG化」)(稱為Fv-PEG、 scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab，)2_PEG 或 Fab，-PEG 的 PEG 化片段)(「PEG」 表示聚(乙烯)甘醇)，或通過將具有原始抗體的至少一個特徵性CDR的所述片段摻入脂質體中。優選，這些功能性片段將是？^80 1 313、？(313，)2、F(ab，)、scFv-Fc型或二抗的片段，其通常具有與產生其的抗體相同的結合特異性。根據本發明，本發明的抗體片段可以通過如酶消化的方法，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通過化學還原的二硫橋鍵的分裂， 從如上所述的抗體獲得。在另一種方式中，本發明中包含的抗體片段可以通過本領域技術人員同樣公知的遺傳重組技術來獲得，或者通過肽合成獲得，例如通過自動化肽合成儀，如 Applera等公司供應的那些。如在此所用的術語「拮抗劑」指的是能夠抑制目標分子(如胞外或跨膜受體)的一種或多種生物活性的分子。拮抗劑可以通過幹擾受體與配體的結合和反之，通過降低受體磷酸化和/或通過使已經由配體激活的細胞喪失能力或殺滅這些細胞來起作用。拮抗劑可以完全阻止受體-配體相互作用或可以本質上通過競爭、構象變化、脫落或下調降低這種相互作用。通過拮抗劑產生的所有這樣的幹擾點將認為是本發明目的的等價物。如在此所用的術語「激動劑」指的是能夠激活目標分子的一種或多種生物活性的任何化合物，包括蛋白、多肽、肽、抗體、抗體片段、偶聯物、大分子、小分子。在治療抗體的研究中，常常期望具有可能作為拮抗劑的抗體。拮抗劑抗體的典型實例是赫塞汀、帕妥珠單抗、愛必妥、抗-VEGFR或抗-IGF-IR抗體。作為特定實例，可以提及由Genentech產生的抗-c-Met 5D5抗體[W096/38557]， 其在各種模型中單獨加入時，表現為有效的激動劑。為了解決這個技術問題，該抗體必須工程化成Fab片段或單價抗體(一臂5M)，以具有拮抗活性。因此，這樣的抗體不能認為是抗體，而是片段，並且沒有呈現出由於「全抗體」形式產生的所有優點(無效應物功能、降低的清除和半衰期[比傳統二價抗體快2倍，如20thE0RTC-NCI-AACR學術討論會，Geneva, 2008 年10月21-24日，Poster411中所述的])。本領域技術人員將認識到效應物功能包括，例如，Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；嗜菌作用；和細胞表面受體 (例如，B細胞受體；BCR)的下調和通過結合清道夫受體結合配體(Fcfoi)延長半衰期，如， 例如，1988年4月14日授權的U. S.專利No. 5，739，277中所述的。
本發明的一個創造性方面是解決這樣的技術問題，即，提高抗體的拮抗活性，同時保持「全二價」形式。在此必須提及本發明可以用於調節人抗體的激動/拮抗活性，人抗體是通過如下方法獲得的通過免疫「人小鼠」獲得(遺傳修飾的產生人免疫球蛋白的小鼠)或使用噬菌體展示技術從選定的ScFV、Fab或任何其他等價片段構建完整的抗體。在鼠抗體的嵌合和/或人源化的過程中可能會遇到另一個傳統的技術問題。本領域技術人員公知，如果鼠抗體的嵌合和/或人源化過程在理論上是非常容易的，但不是這麼容易控制這樣的鼠抗體的嵌合和/或人源化，以至不失去全部或部分的初始特性。嵌合或人源化抗體可能失去一部分的ADCC、CDC、拮抗/激動、結合、(TBC)…活性。更特別地，本發明涉及嵌合和/或人源化處理後，鼠抗體的激動/拮抗活性的改變。作為特定的實例，在人IgGl形式嵌合時，表現為有效拮抗鼠抗體的一組抗-cMet 抗體(下文中描述為224G11、2274H1和11E1)變成部分激動劑。這種從有效拮抗劑至部分激動劑的轉變導致在異種移植模型中體內活性的完全丟失。本發明打算解決這些問題，並且更特別地涉及提高針對特定目標分子的單克隆抗體或其二價功能性片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗體能夠抑制所述目標分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括鉸鏈區重新構建的階段，該階段由通過至少一個胺基酸的刪除、添加或置換來修飾所述鉸鏈區的胺基酸序列組成。清楚表述「提高拮抗活性」必須以其最寬的意思來解釋，即，按照所需的結果。機械地，可以通過抗體的內在拮抗活性的提高和/或抗體的內在激動活性的降低來獲得這樣的結果。更特別地，定量藥理學中術語的基礎定義是基於國際藥理學聯合會(IUPHAR)對受體命名給出的最新推薦(參見，Neubig等，2003)。術語「激動劑」表示結合受體並改變受體狀態而導致刺激或提高的生物應答的配體(任何類型的分子)。激動劑可以作為完全激動劑或部分激動劑-完全激動劑當激動劑誘導的受體刺激到達系統的最大應答能力時，那麼將產生系統最大應答並是該系統中的完全激動劑。幾種激動劑可以引發相同的最大應答，它們全部是該實驗系統中的完全激動劑。-部分激動劑在給定的組織中，在特定的條件下，不能與完全激動劑通過相同系統中的相同受體作用引發相同大的效果的分子(即使在高濃度下應用，使得所有受體應當被佔據時)。部分激動劑通常還是部分拮抗劑，因為在完全激動劑的共同存在下，它們使所述完全激動劑的最大應答降至其自身最大應答。這種完全vs.部分激動劑的指定是系統依賴性的，並且對於一種系統或測量的完全激動劑在另一種系統或測量中可能是部分激動劑。術語「拮抗劑」表示降低另一種藥物(通常是激動劑)的作用的分子。許多拮抗劑作用於和激動劑相同的受體大分子。-在拮抗劑和激動劑共同存在下的系統的應答對應於系統的基礎(沒有任何配體)活性的情況中，拮抗效率可以是完全拮抗。-由拮抗劑和激動劑共同存在引發的最大抑制高於系統的基礎活性時(即使以高濃度應用，使得所有受體應當被拮抗劑佔據時)，拮抗劑可以作為部分拮抗劑。
-當激動劑和拮抗劑的結合互相排斥時，拮抗是競爭性的。這可能是因為激動劑和拮抗劑競爭相同的結合位點或結合重疊的鄰近位點。第三個可能性是涉及不同的位點，但它們以激動劑和拮抗劑分子不能同時被結合的方式影響受體大分子。-當激動劑和拮抗劑可以同時結合受體時，觀察到非競爭性拮抗；拮抗劑結合降低或阻止了激動劑的作用，對激動劑的結合具有或不具有任何作用。傳統上可以通過本領域技術人員已知的任何方法來進行刪除、添加或置換。本領域技術人員可以使用幾種方法來產生給定DNA序列中的添加、刪除或插入。 可以提及但無限制，用胰腺DNA酶I部分消化DNA，用限制酶部分消化DNA，基於連接物的插入突變體，使用BAL31核酶、DNA酶I或核酸外切酶III的刪除突變體的嵌套集合。這些方法在實驗室手冊中有廣泛描述，如Molecular Cloning, A laboratory manual (分子克隆， 實驗室手冊)(Sambrook，Fritsch和Maniatis)。幾種基於PCR的方法也可以用來產生DNA 分子中的刪除、插入或定點誘變，如重疊延伸PCR(Wurch等，1998)，但不限於這一種。為了進行定點誘變，可以使用幾種其他技術，例如，但不限於這幾種，可以提及基於單或雙引物方法的基於寡核苷酸的誘變，基於尿嘧啶結合的Kunkel方法(Kimkel，1985)。這些方法在實驗室手冊中有廣泛描述，如Molecular Cloning, A laboratory manual (分子克隆，實驗室手冊)(Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis)。作為添加的非限制性實例，可以提及鉸鏈區中或鄰近的脯氨酸添加。在本發明方法的優選實施方案中，所述修飾選自i)所述鉸鏈區胺基酸序列的至少一個胺基酸的刪除；和/或ii)將至少一個二硫橋鍵添加至所述鉸鏈區中。為了闡明本發明，將首先詳述第一個方面(i)，第二個方面(ii)將在之後詳述。必須理解這個順序只是由於本發明的書寫，並且如下文中顯而易見的，這兩個方面是同等重要的。在特定的實施方案中，修飾鉸鏈區胺基酸序列的方式將由所述鉸鏈區胺基酸序列的至多2、3或4個胺基酸刪除組成。本發明的特定方面在於所述單克隆抗體是二價抗體。實際上，如以下所看到的，可以通過修飾所述抗體的結構來調節抗體的激動/拮抗活性。第一次，發明人報導了調節這種激動/拮抗活性同時保持抗體二價形式的獨創方式，目標在於良好特性(如長的半衰期或效應物功能)的保持。在此還可以提及，如果現有技術中已經報導了為了提高效應物功能的單克隆抗體鉸鏈區的修飾，但相反從未報導過鉸鏈區中這樣的修飾的興趣在於單克隆抗體的激動/拮抗活性調節。這明顯是本發明的主題，這對於現有技術是新的和創造性的。作為根據本發明方法的一個方面，單克隆抗體是嵌合抗體。「嵌合」抗體用來表示含有源自給定物種抗體的天然可變(輕鏈和重鏈)區並結合與所述給定物種(例如，鼠、馬、兔子、狗、牛、雞等)異源物種的抗體的輕鏈和重鏈恆定區的抗體。可以通過使用遺傳重組技術來製備根據本發明的嵌合類型的抗體或其片段。例如，可以通過克隆含有啟動子和編碼非人(尤其是鼠)可變區的序列、根據本發明的單克隆抗體和編碼人抗體恆定區的序列的重組DNA來生產嵌合抗體。通過這樣的重組基因編碼的本發明的嵌合抗體將是，例如，鼠-人嵌合體，通過源自鼠DNA的可變區來決定該抗體的特異性，並且通過源自人DNA的恆定區來決定其同種型。對於嵌合抗體製備的方法，例如，可以參考文獻 Verhoeyn 等(BioEssays，8 :74，1988) ,Morrison 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :6851-6855,1984)或 US 專利 No. 4，816，567。作為根據本發明方法的另一個方面，單克隆抗體是人源化抗體。「人源化抗體」用來表示其含有源自非人來源抗體的CDR區的抗體，抗體分子的其他部分源自一個(或幾個)人抗體或種系序列。此外，一些骨架(稱為FR)片段的殘基可以進行修飾，以保持結合親和性(Jones等，Nature, 321 =522-525,1986 ；Verhoeyen等， Science, 239 :1534-1536,1988 ；Riechmann 等，Nature，332 :323_327，1988)。可以通過本領域技術人員已知的技術(如，例如，文獻Singer等，J. Immun. 150 2844-2857, 1992 ；Mountain 等，Biotechnol. Genet. Eng. Rev. ，10 :1-142, 1992 ； ■ Bebbington等，Bio/Technology, 10 169-175，1992中所述的那些)，來製備根據本發明的人源化抗體或其片段。其他人源化方法是本領域技術人員已知的，例如，Protein Design Lab (PDL)在專利申請 EP0451216、EP0682040、EP0939127、EP0566647 或 US5，530，101，US6, 180，370， US5，585，089 *US5，693，761中所述的「⑶R嫁接」方法。還可以提及以下專利申請 US5, 639，641 ；US6, 054，297 ；US5,886，152 和 US5, 877，293。作為根據本發明方法的另一個方面，單克隆抗體是人抗體。術語「人抗體」包括具有源自人免疫球蛋白序列的一個或多個可變和恆定區的所有抗體。在優選的實施方案中，所有可變和恆定結構域(或區)源自人免疫球蛋白序列(完全人抗體)。換句話說，包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區(如果存在) 的任何抗體，即，其具有對應於通過人產生的抗體的胺基酸序列和/或已經使用本發明技術人員已知的用於製備人抗體的任何技術製得的胺基酸序列。在一個實施方案中，通過雜交瘤產生人單克隆抗體，該雜交瘤包括獲自轉基因非人動物(例如，轉基因鼠)的B細胞，該轉基因非人動物具有包含融合永生細胞的人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。作為這種轉基因鼠的實例，可以提及XEN0M0USE ，其是包含人免疫球蛋白基因座大片段並缺乏鼠抗體生成的工程化鼠株系(Green等，1994，Nature Genetics，7 13-21)。 XEN0M0USE 產生全人抗體的成人樣人庫(r印ertoire)，並且產生抗原特異性人單克隆抗體。第二代 XEN0M0USE 含有大約 80% 的人抗體庫(Green&Jakobovits，1998，J. Exp. Med.， 188 :483-495)。本領域技術人員已知的任何其他技術，如噬菌體展示技術，也可以用於產生根據本發明的人抗體。根據本發明的方法可以用於任何類型的包含鉸鏈區的免疫球蛋白，S卩，IgA、IgD和 IgG0作為實例，對於IgA同種型，IgAl的鉸鏈區包含胺基酸序列 PSTPPTPSPSTPPTPSPS(SEQ ID No. 8)，而 IgA2 的鉸鏈區包含胺基酸序列 PPPPP(SEQ ID No. 9)。在相似的方式中，IgD的鉸鏈區包含胺基酸序列SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQ ID No. 10)。作為本發明的特定實施方案，優選使用IgG，包括，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。對應於IgG鉸鏈區的不同同種型的各自的胺基酸序列為對於IgGl，PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 11)，對於IgG2, RKCCVECPPCP (SEQ ID No. 7)，對於IgG3，LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCP RCP(SEQ ID No. 12)，和對於IgG4，SKYGPPCPSCP (SEQ ID No. 13)。再更特別地，優選使用IgGl。實際上，在治療抗體的領域中，更特別地，在癌症的治療中，優選產生IgGl，以獲得與特異性結合靶向抗原相關的功能以外的效應物功能，如 ADCC 禾口 CDC0本發明方法的特徵在於所述單克隆抗體是IgGl。在本發明的意思內，「目標分子」涉及單克隆抗體能夠特異性結合或調節活性的任何分子。通常，將這樣的目標分子稱為「抗原」。作為單克隆抗體靶向的目標分子的非限制性實例可以提及可溶性配體、受體 (如，跨膜受體)、跨膜腫瘤標記等。在優選的實施方案中，所述目標分子是跨膜受體。表述「跨膜受體」指的是跨過細胞的細胞質膜的蛋白，該蛋白的胞外結構域具有結合配體的能力，而胞內結構域具有在配體結合時可以改變(提高或降低)的活性(如，蛋白激酶)。換句話說，跨膜受體是完整的膜蛋白，典型地其存在於細胞的細胞質膜內，並在其中運作，但也在一些亞細胞區室和細胞器的膜中。在膜一側結合信號分子或有時結合一對這樣的分子時，跨膜受體啟動另一側的應答。以這種方式，它們在細胞交流和信號傳導中起著獨特且重要的作用。許多跨膜受體由兩個或多個蛋白亞基組成，這些亞基共同運行，並且在配體結合、 脫離或在其「激活」循環的另一個階段時，可能分離。通常基於它們的分子結構來歸類，或因為除了一些受體以外對於所有受體結構的任何詳細內容是未知的，基於它們的假設(並且有時候是實驗證實的)膜拓撲學來歸類。預測最簡單的多肽鏈只穿過脂雙層一次，而其他穿過多達七次(稱為G-蛋白偶聯受體或GPCIO或更多次。與任何完整的膜蛋白相似，跨膜受體可以細分成三個部分或結構域，胞外結構域， 跨膜結構域和胞內結構域。胞外結構域是受體伸出細胞或細胞器外側膜的一部分。如果受體的多肽鏈穿過雙層幾次，外部結構域可以包含幾個伸出膜外的「環」根據定義，受體的主要功能是識別並應答特定的配體，例如，神經遞質或激素(儘管特定的受體也應答跨膜勢能的變化)，並且在許多受體中，這些配體結合胞外結構域。在存在結構證據的大部分受體中，跨膜α螺旋構成大部分的跨膜結構域。在特定的受體中，如尼古丁乙醯膽鹼受體中，跨膜結構域形成通過膜的蛋白質線紋的孔，或離子通道。通過結合合適的配體激活胞外結構域時，孔變成離子可接近的，其隨後通過。在其他受體中，認為跨膜結構域在結合時經歷構象變化，這在胞內發揮出作用。在一些受體中，如7ΤΜ 超家族的成員，跨膜結構域可以含有配體結合袋。
受體的胞內(或細胞質)結構域與細胞或細胞器的內部相互作用，轉播信號。對於這種相互作用基本上存在兩種不同途徑，a)通過與效應物蛋白的特定蛋白-蛋白-相互作用的胞內結構域交流，其隨後將信號沿著信號鏈傳送至其終點和b)使用酶相連的受體， 胞內結構域具有酶活性。通常，這是酪氨酸激酶活性。酶活性也可以位於與胞內結構域相關的酶上。對於細胞調節跨膜受體的活性，存在幾種方式。大部分通過胞內結構域來工作。最重要的方式是磷酸化和內在化(參見遍在蛋白)或第二信使級聯如cAMP、IP、Ca2+或cGMP 的激活。具有本發明中所述修飾的抗體還可以靶向顯示出酶活性的所有膜蛋白。作為實例，可以提及，但不限於，基質金屬蛋白酶(MMP)家族，「解整聯蛋白和金屬蛋白酶結構域蛋白酶」(ADAM)家族、腺苷酸環化酶、……具有本發明中所述修飾的抗體還可以靶向作用於離子通道、孔和轉運子的所有膜蛋白。作為實例，可以提及，但不限於，鈉通道家族、鉀通道家族、尼古丁乙醯膽鹼受體家族、 sigma受體、一元胺轉運子家族。更寬泛地，通過抗體處理還可以靶向對於給定疾病鑑定為特異性標記的所有膜蛋白，該抗體也可以通過本發明中所述的修飾來改進。在本發明的優選實施方案中，所述跨膜受體選自酪氨酸激酶受體、四跨膜蛋白和 GPCR0在更優選的實施方案中，所述跨膜受體是酪氨酸激酶受體，其優選選自IGF-1R、 c-Met、RON、AxU VEGF, VEGFR、Her_2neu、ErbB 家族的同型二聚體和異型二聚體，等。在本申請中，更特別地，在以下的說明書中，將根據IMGT來限定序列。已經限定了 IMGT獨特的編號來比較可變結構域，無論哪一種抗原受體、鏈類型或物種[Lefranc M. -P.， Immunology Today 18,509(1997) ；Lefranc Μ.-P.，The Immunologist，7，132-136(1999)； Lefranc, Μ.-P. , Pommie, C, Ruiz, Μ. , Giudicelli, V. , Foulquier, Ε. , Truong, L., Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc，Dev. Comp. Immunol, 27, 55—77 (2003)]。在 IMGT 獨特的編號中，保守胺基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸23 (第一 -CYQ、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水胺基酸89、半胱氨酸104(第二 -CYQ、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或 J-TRP)。IMGT獨特的編號提供了框架區的標準化劃界(FR1-IMGT 位置1至^，FR2_IMGT 39至55，FR3-IMGT 66至104和FR4-IMGT :118至128)和互補決定區的標準化劃界 CDR1-IMGT 27 至 38，CDR2-IMGT 56 至 65 和 CDR3-IMGT :105 至 117。因為缺口表示未佔據的位置，⑶R-IMGT長度(顯示於括號中並由點分開，例如，[8.8.13])成為關鍵信息。將IMGT獨特的編號用於2D繪圖表示中，稱為IMGT Colliers de Perles [Ruiz, Μ.和 Lefranc,Μ. -P. ,Immunogenetics,53,857-883(2002) ；Kaas,Q.禾口 Lefranc,Μ· _Ρ· ,Current Bioinformatics，2，21-3(K2007)]，和用於 IMGT/3D 結構-DB 的 3D 結構中[Kaas，Q. ,Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ. -P.，T cell receptor and MHC structural data(T 細胞受體禾口 MHC 結構數據)，Nucl. Acids. Res.，32，D208-D210 (2004)]。對於本領域技術人員，將根據IMGT系統所述的本發明變換成任何其他編號系統 (例如，Kabat編號系統)是顯而易見的。對於所有物種的所有IG和TR V-REGION的IMTG獨特編碼依賴於可變區結構的高保守性。該編號，在比對超過5000個序列後設定，考慮並結合框架(FR)和互補決定區 (CDR)的限定，來自X-射線衍射研究的結構數據和超變環的表徵。已經限定了 FR-IMGT 和⑶R-IMGT區的邊界。相似地，IMGT獨特的編號已經用於C-D0MAIN，並且使得可以精確地界定Ig-樣結構域。C-DOMAIN對應於完整的C-REGI0N、大部分C-REGION或僅僅一部分 C-REGI0N，這取決於免疫球蛋白(IG)類型。對於C-D0MAIN(IG和TR)的IMGT編號衍生為對於V-D0MAIN的IMGT獨特編號，從對於V-REGION的最初IMGT獨特編號，直至位置104。因此，可以容易地比較C-DOMAIN和 V-DOMAIN之間的胺基酸位置。為了精確地定位鉸鏈區，將C-DOMAIN的IMGT編號用於精確地定位CHl和CH2結構域。鉸鏈區包括IMGT-CHl的最後一個殘基和IMGT-CH2的第一個殘基之間的所有胺基酸殘基。涵蓋相同鉸鏈區的所有其他免疫球蛋白編號方案，如Kabat或A. Honegger，包括在本發明中。作為本發明的優選實例，基於如上所述的IMGT編號系統，IgGl鉸鏈區的胺基酸序列包含殘基Hl至H14，片段Hl至H9對應於上鉸鏈，片段HlO至H14對應於核心鉸鏈。更特別地，人IgGl鉸鏈區包含胺基酸序列PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 11)，鼠IgGl鉸鏈區包含胺基酸序歹丨J PRDCGCKPCICT(SEQ ID No. 14)。表 權利要求
1.一種提高針對特定目標分子的單克隆抗體、或其二價功能片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗體能夠抑制所述目標分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括鉸鏈區重新構建的階段，該階段由通過至少一個胺基酸的刪除、添加或置換來修飾所述鉸鏈區的胺基酸序列組成。
2.如權利要求1的方法，其中所述修飾選自i)所述鉸鏈區胺基酸序列的至少一個胺基酸的刪除；和/或 )將至少一個二硫橋鍵添加至所述鉸鏈區中。
3.如權利要求2的方法，其中修飾i)由所述鉸鏈區胺基酸序列的至多2、3或4個胺基酸的刪除組成。
4.如權利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是二價抗體。
5.如權利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合抗體。
6.如權利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是人源化抗體。
7.如權利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是人抗體。
8.如權利要求1至7之一的方法，其中所述單克隆抗體是IgGl。
9.如權利要求1至8之一的方法，其中所述目標分子是跨膜受體。
10.如權利要求9的方法，其中所述跨膜受體選自酪氨酸激酶受體、四跨膜蛋白和 GPCR0
11.如權利要求1至10之一的方法，其中所述修飾由選自位置!11、!12、!13、!15、!16、!17、 H8、H9、H1UH12或H14胺基酸的至少一個胺基酸的刪除組成。
12.如權利要求1至10之一的方法，其中所述修飾由位於所述鉸鏈區胺基酸序列的位置Hl和H9之間的「上鉸鏈」區中的至少一個胺基酸的刪除組成。
13.如權利要求1至12之一的方法，其中所述修飾由優選位於位置H4的「上鉸鏈」區中的至少一個半胱氨酸的刪除組成。
14.如權利要求1至12之一的方法，其中所述修飾由向「上鉸鏈」區中引入至少一個半胱氨酸組成。
15.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H7的蘇氨酸由半胱氨酸的置換組成。
16.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H6的賴氨酸由半胱氨酸的置換組成。
17.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置Hl的脯氨酸由半胱氨酸的置換組成。
18.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H2的賴氨酸由半胱氨酸的置換組成。
19.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H3的絲氨酸由半胱氨酸的置換組成。
20.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H5的天冬氨酸由半胱氨酸的置換組成。
21.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H8的組氨酸由半胱氨酸的置換組成。
22.如權利要求14的方法，其中所述修飾由「上鉸鏈」區中位置H9的蘇氨酸由半胱氨酸的置換組成。
23.如權利要求1至10的方法，其中希望提高其拮抗活性的所述單克隆抗體是IgGl 時，所述修飾由IgGl鉸鏈區的胺基酸Hl至H14由IgG2鉸鏈區的胺基酸Hl至H14替代組成。
24.一種篩選針對特定目標分子的拮抗劑單克隆抗體、或其二價功能性片段或衍生物的方法，所述抗體能夠抑制所述目標分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括步驟(a)選擇具有所述目標分子的所述一種或多種生物活性的抑制的初始水平的初始抗體，(b)通過權利要求1至23之一的方法修飾所述初始抗體鉸鏈區的胺基酸序列，(c)評價步驟(b)的修飾抗體抑制所述目標分子的所述一種或多種生物活性的能力，禾口(d)選擇作為陽性結果的步驟(c)的抗體，其具有高於所述抑制初始水平的所述目標分子的所述一種或多種生物活性的抑制水平。
25.一種通過權利要求1至M之一的方法獲得的針對特定目標分子的單克隆抗體，或其二價功能性片段或衍生物，其特徵在於包含選自以下的鉸鏈區胺基酸序列SEQ ID No. 1(PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2(PKSCGCKPCICT)，SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP)，SEQ ID No. 4(PRDCGCKPCPPCP)，SEQ ID No. 5(PRDCGCHTCPPCP)，SEQ ID No. 6(PKSCDCHCPPCP)，SEQ ID No. 7(RKCCVECPPCP)，SEQ ID No. 22(CKSCDKTHTCPPCP)， SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP) , SEQ ID No· 28 (PKSCDKTCTCPPCP)， SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP) , SEQ ID No. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ ID No.31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No.32(PKSCDKTHTCPPCC), SEQ ID No. 33(PSCDKTHTCPPCP)，SEQ ID N ο. 34(PKSCDTHTCPPCP)，SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP)， SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP) , SEQ ID No.38 (PKSCDTHCPPCP)，SEQ ID No. 39(PKSCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 40(PKSCDKTTCPCP)， SEQ ID No.41(PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No.42(PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43(PKSCDCTHCPPCP)，SEQ ID No. 44(PCSCKHTCPPCP)，SEQ ID No. 45(PSCCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 46(PSCDKHCCPPCP)，SEQ ID No. 47(PKSTHTCPPCP)，SEQ ID No. 48(PKSCTCPPCP)或 SEQ ID No. 49(PKSCDKCVECPPCP)。
26.一種單克隆抗體，其特徵在於包含選自以下的胺基酸序列SEQ ID No.1(PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2(PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3(PKSCGCKPCICP), SEQ ID No. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP) , SEQ ID No. 6(PKSCDCHCPPCP)，SEQ ID No. 7(RKCCVECPPCP)，SEQ ID No. 22(CKSCDKTHTCPPCP)， SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP) , SEQ ID No· 28 (PKSCDKTCTCPPCP)，SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP) , SEQ ID No· 30 (PKSCDKTHTCCPCP)， SEQ ID No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP) , SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCC) , SEQ ID No.33 (PSCDKTHTCPPCP)，SEQ ID No. 34(PKSCDTHTCPPCP)，SEQ ID No.35 (PKSCDKTHCPPCP)， SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP) , SEQ ID No.38 (PKSCDTHCPPCP)，SEQ ID No. 39(PKSCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 40(PKSCDKTTCPCP)， SEQ ID No.41 (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43(PKSCDCTHCPPCP)，SEQ ID No. 44(PCSCKHTCPPCP)，SEQ ID No. 45(PSCCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 46(PSCDKHCCPPCP)，SEQ ID No. 47(PKSTHTCPPCP)，SEQ ID No. 48(PKSCTCPPCP)或 SEQ ID No. 49(PKSCDKCVECPPCP)。
27.如權利要求25和沈之一的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體。
28.如權利要求25至27之一的單克隆抗體，其中所述抗體是IgGl抗體。
29.一種分離核酸，其編碼權利要求25至觀的單克隆抗體。
30.如權利要求四的分離核酸，其中所述核酸包含選自SEQID No. 15至SEQ ID No. 21 和SEQ ID No. 50至SEQ ID No. 77的核酸序列。
全文摘要
本發明公開內容涉及抗體工程化領域，並且更特別地，涉及篩選抗體和/或調節抗體激動/拮抗活性的方法。更特別地，本發明公開內容涉及提高針對特定目標分子的單克隆抗體，或其二價功能片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗體能夠抑制所述目標分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括鉸鏈區重新構建的階段，該階段由通過至少一個胺基酸的刪除、添加或置換來修飾所述鉸鏈區的胺基酸序列組成。本發明公開內容還涉及用於這種調節方法的多肽和所獲得的抗體。
文檔編號C07K16/00GK102232086SQ200980148318
公開日2011年11月2日 申請日期2009年12月2日 優先權日2008年12月2日
發明者L·格奇, T·沃琴 申請人:皮埃爾法布雷醫藥公司