水稻木質素合成基因fc1及應用的製作方法

2023-09-19 18:21:35

專利名稱：：水稻木質素合成基因fc1及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物生物
技術領域：
。具體涉及一種水稻木質素合成基因FC1，同時還涉及該基因在水稻中的應用。利用T-DNA標籤(T-DNAtagging)技術從水稻軟稈突變體中克隆並鑑定了水稻木質素合成基因FC1(flexibleculm)，該基因的失活造成植物莖杆強度的降低，出現易倒伏的性狀。通過共分離檢測表明T-DNA插入失活的基因與軟稈突變表型是共分離的。對該基因編碼的胺基酸序列分析證明該基因所編碼的蛋白是一個肉桂醛脫氫酶(Cinnamyl-alcoholdehydrogenase，CAD)，這個酶在植物木質素的合成過程中起重要的作用。形態學觀察和細胞學觀察進一步證明，本發明克隆的基因具有調控植物細胞壁的厚度和植株莖稈的支撐力的功能。利用該基因可以提高農作物的抗倒伏能力，提高水稻秸稈的利用率。
背景技術：
：植株莖稈的強度是植物，尤其是農作物的重要農藝性狀之一。而莖稈的強度又與莖稈組織中相關細胞的細胞壁厚度直接相關。細胞壁的主要成分包括果膠質、纖維素、半纖維素、木質素、多糖以及含羥脯氨酸的糖蛋白。植物細胞壁可以分為中膠層(胞間層)、初生壁和次生壁。中膠層粘合相鄰的細胞，主要由果膠質構成。初生壁是最先形成的細胞壁，正在生長的細胞主要以初生壁保護和支撐它的原生質體。次生壁是在細胞生長完成後沉積而成的，它能增強細胞的強度，是莖杆強度的主要決定成分。次生壁主要由木質素填充，其機械強度較高。木質素是包圍在纖維組織細胞和厚壁組織細胞外的一類物質。它與纖維素和半纖維素合稱為組成植物的「三素」。在木本植物中它的含量佔大約27％-32％，草本植物中大約佔14％-25％。木質素在植物中的功能主要有以下幾個方面1)增加細胞壁的機械強度和防水性。植物在木質化時，木質素不僅可以以共價鍵的方式與細胞壁中的半纖維素相接，還可以同樣的方式和細胞壁蛋白相連，從而增加了細胞壁的強度和緻密度；2)促進水分的運輸。由於有木質素的參與植物細胞經分化才能形成正常的微管系統，才能產生堅實的細胞壁，才能在有壓力的情況下遠距離輸送水份；3)在植物防禦體系中發揮重要作用。木質素保護了細胞內其他重要的成份，以免受到物理的、化學的和生物的破壞。同時木質素的低分子量酚類前體以及多聚作用時產生的游離自由基可以破壞細菌的膜、酶和毒素，可以作為植物防衛反應的物質來起作用(付偉等，植物體內的木質素，生物學通報，2004，3912-14)。在木質素的合成過程中，很多酶參與了該生化途徑。木質素是由香豆醇、松柏醇和介子醇等三種主要的木質醇(monolignol)以多種不同的化學鍵連接而成的。木質素前體(木質醇)的生物合成是從苯丙氨酸開始的。苯丙氨酸通過苯丙氨酸裂解酶脫氨(phenylalanineammonia-lyase，PAL)生成肉桂酸，這是苯基丙烷類物質代謝的第一步，PAL是生物合成苯基丙烷類類化合物的一種關鍵酶。肉桂酸被4-羥化酶(C4H)羥基化後形成對香豆酸。對香豆酸在4-香豆醯輔酶A連接酶(4-Coumsrate-CoALigase，4CL)的作用下可轉化為對香豆醯輔酶A。這種化合物是合成類黃酮、1，2-二苯乙烯和其他苯基丙烷類物質(包括木質素)的前體。對香豆酸在肉桂酸-3羥化酶(cinnamate3-hdroxylase，C3H)的作用下，3位被羥基化生成咖啡酸，該羥基基團在O-甲基轉移酶(caffeateO-methyltransferase，COMT)的作用下可進一步被甲基化生成阿魏酸。阿魏酸在阿魏酸5-羥化酶(ferulate5-hydroxylase，F5H)的作用下被羥基化形成5-羥基阿魏酸，5-羥基阿魏酸中5位的羥基被COMT甲基化後形成芥子酸。羥基肉桂酸可被合成位相應的輔酶A硫酯。CoA硫酯在肉桂醯輔酶A還原酶的催化作用下被還原為相應的醛。這些醛與肉桂醛脫氫酶(Cinnamyl-alcoholdehydrogenase，CAD)反應被進一步還原形成木質醇，木質醇就是木質素的直接前體物質。肉桂醛脫氫酶(CAD)在植物木質素的合成過程中起很重要的作用，它催化木質素前體-木質醇生物合成的最後一步，同時在植物抵抗真菌浸染中也起重要的作用。植物一般通過產生各種酚類物質來抵抗由於機械、化學以及病原誘導的損傷，這些酚類物質也包括通過各種生化反應從肉桂酸中得到的木質素合成的前體物質。因此這些木質素合成的前體物質很自然的就被植物用來合成酚類大分子，這些酚類大分子通過產生一個疏水的物理屏障來抵禦病原入侵和增強損傷組織的機械強度(Vance等，Lignificationasamechanismofdiseaseresistance.AnnuRevPhytopathol.1980，18259-288)。由於木質素在植物細胞壁的結構和修復機制上起很重要的作用，因此人們希望通過基因工程的方法改善木質素的含量。例如，在造紙業製漿過程中通過化學的方法除去紙漿中的木質素的過程是很昂貴的，而且會對環境產生嚴重的汙染，因此對植物木質素的含量的改善可以使造紙工業受益很多(Boudet等，Ligningeneticengineering.MolBreeding.1996，225-39；Campbell等，VariationinLigninContentandComposition(MechanismsofControlandImplicationsfortheGeneticImprovementofPlants).PlantPhysiol.1996，1103-13)。再例如，在大豆種子的儲存過程中，木質素單體通常會被多酚氧化酶氧化，從而使大豆和豆製品中混入比較難看的黃色。而這個現象也許就可以通過降低CAD酶的活性得到解決。通過調節植物體中CAD酶的含量來改變植物體內木質素的含量，已經進行了很多有益的嘗試。例如在菸草中進行CAD的反義表達，雖然沒有使木質素含量減少，但卻可導致木質素中結合的肉桂醛的量增加(Halpin等，Manipulationofligninqualitybydown-regulationofcinnamyylalcohol-dehydrogenase.PlantJ.1994，6，339-350.)，並使這些轉基因植物的木質部呈紅色，而且其中的木質素在溫和的鹼性條件下很容易被提取。分光光度分析表明，來自CAD缺乏菸草中木質素的縮合程度降低，即交聯部位較少(Stewart等，Fourier-transforminfraredandRamanspectroscopicevidencefortheincorporationofcinnamaldehydesintotheligninoftransgenictobacco(NicotianatabacumL)plantswithreducedexpressionofcinnamylalcoholdehydrogenase，Planta，1997，201，311-318.)，這對提高植物組織的消化性有很大的作用(Vailhe等，Cellwalldegradabilityoftransgenictobaccostemsinrelationtotheirchemicalextractionandligninquality，J.Agric.FoodChem.1996，44，1164-1169.)。也有研究表明下調紫花苜蓿CAD可以導致木質素組成發生相似的變化，消化性提高。這裡所描述的肉桂醛脫氫酶基因屬於一個基因家族，因此通過同源序列可以找到來源不同物種的肉桂醛脫氫酶基因。現在人們對在木質素合成過程中起作用的基因有很大的興趣，因為這些基因可能可以用來控制木質素的合成。因此，找到編碼在木質素合成中起作用的酶的核苷酸序列，對研究木質素的合成是很重要的，同時這也提供了一種利用遺傳學的手段來研究木質素的合成以及控制細胞壁結構的機制，而且還可以更好地理解植物自身防禦和修復損傷的機制。水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一，是全球近一半人口賴以生存的基本食糧，在我國有很大的種植面積。FC1基因的克隆為我們利用基因工程技術調控植物的抗逆能力，提高水稻秸稈的利用效率方面有很大的作用。同時在相關領域，如林業、造紙方面也會起到很多積極的作用。
發明內容本發明的目的在於提供一種水稻木質素合成基因FC1，有效地提高了水稻的抗倒伏能力，提高了水稻秸稈的利用效率。本發明提供了FC1基因的核苷酸序列和胺基酸序列，包括SEQIDNO1所示的DNA序列，也包括與SEQIDNO1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的突變體等位基因或衍生物，還含具有相同功能並能達到本發明目的的基因序列。本發明中的SEQIDNO2所示的蛋白質屬於肉桂醛脫氫酶，其中進行一個或幾個胺基酸的替換、插入或缺失胺基酸可以獲得功能類似物。該基因的失活可以導致植物莖杆強度的降低，出現易倒伏的性狀。該基因為調節植物莖杆的機械強度、提高禾本科植物的秸稈利用率提供了一個有用的技術途徑。本發明還涉及一種水稻木質素合成基因FC1在調節水稻莖杆強度中的應用，這種調節的方法可以是通過提高或者是降低FC1的表達。本發明還提供了一種用FC1基因進行高效植物遺傳轉化的方法。具體地說，本發明提供了一種含有SEQIDNO1所示序列的基因或該基因的部分類似功能片段的載體，其中pCFC1，該載體可以表達由上述核酸序列編碼的多肽或同源類似物。本發明還提供了一種含有以上表達載體的宿主細胞，宿主細胞包括大腸桿菌、農桿菌和植物細胞。將本發明所描述的基因失活可以得到莖杆軟化的水稻，可以降低其中的木質素含量，而且可以提高秸稈利用率，此方法切實可行。具體應用可以使用T-DNA插入的方法，或者使用其他使基因失活的方法，如基因敲除等。為了實現上述目的，本發明採用了以下技術措施本發明是使用T-DNA標籤的技術進行基因的分離和克隆。使用根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的遺傳轉化(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ.1994，6271-282)得到了大量的有T-DNA插入標籤的水稻粳稻品種中花11號株系，轉化使用的載體是pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35418-27.)，本文所述的突變體就是在這個突變體庫中通過篩選得到的。篩選方法如下所述，T-DNA轉化植株當代為T0代，由T0代種子經過浸種、催芽後得到T1代植株，將此T1植株按5寸×8寸的間距種植於水稻田，按常規的水稻種植方法(王維金等，作物栽培學，1998，76-127)進行田間管理。通過觀察篩選得到了表型穩定的水稻軟稈突變體，將此突變體命名為fc1，該突變體與正常植株相比莖杆、葉片機械強度降低，植株略矮，並且容易倒伏，如圖1所示。遺傳學實驗表明fc1是一個符合單基因控制遺傳規律的隱性突變體。採用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)(Liu等，ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics1995，25，674-681.)的方法分離得到了這個株系的側翼序列，進行序列分析表明該株系的T-DNA插入在水稻第4染色體上，插入位點所在片斷在公共核苷酸資料庫GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陸號為AL731610.4，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AL731610.4的部分核苷酸片斷。通過序列分析發現，這個T-DNA的插入造成了一個木質素合成基因肉桂醛脫氫酶(CAD)基因內。根據分離得到的側翼序列在基因組中設計引物，所設計的引物位於T-DNA插入位點兩側，通過PCR(polymerasechainreaction)檢測驗證了這個T-DNA序列的插入和突變表型是共分離的，從而確定了就是這個基因的失活造成了這種突變表型的出現。本發明的優點有FC1基因具有影響植物莖稈機械強度的功能，因此它的發現使得應用基因工程技術調控植物莖稈的支撐力、葉片、葉鞘細胞壁的厚度成為可能，而且對調控植物的抗逆能力，提高水稻秸稈的利用效率方面有很大的作用。同時在相關領域，如林業、造紙方面也會起到很多積極的作用。圖1.水稻軟稈突變體fc1的表型圖。左邊是野生型，右邊是突變體。圖2.插入基因的結構和T-DNA插入位點分析圖。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)已經標出，黑色方框表示FC1基因的編碼區，白色方框表示了5』非翻譯區和3』非翻譯區。方框之間的線條表示內含子，T-DNA插入在第一個內含子內。a，b，c分別表示用來驗證共分離的引物。圖3.檢測基因型的結構示意圖。a表示在T-DNA插入位點上遊設計的引物，b表示在插入位點T-DNA下遊設計的引物，c表示根據T-DNA末端序列設計的引物。在T1代植株中，若為T-DNA插入位點純合單株，由於T-DNA片段為10Kb以上，因此a與b配對的PCR擴增為陰性，但a和c配對可以擴增得到一個0.8Kb的產物。若擴增位點為沒有T-DNA的插入的野生型單株，由於沒有c引物結合的位點，則只有a和b配對是可以得到一個1.0kb的產物。而對於T-DNA插入位點雜合單株，則在a和c配對以及a和b配對時都可以擴增得到產物。圖4.20株T1代植株的PCR檢測T-DNA插入位點基因型結果圖。根據PCR擴增結果，判斷1、3、7、8、13、16是T-DNA插入位點純合單株，2、4、6、9、10、12、14、18、19、20是T-DNA插入位點雜合單株，5、11、15、17是野生型單株。圖5.突變體的形態與結構特性圖。fc1突變體和野生型的株高和含水量測定。圖5a株高測定，突變體與對照相比矮化大約30釐米。圖5b含水量測定，突變體的含水量和野生型相比提高8.6％。圖6.fc1突變體與野生型木質素染色結果圖，使用間苯三酚染色，顯微鏡下放大400倍觀察結果。圖6a.突變體莖杆橫切，圖6b.野生型莖杆橫切，圖6c.突變體葉片橫切，圖6d.野生型葉片橫切。圖7.fc1突變體與野生型莖杆機械強度測定結果圖，突變體莖杆第一節間的平均折斷力為22N，野生型莖杆第一節間的平均折斷力為105N。圖8.互補試驗使用的載體pCFC1示意圖。使用限制性內切酶HindIII從BAC克隆OSJNBa0022K06上切下一個8.8kb的核酸片段，這個核酸片段包含完整的FC1基因ORF區。具體實施例方式實施例11、水稻材料水稻(Oryzasativa)T-DNA插入突變體fc1(flexibleculm)來自原始野生型材料為「中花11」粳稻品種。此突變體的獲得是通過農桿菌介導的遺傳轉化得到了大量的有T-DNA插入標籤的中花11號株系，轉化使用的載體是pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35(3)418-27)，本文所述的突變體就是在這個突變體庫中通過篩選得到的。篩選方法如下所述，轉化植株當代為T0代，T0代植株種子經過浸種、催芽後得到T1代植株，將此T1植株5寸×8寸的間距種植於水稻田，按常規的水稻種植方法進行田間管理。通過篩選得到了表型穩定的水稻軟稈突變體(fc1)，該突變體與正常植株相比莖杆、葉片機械強度降低，植株變矮，並且容易倒伏。2、T-DNA插入側翼序列的分離使用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)的方法分離得到了這個突變體的T-DNA側翼序列。具體操作步驟如下取fc1突變體幼嫩的葉片，使用CTAB法(Liu等，Agenome-widearnalysisofwidecompatibilityinriceandpreciselocationofs5locusinthemolecularmap.TAG，1997，95809-814)抽提其總DNA，然後進行PCR反應。根據轉化載體pFX-E24.2-R15的T-DNA左側末端設計的嵌套式特異引物序列和引物在載體上對應的位置如下(後面的數字表示引物在載體上的位置)LSP25』-GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC-3』6701-6677；LBT25』-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3』6550-6524；LBT35』-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3』6447-6420。用於分離側翼序列的簡併引物及其序列為AD2a5』-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3』。反應體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP2.0μl；25mMMgCl22.0μl；10μMLSP20.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP2.0μl；25mMMgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μMLBT20.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2MmdNTP1.5μl；25MmMgCl21.2μl；50％甘油2.0μl；10μMLBT30.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；加ddH2O至20μl。反應程序按照Liu的方法進行(Liu等，ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics1995，25，674-681.)。反應完成後，取第三輪反應產物5μl在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。挑出有有效擴增的剩餘產物5μl用去磷酸化酶(SAP，Takara公司)和核酸外切酶(ExoI，NEB公司)消化，消化產物取2μl使用美國PerkinElmer公司的測序試劑盒(BigDyeKit)進行測序反應，反應產物使用DNA自動測序儀進行序列測定(ABI377Sequencher)，測序引物序列和在載體上的位置為NTLB55』-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3』6437-6418，具體操作按操作手冊進行(PE公司)。得到序列後，採用BLAST分析方法(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)將這條側翼序列與公共核苷酸資料庫GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色體位置的水稻基因組序列進行比較分析，定位結果發現這條側翼序列定位於水稻4號染色體，位於GenBank中的登陸號為AL731610.4的克隆中，插入位點是87249，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AL731610.4的部分核苷酸片斷，通過序列分析發現，這個T-DNA的插入造成了一個木質素合成基因肉桂醛脫氫酶(CAD)基因的失活。分離得到的側翼序列如下tacgtgccattccgaatcaaagcgagccgcaatgtgtattagagttgtctaagcgtcatatggggtttacaccacattactagcattttactgagccttaaccttttagcagaactgcagtggttattacttcagcattgagagttcagactctcaagtacacaagaagagagagcctaaacaccttgcttcacctcccaagattttaactaagccatgaactggtagaactgaaatttttcttttattttgctttccctttggttctccattatgactagcaaaaacaccgtatccagcagggccatcagggtacatttgcttacgctgatgaggtggagcgtatgccatgccattgggtgctagttgtgacgttccgtttggcattacaaaaatacctgctggcactgggcaaatagcgtgaatgctggattgcttggaatagttatgaacaggccactggaggcaacatattatggagagaaaccatggtcgatattggcaacgccgttttggataatggcaaattcatgctgggggtacttttggggggcactggggtgctcgagttgttgctgttaacagaaatgtgtctta3、T-DNA插入側翼序列與突變表型的共分離檢測。為了研究T-DNA的遺傳分離，將T-DNA標記的水稻T1代植株進行田間種植，並且進行了基因型的檢測。從總共20株T1代的幼嫩葉中提取的基因組DNA(CTAB法)用作基因型分析，以確定它們為純合或雜合體。PCR反應條件先94℃3分鐘變性，然後94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘，總共進行35個循環，最後72℃7分鐘延伸。下述引物a、b和c用於PCR反應。引物a(FC1基因特異性基因組正向引物)5』-GCGACCATTCTGGCTGTGAT-3』引物b(FC1基因特異性基因組反向引物)5』-AACCTGAAACGGCGGTAGTG-3』引物c(T-DNA邊緣特異性反向引物)5』-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3』如圖2的示意圖所示，引物a是來源於FC1基因內含子的正向引物，引物b是來源於FC1基因內含子的反向引物。引物c是來源於T-DNA邊界區域的反向引物。T1代純合植株只有引物a和c組合可以得到一個0.8kb的PCR片段，這是因為通過引物a和b組合擴增由於片段太大而不能擴增DNA片段(14.3kb)(圖3)。野生型植株由於在基因組中沒有T-DNA插入，因此能夠利用引物a和b的組合來得到一個1.0kb的PCR片段，而不能有引物a和c組合的PCR片段。雜合的T1代植物則可以分別通過ac和ab的組合來得到0.8kb和1.0kb的PCR擴增物。實驗結果如圖4所示。在基因型的檢測中發現，泳道1、3、7、8、13、16是T-DNA插入位點純合基因型單株，而泳道2、4、6、9、10、12、14、18、19、20為T-DNA插入位點雜合基因型單株，5、11、15、17為該位點不含T-DNA插入的野生型單株。在進行田間種植時發現，T-DNA插入位點純合單株，也就是1、3、7、8、13、16這幾個單株在田間出現了半矮、易倒伏的田間表型，而其他的植株都表現出正常的表型。這個結果證明T-DNA插入與突變表型共分離，而且突變體是由於這個T-DNA插入造成的單位點隱性突變。將T1代植株的子代種植得到T2代，將T2代再次種植到田間進行表型與T-DNA共分離的分析，分析發現T1代T-DNA插入位點純合突變體的子代(T2代)不再分離，表型一致，T1代T-DNA插入位點雜合突變體的子代(T2代)出現了正常植株和突變植株，正常植株和突變植株的比例是3∶1，使用同樣的方法進行PCR檢測，檢測結果表明T-DNA的插入與突變表型仍然是共分離的。由此確證，這個突變體是由於這個T-DNA插入造成的單位點隱性突變。4、對fc1突變體的表型分析。在正常田間種植條件下，fc1突變體與野生型相比，株型略矮，葉片與莖杆的機械強度也降低了(圖1)。在水稻成熟期對株高進行測定，發現突變體比野生型矮約30釐米。對突變體和對照的含水量進行測定發現，突變體的含水量和野生型相比提高8.6％(圖5)。含水量的具體測定方法如下將突變體和對照於正常田間條件進行種植，待生長到成熟期，取突變體和對照的莖杆活體秤其鮮重M1，然後把莖杆放於烘箱中於80℃烘至衡重，然後再秤其乾重M2，(M1-M2)/M1則為植株的含水量。通過對突變體和野生型植株的組織切片表明，和野生型相比，在突變體的外皮層厚壁組織細胞中，木質素的含量出現了顯著的降低，而且厚壁組織細胞的加厚不如野生型那樣多，因此導致突變體的莖杆機械強度比野生型有顯著的降低。在葉片中也出現了類似的情況，突變體的木質素著色較少(圖6)，使突變體的葉片比野生型明顯要軟。染色方法使用間苯三酚進行木質素染色，間苯三酚主要對木質素中的醛類物質特異性染色，反應中染色的深淺一般定性地反映木質化部位的木質素總含量。具體操作如下，取突變體和野生型植株的第二節的節間，使用FAA固定液固定24小時，然後對固定的組織進行徒手切片，得到大約20μm厚的切片，將切片使用2％的間苯三酚溶液染色2分鐘，然後在玻片上加入一滴濃鹽酸進行顯色1分鐘，然後於光學顯微鏡(Olympus，Japan)下放大400倍進行觀察。使用微力材料試驗機(Instron5848MicroforceTester)對突變體和對照的機械強度進行了測定，測定時分別取突變體和對照的主莖的第一節，從第一節上截取5cm長的一段，使用微力材料試驗機的夾具夾住材料的兩端，然後進行拉伸，讀取將試驗材料拉斷所需要的力。測定結果發現，突變體的莖杆機械強度與對照相比有很顯著的降低(圖7)。5、基因的分析。根據BLAST(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)分析結果，發現FC1基因編碼的蛋白質與肉桂醛脫氫酶(CAD)有60％同源性。將這個基因的序列在日本全長cDNA文庫(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中進行搜索，找到了這個基因的全長cDNA，克隆編號是AK102452，這個全長cDNA有1329bp，功能預測是一個肉桂醛脫氫酶(CAD)基因。這個全長cDNA的序列如下GGCATAGACCTAGCCAGCTAGCAACCGACAAGCCAAGGCGACGGCAATGGCGCCGACGACGACGGCCACGGCGGCGGCGGAGCAGGCGCCGCCGCCGCAGCATACGAGGAAGGCGGTGGGGCTCGCCGCGCACGACGACTCCGGCCACCTCACACCCATCCGCATCTCGCGCAGGAAAACTGGAGATGACGACGTCGCTATAAAGGTGCTGTACTGTGGGATTTGTCACTCTGACCTGCACACCATCAAGAATGAGTGGAGAAACGCTGTCTACCCAGTTGTTGCAGGGCACGAGATCACCGGGGTGGTGACCGAGGTGGGGAAGAACGTGGCGAGGTTCAAGGCCGGCGACGAGGTCGGCGTCGGGTGCATCGTGAACACCTGCGGCGGCTGCGAGAGCTGCCGGGACGGCTGCGAGAACTACTGCTCCGGCGGGGTCGTCTTCACCTACAACTCCGTCGACCGGGACGGCACGCGCACCTACGGCGGCTACTCCGACGCGGTGGTCGTCAGCCAGCGCTTCGTCGTGCGCTTCCCCTCCTCCGCCGGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCTGCCGCTGGACAGCGGCGCGCCGCTGCTGTGCGCCGGGGTGACGGTGTACGCGCCGATGAGGCAGCATGGGCTGTGCGAGGCCGGGAAGCACGTCGGCGTGGTGGGGCTCGGCGGGCTCGGCCACGTCGCCGTCAAGTTCGCCAGGGCGTTCGGGATGAGGGTGACGGTGATCAGCACGTCGCCGGTGAAGAGGCAGGAGGCCCTGGAGAGGCTCGGCGCCGACGGCTTCATCGTCAGCACCAACGCCAGTGAGATGAAGGCTGCGATGGGCACCATGCATGGCATCATCAACACGGCCTCTGCAAGCACATCCATGCACTCTTACCTGGCACTCTTGAAGCCCAAGGGCAAGATGATCTTGGTTGGCCTGCCTGAGAAGCCTCTCCAGATCCCAACCTTCGCTTTGGTTGGAGGGGGCAAGATACTAGCTGGGAGCTGCATGGGGAGCATCAGTGAAACGCAGGAGATGATCGACTTCGCCGCCGAGCACGGGGTGGCCGCCGACATCGAGCTGATCGGCGCCGACGAGGTGAACACGGCCATGGAGCGCCTCGCCAAGGGCGACGTCAGGTACCGCTTCGTCGTCGACATCGGCAACACCCTCAGGTCGGATTGACTAGGGAGCTCACTGTCACTGGTCTCAGCTCTGTAGCATACCGGACCTGCAATCCTGCAAAGTAGTGCAATCTTCTTGCTACAAGACATACATATCACCTCTACTTGGTGTCAATAAATGTAGCAAAAGAGGTACATTGTTGT實施例2轉化植物(水稻為例)提取日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06質粒5μg，使用限制性內切酶HindIII(Takara公司)完全消化質粒，將酶切產物使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳(40V，10小時)，挖取8.8kb的DNA片斷回收。取回收產物100ng，與經過限制性內切酶HindIII(Takara公司)消化過的雙元載體pCABIA2301(http://www.cambia.org)50ng使用T4DNA連接酶(NEB公司)於16℃進行連接反應，pCAMBIA2301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoIntemationalAgriculture)惠贈。反應進行16小時後，取連接產物2μl電轉化大腸桿菌(E.Coli)感受態細胞DH10B(購自美國Invitrogen公司)，轉化產物進行蘭白斑篩選。挑取白色轉化子，使用FC1基因特異的引物a和b組合進行PCR陽性克隆的篩選，PCR反應條件先94℃5分鐘變性，然後94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘，總共進行35個循環，最後72℃7分鐘延伸。獲得了用於轉化的質粒pCFC1(圖7)，這個核酸片段包含完整的FC1基因ORF區，將這個質粒20ng通過電擊的方法轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，使用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化fc1突變體(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ，1994，6271-282)的愈傷組織，同時將不含FC1基因的空載體轉化FC1突變體愈傷組織，得到的轉基因植株作為對照。本發明共獲得獨立的轉FC1基因水稻植株60株，PCR檢測陽性植株為51株，轉空載體的轉基因植株32株。結果轉空載體的轉基因植株全部表現為軟杆，而陽性的轉FC1基因水稻植株有41株表型恢復了正常，而陰性的轉FC1基因水稻植株仍然表現為軟杆，部分轉基因莖杆機械強度測定的結果見表2。由此可見，通過基因互補轉化，FC1基因使FC1突變體的軟杆表型得到了恢復，更進一步的證明了FC1基因具有控制水稻莖杆強度的功能。農桿菌介導的遺傳轉化步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青黴素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；G418(卡拉黴素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞碸)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)組織培養的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然後20-25℃下定容至1000ml。2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g20-25℃下下溶解並定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加/入300ml蒸餾水並加熱至70℃，然後加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解後混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存備用。4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存備用。5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g20-25℃下溶解並定容至1000ml。6)MSmix母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g20-25℃下溶解並定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，20-25℃下保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，20-25℃下保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌後4℃保存備用。12)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內，4℃保存備用。13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，20-25℃下保存備用。14)KT貯存液(1mg/ml)KT100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃下保存。(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。4)共培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養基N6max母液(10X)5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調節pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調節pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。7)預分化培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。8)分化培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養基(LB培養基不含瓊脂粉)蛋白腖2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝於500ml三角瓶，滅菌後20-25℃保存備用。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟4.1愈傷誘導(1)將成熟的水稻種子去殼，然後依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)置於黑暗處培養4周，溫度24-26℃。4.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度24-26℃。4.3預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養2周，溫度24-26℃。4.4農桿菌培養(1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基上預培養農桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28℃搖床上培養2-3小時。4.5農桿菌侵染(1)將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內；(2)調節農桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20℃。4.6愈傷洗滌和選擇培養(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青黴素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；(4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇2-3次，每次2周。(G418篩選濃度為50μm)4.7分化(1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7周；(2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養(20001x)，溫度26℃。4.8生根(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化時產生的根；(2)然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26℃。4.9移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。表1.FC1突變體和對照莖杆強度的測定結果p＝0.00091，t＝8.8247，t0.05＝4.6041，平均值＝樣品平均折斷力±標準偏差表2.T0代轉基因植株莖杆強度測定結果注MpC1-1到MpC1-10這10株是使用PC1301空載體轉化突變體愈傷所得到的植株，MpCFC1-1到MpCFC1-20這20株是使用互補載體pCFC1轉化突變體愈傷所得到的植株，*表示沒有數據。SEQ.IDNo.1110華中農業大學120水稻木質素合成基因FC1及用途1301401411602170PatentInversion3.121012114106212DNA213Oryzasativa220221CDS222(47)..(174)223220221CDS222(1696)..(1809)223220221CDS222(2371)..(2911)223220221CDS222(3506)..(3659)223220221CDS222(3761)..(3960)2234001ggcataaacctagccagctagcaaccgacaagccaaggcgacggcaatggcgccg55MetAlaPro1acgacgacggccacggcggcggcggagcaggcgccgccgccgcagcat103ThrThrThrAlaThrAlaAlaAlaGluGlnAlaProProProGlnHis51015acgaggaaggcggtggggctcgccgcgcacgacgactccggccacctc151ThrArgLysAlaValGlyLeuAlaAlaHisAspAspSerGlyHisLeu20253035acacccatccgcatctcgcgcaggtatgaacagccaaccgtataccgctccat204ThrProIleArgIleSerArgArg40gctaagaggatctttgtcgtgctcgatgattgctcgatgattctcccgcgccatggcgcc264attgatgggagattgggagacatatggagcttttttttttctctccagagtttaagatga324tctatcgtgtttgaatttgactgttactctcgtagcaacaatagtttacaggatgtccac384atcgaattagtgaaaatcgccgtttggttcatggagttaatagaatctgaagctctcatg444agccagcgtcacttgagctttcgatttttgttttccccttccatttccagtcatttccag504ccttctcatcggatttgtagattgtagttttgcatttgatttccctgcgagcaacggtgc564tcagcatttgcacatcgaatttcggtcatccatgtgcaaaggaagcaaaattcaccactt624tttgaaactgttcttttttaaaaatcttttagagaagtgtatttattacctggcctcgtt684caaccggatatatgcagccatttaaattggttctgaaactgttcttgatcaaatggagta744tctcaaccaagccctttcgtgccaaatcaacaaacaacagcaaaatctttccccagacgt804ctacagtacaaaaaccctgaccatccagcaccagccagcgctggctcactgacctgcagc864aaccagctttaaaaaccatgcgcatttgcagcacgtattctgtaccaggaatacgggatc924cgtcagatctcaactgcaaggcaccctttcttcaattgtttttggtggtgagttaatact984gttcaacagtgaccatactgggcatgcctcagctgcaagaatttatggtgctcgatcgct1044actacgtcatccatcttcttttcatgtgcgaccattctggctgtgattggctggctgctg1104ctgtcaaagtaacaggagtgatttactttcacagtctggttgtatggtacataattcagt1164tatccttctggaatctgaactcctcctggcttagtcatagcagtaaaaatgttcattcaa1224gaaacaggctttcaagcagtaggcggcttgctgcacatggcttgtttttgttaccagttt1284ttttgtcgagcctatgtgaattttcacaagtttacagccatctgtgtgatggtaaattga1344ggatcttgctgtatgccaattcacttgctagtgttgtaagcatgcatcttctttcagctt1404cagcagttcaaggctgttgatttgatggtactgaattagttccctgaaatacttcagata1464aagtaaaagggaaagcaaaataaaagaaaaatttcagttctaccagttcatggcttagtt1524aaaatcttgggaggtgaagcatggtgtttaggctctctcttcttgtgtacttgagagtct1584gaactctcaatgctgaagtaataaccactgcagttctgctaaaaggttattggctcagta1644gagaaatagtatatgtttctgacttgtgttctatatattgccatttttcaggaaa1699Lysactggagatgacgacgtcgctataaaggtgctgtactgtgggatttgt1747ThrG1yAspAspAspValAlaIleLysValLeuTyrCysG1yI1eCys45505560cactctgacctgcacaccatcaagaatgagtggagaaacgctgtctac1795HisSerAspLeuHisThrIleLysAsnGluTrpArgAsnAlaValTyr657075ccagttgttgcagggtacatccttcttattgcatcaccaatttatcaatcaatc1849ProValValAlaGly80gtttttcttttcttcttggttctgtgcgcatccagatggaaaggctggatgcaatttcat1909tgcttagtgaaatatccattatcagttcatactttcttccggcaaagctgaattatcata1969ctgtaaactgcaaatcttgtcagttttttttcacgataatgaaattcattttgtttttac2029ttcaaagaagctacaaccaaccactaccgccgtttcaggttataagacgttttaacttta2089gtcaaagtcaaactgcttcaagtttgactaagtttgtagaaaaaataataataacatttt2149caacccaagacaaatttattatgaaaatatattcagttattaatttaataaaactaattt2209ggtattacaaatattactatatttgtttataaacttagtcagactttatcaaagtcaaaa2269catcctgtaacctaaaacggagggagtattactctaaagtgctttcaacttacttggaaa2329aaagaaatgcaaactttggctgcatggtttgattgatgcaggcacgagatcacc2383HisGluIleThr85ggggtggtgaccgaggtggggaagaacgtggcgaggttcaaggccggc2431GlyValValThrGluValGlyLysAsnValAlaArgPheLysAlaGly9095100gacgaggtcggcgtcgggtgcatggtgaacacctgcggcggctgcgag2479AspGluValGlyValGlyCysMetValAsnThrCysGlyGlyCysGlu105110115agctgccgggacggctgcgagaactactgctccggcggggtcgtcttc2527SerCysArgAspGlyCysGluAsnTyrCysSerGlyGlyValValPhe120125130acctacaactccgtcgaccgggacggcacgcgcacctacggcggctac2575ThrTyrAsnSerValAspArgAspGlyThrArgThrTyrGlyGlyTyr135140145tccgacgcggtggtcgtcagccagcgcttcgtcgtgcgcttcccctcc2623SerAspAlaValValValSerGlnArgPheValValArgPheProSer150155160165tccgccggcggcggcgccggcgccgcgctgccgctggacagcggcgcg2671SerAlaGlyGlyGlyAlaGlyAlaAlaLeuProLeuAspSerGlyAla170175180ccgctgctgtgcgccggggtgacggtgtacgcgccgatgaggcagcat2719ProLeuLeuCysAlaGlyValThrValTyrAlaProMetArgGlnHis185190195gggctgtgcgaggccgggaagcacgtcggcgtggtggggctcggcggg2767GlyLeuCysGluAlaGlyLysHisValGlyValValGlyLeuGlyGly200205210ctcggccacgtcgccgtcaagttcgccagggcgttcgggatgagggtg2815LeuGlyHisValAlaValLysPheAlaArgAlaPheGlyMetArgVal215220225acggtgatcagcacgtcgccggtgaagaggcaggaggccctggagagg2863ThrValIleSerThrSerProValLysArgGlnGluAlaLeuGluArg230235240245ctcggcgccgacggcttcatcgtcagcaccaacgccagtgagatgaag2911LeuGlyAlaAspGlyPheIleValSerThrAsnAlaSerGluMetLys250255260gtaattttaaagctagtttgatcaagtcaagagattattaaatgaactttaagaacggat2971tacacgatagtaattacaatctacaactcctgtacaagtagtaaattaataggaccactt3031tggactgagttaagaagagatcaatgaactattcagttctacattaatcgtgtagtcata3091tggaaggacatcctactgatgcagatgcagtaatatggcacatcacaaacatacaatttc3151aaatttgacttttacaagttgcgtttgatatgttatttttgttacaaattatagaagtcg3211aatttgaatttgcatgtttgtggagtgttatattagtagatgtcaatctattttttcaat3271tttttttaatatttttataatcgtttaattaacatgcaataaacgggttaacatccactc3331aagtggttataatccatctccatcaatttattgatgtgctgcagtgcaactttgcaaggc3391tatgcaagccgaagaaatctttgaatacaactgatgcacctcattgccgacagagcatct3451taagattgtttggtcaagtatctgaatttgcattttggacttgtgtttttgcaggct3508Alagcgatgggcaccatgcatggcatcatcaacacggcctctgcaagcaca3556AlaMetGlyThrMetHisGlyIleIleAsnThrAlaSerAlaSerThr265270275tccatgcactcttacctggcactcttgaagcccaagggcaagatgatc3604SerMetHisSerTyrLeuAlaLeuLeuLysProLysGlyLysMetIle280285290ttggttggcctgcctgagaagcctctccagatcccaaccttcgctttg3652LeuValGlyLeuProGluLysProLeuGlnIleProThrPheAlaLeu295300305310gttggaggtaatttactagtttgtctgacgctgcatcgtctgattccttctcaaatt3709ValGlycatggcaaaatttgacagtttgttttgtgacaaatctttgcaaatcaacagggggc3765GlyGlyaagatactagctgggagctgcatggggagcatcagtgaaacgcaggag3813LysIleLeuAlaGlySerCysMetGlySerIleSerGluThrGlnGlu315320325330atgatcgacttcgccgccgagcacggggtggccgccgacatcgagctg3861MetIleAspPheAlaAl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