轉基因光合微生物和光生物反應器的製作方法

2023-09-19 18:30:45 1

專利名稱：轉基因光合微生物和光生物反應器的製作方法
技術領域：
本發明總體上涉及轉基因微生物和它們培養的方法及裝置。背景為滿足全球增加的能源需求，要尋求化石燃料應用的有效而環境上合理的替代方 案。可從植物生物量生產替代燃料，例如乙醇或生物柴油。例如，當前方法中用於生產乙醇 的關鍵成分稱為可發酵糖。最常見的可發酵糖是蔗糖、葡萄糖或高果糖玉米糖漿的形式。目 前培養以產生這種生物量的植物包括玉米、甘蔗、大豆、油菜、麻風樹(jatropha)，等等。然 而，用於產生可發酵糖的許多植物生物量需要大量能量密集型預處理。此外，利用這種植物 生物量會導致土壤耗竭、侵蝕和食物供應的轉變。已知一些藍細菌通過蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶的作用產生蔗糖，其作 為滲透保護劑(osmoprotectant)而得到廣泛研究。對於鹽耐受性，藍細菌可分成三 組。耐受性低(低於700mM)的菌株合成蔗糖(例如，細長聚球藍細菌(Synechococcus elongatus)PCC 7942)或稱為海藻糖的另一種二糖[Blumwald 等，Proc Natl Acd Sci USA(1983) 80 :2599-2602 和 Reed 等，FEMS MicrobiolRev (1986) 39 :51-56]。具有中等耐滷 性(halotolerance) (0. 7-1. 8mM)的菌株，例如集胞藍細菌(Synechocystis sp.)PCC 6803 產生葡糖基甘油。甘氨酸甜菜鹼(glycine betaine)或穀氨酸甜菜鹼(glutamate betaine) 的累積導致高鹽耐受性(高達2. 5M)。然而，Miao等人[FEMS Microbiol Lett (2003) 218 71-77]測定到，當agp基因缺失阻斷葡糖基甘油的生物合成時，集胞藍細菌PCC6803產生蔗 糖作為其滲透保護劑。乾旱耐受性藍細菌在對基質水分應激(matric water stress)的反 應中也產生蔗糖和海藻糖[Hershkovitz 等，ApplEnviron Microbiol (1991) 57 :645-648]。對集胞藍細菌PCC 6803 (ATCC 27184)和細長聚球藍細菌PCC 7942 (ATCC 33912) 研究較多，有遺傳學工具可用並且已知它們的基因組序列(參見，例如Koksharov^O.A.和 Wol k，C.P.2002. Appl Microbiol Biotechnol58,123-137 ；Ikeuchil, Μ.和 Satoshi Tabata, S.2001.PhotosynthesisResearch 70,73-83 ；Golden, S. S. , Brusslan, J.禾口 Haselkorn, R. 1987. Methods in Enzymology 153,215-231 ；Friedberg, D. 1988. Methods inEnzymology 167,736-747 ；Kaneko, Τ.等.1996. DNA Research 3，109—136)。許多應用需要商品化培養光合微生物，所述光合微生物例如是極大螺旋藻(Spirulina maximum)、純頂螺方寵藻(Spirulina platensis)、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、布朗葡萄藻(Botrycoccus braunii)、小球藻(Chlorellavulgaris)、蛋白核小 求藻(Chlorella pyrenoidosa)、羊角月芽藻(Serenastrumcapricomutum)、四 1 }藻 (Scenedesmus auadricauda)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、急尖権藻(Scenedesmus acutus)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、項圈藻 (Anabaenopsis)、管鏈藻屬(Aulosira)、柱抱藻屬(Cylindrospermum)、Scenecoccus sp.、 Scenecosystis sp.和底棲藍藻(Tolypothrix)，所述應用包括精細化學品、藥物、化妝顏 料、脂肪酸、抗氧化劑、具有預防作用的蛋白質、生長因子、抗生素、維生素和多糖的生產。低 劑量的藻類生物量(algic biomass)也可用於替代或降低動物飼料中的抗生素水平或用作 蛋白質來源。此外，可通過熱處理使得以溼潤形式(與乾燥形式相對)提供的藻類生物量 發酵或液化以提供燃料。因此，增加這種有機體的培養效率的能力極其令人感興趣。一般而言，目前的光合生物反應器依賴於在液相系統中培養微生物以產生生物 量。這些系統通常是露天池型反應器(open-air pond-type reactor)或封閉的罐型反應 器(tank-type reactor)。然而，通常認為封閉的生物反應器在許多方面比池型反應器有改 進。重要的是，封閉系統提供了抵禦環境汙染的屏障。此外，這些系統能更好地控制液體介 質的溫度和氣體含量。封閉的光生物反應器的應用仍受限於光合微生物對光的需求(即，光化射線提供 光合微生物將二氧化碳固定成有機分子所需的能量)。因此，光化微生物的充足照射是必 須滿足的要求。然而，隨著液相光生物反應器中細胞密度的增加，光線透射入介質的能力降 低，從而通常限制了可能達到的細胞密度。此外，為防止有機體的不良沉降，通常需要對液 體介質作某些類型的攪拌，該過程需要能量輸入。現已作了多種嘗試來設計將光線帶到液相系統中有機體的方法。例如，一些系統 包括使液體培養基經透明管道循環。其它嘗試包括將光源置於介質內或者將反射顆粒弓I入 培養基以調節該培養物的射線吸收度(radiationabsorbance)。儘管作出了這些嘗試，但在 細胞密度較高時，液相系統中培養有機體的能力尚未達到顯著增加。除了上述對光的需求，液相光生物反應器的應用還需要為光合微生物提供足夠的 二氧化碳以供光合作用。這些系統通常整合了某些類型的額外通氣系統以增加溶解於介質 的二氧化碳濃度。如果無需通氣將極大簡化該系統，從而降低操作成本。液相光生物反應器還往往不能良好適用於常規的連續生產方法。大體積液體的轉 移通常是複雜而繁重的。此外，由於液相系統通常需要循環、攪拌、通氣等機械裝置，只操作 一個或少數幾個大型培養裝置而非多個較小的裝置通常更簡單而且成本效率更高。因此， 目前實施的方法涉及處理較大的批次(即，培養一批光合微生物，然後收穫得到的所有生 物量)。因此，本領域極其需要推進光合生物反應器的設計。提供的新型光合生物反應器 能有效培養並收穫較高密度的光合微生物而無需大量水或其它液體介質，無需上述非常措 施來供應充足光線和二氧化碳，並且成本合理，這代表了本領域的實質性進步，並有助於工 業和消費者，等等。發明概述本文提供經工程改造以積累碳水化合物，例如二糖的轉基因細菌。還提供了培養光合微生物的光生物反應器，其包括適於為光合微生物提供營養物和水分的非膠狀的固體 培養支持物和覆蓋該培養支持物表面的至少一部分的物理屏障。公開了整合有光生物反應 器的大規模和連續培養光合微生物的裝置以及使用方法。還公開了利用本發明的光生物反 應器從光合微生物產生可發酵糖的方法。一方面提供了培養光合微生物的光生物反應器。該光生物反應器包括非膠狀的 固體培養支持物，該支持物適於為在其表面的至少一部分上的光合微生物提供營養物和水 分，其中當該表面的所述部分非水平定位時，該表面的所述部分的形狀允許光合微生物粘 附其上；以及覆蓋該培養支持物表面的至少所述部分的物理屏障，其中該物理屏障設置成 允許接種該培養支持物表面的所述部分，形成並維持適於培養這種光合微生物和收穫這種 培養的光合微生物的環境。在一些實施方式中，該光生物反應器包含在該培養支持物表面的所述部分上的光 合微生物。在一些實施方式中，該光生物反應器還包含經工程改造以累積二糖的細胞，如下 文進一步描述，其中該細胞粘附於該固然培養支持物。在一些實施方式中，該培養支持物表 面的所述部分能以每升當量至少約50克幹生物量的密度培養光合微生物。在一些實施方式中，該培養支持物是柔性的。在一些實施方式中，該培養支持物包 含一種或多種剛性材料。在一些實施方式中，該光生物反應器的培養支持物包含至少兩層， 第一層毗連第二層，其中所述至少兩層的材料是相同或不同的材料。在一些實施方式中，所 述第一層包含高表面積生長材料，所述第二層包含可滲透的材料。在一些實施方式中，該光 生物反應器的培養支持物包含柔性連接的剛性部分，其中所述剛性部分由一種或多種剛性 材料構成。在一些實施方式中，該光生物反應器包含單個培養支持物。在一些實施方式中， 該光生物反應器包含多個培養支持物。在一些實施方式中，該培養支持物包含織物。在一些實施方式中，所述織物由天然 的、改性天然的、合成的纖維或它們的組合構成。在一些實施方式中，所述織物是紡織織物、 編織織物、氈、交聯纖維聚合物構成的篩網或它們的組合。在一些實施方式中，所述天然纖 維選自棉花、羊毛、大麻纖維、樹纖維、其它纖維素纖維和它們的組合。在一些實施方式中， 所述改性天然纖維選自硝酸纖維素、醋酸纖維素、磺酸纖維素、交聯的澱粉和它們的組合。 在一些實施方式中，所述合成纖維選自聚酯、聚丙烯酸酯、聚胺、聚醯胺、聚碸和它們的組合。

在一些實施方式中，該培養支持物包被有水分吸附聚合物。在一些實施方式中，所 述織物、織物的纖維或二者包被有水分吸附聚合物。在一些實施方式中，水分吸附聚合物選 自瓊脂、聚丙烯酸酯、聚醯胺、聚胺、聚乙二醇、改性澱粉和它們的組合。在一些實施方式中，光生物反應器的物理屏障對於固體顆粒和液體至少是實質性 不可滲透的，但不阻止氣體或蒸氣向和從培養支持物表面所述部分附近的空間的運輸，也 不阻止培養支持物表面的所述部分的光化射線。在一些實施方式中，物理屏障對於水蒸氣 的不滲透性足夠，從而潤溼的培養支持物會保留足夠的水分，因此光合微生物在培養期間 能維持充分的水合。在一些實施方式中，所述屏障設置成封閉培養支持物和其上的任何光 合微生物，並設置成能在至少光合微生物的培養的部分期間可鬆脫地密封。在一些實施方 式中，物理屏障是柔性的。在一些實施方式中，物理屏障還包含對於固體顆粒、液體、氣體和 蒸氣至少基本上不可滲透的第一部分，和對於氣體和蒸氣可滲透，但對於固體顆粒和液體至少基本上不可滲透的第二部分。在一些實施方式中，屏障的第二部分的氣體或蒸氣交換 率是至少約5葛爾萊秒(Gurley second)到不超過約10，000葛爾萊秒。在一些實施方式 中，屏障的第二部分包含選擇性膜，該選擇性膜含有烯烴纖維或聚乙烯纖維材料、聚四氟乙 烯過濾介質、纖維素過濾材料、纖維玻璃過濾材料、聚酯過濾材料、聚丙烯酸酯過濾材料、聚 碸膜或尼龍膜。在一些實施方式中，第一部分對於光化射線至少是基本上透明的，且第二部 分對於光化射線不是至少基本上透明的，以及第一和第二部分相對於彼此和培養支持物表 面的至少所述部分的設置應具有充足量的光化射線和氣體交換以支持光合微生物的光合 作用。在一些實施方式中，光生物反應器還包括置於培養支持物和物理屏障之間的光化 射線源。在一些實施方式中，物理屏障在培養支持物和光化射線源之間，其對於這種光化射 線足夠透明並具有足夠的氣體透過性從而允許光合微生物在培養期間進行光合作用。在一些實施方式中，光生物反應器還包括在培養支持物上、其內或同時在其上和 其內的水、營養物或它們的組合。在一些實施方式中，光生物反應器還包括一個或多個連接 點以便連接所述光生物反應器與某構件。在一些實施方式中，固體培養支持物還包括一個 或多個連接點以便連接該培養支持物。在一些實施方式中，光生物反應器還包括液體供應 系統、營養物供應系統、氣體供應系統和微生物供應系統中的至少一種。另一方面提供培養光合微生物的裝置。此類裝置包括至少一個上述光生物反應器 和與所述至少一個光生物反應器相連的構件，該構件將所述至少一個光生物反應器的至少 一個培養支持物非水平地定位。在一些實施方式中，所述至少一個光生物反應器懸掛在該 構件上。在一些實施方式中，物理屏障基本上覆蓋該構件。在一些實施方式中，該構件包括 傳送系統或其組件，從而所述至少一個培養支持物能沿著該傳送系統的路徑傳送。在一些 實施方式中，該裝置還包括以下的一個、兩個或三個接種站，從而在各培養支持物沿著傳 送系統的路徑傳送時可用光合微生物接種；培養站，從而在各培養支持物沿著傳送系統的 路徑傳送時培養各接種的培養支持物上的光合微生物；和將培養支持物傳送到的收穫站， 從而可自各培養支持物收穫培養的光合微生物的至少一部分。在一些實施方式中，接種站 和收穫站基本上彼此毗連或者基本上是共存的(coextensive)。在一些實施方式中，該裝置 還包括誘導站以誘導各培養支持物上的光合微生物合成可發酵糖。在一些實施方式中，該 裝置還包括液體供應系統、營養物供應系統、氣體供應系統或微生物供應系統中的至少一 種。在一些實施方式中，該裝置還包括粘附於固體培養支持物上的光合微生物。在一些實 施方式中，該裝置還包括經工程改造以累積二糖的細胞，如下所述，其中該細胞粘附於所述 固體培養支持物。另一方面提供經工程改造以累積二糖的轉基因光合微生物細胞。所述轉基因光合 微生物細胞包含以5』到3』的轉錄方向操作性相連的組分在光合微生物細胞中起作用的 啟動子；包含編碼具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽選自 二糖磷酸合酶或二糖磷酸磷酸酶(disaccharid印hosphate phosphatase)；和轉錄終止序 列；其中與不含DNA構建物的光合微生物細胞相比，該轉基因光合微生物細胞累積的二糖 水平增高。在一些實施方式中，該轉基因光合微生物細胞包含含有第一核苷酸序列和第二核 苷酸序列的多核苷酸，所述第一核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性的多肽，而所述第二核苷酸序列編碼具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。在一些實施方式中，其包含含有核苷 酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的 多肽。在一些實施方式中，其包含編碼具有二糖磷酸合酶活性的多肽的第一核苷酸序列；編 碼具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽的第二核苷酸序列；和編碼具有二糖磷酸合酶活性和二 糖磷酸磷酸酶活性的多肽的第三核苷酸序列。在一些實施方式中，該轉基因光合微生物細胞的多核苷酸選自(a)包含編碼選 自下列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸具有蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性 的SEQ ID NO :2或與其95%相同的序列；具有蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO :4或 與其95%相同的序列；具有蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO 6與其95%相同的 序列；具有海藻糖磷酸合酶(TPQ活性的SEQ ID NO :77或與其有95%相同的序列；具有海 藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO 79或與其有95%相同的序列；具有葡糖基甘油 磷酸合酶(GPQ活性的SEQ ID NO 81或與其有95%相同的序列；具有葡糖基甘油磷酸磷 酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 83或與其有95%相同的序列；具有甘露糖基果糖磷酸合酶 (MPS)活性的SEQ ID NO :85或與其有95%相同的序列；和具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶 (MPP)活性的SEQ ID NO :87或與其有95%相同的序列；(b)分離多核苷酸，其包含編碼蔗 糖磷酸合酶/蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO :1或與其有95%相同的序列；編碼 蔗糖磷酸合酶(SPQ活性的SEQ ID NO :3或與其有95%相同的序列；編碼蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP)活性的SEQ ID NO 5或與其有95%相同的序列；編碼海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的 SEQ ID NO: 76或與其有95%相同的序列；編碼海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO: 78或與其有95%相同的序列；編碼葡糖基甘油磷酸合酶(GPQ活性的SEQID NO 80或與 其有95%相同的序列；編碼葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 82或與其有 95%相同的序列；編碼甘露糖基果糖磷酸合酶(MPQ活性的SEQ ID NO :84或與其有95% 相同的序列；和編碼甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID N0:86或與其有95% 相同的序列；(c)在嚴格條件下與選自如下的核酸序列雜交的分離多核苷酸SEQ IDNO :1, 其中該分離多核苷酸編碼具有ASF活性的多肽；SEQ ID NO :3，其中該分離多核苷酸編碼具 有SPS活性的多肽；SEQ ID NO :5，其中該分離多核苷酸編碼具有SPP活性的多肽；SEQ ID NO :76，其中該分離多核苷酸編碼具有TPS活性的多肽；SEQ ID NO :78，其中該分離多核苷 酸編碼具有TPP活性的多肽；SEQ ID NO :80，其中該分離多核苷酸編碼具有GPS活性的多 肽；SEQ ID NO :82，其中該分離多核苷酸編碼具有GPP活性的多肽；SEQ ID NO :84，其中該 分離多核苷酸編碼具有MPS活性的多肽；SEQID NO :86，其中該分離多核苷酸編碼具有MPP 活性的多肽；其中所述嚴格條件包括在65°C下，在包含6X SSC (0. 9M氯化鈉和0. 09M檸檬 酸鈉)的溶液中溫育；和(d)分離多核苷酸，其與(a)、(b)或(c)所示多核苷酸序列互補。在一些實施方式中，所累積二糖的單體對於細胞是內源性的。在一些實施方式中， 所累積二糖的一種或多種單體對於細胞是外源性的，且這些單體的表達經工程改造進入細 胞。在一些實施方式中，所述細胞是藍細菌細胞、光合細菌或綠藻。在一些實施方式 中，所述細胞是藍細菌細胞。在一些實施方式中，所述細胞是選自聚球藍細菌或集胞藍細菌 的藍細菌。在一些實施方式中，所述啟動子是誘導型啟動子。在一些實施方式中，所述啟動子可由選自溫度、PH、代謝物、光、滲透劑、重金屬或抗生素等因素誘導。在一些實施方式中，所 述啟動子選自 carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA 禾Π λ ra。在一些實施方式中，所述細胞的DNA構建物包含選自下列的核苷酸序列SEQ ID 唚19(編碼38€的？1^匕八1^11) ；SEQ ID NO :20 (編碼 asf 的 pLybAL12) ；SEQ ID NO :44(編 碼 asf 的 pLybAL15) ；SEQ ID NO 45 (編碼 asf 的 pLybAL16) ；SEQ ID NO 46 (編碼 asf 的 pLybAL17) ；SEQ ID NO :47 (編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO :48 (編碼 asf 的 pLybAL 19) ；SEQID NO :49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQ ID NO :50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID NO :51(編碼 asf 的 pLybAL13f) ；SEQ ID NO :52 (編碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQ ID NO :53(編 碼 asf 的 pLybAL14f) ；SEQ ID NO 54(編碼 asf 的 pLybAL14r) ；SEQ ID NO 65 (編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69 (編碼 asf 的 pLybAL8f) ；SEQ ID NO :118 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL23) ；SEQ ID NO 121 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO 122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO 123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQID NO :124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO :125 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO :126 (編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ IDNO :130 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24)；禾口 SEQ ID NO 133 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33)。在一些實施方式中，細胞累積至少約0.1微克二糖/分鐘/克幹生物量。在一些 實施方式中，細胞累積至少約0.1微克二糖/分鐘/克幹生物量到多達約10微克二糖/分 鍾/克幹生物量。在一些實施方式中，所述細胞不包含選自下列的核苷酸序列SEQ ID NO :70、SEQ ID N0:72和SEQ ID NO :74，或與它們有至少95%相同，還且具有轉化酶活性或蔗糖酶鐵氧 還蛋白(sucraseferridoxin)活性的核苷酸變體。在一些實施方式中，所述細胞不表達選 自如下的多肽序列:SEQ ID N0:71、SEQ ID NO :73和SEQ ID NO :75，或與它們有至少95% 相同，且具有轉化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋白活性的多肽變體。在一些實施方式中，所述細 胞表達小幹擾RNA，所述小幹擾RNA對選自下列的核苷酸序列有特異性SEQID NO :70、SEQ ID N0:72和SEQ ID NO :74，或與它們有至少95%相同，且具有轉化酶活性或蔗糖酶鐵氧還 蛋白活性的核苷酸變體。在一些實施方式中，所述細胞還包含分離多核苷酸，該多核苷酸包含編碼活性通 道蛋白多肽的SEQ ID NO :94或與其有95%相同的序列；編碼多肽的分離多核苷酸，該多 肽包含SEQ ID NO 95或與其有95%相同的序列並具有通道蛋白活性；或包含SEQ ID NO 91(編碼通道蛋白的pLybAL32)的分離多核苷酸；其中累積的二糖是蔗糖，該細胞表達通道 蛋白，且表達的通道蛋白將累積的蔗糖從細胞中分泌。另一方面提供人工DNA構建物。在一些實施方式中，人工DNA構建物包含至少 一條選自如下的序列SEQ ID NO :19(編碼asf的pLybALll) ；SEQID NO :20 (編碼asf的 pLybAL12) ；SEQ ID NO :44 (編碼 asf 的 pLybAL15) ；SEQ ID NO :45 (編碼 asf 的 pLybAL16)； SEQ ID NO :46(編碼 asf 的 pLybAL17) ；SEQ ID NO :47 (編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO 48(編碼 asf 的 pLybAL19) ；SEQ ID NO :49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQ ID NO 50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID NO 51(編碼 asf 的 pLybAL 13f) ；SEQID NO 52(編碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQ ID NO :53(編碼 asf 的 pLybAL14f) ；SEQ ID NO :54(編碼 asf 的 pLybAL14r) ；SEQ ID NO :65 (編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69 (編碼 asf 的 pLybAL8f)；SEQ ID NO 118(編碼 和 的 pLybAL23) ；SEQ ID NO 121(編碼 和 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO :122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO :123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQ ID NO :124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO :125(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO :1 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ ID NO :130(編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24) ；SEQ ID NO :133 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33) ；SEQ ID NO 91(編碼通道蛋白的 pLybAL32) ； SEQ ID NO 102 (編碼 SS-UPP 的 pLybAL3f) ； SEQ ID NO: 103(編碼 SE-UPP 的 pLybAL5f) ； SEQ ID NO :106(編碼 SE-UPP 的 pLybAL4f) ； SEQ ID NO 107 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL9f) ； SEQ ID NO 109 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL6fb) ； SEQ ID NO: 110(編碼 SE-UPP 的 pLybALlOfb)；和 SEQ ID NO 91 (編碼通道蛋白的 pLybAL32)。另一方面提供培養光合微生物的方法。培養光合微生物的方法可利用上述的任何 光生物反應器或裝置。該方法包括用光合微生物接種培養支持物；在接種的培養支持物上 培養該光合微生物；和從該培養支持物上收穫至少一部分培養的光合微生物。在一些實施 方式中，該方法還包括接種培養支持物後密封光生物反應器的物理屏障，從而在培養光合 微生物的全部或實質性部分的同時維持物理屏障密封。在一些實施方式中，該物理屏障可 鬆脫地密封。在一些實施方式中，該方法還包括將各培養支持物輸送至接種站、培養站和收 獲站。在一些實施方式中，該方法還包括以下的至少一種為培養支持物提供液體；為培養 支持物供應營養物；或為培養支持物供氣。在一些實施方式中，光合微生物培養至每升當量 至少約50克幹生物量的密度。在一些實施方式中，光合微生物包含經工程改造以累積二糖 的轉基因光合微生物，如上所述。另一方面提供產生可發酵糖的方法。產生可發酵糖的方法可利用上述任何光生物 反應器或裝置。產生可發酵糖的方法包括用能累積可發酵糖的光合微生物接種培養支持 物；在接種的培養支持物上培養光合微生物；分離累積的可發酵糖。在一些實施方式中，可 發酵糖累積在光合微生物內。在一些實施方式中，分離累積的可發酵糖包括從培養支持物 上收穫至少一部分培養的光合微生物；和從收穫物回收可發酵糖。在一些實施方式中，累積 的可發酵糖從光合微生物分泌，並從培養基中分離。在一些實施方式中，分離累積的可發酵 糖包括從培養基分離累積的可發酵糖。在一些實施方式中，該方法還包括在接種培養支持 物後可鬆脫地密封光生物反應器的物理屏障，從而在培養光合微生物的全部或實質性部分 的同時維持物理屏障密封。在一些實施方式中，該方法還包括以下的至少一種為培養支持 物供應液體；為培養支持物供應營養物；或為培養支持物供氣。在一些實施方式中，該方法 還包括將各培養支持物輸送至接種站、培養站和收穫站中的至少一種。在一些實施方式中，該方法還包括通過光合微生物誘導可發酵糖合成。在一些實 施方式中，誘導可發酵糖合成包括使光合微生物接觸選自以下的誘導因素溫度、PH、代謝 物、光、滲透劑、重金屬和抗生素。在一些實施方式中，誘導可發酵糖合成包括用鹽化合物處 理光合微生物。在一些實施方式中，鹽化合物是氯化鈉。在一些實施方式中，鹽化合物的添 加濃度是約0. OlmM-L 5M或約0. 2-0. 9M。在一些實施方式中，通過氣溶膠噴霧將誘導因素 施加於生長表面。在一些實施方式中，將光合微生物培養至每升當量至少約50克幹生物量 的密度。在一些實施方式中，可發酵糖包括選自下列的至少一種糖葡萄糖、果糖、蔗糖、海 藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。在一些實施方式中，可發酵糖包括選自蔗糖或海藻糖的 至少一種糖。
在一些實施方式中，所述光合微生物包括天然光合微生物。在一些實施方式中，所 述光合微生物包括遺傳修飾的光合微生物。在一些實施方式中，所述光合微生物包括藍細 菌。在一些實施方式中，所述光合微生物包括選自聚球藍細菌或集胞藍細菌的藍細菌。在 一些實施方式中，所述光合微生物包括經工程改造以累積二糖的轉基因光合微生物，如上 所述。從下文可部分明白並部分指出了其它目的和特徵。附圖簡述本領域技術人員應知道下述附圖只是出於說明目的。附圖不是要以任何方式限制 本發明教導的範圍。

圖1顯示本發明光生物反應器的正視圖，包括固體培養支持物、透明的保護性外 屏障層、選擇面板、可再密封的閉合器和用於懸掛該裝置的支持部件。圖2顯示本發明光生物反應器的側視圖，包括固體培養支持物、透明的保護性外 屏障層、選擇面板、可再密封的閉合器和用於懸掛該裝置的支持部件。圖3顯示多個本發明光生物反應器或培養支持物的一種配置，這些光生物反應器 或培養支持物沿著多個閉環輸送系統從共同的接種和收穫中心向外輻射狀擴散，從而構成 光生物反應器場(photobioreactor farm)。圖4是描繪藍細菌中光合產生蔗糖的草圖。圖5是集胞藍細菌PCC 6803(Ssp6803)蔗糖磷酸合酶(SPQ和蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP)蛋白與細長聚球藍細菌PCC 7942(Selo7942)活性SPS/SPP融合物(ASF)的多肽序列 比對。Ssp6803含有編碼SPS和SPP活性的不同基因。集胞藍細菌PCC 6803的SPS蛋白具 有推定的無活性SPP結構域，因為許多活性殘基不是保守的。經典的HAD水解酶活性位點 殘基示於以上比對,其中保守件胺基酸如下劃線所示和非保守件殘基則標上雙下劃線。斜 體字顯示了集胞藍細菌PCC 6803 SPS的無活性SPP結構域內的八胺基酸插入。關於方法 的其它細節見實施例4。圖6是pLybALll的示意圖。pLybALll能構建藍細菌DNA文庫並選擇啟動子序列。 無啟動子的asf基因在雙向終止子後，由多克隆位點(MCS)隔開。oriV能在大多數革蘭氏 陰性生物中進行質粒複製。oriT能在pRK2013輔助質粒的幫助下將大腸桿菌的質粒接合轉 移至選擇的藍細菌(或其它有機體)。存在內醯胺酶基因(bla)以供在大腸桿菌中選 擇。可將藍細菌基因組DNA克隆入MCS而在大腸桿菌中構建DNA文庫。然後可通過接合或 直接轉化將該質粒文庫轉移至藍細菌。隨後可通過氯黴素乙醯轉移酶基因(cat)表達選擇 氯黴素抗性來分離活性啟動子。可通過檢驗氯黴素乙醯轉移酶活性和直接檢測蔗糖產量來 評估啟動子強度。關於方法的其它細節見實施例5。圖7是pLybAL12的示意圖。pLybAL12能分析預先選擇的啟動子驅動asf表達的 能力。pLybAL12和pLybALll之間的唯一差別是在氯黴素乙醯轉移酶基因(cat)之前有活 性啟動子存在。可將從PCR擴增的藍細菌染色體DNA中分離的特定DNA序列克隆入MCS。 氯黴素和氨苄青黴素均可用於在大腸桿菌中選擇。然後可通過接合或直接轉化將該質粒文 庫轉移至藍細菌。隨後可通過氯黴素乙醯轉移酶基因(cat)表達選擇氯黴素抗性來分離攜 帶質粒的藍細菌。可通過檢驗氯黴素乙醯轉移酶活性和直接檢測蔗糖產量來評估啟動子強 度。關於方法的其它細節見實施例5。
圖8是描繪構建藍細菌啟動子文庫的草圖。關於方法的其它細節見實施例8。圖9是描繪pSMART-LCKan的示意圖。關於方法的其它細節見實施例8。圖10是顯示細長聚球藍細菌PCC 794hsf中可能的啟動子的序列表。顯示的是 含有克隆到氯黴素抗性標記上遊的細長聚球藍細菌PCC 7942的asf基因的擴增PCR產物。 分別以單下劃線和雙下劃線顯示編碼蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶多肽活性的asf區 域。所有DNA元件以斜體字顯示並在上方標出。起始和終止分別表示起始和終止密碼子。 SD表示Siine-Delgarno序列。推定啟動子的_35和-10區域以灰色突出顯示。關於方法 的其它細節見實施例8。圖11是描繪藍細菌基因組中基因無標記缺失的兩步方法的示意圖。該方案假定 所用的藍細菌菌株缺失其UPP基因。UPP基因在蔗糖生物合成插入期間缺失。必須鑑定已 靶向缺失的感興趣基因。起始菌株耐受5-氟尿嘧啶，但對卡那黴素敏感。通過插入含有卡 那黴素抗性標記和活性upp的表達盒來完全或部分刪除該基因，從而使得該菌株耐受卡那 黴素，但對5-氟尿嘧啶敏感。然後可除去upp和卡那黴素抗性標記，從而使得該菌株再次 對5-氟尿嘧啶耐受，但對卡那黴素敏感。關於方法的其它細節見實施例12。圖12是光生物反應器實施方式的示意圖。圖12A是正視圖，而圖12B是側視圖。 該光生物反應器包括懸掛元件(6)；培養基供應(8)；氣體供應(10)；生長表面O)；外屏障 層(7)；快速連接器；和產物收穫管線(9)。圖13是單一材料形式(圖13A)和雜合材料形式(圖13B)的生長表面示意圖。發明詳述本申請涉及可發酵糖累積性光合微生物，固相光反應器裝置和各自的使用方法。在累積可發酵糖的光合微生物中，優選產生二糖，其通常不被該光合微生物利用 因而能累積在培養的生物量內(例如，蔗糖、海藻糖)。在一些實施方式中，光合微生物經遺 傳工程改造以合成通常按照滲透應力途徑產生的二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，從而該糖能 在沒有滲透應力存在下或其水平降低下產生。與較高等植物相比，由於培養光合微生物的 效率更高而環境影響更低，該方法在可持續性上相對於目前的生物燃料生產實踐有重要改 進。有利的是，合成二糖的以上方法已適於在本發明光生物反應器內進行。本文所述光生物反應器利用固體培養支持物。有利的是，提供充足光照的困難至 少部分緩解。在光生物反應器中利用上述固體培養支持物能培養和生長光合微生物，其細 胞密度高於商業規模的液相生物反應器(例如，細胞密度超過每升當量200克幹生物量)。 此外，與常規商業規模液相光生物反應器相比，本文所述光生物反應器的各種實施方式操 作起來使用更少的能源並且更簡便。與常規液相光生物反應器相比，本文所述光生物反應器的諸實施方式提供額外的 益處。例如，液相系統通常需要特定的設備以遞送足夠濃度/量的二氧化碳至光合微生物 以支持它們的生長和光合作用。相比之下，通過在固體培養支持物上培養微生物，可以相對 簡單、成本較低的方式提供二氧化碳，例如接觸周圍的空氣。如果需要額外的二氧化碳，可 容易地通過，例如將其加入圍繞或接觸培養支持物的氣氛(例如，空氣)中來遞送。另一益 處是便於輸送。液相光生物反應器可以是池(完全固定的)或大體積的槽或多個管道。相 比之下，在各種實施方式中，光生物反應器是平坦而柔性的，從而能將其或多個生物反應器 堆疊、捲起、摺疊和/或以相似方式配置從而較易運輸。在各種實施方式中，光生物反應器的配置方式應使其自某系統懸掛下來從而允許便於將一個或多個光生物反應器從一個位 置輸送至另一位置。可在商業規模上利用這種便攜性，從而能採用有效方法以連續方式處 理和加工大量光生物反應器。本申請一方面涉及利用光合微生物產生可發酵糖原料的方法。可發酵糖優選可發 酵二糖。可發酵二糖的例子包括但不限於蔗糖和海藻糖。可發酵糖可以是光合微生物通常 不利用的二糖。例如，藍細菌通常不利用海藻糖，因此可累積在培養的生物量內而不被內源 性代謝途徑實質性降解。可發酵糖可以是光合微生物通常可利用的二糖。對於不用作基礎 能源的二糖，即使有內源性代謝途徑存在，該二糖亦常可累積至足夠水平。如果內源性降解 途徑是目標可發酵糖特異性的，可工程改造該光合微生物以降低或消除這種活性。例如，可 對經工程改造以累積蔗糖的藍細菌作進一步改造以降低或消除蔗糖轉化酶活性。在各種實 施方式中，可利用對滲透或基質水分應激起反應而合成可發酵二糖的光合微生物菌株。在 其它實施方式中，光合微生物的轉基因菌株經工程改造從而在沒有滲透應力存在或其水平 降低情況下累積可發酵二糖。有利的是，合成可發酵二糖的前述方法可適於在本文所述光 生物反應器內進行。與較高等植物相比，由於培養光合微生物的效率更高而環境影響更低，本文所述 的組合物、裝置和方法在可持續性上相對於目前的生物燃料生產實踐有重要改進。光合微生物本文提供經遺傳學改造以累積二糖的光合微生物。所述光合微生物可以是，例如 天然光合微生物，如藍細菌，或工程改造的光合微生物，如人工光合細菌。累積的二糖的例 子包括但不限於蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。在各種實施方式中，在宿主光 合微生物(例如，藍細菌)中工程改造一種或多種基因從而導致所需二糖的累積，所述基因 編碼負責從相應的磷酸化單體產生所需二糖的蛋白質。在一些實施方式中，工程改造宿主 光合微生物的內源性途徑從而累積二糖。例如，可工程改造藍細菌中的滲透蔗糖途徑從而 在沒有滲透應力下累積蔗糖。在一些實施方式中，在藍細菌中工程改造外源性二糖途徑從 而累積二糖。例如，可工程改造大腸桿菌的滲透海藻糖途徑以在藍細菌中累積海藻糖。合酶和磷酸酶可轉化光合微生物使之具有用於所需二糖的合酶活性和磷酸酶活性。例如，可工 程改造藍細菌使之具有蔗糖磷酸合酶活性和蔗糖磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造藍 細菌使之具有海藻糖磷酸合酶活性和海藻糖磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造藍細菌 使之具有葡糖基甘油磷酸合酶活性和葡糖基甘油磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造藍 細菌使之具有甘露糖基果糖磷酸合酶活性和甘露糖基果糖磷酸磷酸酶活性。預計可在其它 光合微生物中類似地工程改造這些活性。可藉助各基因，一種編碼具有合酶活性的多肽而另一種編碼具有磷酸酶活性的多 肽；或通過同時編碼合酶活性和磷酸酶活性的一個基因而將合酶活性和磷酸酶活性工程改 造入光合微生物。例如，合酶活性或磷酸酶活性可存在於融合多肽中。所需二糖的單體糖可以是光合微生物內源性或外源性的。如果所需二糖的單體糖 是內源性的，可工程改造該光合微生物以產生水平升高的這種單體。如果所需二糖的單體 糖是外源性的，可工程改造該光合微生物以產生這種外源性單體。可工程改造光合微生物從而在一定發育階段後，或經誘導後連續合成和累積所需二糖。根據誘導型啟動子的作用，誘導二糖合成可與本文進一步詳細討論的所編碼的合酶 或磷酸酶和誘導劑相關。在一些實施方式中，本文所述的轉化藍細菌可累積每分鐘每克幹生物量至少約 0.1微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。在一些實施方式中，轉 化的藍細菌可累積每分鐘每克幹生物量至少約0. 1到高達約10微克二糖(例如，蔗糖、海 藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。例如，轉化的藍細菌可累積每分鐘每克幹生物量至少 約0. 2、至少約0. 3、至少約0. 4、至少約0. 5、至少約0. 6、至少約0. 7、至少約0. 8、或至少約 0.9微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。在其它實施方式中，各 種轉化的光合微生物累積相似量的二糖。預計各種實施方式將累積以上限定的數值範圍內的二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡 糖基甘油或甘露糖基果糖)。例如，一些轉化的藍細菌可累積每分鐘每克幹生物量至少約 0.1到高達約0.9微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每 克幹生物量至少約0. 1到高達約0. 8微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖 基果糖)；每分鐘每克幹生物量至少約0.1到約0.7微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基 甘油或甘露糖基果糖)，等等。類似地，一些轉化的藍細菌可累積每分鐘每克幹生物量至少 約0.2到高達約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘 每克幹生物量至少約0. 3到高達約1. 0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露 糖基果糖)；每分鐘每克幹生物量至少約0.4到高達約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、 葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每克幹生物量至少約0. 5到高達約1. 0微克二糖(例 如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每克幹生物量至少約0. 6到高達約 1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分鐘每克幹生物量至 少約0.7到高達約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分 鍾每克幹生物量至少約0. 8到高達約1. 0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘 露糖基果糖)；或每分鐘每克幹生物量至少約0.9到高達約1.0微克二糖(例如，蔗糖、海 藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。測定宿主細胞中糖累積的方法是本領域技術人員熟知 的(參見，例如實施例10)。宿主經遺傳工程改造以累積二糖的宿主可以是任何光合微生物。所述光合微生物可以 是，例如天然光合微生物，如藍細菌，或工程改造的光合微生物，如人工光合細菌。天然具有 光合作用或經工程改造具有光合作用的示範性微生物包括但不限於細菌；真菌；古細菌； 原生生物；微觀植物，例如綠藻；和動物，例如浮遊生物、渦蟲(planarian)和變形蟲。天然 光合微生物的例子包括但不限於極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽生杜氏藻、布朗葡萄藻、小球 藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾柵藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、斜生柵藻、項圈藻、管 鏈藻屬、柱孢藻屬、Scenecoccus sp.、Scenecosystis sp.禾口 /或底棲藍藻。宿主光合微生物優選藍細菌。藍細菌也稱為藍-綠藻，其是廣泛的產氧光自 養生物。宿主藍細菌可以是藍藻門的任何光合微生物。宿主藍細菌可以是單細胞或菌 落(例如，絲狀、片狀或球狀)形態。宿主藍細菌優選是單細胞藍細菌。可工程改造 以累積二糖的藍細菌的例子包括但不限於以下屬集胞藍細菌、聚球藍細菌、熱聚球藍 細菌(Thermosynechococcus)、念珠藍細菌(Nostoc)、原綠球藻(Prochlorococcu)、微囊藍細菌(Microcystis)、魚腥藍細菌(Anabaena)、螺旋藍細菌(Spirulina)和粘桿菌 (Gloeobacter)。宿主藍細菌優選集胞藍細菌或聚球藍細菌。宿主藍細菌更優選細長聚球 藍細菌 PCC 7942 (ATCC 33912)和 / 或集胞藍細菌 PCC 6803 (ATCC 27184)。蔗糖可通過依次起作用的兩種酶活性，蔗糖磷酸合成酶(sps)和蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP)的催化作用實現在光合微生物，例如藍細菌中生物合成蔗糖(參見，例如圖4)。這 種活性存在於適應滲透和基質水分應激的一些藍細菌(參見，例如Lurm，J. Ε. 2002. Plant Physiol 128,1490-1500)。可在藍細菌中工程改造這些活性之一或二者從而導致蔗糖累 積。工程改造光合微生物以累積蔗糖的特別感興趣的基因是細長聚球藍細菌PCC 7942的活性sps/spp融合(asf)基因。Asf具有sps和spp生物合成功能(參見，例如實 施例4)。在一些實施方式中，ASF-編碼核苷酸序列從其天然來源(例如細長聚球藍細菌 PCC 7942)克隆，並插入宿主藍細菌(參見，例如實施例4-9)。在一些實施方式中，轉化的 宿主光合微生物包含SEQ ID NO :1所示asf多核苷酸。在一些實施方式中，用編碼SEQ ID NO 2所示ASF多肽的核苷酸序列轉化光合微生物。在另外的實施方式中，轉化的宿主光合 微生物包含與SEQ ID NO :1有至少約80%序列同一性的核苷酸序列或編碼具有sps和spp 活性並與SEQ ID NO :2有至少約80%序列同一性的多肽的核苷酸序列。例如，轉化的宿主 光合微生物，如藍細菌可包含與SEQ ID NO :1有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或 至少約99%序列同一性的核苷酸序列，其中該轉化的宿主顯示ASF、SPS和/或SPP活性和 /或累積蔗糖。例如，轉化的宿主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :2有至少約85%、至 少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中該轉化的宿 主顯示ASF、SPS和/或SPP活性和/或累積蔗糖。再例如，轉化的宿主光合微生物可包含 在嚴謹性雜交條件下在SEQ ID NO 1的全長上與SEQ ID NO 1雜交的核苷酸序列，該核苷 酸序列編碼活性SPS/SPP融合(ASF)多肽。再例如，轉化的宿主光合微生物可包含任何上 述序列的互補序列。在一些實施方式中，蔗糖磷酸合酶(sps)(參見，例如SEQ ID NO :3編碼sps基因， SEQ ID NO :4編碼SPS多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中表達或過量 表達。例如，可用具有SEQ ID NO :3所示序列的核苷酸轉化光合微生物，從而表達蔗糖磷 酸合酶。再例如，可用與SEQ IDNO :3具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約 95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉化光合微生物，所述SEQ ID NO :3編碼具有 蔗糖磷酸合酶的多肽。再例如，轉化的宿主光合微生物可包含編碼與SEQID NO :4具有至少 約85 %、至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所 述轉化的宿主顯示SPS活性和/或累積蔗糖。在一些實施方式中，蔗糖磷酸磷酸酶(spp)(參見，例如SEQ ID NO 5編碼spp基 因和SEQ ID NO :6編碼SPP多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中表達或 過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍細菌，從 而表達蔗糖磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO: 5具有至少約80%、至少約85%、至少 約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉化光合微生物，所述SEQ ID NO :5編碼具有蔗糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉化的宿主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :6具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一性的多 肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示SPP活性和/或累積蔗糖。在一些實施方式中，光合微生物經工程改造以表達ASF、SPS和/或SPP中的一種 或多種。例如，可工程改造光合微生物，如藍細菌，以表達ASF和SPS ；ASF和SPP ；SPS和 SPP ；或 ASF、SPS 禾口 SPP0海藻糖可通過依次起作用的兩種酶活性，海藻糖磷酸合成酶(tps)和海藻糖磷酸磷酸酶 (tpp)的催化作用實現生物合成海藻糖。可在光合微生物中工程改造這些活性之一或二者 從而導致海藻糖累積。一些光合微生物，例如藍細菌中天然不發生海藻糖的生物合成。在一些實施方式中，海藻糖磷酸合酶(tps)(參見，例如SEQ ID NO :76編碼tps基 因，SEQ ID NO :77編碼TPS多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中表達或 過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :76所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍細菌， 從而表達海藻糖磷酸合酶。再例如，可用與SEQ ID NO :76具有至少約80%、至少約85%、 至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %同一性百分比的核苷酸轉化光合微生物，所述SEQ ID NO :76編碼具有海藻糖磷酸合酶的多肽。再例如，轉化的宿主光合微生物可包含編碼與 SEQ ID NO :77具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一性的多 肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示TPS活性和/或累積海藻糖。在一些實施方式中，海藻糖磷酸磷酸酶(tpp)(參見，例如SEQ ID NO 78編碼tpp 基因，SEQ ID NO :79編碼TPP多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中表達 或過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :78所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍細菌， 從而表達海藻糖磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO :78具有至少約80%、至少約85%、 至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %同一性百分比的核苷酸轉化光合微生物，所述SEQ ID NO :78編碼具有海藻糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉化的宿主光合微生物可包含 編碼與SEQ ID NO :79具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序列同一 性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示TPP活性和/或累積海藻糖。葡糖基甘油在一些實施方式中，葡糖基甘油磷酸合酶(gps)(參見，例如SEQ ID NO 80編碼 gps基因，SEQ ID NO 81編碼GPS多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中 表達或過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :80所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍 細菌，從而表達葡糖基甘油磷酸合酶。再例如，可用與SEQ ID NO :80具有至少約80%、至少 約85 %、至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 %同一性百分比的核苷酸轉化光合微生物， 所述SEQ ID NO :80編碼具有葡糖基甘油磷酸合酶的多肽。再例如，轉化的宿主光合微生物 可包含編碼與SEQ ID NO :81具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%序 列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示GPS活性和/或累積葡糖基甘油。在一些實施方式中，葡糖基甘油磷酸磷酸酶(gpp)(參見，例如SEQ IDNO 82編碼 gpp基因，SEQ ID NO 83編碼GPP多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中 表達或過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :82所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍 細菌，從而表達葡糖基甘油磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO :82具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉化光合微生物，所述SEQ ID NO :82編碼具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉化的宿 主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :83具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或 至少約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示GPP活性和/或累 積葡糖基甘油。甘露糖基果糖在一些實施方式中，甘露糖基果糖磷酸合酶(mps)(參見，例如SEQ IDNO 84編碼 mps基因，SEQ ID NO 85編碼MPS多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物中 表達或過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :84所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍 細菌，從而表達甘露糖基果糖磷酸合酶。再例如，可用與SEQ ID NO :84具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉化光合微 生物，所述SEQ ID NO :84編碼具有甘露糖基果糖磷酸合酶的多肽。再例如，轉化的宿主光 合微生物可包含編碼與SEQ ID NO 85具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少 約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示MPS活性和/或累積甘 露糖基果糖。在一些實施方式中，甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(mpp)(參見，例如SEQ IDNO 86編 碼mpp基因，SEQ ID NO 87編碼MPP多肽)或其同源物經工程改造而在轉化的光合微生物 中表達或過量表達。例如，可用具有SEQ ID NO :86所示序列的核苷酸轉化光合微生物，如藍 細菌，從而表達甘露糖基果糖磷酸磷酸酶。再例如，可用與SEQ ID NO :86具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%同一性百分比的核苷酸轉化光合微 生物，所述SEQID NO :86編碼具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，轉化的宿 主光合微生物可包含編碼與SEQ ID NO :87具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、或 至少約99%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述轉化的宿主顯示MPP活性和/或累 積甘露糖基果糖。分子工程改造本領域技術人員能設計、製備和檢驗與asf序列具有以上所需同一性百分比並保 留所表達蛋白質的所需活性和/或糖累積表型的變體核苷酸和它們編碼的多肽。例如，可 根據參考文獻所述方法進行突變體的定向進化和快速分離，所述參考文獻包括但不限於 Link 等· (2007) Nature Reviews 5 (9)，680-688 ；Sanger 等.(1991) Gene 97 (1)，119-123 ； Ghadessy 等.Q001)Proc Natl AcadSci USA 98 (8) 4552-4557。因此，本領域技術人員能制 備大量與本文所述參比序列具有，例如至少95-99%同一性的核苷酸(例如，asf、sps、spp、 tps、tpp、gps、gpp、mps 或 mpp)和 / 或多肽(例如，ASF、SPS、SPP、TPS、TPP、GPS、GPP、MPS 或MPP)變體，並根據本領域的常規方法從其中篩選包括二糖累積在內的表型。通常可在任 何位置作出保守性取代，只要能保留所需活性。核苷酸和/或胺基酸序列同一性百分比(％ )應理解為當比對兩條序列時，相比於 參比序列，與候選序列中的核苷酸或胺基酸殘基相同的核苷酸或胺基酸殘基百分比。為測 定同一性百分比，可比對序列，且如果需要，可引入空位以實現最大序列同一性百分比。測 定同一性百分比的序列比對方法是本領域技術人員熟知的。可利用公眾常可用的計算機軟 件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)軟體比對序列。本領域技術人員可 決定檢測比對的合適參數，包括在所比較序列的全長獲得最大比對所需的任何算法。比對序列時，給定序列A與給定序列B的序列同一性百分比(或可表述成與給定序列B具有或 包含與給定序列A的一定序列同一性百分比)可計算為序列同一性百分比=X/Y100，其 中X是通過比對A和B的序列比對程序或算法評分為相同匹配的殘基數，Y是B中的殘基總 數。如果序列A的長度不等於序列B的長度，A相對於B的序列同一性百分比不等於B相 對於A的序列同一性百分比。「高嚴謹性雜交條件」定義為在65°C，在6Χ SSC緩衝液(即，0.9M氯化鈉和 0.09M檸檬酸鈉)中雜交。在這些條件下，通過計算兩條序列之間的DNA雙螺旋的解鏈 溫度(Tm)可測定給定的一組序列是否會雜交。如果在6XSSC的鹽條件下，特定雙螺旋的 解鏈溫度低於65°C，則兩條序列不會雜交。另一方面，如果相同鹽條件下的解鏈溫度高 於65°C，則序列會雜交。通常可利用下式測定任何雜交的DNA:DNA序列的解鏈溫度Tm = 81. 5°C +16. 6 (Iog10 [Na+]) +0. 41 (G/C 含量分數)-0. 63(% 甲醯胺)-(600/1)。此外，核苷酸 同一性每降低1%, DNADNA雜交體的Tm降低1-1. 5°C (參見，例如Sambrook和Russel， 2006)。可採用本領域已知的各種標準技術轉化宿主細胞(參見，例如Sambrook和 Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分 子克隆的精簡方案實驗室手冊)，冷泉港實驗室出版社，ISBN-IO :0879697717 ；Ausubel ^ . (2002) Short Protocols in MolecularBiology (分子生物學簡便方案)，第 5 版， Current Protocols (最新方案)，ISBN-10 :0471250929 ;Sambrook 和 Russel (2001) Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第3版，冷泉港實驗室 出版社，ISBN-10 :0879695773 ；Elhai, J.和 Wolk，C. P. 1988. Methods in Enzymologyl67, 747-7 )。此類技術包括但不限於病毒感染、磷酸鈣沉澱、脂質體介導的轉染、微量注射介 導的遞送、受體介導的攝取、細胞融合、電穿孔等。可選擇和繁殖轉染的細胞以提供包含穩 定整合入宿主細胞基因組的表達載體的重組宿主細胞。啟動子可將上述核苷酸序列中(^i^[J,asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)的一
種或多種操作性連接於可在宿主光合微生物中起作用的啟動子。如果宿主是藍細菌，啟動 子最好可在藍細菌和細菌，例如大腸桿菌中有效起作用。啟動子選擇能在各種條件下表達 所需的基因產物。可在其中插入載體構建物的光合微生物宿主細胞，例如藍細菌中選擇起最佳作用 的啟動子。還可根據它們的調節特徵選擇啟動子。此類特徵的例子包括轉錄活性和可誘導 性升高。啟動子可以是誘導型啟動子。例如，可根據溫度、pH、激素、代謝物(例如，乳糖、甘 露糖、胺基酸)、光(例如，波長特異性的)、滲透勢(例如，鹽誘導的)、重金屬或抗生素誘導 啟動子。本領域技術人員已知許多標準的誘導型啟動子。在一些實施方式中，啟動子是溫度誘導型的啟動子。例如，λ啟動子是可在藍細 菌中起作用的溫度誘導型啟動子。令人意外的是，λ啟動子起作用的溫度不同於當其在 大腸桿菌中起作用時的溫度。在大腸桿菌中，λ啟動子在42°C最有活性，該溫度高於藍細 菌的正常存活範圍。一般而言，在大腸桿菌中，約30°C-35°C時，λ啟動子的表達增加約 5% -10%，約37°C時，表達增加約20% ；但在約37°C _42°C，表達增加約100%。在藍細菌中，λ啟動子在約30°C _35°C最有活性，其是藍細菌的理想生長溫度範圍，並且該範圍遠低 於λ啟動子在大腸桿菌中的最佳表達。因此，λ啟動子在藍細菌中提供二糖生物合成活 性的有效表達。可插入質粒的啟動子的例子包括但不限於carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA和 λ ΡΚ(參見，例如實施例6)。在一些實施方式中，啟動子可在藍細菌和大腸桿菌中有效起作 用。在一些實施方式中，asf編碼區包含啟動子及所述編碼區(參見，例如實施例8)。例 如，asf編碼區可在asf的SPP結構域之前包含啟動子(參見，例如圖10)。這種內部啟動 子可在asf編碼區起點處攜帶或不攜帶啟動子。術語「嵌合的」應理解為指兩個或更多個不同多核苷酸分子的部分的融合產物。 「嵌合啟動子」應理解為指通過操作已知啟動子或其它多核苷酸分子產生的啟動子。例如， 可通過融合第一啟動子的異源增強子結構域與第二啟動子及其自身的部分或完整調節元 件，從而將此類嵌合啟動子與可賦予或調節一個或多個啟動子或調節元件的基因表達的增 強子結構域組合。因此，本發明包括按照本文公開的方法設計、構建和利用嵌合啟動子以調 節操作性連接的多核苷酸序列的表達。可通過多種方法設計或工程改造新型嵌合啟動子。例如，可通過融合第一啟動子 的增強子與第二啟動子來產生嵌合啟動子。相對於該第一或第二啟動子，得到的嵌合啟動 子可具有新型表達特性。可構建新型嵌合啟動子使得第一啟動子的增強子結構域融合在第 二啟動子5』端、3』端或內部任何位置。構建物可在構建物中提供任何上述可轉錄多核苷酸分子序列。本發明構建物通常包含在 宿主光合微生物，例如藍細菌中起作用的，操作性連接於上述二糖生物合成的可轉錄多核 苷酸分子(^iJ$n，asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)，^iJ$nSEQ ID N0:l、3、5、76、 78、80、82、84和86所示及其變體的啟動子。示範性啟動子如上所述。還可在重組構建物中提供一個或多個額外的啟動子。這 些啟動子可操作性與上述任何可轉錄的多核苷酸分子序列連接。術語「構建物」應理解為指任何重組多核苷酸分子，例如質粒、粘粒、病毒、自主復 制的多核苷酸分子、噬菌體、或線形或環狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，它們衍 生自任何來源，能進行基因組整合或自主複製並包含多核苷酸分子，其中一個或多個多核 苷酸分子已按照功能上的操作性方式連接，即操作性連接。術語「載體」或「載體構建物」應 理解為指可為轉化目的使用的任何重組多核苷酸構建物，即，將異源DNA引入宿主光合微 生物，例如藍細菌中。此外，構建物可包括但不限於來自感興趣基因的非翻譯區的額外多核苷酸分子。 這些額外的多核苷酸分子可衍生自相對於構建物中存在的其它元件為天然或異源的來源。質粒在一些實施方式中，用基於質粒的表達系統轉化宿主光合微生物，例如藍細菌 (參見，例如實施例幻。編碼感興趣基因的質粒優選包含啟動子，例如上述那些中的一個或 多個。對於基於質粒的轉化，優選能在大腸桿菌和藍細菌中起作用的宿主範圍廣的質粒，該 質粒提供在能有效轉移入最終宿主(藍細菌)的方便快速生長熟知系統(大腸桿菌)中起 作用的優勢。在一些實施方式中，可聯用基於質粒的轉化和染色體整合，其中質粒方案用於設計和檢驗基因變體，然後進行所鑑定變體的染色體整合。可通過本領域已知的許多方法(參見，例如Mudier (2005) Protein ExprPurif. 41(1), 207-234 ;Gellissen 編，(2005)Production of RecombinantProteins Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems (重組蛋白生產新型微生物和 真核表達系統)，ffiley-VCH, ISBN-IO :3527310363 ；Baneyx (2004) Protein Expression ^Technologies (蛋白質表達技術)，Taylor 和 Francis，ISBN-10 :0954523253)評估按照本 文所述方法開發的宿主菌株。本文提供用於編碼sps、spp和/或asf的質粒構建物的核苷酸序列。編碼sps、 spp和/或asf的質粒構建物的例子包括但不限於=PLybALll (SEQ ID NO 19)(參見，例如 圖6)和pLybAL12(SEQ ID NO :20)(參見，例如圖7)。本文還提供用於編碼tps和tpp的質 粒構建物的核苷酸序列。編碼tps和tpp的質粒構建物的例子包括但不限於PLybAL23 (SEQ ID NO :118)。技術人員應知道可為累積其它二糖，例如葡糖基甘油和甘露糖基果糖所需的 生物合成基因製備類似構建物。在一些實施方式中，轉化的宿主光合微生物包含pLybALll (SEQ ID N0:19)或 pLybAL12(SEQ ID NO :20)。在一些實施方式中，轉化的宿主光合微生物包含pLybAL23 (SEQ ID NO :118)。例如，轉化的藍細菌可包含 pLybALll(SEQ ID NO 19)、pLybAL12 (SEQ ID NO: 20)或 pLybAL23(SEQ ID NO :118)。包含二糖生物合成基因的質粒構建物還可包含啟動子。包含sps、spp和/或 asf及啟動子的質粒構建物的例子包括但不限於pLybAL7f (SEQ ID NO :65) ；pLybAL8f, 包含卡那黴素抗性(SEQ ID NO 69) ；pLybAL13f (SEQ IDNO 51), pLyAL13r(SEQ ID NO: 52), pLybAL14f (SEQ ID NO :53)，pLybAL14r(SEQ ID NO :54)，pLybAL15(SEQ ID NO: 44), pLybAL16(SEQ ID NO :45)，pLybAL17(SEQ ID NO :46)，pLybAL18(SEQ ID NO :47)， pLybAL19(SEQ ID NO :48)，pLybAL21(SEQ ID NO :49)和 pLybAL22(SEQ ID NO :50)。包 含tps和tpp及啟動子的質粒構建物的例子包括但不限於PLybAL23 (SEQ ID NO :118)、 pLybAL28(SEQ ID NO :121)、pLybAL29(SEQ ID NO :122)和 pLybAL30(SEQ ID NO :123)。技 術人員應知道可為累積其它二糖，例如葡糖基甘油和甘露糖基果糖所需的生物合成基因制 備類似的含啟動子構建物。在一些實施方式中，轉化的宿主藍細菌包含pLybAL7f(SEQ ID NO :65)；
pLybAL8f(SEQIDNO :69) ；pLybAL13f(SEQIDNO51)，pLyAL13r(SEQIDNO:52),pLybAL14f(SEQIDNO53)，pLybAL14r(SEQIDNO54)，pLybAL15(SEQIDNO:44),pLybAL16(SEQIDNO45)，pLybAL17(SEQIDNO 46)，pLybAL18(SEQIDNO:47),
pLybAL19 (SEQ ID NO :48)，pLybAL21(SEQ ID NO :49)和 pLybAL22 (SEQ ID NO :50)。在一 些實施方式中，轉化的宿主藍細菌包含pLybAL28(SEQ ID NO 121)、pLybAL29 (SEQ ID NO: 122)、pLybAL30(SEQ ID NO :123)和 pLybAL23(SEQ ID NO :118)。糖分泌在各種實施方式中，轉化的二糖累積的光合微生物可將累積的二糖自細胞內分泌 入其生長環境。二糖分泌可以是轉化光合微生物以累積二糖的固有作用，或者可進一步工 程改造光合微生物以分泌二糖。例如，經轉化以累積海藻糖的一些藍細菌本身從細胞中分 泌海藻糖(參見，例如實施例19-20)。再例如，可進一步工程改造經轉化以累積蔗糖的藍細菌以從細胞中分泌蔗糖(參見，例如實施例16)。可進一步工程改造宿主光合微生物，例如藍細菌以分泌二糖。在一些實施方式 中，轉化的宿主光合微生物經工程改造以表達所累積二糖特異性的通道蛋白。例如，可進 一步工程改造經工程改造以累積蔗糖的藍細菌，從而表達蔗糖通道蛋白(參見，例如實施 例16)。在一個實施方式中，轉化的二糖累積性藍細菌包含scrY核酸，例如SEQ ID NO 94。在一個實施方式中，轉化的二糖累積性藍細菌包含編碼scrY多肽，例如SEQ ID NO: 95的核酸。在一個實施方式中，轉化的二糖累積性藍細菌包含含有scrY的質粒，例如 pLybAL32(SEQ ID NO :91)。預計類似的方法可應用於其它光合微生物或其它靶二糖。糖降解的調節在一些實施方式中，進一步工程改造宿主光合微生物，例如藍細菌，通過調節降解 活性以提高二糖產量(參見，例如實施例14)。在一些實施方式中，可下調或消除轉化的光 合微生物中的轉化酶同源物。例如，可下調或消除轉化的藍細菌中集胞藍細菌PCC 6803的 轉化酶同源物(核苷酸序列SEQ ID NO 70 ；多肽序列SEQ ID NO 71)。再例如，可下調或消 除轉化的藍細菌中細長聚球藍細菌PCC 7942的轉化酶同源物(核苷酸序列SEQ ID NO 72 ； 多肽序列SEQ ID NO :73)。在一些實施方式中，下調或消除轉化的藍細菌中蔗糖酶鐵氧還蛋 白-樣蛋白。例如，可下調或消除轉化的藍細菌中集胞藍細菌PCC 6803的蔗糖酶鐵氧還蛋 白-樣蛋白(核苷酸序列SEQ ID NO 74 ；多肽序列SEQ ID NO 75) (Machray G. C.等.1994. FEBS Lett 354,123-127).可採用，例如圖11所述的無標記缺失方案(參見，例如實施例 12-13)刪除這些基因。經工程改造以在藍細菌中累積的其它二糖可採取類似的方法。本領域已知下調以上基因或使之沉默的其它方法。例如，可利用反義寡核 苷酸、蛋白質適配體、核苷酸適配體和RNA幹擾(RNAi)(例如，小幹擾RNA(siRNA)、短 髮夾 RNA(shRNA)禾口 微小 RNA (miRNA)(參見，例如 Fanning 禾口 Symonds Q006) Handb Exp Pharmacol. 173，289-303G，描述 了錘頭核酶和小髮夾 RNA ;Helene，C.等，(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 ；Maher (1992)Bioassays 14(12) :807-15,描述 了靴向 脫氧核糖核苷酸序列；Lee等.Q006)Curr Opin Chem Biol. 10，1-8，描述了適配體； Reynolds 等，Q004)Nature Biotechnology 22 (3)，3洸_330，描述了 RNAi ;Pushparaj 和 Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33 (5-6), 504-510，描述了 RNAi ;Dillon 等.Q005) Annual Review of Physiology 67，147_173，描 述了 RNAi ;Dykxhoorn 禾口 Lieberman (2005) Annual Review ofMedicine 56，401—423，描述 了 RNAi)下調或消除二糖降解活性。RNAi分子可商品化購自各種來源(例如，德克薩斯州 安變公司(Ambion，TX)；密蘇裡州西格瑪阿爾德裡奇公司(Sigma Aldrich, M0)；英傑公司 (Invitrogen)) 0採用各種算法的幾種siRNA分子設計程序是本領域已知的(參見，例如 Cenix 算法，安變公司；BLOCK-iT RNAi Designer，英傑公司；siRNAWhitehead Institute Design !"ools，生物信息學和研究計算公司(Bioinofrmatics&Research Computing))。確 定最佳siRNA序列的特性影響包括siRNA末端的G/C含量、siRNA的特定內部結構域的Tm、 siRNA長度、CDS(編碼區)內靶序列的位置和3』突出端的核苷酸含量。在一些實施方式中，可進一步工程改造宿主光合微生物以促進二糖從細胞中分 泌。例如，可進一步工程改造藍細菌以促進蔗糖從細胞中分泌(參見，例如實施例15-16)。 處於低滲環境時，蔗糖可從細胞中自動除去，如一些生物從高鹽轉入低鹽環境時滲透保護劑所作的那樣(Schleyer, M.，Schmidt, R.和 Bakker，E. P. 1993. Arch Microbiol 160， 424-43 ；Koo, S. P.，Higgins, C. F.和 Booth, I. R. 1991. J Gen Microbiol 137，2617-2625 ； Lamark, Τ.，Styrvold,0.B.和 Strgim, A. R. 1992. FEMS Microbiol. Lett 96，149-154)。可 工程改造蔗糖通道蛋白使之在轉化的藍細菌中表達(參見，例如實施例16)。可按照上述技 術克隆這些基因並轉化入藍細菌。這些方法可適用於其它光合微生物。在一些實施方式中，通過穩定整合入宿主的染色體來轉化宿主光合微生物。例如， 宿主藍細菌通過穩定整合入宿主的染色體來轉化(參見，例如實施例11-1 。染色體整合 可確保靶基因安裝在有機體內而沒有採用質粒基因表達有時會發生的逐出風險。染色體整 合還可降低或消除為維持靶基因而對抗生素的需求。染色體整合方案優選將基因靶向插入染色體中稱為upp的基因座(參見，例如實 施例11-1 。該位點編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶(UPRT酶)，其是嘧啶生物合成中的清 除酶。採用該方案允許通過可除去未整合有機體的5-氟尿嘧啶(5-FU)選擇候選對象。通 常在藍細菌系統中採用分離方法，因為這些有機體含有它們的染色體的多個拷貝(例如， 對於集胞藍細菌PCC 6803多達12拷貝，對於細長聚球藍細菌PCC 7942是16拷貝)。該方 案對於藍細菌特別有吸引力，因為該方法可避免採用依賴用於成功分離的選擇性壓力和統 計學積分的傳統分離技術。利用5-FU作為篩選劑更有效，因為它能防止哪怕含有一個活性 upp基因的任何有機體生長。以此方式，與傳統技術所需的過程相比，可在較少生長周期中 快速選擇完全整合的候選對象。固相光合生物反應器本文提供培養光合微生物的光生物反應器，其包括固相培養支持物以供光合微生 物生長。固相培養支持物或固體培養支持物或固體支持物等通常理解成表示既非液體也 非氣體的培養支持物。雖然該支持物本身是固體的，但可選擇該支持物結構以便吸附液體 (例如，生長培養基)、氣體或二者。在下文更全面描述的某些優選實施方式中，所述固體支 持物可吸收水分以供微生物在培養期間使用。本文所述光生物反應器的各種實施方式可支持光合微生物生長。在光生物反應 器中生長的光合微生物可以是，例如天然光合微生物，例如藍細菌，或工程改造的光合微生 物，例如人工光合細菌。天然具有光合作用或經工程改造具有光合作用的示範性微生物包 括但不限於細菌；真菌沽細菌；原生生物；微觀植物，例如綠藻；和動物，例如浮遊生物、 渦蟲和變形蟲。天然光合微生物的例子包括但不限於極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽生杜氏 藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾柵藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、 斜生柵藻、項圈藻、管鏈藻屬、柱孢藻屬、聚球藍細菌、集胞藍細菌和/或底棲藍藻。優選配置生物反應器以支持接種、培養和/或收穫如上所述經轉化以累積二糖的 藍細菌。所述光生物反應器可以是下文更全面描述的開放式或封閉式系統。在各種實施方 式中，光生物反應器包括固相培養支持物、保護屏障層和懸掛元件。光生物反應器的一些實 施方式可包括遞送和/或除去氣體、液體、營養物和/或光合微生物的系統。遞送系統可以 是，例如標準管道附件。各種管路的任一種可包括快速連接的管道附件。光生物反應器可具 有氣體遞送管線，其能遞送例如遞送二氧化碳或普通空氣。光生物反應器可具有液體遞送 管線。液體遞送管線優選與滴流或滴液系統連接，所述滴流或滴液系統將液體(例如，水)運送至固相培養支持物。光生物反應器可具有營養遞送管線。本領域普通技術人員能配製 用於光合微生物生長和維持的營養組合物。在一些實施方式中，可以合併營養和液體遞送 管線，例如以供應基於液體的營養混合物。在一些實施方式中，液體遞送管線或營養遞送管 線可以是將液體培養基分配在生長表面上的噴霧裝置。在這種噴霧裝置中，光生物反應器 應足夠大，從而能，例如在外層，如屏障層和固相培養支持物之間容納噴霧裝置。營養物通 常以水基組合物供應。可有利地提供不同的水遞送管線和營養物遞送管線以便獨立控制水 分和營養物水平。光生物反應器可具有產物收穫管線以便收集光合微生物和/或液體懸浮 /可溶性產物。光生物反應器可具有接種管線以便接種光合微生物。在一些實施方式中，可 合併液體、營養物和/或接種管線。圖1(正視圖)和圖2 (側視圖)描述了固相光生物反應器的一個實施方式。在這 些實施方式中，保護屏障7包圍固相培養支持物2。圖2顯示固體培養支持物在構成保護屏 障7的保護屏障層3之間。固體培養支持物2提供在其上培養光合微生物的表面。構成保 護屏障7的保護屏障層3是透明的，從而光化射線能達到固體培養支持物2的表面以支持 光合微生物生長。可重複密封的外罩4使得保護屏障7可鬆脫地密封。氣體和蒸氣交換通 過結合入保護屏障7的材料的選擇性面板5進行。可通過支持元件6將光生物反應器1懸 掛成垂直或非水平方向。固相光生物反應器的另一實施方式描述於圖12A(正視圖)和圖12B(側視圖)中。 可將反應器1設計成分段形式，這種形式有助於維修和將表面和/或管路的汙染可能性降 低到最小。各段可經各種供應和產物收穫管線的管路(例如，快速連接形管路)與反應器 連接。可通過懸掛元件6將反應器支撐在，例如軌道上，從而反應器1能懸在空中並有助於 各段的快速維修。外部保護屏障7可以是能使光線穿透的透明材料，從而有助於生長表面 2上的光合作用，且防止環境汙染和水分因蒸發而損失。生長表面2可由能保持水分、供應 營養物、除去產物和/或能使光合微生物高密度生長的材料構成。可通過管路供應生長表 面2，該管路通過液體培養基提供連續補料/從該表面收穫產物。培養基管道8可以是將液 體滲至表面2的多孔軟管，培養基可因重力而濾過生長表面2。液體可通過收穫管9在反應 器底部收穫，該管收穫產物和過量的液體培養基以運出反應器1。可通過氣體分散管10將 氣體，例如二氧化碳和空氣供應給反應器。氣體供應管10可提供正壓環境，預計能以受控 而有效的方式提供生長所需的氣體。氣體供應管線10還可通過溼化進入的氣流而有助於 將水分損失降至最少。反應器中的過量氣體可由可呼吸面板5(在相反側，未示出)排出， 該面板是能使氣體通過但最小化或消除環境汙染的多孔材料。通過過濾供應管線10遞送 的進入氣體，反應器1的正壓配置預計能使汙染程度最小化。正壓還通過提供給氣流由內 向外的途徑而能防止環境汙染。在圖12B描述的實施方式中，反應器1的結構元件以相對於生長表面的方向描述。 允許過量氣體溢出反應器1的可呼吸面板5可面向該裝置的底部安置，以提供氣體穿過生 長表面2轉移的途徑。將可呼吸面板5定位在屏障表面7底部還能最小化或防止二氧化碳 因其密度高於空氣而隔開和聚集的可能性。可根據培養表面2上最佳生長要求的氣體流動 速度來確定可呼吸面板5的尺寸。固相培養支持物本文所述光生物反應器的固相培養支持物提供光合微生物在其上和/或其中能生長的表面。固相培養支持物優選包含為有機體提供水分和/或營養物或有助於提供和/ 或保留水分和/或營養物的材料，從而促進和維持生長。本發明的實施方式不限於可培養 的光合微生物的類型或菌株。本領域普通技術人員將知道細胞生長所需的水分的量和營養 物的用量及組成將根據待培養的光合微生物的類型或菌株和應用而變化。通常應避免對光 合微生物的生長具有有害作用的材料(或那些材料中或其上所含的物質)。可採用單光生物反應器培養一種類型或多種類型或菌株的光合微生物。此外，固 體培養支持物可包含適合一個培養周期或多個培養周期的一種或多種材料，培養周期之間 可以進行或不進行滅菌。還有，可將光生物反應器配置成在一個或多個固體支持物上培養 一種類型或菌株的微生物或多種類型或菌株的微生物。在一些實施方式中，可以在一個培 養支持物上同時培養不同光合微生物的群體，或光合和非光合微生物的群體，而不是純性 培養。單光生物反應器還可包含多個培養支持物。因此，在另一實施方式中，單保護屏障內 的多個培養支持物可同時培養一種或多種類型或菌株的光合微生物。固體培養支持物優選包含相對多孔的材料。相對多孔的材料通常具有較大表 面積，可比相對非多孔的材料保留和/或吸附更多水分。還優選具有質地粗糙或形貌 (topographical)表面的固體培養支持物。與質地相對不粗糙或平滑的表面相比，質地粗糙 或形貌表面能提高細胞密度。雖然通常對支持材料和表面形貌作出選擇以增強微生物與支 持物的粘附作用，但通常需要該生物不是非常緊密地粘附以致於妨礙它們的移動或收穫。 在一些實施方式中，固體培養支持物包含適合微生物粘附和生長的材料。在一些實施方式 中，固體培養支持物包含減少或消除生物膜形成的材料。據信，本文所述光生物反應器的固相支持物不同於本領域所用的固體支持物(例 如，微生物生長最常用的固相支持物是瓊脂)。瓊脂通常澆鑄在剛性形態的物體中，例如培 養皿，並在其中使用以維持其物理完整性，因為瓊脂在接觸最低水平的應力、應變或二者時 易破碎或撕裂。相比之下，所述培養支持物的各種實施方式足夠強且耐用，從而能用於光生 物反應器中同時維持其物理完整性而無需更強、更耐用的「框架」。或者從另一方面講，現有 技術涉及與實質上更強、更耐用材料(例如，培養皿)接觸，從而形成複合體的弱瓊脂支持 物的充足部分。因此，所述光生物反應器的各種實施方式的固相支持物本身適合於培養微 生物，並且足夠強而耐用。下文描述了固相支持物的其它所需的物理特徵和/或操作參數。例如，支持物可 以是相對平坦和剛性的(類似平板)，或者其可由通過，例如絞鏈、彈簧、金屬絲、絲帶等柔 性連接的多個平坦而剛性的部件構成。合適的剛性材料包括但不限於各種金屬、聚合物、 陶瓷及其複合材料。剛性材料優選具有提高光合微生物與其粘附性的表面形貌。此外，剛性 材料可以所需水平的多孔性形成，以增強遞送水分和/或營養物至光合微生物的能力。此 外，剛性材料可包被有吸附劑或超級吸附聚合物製劑(見下文)。或者，支持物可基本上由 柔性材料，例如織物構成。用於固相支持物中的織物包括但不限於棉、聚酯和/或棉聚酯 摻混物，任選包被有吸附劑或超級吸附劑聚合物製劑。培養支持物的柔性是極為有利的，因 為它使得培養支持物可以摺疊、扭轉、懸掛或捲起以便儲存、運輸或處理。此外，固相培養支持物優選其結構在高溫下(例如，約120°C和更高)穩定，例如高 壓滅菌器消毒期間通常會遇到的，並且不會如瓊脂般融化。因此，在一個實施方式中，可通 過高壓滅菌法消毒該培養支持物，然後置於本發明的保護屏障內。在另一實施方式中，該培
本發明的固體培養支持物可包含支持光合微生物生長的任何材料或由其製備。例 如，該支持物可由天然材料、修飾的天然材料、合成材料或它們的任何組合構成。天然材料 包括但不限於棉、羊毛、加工的紡織植物纖維和天然多糖(例如，瓊脂、澱粉、纖維素)。修 飾的天然材料可包括但不限於化學修飾的植物纖維，例如硝酸纖維素或纖維素酯，除與聚 酯或聚醯胺纖維共同紡織的或摻混的天然纖維外。合成材料包括但不限於由尼龍、纖維玻 璃、聚矽氧烷、聚酯、聚烯烴、聚醯胺、共聚酯、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚磺酸酯構成的纖維。 固體培養支持物材料的其它例子包括但不限於絲網、聚氨酯泡沫、氯乙烯泡沫、玻璃碳泡 沫、聚酯/聚乙烯泡沫、聚醯亞胺泡沫、聚異氰酸酯泡沫、聚苯乙烯泡沫和聚酯泡沫或它們 的組合。在各種實施方式中，固體培養支持物是織物。可通過以下方法形成織物，例如，但 不限於紡織、編織、制氈和將纖維或聚合物鍵合或交聯在一起。可以構建鬆散的或開放式 的織物。或者，可以緊密構建織物。即，具有明顯質地、表面積、形貌可變性和/或粗糙度的 織物可將光合微生物更多地機械鍵合或粘附於培養支持物，因此在用有機體接種支持物和 /或其培養和/或收穫過程期間對光生物反應器進行操作、運輸或者移動的實施方式中是 特別優選的。在大多數情況中，有機體與基板的粘附性不宜太大，以致於過分阻礙在收穫操 作期間移動它們。此外，可通過選擇通常是疏水性、親水性織物或這些織物的混合物來控制 織物保留有機體所用水分和/或營養物的能力。這些特性使得固體支持物能保留和/或運 送水分和/或溶解於其中的營養物，從而這些水分和/或營養物能為表面生長的微生物所 用。可選用能增強光合微生物生長的材料包被支持物來提高培養支持物的特性，特別 是水分和/或營養物保留。例如，可用瓊脂或超級吸附劑聚合物，如修飾的纖維素酯、丙烯 酸酯或丙烯酸酯/多胺共聚物摻混物包被培養支持物。這些包被材料通常能吸附和保留超 過其乾重10-100倍的水。在一些實施方式中，這些材料配製成在離子性培養基組分存在下 將保留它們的超級吸附特性。包被材料可包被培養支持物表面，或織物的纖維(如果使用 的話)，或二者。在一個實施方式中，在瓊脂中包被作為培養支持物的毛巾布樣品。當如此 包被固體培養支持物時，如果光合微生物與其相連，則培養支持物的「表面」包括包被物的 表面。為使培養支持物薄、柔軟和輕，包被物優選薄的，例如不超過約100微米。然而，還可 依據所需應用，或固體培養支持物和所選包被材料的組合利用較厚包被物。所述固相培養支持物可以是複合分層結構。固相培養支持物可包含布置成毗鄰的 至少兩層。多層固相培養支持物可偶聯，例如通過鍵合、縫合、粘合、壓制或任何其它合適的 方法。各層可各自獨立選自上述幾種材料。例如，所述固相培養支持物可包含織物第一材 料層，其鍵合至合成泡沫第二材料層。再例如，所述固相培養支持物可包含合成泡沫第一材 料層，其鍵合至密度相同或不同的合成泡沫第二材料層。所述固相培養支持物優選複合分 層結構，該結構至少包含由高表面積生長材料構成的第一層和由可滲透型材料構成的第二 層。除了提供水分、營養物和表面以供附著，培養支持物可提供捕獲光化射線的表面。 因此，在一些實施方式中，固體培養支持物的尺寸是片狀的。即，所述支持物的深度小於支持物的長度和寬度。在一個實施方式中，所述培養支持物是保護屏障的薄膜樣層之間的片 狀層。這種平的生物反應器可如平板那樣懸掛。在另一實施方式中，培養支持物恰如光生 物反應器的外層屏障所封閉的幕布那樣懸掛。傳統固相支持物，例如瓊脂的薄片易裂開，可 能不能如此懸掛。因此，優選單獨的固體培養支持物在懸掛時，甚至在用液體飽和時能維持 其完整性。如本文所示，毛巾布類型編織的織物可提供合適的固體支持物(參見，例如實施 例1)。本領域技術人員應知道其它天然的、經修飾天然的和合成材料也可接受。毛巾布提 供許多據信是本發明固體支持物的理想特性。例如，當在常規條件下(例如，溫度)，採用非 破壞性技術(例如，彎曲、摺疊、扭轉或捲曲)操作時，其柔軟，不易撕裂、扯開、破碎或破裂。 類似地，當適度拉伸時(甚至用液體飽和時)，毛巾布通常不易撕裂、扯開或破碎。此外，毛 巾布常是高度質地粗糙的，因為其由許多纖維環構成。這為微生物粘附提供了大表面積，從 而增加了可在任何給定尺寸的支持物上生長的微生物數量。此外，棉毛巾布通常吸附至少 約3倍其本身的重量，從而織物支持物能保留水分和溶解於其中的任何營養物，使得它們 為支持物表面生長的微生物所用。因此，各種實施方式提供固體培養支持物，該固體培養支 持物是薄的或片狀尺寸，懸掛時能支持其本身的溼重，柔性的，易彎曲的、具有吸附性、質地 高度粗糙或它們的任何組合。上述支持物可以(在許多應用中優選)反覆使用，更優選的是，只要它們結構合理 並提供足以支持單次使用後沉積的微生物生長的表面，從而能降低操作成本和廢料。即，某 些應用中可以優選單用支持物，例如培養用於產生藥物產品，如小有機分子或治療蛋白和 肽的重組光合微生物。為降低這種單用支持物的成本以及鑑於不會再使用它們的事實，此 類支持物無需耐用，因此可用成本較低和耐用性較差的方法和/或材料製備或構建。例如， 由類似於紙巾纖維的紙纖維構成的支持物可能適合。固相培養支持物的幾種實施方式描述於圖13。圖13A描述的固相培養支持物材料 是可提供可維持表面以供有機體生長、水分和營養物通路、有機體附著點和/或除去培養 產物的一種材料。該材料允許液體滲濾和平衡擴散，從而在表面和有機體之間交換營養物、 水分和產物。該結構構造圖是可作尺寸和形狀優化的高表面積材料的一種實例。圖13B所 述固相培養支持物材料是由各自對於生長表面具有特定功能的多層材料組成的混合材料。 基底層可以是使得經材料滲濾而有效供應營養物和水分以及除去產物的多孔材料。基底材 料還可為生長表面提供物理支持。外層要求與基底層連接，並可作優化以提供有機體的附 著點。就表面積和與培養的微生物的相容性而言，表面層可更多地控制表面生長環境。保護屏障本文所述的光生物反應器可包含保護固體培養支持物和生長表面免遭汙染和/ 或水分喪失的屏障。同時，光生物反應器將光化射線(陽光或人工光)和二氧化碳提供給 光合微生物。在各種實施方式中，光生物反應器包括培養光合微生物的至少一個固體支持 物和保護屏障。保護免遭物理操作和/或汙染為防止汙染，保護性物理屏障可至少部分覆蓋固體培養支持物。在某些實施方式 中，物理屏障可包含培養支持物。保護性屏障還可控制(至少部分控制)水分從支持物和/ 或光生物反應器內的空氣中散失到光生物反應器外的空氣中。本領域技術人員應知道，可依據所需的本發明實施方式從多種類型的材料中的任一種構建保護屏障。所述保護屏障可完全包圍培養支持物。如果保護屏障是永久密封的，必須破壞、切 割、撕開屏障，或作相似處理才能取得其內的培養支持物。因此，在一些實施方式中，從保護 屏障到培養支持物和微生物生長表面提供了通路。在優選的實施方式中，保護屏障可鬆脫地密封。可鬆脫密封可以是多種密封類 型中的任一種，包括但不限於拉鏈-型密封，例如Ziploc 儲存袋(sc強生公司(sc Johnson Company))、鉤環型扣件(例如，威克羅美國公司(Velcro USA，Inc.))、扭結(twist ties)、尼龍扣條(zipties)、撳鈕、夾具、壓敏背襯粘合劑表面(pressure sensitive adhesive backed surfaces)和該領域已知的所有等同方式。然而，不一定需要完全密封； 不完全密封外層屏障可能更有效，從而更易於取得培養支持物。光生物反應器可在保護屏障內包含一個培養支持物或多個培養支持物。在一些實 施方式中，在一個保護屏障內包含一個培養支持物。例如，塑膠袋可形成其中包含了一個固 體培養支持物的保護屏障(參見，例如圖1)。在其它實施方式中，一個保護屏障可包含多個 固體培養支持物。例如，溫室型結構可形成其中包含了多個固體培養支持物的保護屏障。光化射線的傳遞光生物反應器可將光化射線(陽光或人工光)傳遞至光合微生物。但本發明的保 護屏障無需透光。如果其中提供光合微生物生長所需的足夠光源，一些實施方式可包含包 圍在不透明保護屏障內的培養支持物。提供透明的屏障以利用陽光，例如作為光源可能更 理想、更簡單、更經濟等。優選的實施方式提供包含以下材料的透明屏障，例如但不限於玻璃或任何類型 的透明或通常可見光能穿透的聚合物，例如聚乙烯、丙烯酸聚合物、聚對苯二甲酸乙二醇 酯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯或它們的共聚物或它們的組合。透明屏障可以選自耐用且不易扯 開、撕裂、破裂、磨損、粉碎或其它類似物理損壞的材料。可依據耐受高壓滅菌器消毒或其它 接觸極端溫度的能力選擇透明屏障材料。此外，可選擇耐受長期接觸陽光或其它輻射而不 脫色或退化的透明屏障材料。本領域技術人員應知道耐受光氧化的特定塗層或製劑可能特 別有用。此外，可選擇紅外反射或吸收塗層以降低和/或調節本發明光生物反應器內的溫 度累積。本領域技術人員應知道透明屏障材料的厚度會根據機械性能規模而有所不同。例 如，透明屏障材料可以為約IOmil厚度的工業/海運業類型塑料，或者可以為家用塑膠袋類 型，g卩，約anil厚。在一個實施方式中，透明屏障材料薄而柔韌。例如，透明屏障材料可以 低於約IOrni 1。在一些實施方式中，屏障形成覆蓋薄的、柔韌的固體培養支持物兩側的保護層或 薄膜。該實施方式的裝配光生物反應器將是柔韌的，可以彎曲、捲曲、摺疊、扭轉等以便儲 存、運輸、運送或處理。在另一實施方式中，透明屏障材料是剛性的。例如，屏障可以是玻璃 溫室。溫室玻璃的厚度最可能優選與建築實踐相一致，但也可能改變。出於實踐目的，此類 實施方式的光生物反應器將是固定的，但可在一個保護性透明屏障的空間內對多個固體支 持物進行操作、運輸、運送，等等。雖然可選擇保護屏障以提供足夠的光線供光合微生物生長，但無需整個屏障是透 明的。因此，在一些實施方式中，屏障的諸部分，例如一條或多條邊緣由非透明材料製成。所述非透明材料可以由以下材料構成，包括但不限於聚乙烯纖維材料(Tyvek )、聚四氟 乙烯過濾介質、纖維素過濾材料、玻璃纖維過濾材料、聚酯過濾材料和聚丙烯酸酯過濾材料 和它們的組合。可因耐用性選擇非透明材料。在此類實施方式中，可進一步保護屏障的透 明部分以免被耐用的非透明部分導致的撕裂、撕開、磨損、脫落等等。在一個實施方式中，非 透明部分提供或包含連接結構和/或加強結構，從而通過進一步包含安裝或連接點(例如， 孔、環、鉤、索環或其它技術上的等同裝置、開口或凹槽)和/或將該光生物反應器固定於某 結構的某機構而懸掛該光生物反應器。雖然任何此類安裝點不一定要位於非透明部分中或 其上，但它們可包含在該屏障的非透明部分內或其上，屏障的透明部分內或其上，或屏障的 非透明和透明部分內或其上。該連接結構還可包含在該固體培養支持物內或其上，或穿過 該固體培養支持物。在一些實施方式中，該裝置具有可分辨的前側和後側。該裝置的前側表示面對光 源，因此前側上的屏障部分優選透明的，而偏離光源側的保護屏障部分不必需是透明的。提供氣體交換在光合作用期間，光合微生物消耗二氧化碳並釋放氧。本文所述的光生物反應器 可提供足以產生所需量的光合作用的二氧化碳。將二氧化碳供應到光生物反應器內的一種 方式是允許在該光生物反應器內的空氣和其周圍空氣之間的直接氣體交換。例如，可在保 護屏障中提供洞、通氣孔、窗或其它此類開口，從而該系統對於周圍的空氣是開放的。但當考慮到光合微生物的汙染時，這種開放式構形可能不理想。為解決該問題，保 護屏障可將一個或多個固體支持物完全密封在內以隔開外部空氣。在此類實施方式中，可 通過將二氧化碳引入該封閉外殼中來維持所需濃度。例如，本領域技術人員將知道來自二 氧化碳壓縮罐的管路或管道使得二氧化碳混合入封閉在光生物反應器內的空氣中。此外， 已知可利用工廠、工業設備、發電站等的排放物作為光合微生物的二氧化碳源，因而能減少 碳排放。在一個實施方式中，供氣管線可將二氧化碳提供至生長表面局部區域。提供氣體可透過的選擇性屏障來利用大氣二氧化碳可能是理想的、更簡單、更經 濟等。因此，一些光生物反應器實施方式提供選擇性屏障，其允許在保護屏障內封閉的環境 與周圍空氣之間交換氣體和蒸氣，但仍能提供密封物理屏障以免汙染。此類屏障可以是至 少部分氣體/蒸氣可透過的(例如，透過性遠低於常規紡織織物、高於塑料膜和/或類似於 銅版紙)，因此能交換氣體，例如二氧化碳和氧，但對於固體和液體至少是部分透過的，優選 不透過。在一些實施方式中，光生物反應器可包含半透屏障層和氣體供應管線以在生長表 面周圍或附近區域維持高二氧化碳濃度。在一些實施方式中，選擇性屏障的平均孔徑或直徑不大於約10微米，氣體交換率 至少約5，不大於約10，000葛爾萊秒(葛爾萊秒或葛爾萊是描述在給定壓力差下100立方 釐米氣體經過1. 0平方英寸的給定材料所需秒數的單位)。因此，除了允許氣體交換，所述 選擇性屏障可防止水分從封閉的系統中流失。保護屏障的選擇性屏障部分可由任何合適的聚合物材料構成，例如紡絲粘合烯烴 屏障(spunbonded olefin barrier)。可從杜邦公司(DuPont)容易地購得商標Tyvek 的具有各種特性的紡絲粘合烯烴屏障(極細的聚乙烯纖維)。此類材料因組合了多種物理 特性而尤其有利，即，它們能阻止液體傳遞，例如水，但具有高度氣體/蒸氣透過性；它們強 度較高，吸附少量或不吸附水分，耐撕裂，具有明顯的彈性和高度柔韌性。當在MIT彎曲測試儀(flex tester) (TAPPI方法T_42;3)上測試時，紡絲粘合烯烴可超過20，000輪。此外， 它們對大多數酸、鹼和鹽呈惰性，雖然長期接觸氧化物質，例如濃硝酸或過硫酸鈉會導致強 度有一定喪失。紡絲粘合烯烴屏障具有良好的尺寸穩定性，即，恆溫，0-100%相對溼度下， 薄片尺寸的改變小於0.01%。某些產物符合美國聯邦規則法典第21條(Title 21 of the United States Code of Federal Regulations) (21 CFR177. 1520)對於直接食品接觸應用 的要求。它們還具有優秀的黴菌和發黴抗性；以及中性PH。然而，遺憾的是，它們的UV抗 性不好。即，通常預期室外使用壽命至少1-3個月。此外，可用不透明塗層或通過在聚合物 纖維中包含入UV抑制劑來改進它們的UV抗性。此外，由於迄今為止生產的紡絲粘合烯烴 是不透明的，包含這種材料的保護屏障部分優選不存在和/或不多從而不會損害光合微生 物的培養。具體地說，可以產生「硬」和「軟」結構類型的紡絲粘合烯烴。10型是「硬的」面-粘 合產品，其是光滑的、硬的非定向的紙-樣形式。14和16型是「軟的」點-粘合產品，其具 有浮雕花紋以提供織物-樣柔性基材。14型(或其等價物)可在，例如要求屏障的耐用性 和呼吸性的情況下使用。16型是穿有5-20mil (0. 13-0. 51mm)孔的針，從而給予它們比14 型更高的空氣和水分透過性，額外的柔軟度和更高的柔韌性和懸垂性，但撕裂強度和屏障 特性較低。因此，可通過選擇一種或多種類型的紡絲粘合烯烴產品來定製選擇性屏障的特 定特性。選擇性聚合物屏障的其它例子包括但不限於尼龍、聚碸、聚四氟乙烯、纖維素、玻 璃纖維、聚酯和聚丙烯酸酯膜和過濾材料以及它們的組合。保護屏障的整體無需是氣體透過性的，從而提供對於光合微生物的生長具有充分 選擇性的屏障。只需足夠進行充分氣體交換的保護屏障部分是氣體透過性的。在一個實施 方式中，所述選擇性部分是保護屏障面板(參見，例如圖1)。可改變與支持物表面面積相關 的選擇性面板的大小和位置以獲得特定應用所需的氣體交換量而不會過度阻礙微生物的 培養。本領域技術人員應知道由氣體可透過的選擇性材料構成的外部屏障面積百分比將取 決於該材料的氣體透過率。事實上，由於氣體可透過部分將仍允許水蒸氣穿過其運送，在各 種實施方式中，選擇該保護屏障的氣體可透過部分的大小以充分運送氧和二氧化碳，同時 使水分流失最小化。懸掛和傳送系統可將本文所述的光生物反應器構建為用於大規模生產和/或通過，例如整合入操 控和傳送系統來收穫。圖3顯示用於以連續方法操控大量光生物反應器的光生物反應器場 (photobioreactor farm)的示範性設計的俯視圖。將該光生物反應器或培養面板(未單獨 顯示)連接於傳送系統8。傳送系統8將培養面板沿著它們的路徑移動。多個傳送系統匯 聚到位於中心的接種和收穫中心9。因此，培養面板移入接種和收穫中心9，在此處對它們 進行加工(例如，收穫和/或接種)，然後在接種後以及生物量的培養期間將面板移離中心。 隨後在收穫前的培養後期將面板移回中心，最終攜帶用於收穫的成熟生物量到達中心。然 後重複該周期。收穫的生物量可經管道10運送以便進一步加工。可通過加入額外傳送系統 或額外接種和收穫中心來提高光生物反應器場的性能以形成專用於生物量產生的大陣列。光生物反應器的懸掛為給光合微生物提供光，光生物反應器的優選實施方式中的培養支持物是薄的，片狀的。當水平定位時，底層空間(floor space)的充分利用率易降低，因此，在本發明的 某些實施方式中，培養支持物是非水平定位的，優選基本上垂直的，或者更優選垂直的。然 而，培養支持物基本上可以任何方式定位，只要足夠量的光化射線可達到微生物。因此，當 光生物反應器的類型是保護屏障在固體支持物周圍形成緊密結合的膜或層時，整個光生物 反應器的優選方向是垂直的，但任何方向均可接受。為清楚起見，上述方向(例如，垂直、水 平、基本上垂直、非水平等)是相對於培養支持物下方的底層或底面而言，假定該底層或底 面是水平的。可利用各種結構、支架、平臺、擱物架等以所需方向放置或懸掛培養支持物或整個 光生物反應器。具體地說，培養支持物和/或保護屏障可懸掛在能懸掛固體培養支持物和 /或光生物反應器的繩、線、鉤、纜繩、軌道、鋼軌、鏈、架子、杆、管、支架、平臺、梁或任何其它 此類結構上，或與其相連。多個培養支持物和/或光生物反應器可懸掛在同一結構上，類似 晾衣繩上懸掛的被單。可靜態，或以允許它們移動的方式懸掛培養支持物和/或光生物反 應器。孔、環、鉤等的位置優選將培養支持物和/或光生物反應器的重量基本上平均分布。懸掛光生物反應器或培養支持物(尤其是以垂直方向)在空間上高效，並可提供 操作優勢。然而，本發明的生物反應器或培養支持物無需懸掛。例如，在本發明的某些實施 方式中，所述培養支持物具有足夠的剛性，如果以非水平、垂直或基本上垂直(例如，在支 持物類似於剛性平板、面板、柵格等的實施方式中，通過將其基底固定或安置於某表面或其 上)定位，其可支持其本身重量並將維持如此定位。在另一實施方式中，保護屏障自由樹 立，例如溫室，多個培養支持物在其內懸掛和/或自由樹立。懸掛光生物反應器和/或培養支持物(特別是以垂直方向)在空間上高效，可能 提供操作優勢。然而，本發明的生物反應器或培養支持物無需懸掛。例如，在本發明的某些 實施方式中，所述培養支持物具有足夠的剛性，如果以非水平、垂直或基本上垂直(例如， 在支持物類似於剛性平板、面板、柵格等的實施方式中，通過將其基底固定或安置於某表面 或其上)定位，其可支持其本身重量並將維持如此定位。在另一實施方式中，保護屏障自由 樹立，例如溫室，多個培養支持物在其內懸掛和/或自由樹立。傳送本文還描述了將光生物反應器、光生物反應器的保護屏障內的培養支持物或它們 的某些組合從一個位置傳送至另一位置的系統。對於各種原因，可運送光生物反應器和/ 或培養支持物的能力是有利的。例如，可以優化它們的位置以便接受光線，維持所需溫度 或氣體含量。當多個光生物反應器或培養支持物分屬不連續步驟，例如接種、培養、誘導和 /或收穫時，運送能力可特別有利，因為可能採用連續型方法將光生物反應器或培養支持物 更有效地移動至數個指定的位置，而不是將所需材料和設備運送至固定的光生物反應器或 培養支持物。因此，即使在接種後，亦可傳送生長表面，無論是單獨傳送培養支持物或封閉在保 護屏障中的培養支持物。本領域技術人員熟悉常用於工業應用的多種類型的傳送系統。該 傳送系統不限於任何特定類型，只要其能移動一個或多個光生物反應器或培養支持物。本 領域技術人員應知道光生物反應器或培養支持物與傳送系統之間的連接類型會依據所用 傳送系統的類型而有所不同，可作出選擇與作為培養支持物和/或保護屏障一部分的任何 固定點共同起作用。雖然預想能通過一個或多個馬達驅動的機械方式(例如，通過鏈條和齒輪的作用)傳送培養支持物或光生物反應器，但還可用人力傳送它們(例如，簡單地推動 懸掛的生物反應器，所述生物反應器通過沿著軌道滑動的軸承機構連接於軌道)。懸掛光生物反應器和/或培養支持物(特別是以垂直方向)的傳送系統在空間上 高效，可能提供操作優勢。但傳送系統無需依賴於將光生物反應器或培養支持物懸掛起來。 例如，光生物反應器可沿著傳送系統的頂部移動，例如通過在滾筒傳送帶上滑動。在一個實 施方式中，該傳送帶系統可移動包含封閉在保護屏障中的培養支持物的光生物反應器。或 者，光生物反應器的保護屏障可以是保護一個或多個移動多個培養支持物的傳送帶系統的 大封閉外殼。光生物反應器場對於大規模應用，構建具有足夠大小的單個培養支持物可能不實際。因此提供了 利用兩個或數個或數十或數百或數千或更多個培養支持物以便在光生物反應器「場」中培 養光合微生物。這些培養支持物可均位於單個保護屏障內，因此包含單個光生物反應器，或 者多個培養支持物可以是多個光生物反應器的一部分。在任一情況中，將多個光生物反應 器或培養支持物組織在光生物反應器場內以便有效操作和處理是有利的。組織它們的配置 以最大程度得到從光源，例如太陽獲取的能量也是有利的。這種組織可包括以有序方式配 置多個光生物反應器或培養支持物，所述方式例如但不限於行、列、同心圓、柵格形式，從 中點向外輻射，等等。在各種實施方式中，該場包括懸掛在同一結構上，例如軌道、鋼軌、鏈、線等的多個 光生物反應器或培養支持物。在進一步的實施方式中，該結構是傳送系統的一部分，且該光 生物反應器或培養支持物沿著傳送系統的路徑從一個位置移動至另一位置。光生物反應器場可包括一個傳送系統或經配置的多個傳送系統，從而操控多個光 生物反應器或培養支持物。這種配置能放大以便同時包括兩個或數個或數十或數百或數千 或更多個傳送系統，從而操控兩個或數個或數十或數百或數千或更多個光生物反應器或培 養支持物。除了傳送系統外，光生物反應器場可包括指定的區域、站或中心以便執行諸如接 種、培養、誘導和/或收穫光合微生物等步驟。這些中心可以是執行某些步驟的專門設備的 位置。傳送系統的路徑可將光生物反應器或培養支持物帶至執行特定步驟的此類中心。然 後該光生物反應器或培養支持物可沿之移動至序列中的下一區域或中心。沿傳送系統的不 同光生物反應器或培養支持物可沿著該路徑位於不同中心，因此可同時進行不同步驟。在 一個實施方式中，傳送系統的路徑是環。一旦光生物反應器或培養支持物完成一輪培養過 程中的步驟，其可重複該過程。留出要被破壞或者最終需要替換的一些單位，基本上可反覆 使用同一套光生物反應器或固體培養支持物。在進一步的實施方式中，可在相同或幾乎相同的位置進行培養和收穫。該位置稱 為接種和收穫中心(參見，例如圖幻。在接種和收穫中心接種光生物反應器和/或固體培 養支持物。傳送系統形成環，然後運送光生物反應器或培養支持物離開接種和收穫中心。所 述光生物反應器或培養支持物隨後沿著傳送系統的路徑移動足以獲得所需細胞生長量的 時間。然後傳送系統將光生物反應器或培養支持物返回接種和收穫中心收穫。多個傳送系 統可共有它們自此輻射出去的同一接種和收穫中心。如果還需要更大的生產力，光生物反 應器場可包括多個接種和收穫中心以操作多個傳送系統的光生物反應器或培養支持物。雖 然可實現效率提高，但接種和收穫位置無需是相同的或幾乎相同的位置。
光生物反應器的使用方法培養光合微生物本文所述的固相光生物反應器可用於培養光合微生物。可在固相光生物反應器 中培養的光合微生物包括但不限於天然光合微生物，例如藍細菌，或工程改造的光合微生 物，例如人工光合細菌。天然具有光合作用或經工程改造具有光合作用的示範性微生物包 括但不限於細菌；真菌沽細菌；原生生物；微觀植物，例如綠藻；和動物，例如浮遊生物、 渦蟲和變形蟲。天然光合微生物的例子包括但不限於極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻、鹽生杜氏 藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾柵藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、 斜生柵藻、項圈藻、管鏈藻屬、柱孢藻屬、聚球藍細菌、集胞藍細菌和/或底棲藍藻。在固相光生物反應器中生長的光合微生物優選包括藍細菌。可在生物反應器中生 長的藍細菌可以是藍藻門的任何光合微生物。在生物反應器中生長的藍細菌可以是單細胞 或菌落(例如，絲狀、片狀或球狀)形態。在生物反應器中生長的藍細菌優選是單細胞藍 細菌。可在生物反應器中生長的藍細菌的例子包括但不限於以下屬集胞藍細菌、聚球藍 細菌、熱聚球藍細菌、念珠藍細菌、原綠球藻、微囊藍細菌、魚腥藍細菌、螺旋藍細菌和粘杆 菌。在生物反應器中生長的藍細菌優選集胞藍細菌或聚球藍細菌(例如，細長聚球藍細菌 PCC7942 (ATCC 33912)和/或集胞藍細菌PCC 6803 (ATCC 27184))。在生物反應器中生長 的光合微生物更優選如本文公開的經工程改造以累積二糖的轉基因光合微生物。可給光生物反應器的固體培養支持物接種光合微生物，以及添加水分和其它組 分，包括但不限於營養物、鹽、緩衝劑、金屬、氮、磷酸、硫等。然後可鬆脫地密封該光生物反 應器，其中培養支持物在保護屏障內。例如，通過懸掛而將密封的光生物反應器以能控制光 照和溫度的位置和方式安置。安置可以是靜態的，或者光生物反應器可移動，例如以確保在 一天時間中最大程度接觸太陽輻射。光合微生物可培養所需的時間。本領域技術人員應知 道時間長度應根據微生物類型和所需的細胞生長密度而有所不同。例如，對於某些藍細菌 菌株，約4-約7天內的培養期可提供每升當量約50-約250克幹生物量的細胞產量。一段 培養時間後，可打開可鬆脫密封並收穫光合微生物。本文所用的「每升當量幹生物量的克數」是通過計算在所述培養表面生長的生物 量層的平均深度(例如，約150微米)並乘以培養表面的長度和寬度值來確定的單位。該 計算得到的是體積。然後，使自培養表面收集的生物量的重量與該體積相關，表示為「每升 當量幹生物量的克數」。連續培養方法如果培養光合微生物的過程可以連續進行，例如流水線那樣，則能實現更高的效 率。與要求設備和生產力能一次操控大量生物量，然後在批次之間無事可做不同，連續系統 要求的總生產力不高，但通過連續操作能更有效地利用生產力。通過將培養分成更小但更 多的組分，可將諸組分組織成空間上連續的配置。然後可以同時進行總體生產工藝中的不 同離散步驟。培養組分經歷某一工藝步驟後，該組分在工藝中向前移動，而另一組分代替其 在該步驟中。因此，終產物的產生不限於大批次的完成，而可隨著各組分完成該流水線樣工 藝而定期產生。此外，一輪工藝完成後，諸組分可立即再次開始該工藝，如此反覆。更具體地說，連續培養涉及利用可傳送光生物反應器或培養支持物以採用連續方 式培養光合微生物的方法。連續工藝應理解成允許光生物反應器或固體培養支持物從培養工藝的一個步驟前進至另一步驟的空間關係。或者，可將一個大的結構支持物用於連續工 藝中。具體地說，支持物可以是沿某線路(例如，類似於優選垂直布置的傳送帶)運行的環 狀材料(例如毛圈織物)。最終的結果是隨著多個光生物反應器或固體培養支持物順序而 反覆完成該工藝，可實現定期產生生物量。該類工藝表示大規模應用有機會在大但頻率低 的批次中產生生物量的過程中提高效率。在優選的實施方式中，連續空間關係沿著傳送系統的路徑。操作方式類似於流水 線。可以各種方式操作此類傳送系統。例如，可不間斷地操作傳送系統，同時將光生物反應 器或培養支持物從一個位置移動至另一位置。在此類實施方式中，進行接種、收穫等的同時 光生物反應器或培養支持物在移動。或者，可停止傳送系統以實施諸步驟，然後光生物反應 器或培養支持物重新移動至下一步驟的位置。此外，可不間斷地操作傳送系統，將光生物反 應器或培養支持物與傳送系統的移動相脫離以進行處理，然後重新連接從而再次進入傳送 流程。本領域技術人員應知道該通用方案也可能有其它排列。在連續培養方法的一個實施方式中，在沿著傳送系統的一個位置接種多個光生物 反應器。然後傳送系統將光生物反應器移動至進行光合微生物培養的區域。在傳送的該部 分，可以最佳光照而定位該光生物反應器以促進生長和光合作用。隨後，光生物反應器到達 可收穫光合微生物的位置。然後光生物反應器可沿傳送系統的路徑回到接種點以再次開始 該工藝。為提高效率，可使光生物反應器離開接種位置和到達收穫位置之間的時間與光合 微生物產生的所需生長量的時間一致。該工藝步驟不限於接種、培養和收穫；其它步驟可 包括誘導細胞合成所需產物或滅菌。雖然，以上實施方式描述了可傳送光生物反應器的系 統，但應該知道可在一個保護屏障內實施相同類型的連續培養以便傳送和處理多個固體培 養支持物。產生可發酵糖的方法可從更有效地培養光合微生物中獲益的一種技術是為替代燃料，例如乙醇或生物 柴油而產生生物量。與目前培養以產生生物量的植物，例如玉米、甘蔗、大豆、油菜籽、麻風 樹等相比，光合微生物，例如藍細菌產生生物量的速率更快，從而可導致更高的生產率。此 外，通過微生物直接產生二糖避免了利用植物生物量產生可發酵糖的大量能量密集型預處 理。此外，利用光養微生物替代植物可獲得較高的可發酵糖產率而沒有土壤耗竭、侵蝕和食 物供應轉變。與其它微生物相比，優選光養微生物，因為可從環境中供應它們的碳源(CO2) 和能源(光)，從而能極其廉價地培養它們。此外，可利用光養微生物消耗工業過程的碳排 放，因而提供了進一步的環境益處。從光合微生物產生大量可發酵糖的一個難點是它們通常消耗產生的碳水化合物 而非累積它們。雖然某些糖，例如蔗糖或海藻糖不為光合微生物用作主要碳源，但仍有緩慢 同化的機制。儘管有再處理機制(reprocessing mechanism)，此類材料可累積而不代謝。 如果能適當工程改造生物，則可滅活同化機制，從而能產生高產量的糖。本文提供由光合微生物產生可發酵糖，特別是二糖的方法。可發酵糖的例子包括 但不限於蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。所述可發酵糖優選蔗糖或海藻糖。 該方法適用於連續方式，從而提高生產的成本效率。可利用能合成可發酵糖的光合微生物實施該方法的各種實施方式。一些實施方式 利用和控制滲透-和基質水保護作用(matric water protection)等天然現象以產生發酵原料。在一個實施方式中，可發酵糖的合成誘導型的。在另一實施方式中，可通過遺傳操作 修飾可發酵糖的合成使之組成地產生。產生可發酵糖的光合微生物優選藍細菌。在一些實施方式中，藍細菌根據誘導型 內源性途徑累積二糖。在一些實施方式中，轉基因藍細菌根據工程改造的外源性途徑累積 二糖。上文進一步詳細討論了內源性和外源性途徑。轉基因光合微生物優選上文討論的一種或多種。能累積二糖的藍細菌菌株的兩個非限制性例子是細長聚球藍細菌PCC7942和集 胞藍細菌PCC 6803。天然細長聚球藍細菌PCC 7942接觸高達約700mM(其耐受上限)的鹽 濃度後合成蔗糖。當通過刪除agp基因阻斷葡糖基甘油生物合成時，集胞藍細菌PCC 6803 在接觸其耐受上限(可高達900mM)的鹽濃度後產生蔗糖作為其滲透保護劑。在一些實施 方式中，可通過將霧化鹽溶液直接施加於培養表面進行鹽誘導。該方法的優點之一是根據 品種的生長時間沿著生長表面可控制地引入施加物，從而能平衡生物量的累積和二糖，例 如蔗糖的產生。為產生可發酵糖，可在固體培養基上或在液體或凝膠培養基中培養和生長光合微 生物。本領域熟知光合微生物的培養和生長。因此，除了本文另有注釋，可根據此類已知的 方法進行光合微生物的培養和生長。例如，經工程改造以累積二糖的轉基因藍細菌可在液 體培養基中培養和生長。可從此類液體培養基中分離累積的糖，如果其從細胞中分泌的話。 可從自液體培養基收穫的光合微生物中分離累積的糖。在一個實施方式中，經工程改造以 累積海藻糖(如上所述)的轉基因藍細菌在液體培養基中培養和生長。可從液體培養基中 直接分離從轉基因藍細菌中分泌出的海藻糖。在一個實施方式中，經工程改造以累積蔗糖 (如上所述)的轉基因藍細菌在液體培養基中培養和生長。可從自液體培養基收穫的工程 改造藍細菌直接分離蔗糖。在一個實施方式中，經工程改造以累積和分泌蔗糖(如上所述) 的轉基因藍細菌在液體培養基中培養和生長。可從液體培養基中直接分離轉基因藍細菌分 泌的蔗糖。優選在誘導之前將光合微生物培養至每升當量至少約50克幹生物量的較高細胞 密度。可採用本文所述的固相光生物反應器實現這種較高的細胞密度。然後可用濃度確定 的合適鹽化合物處理累積的生物量來啟動/誘導二糖(例如，蔗糖)產生，所述合適鹽的濃 度能有效改變通過溶液電導率測得的培養基中水活性。在進一步優選的實施方式中，氯化 鈉是所用的鹽。合適的響應時期後(例如，至少約1小時到不超過約48小時)，可收穫載有 蔗糖的細胞，並處理以分離和回收產生的蔗糖。合適的響應期通常在至少約5小時到不超 過約M小時以內。更常見的合適響應期在至少約10小時到不超過約20小時以內。在一個實施方式中，合成的大多數二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油、甘露糖 基果糖)累積在細胞內。在另一實施方式中，所述細胞分泌所述二糖，然後從光生物反應器 中回收。無論二糖是在細胞內還是分泌的，可採用任何合適的收穫方法獲得該二糖，所述方 法包括但不限於施加於培養表面的水性噴霧洗滌液。可收集包含細胞和/或二糖的洗滌 液，並處理以分離和回收該二糖。現已詳細描述了本發明，應該明白可能有改型、變型和等同的實施方式而不脫離 隨附權利要求所限定的本發明範圍。此外，應該知道本說明書中提供的所有實施例是非限 制性實施例。實施例提供以下非限制性實施例是為了進一步說明本發明。本領域技術人員應知道以下 實施例公開的技術代表了發明人已經發現的能良好實施本發明的方法，因此可視作構成其 實施方式的實例。然而，本領域技術人員鑑於本文公開應知道可在公開的具體實施方式
中 作出許多改變並仍能獲得類似或相似的結果而不脫離本發明的構思和範圍。實施例1 固相光生物反應器構建的靜態樣機裝置包括anil聚乙烯屏障層和Ziploc 可釋放外套。將60cm2 可呼吸面板整合入一面，將225cm2編織的棉織物培養支持物表面置於其中。用70體積％水 性乙醇處理，然後在50°C用無菌過濾空氣流乾燥使該裝置滅菌。將30ml無菌BG-Il培養基 吸附到培養支持物上，然後利用氣溶膠點樣器將細長聚球藍細菌PCC 7942的預培養物接 種於生長表面。在沈！下，在BG-Il培養基中使預培養物生長2天，然後接種。將光生物反 應器置於維持在33°C的孵育室中，用冷白螢光燈以300微愛因斯坦(microeinstein)照射。 2天後，反應器顯示出有機體的活性生長，繼續生長2天，隨後從培養箱中取出該反應器，用 去離子水洗滌生長表面。蒸發除去水從而獲得25%ig乾重生物量。實施例2 通過光合微生物產生蔗糖以下是說明通過聯用光合微生物和光生物反應器產生蔗糖的方法的預言性實施 例可用。可在約15-40°C的溫度範圍內，約60-300微愛因斯坦照射下，二氧化碳濃度為約 0. 2-15體積％的條件下，用集胞藍細菌PCC 6803或工程改造的集胞藍細菌運行至少一個 光生物反應器，例如如實施例1或3所述得本發明的光生物反應器約4-7天。初始培養期 後，可利用氣溶膠噴霧，以濃度範圍約0. 01-1. 5M，更優選約0. 2-0. 9M的水性鹽溶液處理該 生長表面。再培養約1-2天以使蔗糖產生。然後用去離子水洗滌表面以收穫生長表面。在 進一步的實施方式中，洗滌水是無菌的新鮮培養基，洗滌強度應能收集約70-90%的細胞質 量。然後可繼續培養保留在培養支持物上的生物量作為後續周期。根據所用的生長表面材 料和有機體，估計這些培養的產量應是約200-600mg幹生物量。實施例3 用吸附劑聚合物包被的固體培養支持物用分散於BG-Il培養基中的無菌1. 5重量％瓊脂的熱溶液浸漬塗布實施例1所述 類型的靜態光生物反應器的生長表面。使塗布的生長表面冷卻和硬化，隨後將該表面插入 滅菌的保護屏障內以形成光生物反應器裝置並用實施例1所述得在預培養物中生長的細 長聚球藍細菌接種。基本上按照實施例1所述進行培養和收穫。實施例4:ASF基因靶通過調控蔗糖磷酸合酶(sps)和蔗糖磷酸磷酸酶(spp)活性來研究藍細菌中蔗糖 的生物合成。許多藍細菌中早已具有此類活性以便適應滲透和基質水分應激(參見，例如 Lunn, J.E.2002.Plant Physiol 128,1490-1500)。Lunn, J. Ε. (2002. Plant Physiol 128，1490-1500)分析了包括集胞藍細菌 PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC 7942在內的幾種生物的sps和spp基因的基因組構成。Lurm 提出集胞藍細菌PCC 6803的蔗糖磷酸合酶(SEQ ID NO 3)具有無活性的蔗糖磷酸磷酸酶 (SPP-樣)結構域和不同的SPP活性。該SPP-樣結構域與spp的同一性水平高，但缺失滷 代酸脫滷素酶(haloaciddehalogenase) (HAD)超家族的許多保守性活性位點殘基。雖然還未對細長聚球藍細菌PCC 7942作研究，但Lurm提出兩種活性均包含在一種酶中。這些酶 的比對示於圖5。檢索細長聚球藍細菌PCC 7942基因組未在染色體上其它處顯示有不同的sps基 因。利用細長聚球藍細菌PCC 7942酶(SEQ ID NO :2)，從而無需多基因表達。雖然PCC 7942 的基因稱為sps，但由於它是攜帶SPS和SPP活性的一種酶融合體，其根據活性SPS/SPP融 合體而稱為asf (SEQ ID NO :1)(不同SPP酶的可能表達的進一步信息見下文)。表達細長聚球藍細菌PCC 794hsf基因產物(SEQ ID NO 2)有兩種方法。第一種方法是根據寬範圍宿主的載體PMMB67EH構建的基於質粒的表達系統 (Furste, J. P. , Pansegrau, W. , Frank, R. , Blocker, H. , Scholz, P. , Bagdasarian, Μ.禾口 Lanka, Ε. 1986. Gene 48,119-131) 質粒 pMMB67EH 是 RSF1010 的衍生物，其在大多數革蘭 氏陰性，甚至在一些革蘭氏陽性有機體中複製，因而能對大腸桿菌、集胞藍細菌PCC 6803、 細長聚球藍細菌PCC7942和各種其它藍細菌中的蔗糖產生作基於質粒的分析(Kr印s，S.， Ferino, F. , Mosrin, C. , Gerits, J. , Mergeay, M.禾口 Thuriaux, P. 1990. Mol Gen Genet221, 129-133 ；Marraccini, P. , Bulteau, S. , Cassier-Chauvat, C. , Mermet-Bouvier, P.禾口 Chauvat, F. 1993. Plant Molecular Biology 23,905-909 ；Gormley, Ε. P.禾口 Davies， J. 1991. J Bacteriology 173,6705-8)。第二種方法是穩定整合入集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC7942的染 色體的UPP (尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶)基因座。出於下述原因選擇UPP基因座。實施例5 基於質粒的表達為基於質粒表達asf基因產物設計兩種質粒PLybALll (參見，例如圖6 ；SEQ ID NO 19)和pLybAL12(參見，例如圖7 ；SEQ ID NO 20)。構建質粒pLybAL12以便從預定的 啟動子表達，構建PLybALll以便從隨機選擇的啟動子表達。如下所示構建兩種質粒。採用全細胞作為模板，利用以下寡核苷酸，通過PCR擴增 細長聚球藍細菌PCC 7942的asf基因，從而產生SEQ ID NO :1所示產物5' -AGACTACAAT TGGGGCGTTTTCTGTGAG-3' (MfeI限制性核酸內切酶位點是在核苷酸位置7_12) (SEQ ID NO 7)禾卩 5' -CTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTCTGAAAAGGTTAAGCGATCGCCTC-3' (SEQ ID NO :8)。在含和不含上遊啟動子的情況下，從pBeloBACll (GenBank登錄號冊111；3)擴增編 碼氯黴素乙醯基轉移酶的基因(cat)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從pBeloBACll擴增缺乏啟動子的cat基因，從而產 生 SEQ ID N0:11 所示產物5' -TTATCGCGATCGTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAG-3 『 (SEQ ID NO 9)和 5' -CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3『 (SEQ ID NO 10) (PvuI和 PmlI 限 制性核酸內切酶位點分別是在核苷酸位置4-9和10-15)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從pBeloBACll擴增攜帶啟動子的cat基因，從而 產生 SEQ ID NO :14 所示產物5 『 -TTTTGGCGATCGTGAGACGTTGATCGGCACGTAAG-3 『 (SEQ IDNO 12)和 5' -CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3『 (SEQ IDNO 13) (PvuI 和 PmlI 限 制性核酸內切酶位點分別在核苷酸位置7-12和10-15)。用PvuI消化攜帶cat基因的PCR產物，用T4DNA聚合酶填平末端。然後將它們分 別與asf PCR產物連接。通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到的產物，用MfeI和RiilI消化，然 後用T4DNA連接酶連接於用EcoRI和HpaI消化的pMMB67EH的6. 6Kbp產物。將連接產物轉化入化學感受態的ΝΕΒδα (麻薩諸塞州伊普斯威奇新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs ；IpSWich，MA))，37°C下，在補加了 100微克/毫升氨苄青黴素的LB瓊脂上作選擇。 37°C下，在補加了 100微克/毫升氨苄青黴素的LB中培養所選的候選物以便小量製備，通 過限制性核酸內切酶消化分析，然後利用以下寡核苷酸通過序列分析驗證5' -GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3' (SEQ ID NO 15)、5' -TATCACTTATTCAGGCGTAGCAACCAG-3『 (SEQ ID NO 16)、5' -GTCGTTAGTGACATCGACAACACACTG-3『 (SEQ ID NO 17)和5' -GATCGCGATACTGATCGAGATAGGTC-3 『 (SEQ ID NO: 18)。選擇 pLybAL 11 的候 選號 5(pLybALll-5) (SEQ ID NO :19)和 pLybAL12 的候選號 1 (pLybAL12_l) (SEQ ID NO :20) 作進一步研究。根據小量製備期間的質粒產量，在大腸桿菌菌株NEB Turbo (麻薩諸塞州伊普斯威 奇新英格蘭生物實驗室)中增殖時，這些質粒的拷貝數顯示極大減少，提示宿主菌株的選 擇對這些質粒的重要性。實施例6:啟動子插入選擇6個啟動子插入pLybAL12_5。選擇編碼氨基甲醯磷酸合酶的集胞藍細菌 PCC 6803carB的推定啟動子，因為它在嘧啶和精氨酸生物合成中的作用而可能是強啟動 子，其可能緊鄰基因PyrR的上遊，在此情況中它們作為操縱子共同轉錄。集胞藍細菌PCC 6803 (Aichi，M.，Takatani，N.和 Omata, T. 2001. J Bacteriol. 183,5840-5847)和細長聚 球藍細菌 PCC 7942 (Maeda, S-I.等.1998. J Bacteriol 180，4080-4088)的硝酸鹽還原酶 (nirA)啟動子因為能通過氮源調節而選擇。還選擇細長聚球藍細菌PCC 7942的光系統II Dl 蛋白(psbAII)的強光照階段啟動子(Golden, S. S. ,Brusslan, J.和 Haselkorn，R. 1986. EMBO Journal 5，2789-2798)和集胞藍細菌PCC 6803的兩個暗階段啟動子[dnaK (Aoki， S. , Kondo, T.和 Ishiura M. 1995. J Bacteriol 177,5606-11)和 kaiA(Kucho，K-I. 等.2005. J BaCteriO1187，2190-2199)]作為調節的藍細菌衍生啟動子。最後，選擇已顯 示在藍細菌中有活性的入^溫度調節啟動子(Ferino，F.和Chauvat，F. 1989. Gene 84， 257-66 ；Mermet-Bouvier, P.禾口 Chauvat，F. 1994.Current Microbiology 28，145—148)。採用全細胞作為模板，利用以下寡核苷酸通過PCR擴增啟動子，從而產生所示產 物。引入用於克隆的限制性核酸內切酶位點示於序列中。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增集胞藍細菌PCC 6803 pyrR(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :23)5' -CGGTGTGCATGCCGTTATTGATGGAATG-3' (SEQ ID NO :21)和5' -TCACTAGGTACCTMATTACCTGGGAAGCCAG-3' (SEQ ID NO :22)，二者的限制性核 酸內切酶位點在核苷酸位置7-12。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增集胞藍細菌PCC 6803nirA(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :26)5' -CCCAAGGCATGCAGGAAAACAAGCTCAGAATGCTG-3' (SEQ IDNO :24)禾口5' -TTTATTGGTACCAACGCTTCAAGCCAGATAACAGTAGAGATC-3' (SEQ ID NO :25)，二者 的限制性核酸內切酶位點在核苷酸位置7-12。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增細長聚球藍細菌PCC7942psbAII (Sphl/Kpnl)(SEQ ID NO :29)5' -ATCTTTGCGTTCCGTGACGGCTACTG-3' (SEQ ID NO :27)和5' -GCAGATGGTACCGGTCAGCAGAGTG-3『(在核苷酸位置7_12具有限制性核酸內切 酶位點)(SEQ ID NO 28)。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增細長聚球藍細菌PCC 7942nirA(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :32)5' -CAGCCAGCATGCATAAATTTCTGTTTTGACCAAACCATCC-3' (SEQ ID NO :30)和5' -GTGGCTGGTACCATGGATTCATCTGCCTACAAAG-3' (SEQ ID NO :31)，二者在核苷酸 位置7-12具有限制性核酸內切酶位點。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增XPK(XbaI/KpnI) (SEQ IDNO :35) 5' -GTGCATTCTAGATGGCTACGAGGGCAGACAGTAAG-3' (SEQ ID NO 33)禾口5『 -TTCTGTGGTACCATATGGATCCTCCTTCTTAAGATGCAACCATTATCACC-3『 (SEQ ID NO 34)，二者在核苷酸位置7-12具有限制性核酸內切酶位點。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增集胞藍細菌PCC 6803 dnaK(SphI/ KpnI)(SEQ ID NO :38) 5' -GCCCCAGCATGCACCAGTAAACATAAATCTC-3' (SEQ ID NO :36)和5' -ATTGGTGGTACCGAGGTCAATCCCMCAAC-3' (SEQ ID NO :37)，二者在核苷酸位置 7-12具有限制性核酸內切酶位點。利用以下寡核苷酸，通過PCR從全細胞擴增集胞藍細菌PCC 6803 kiaA(SphI/ KpnI) (SEQ ID NO :41)5' -GCCAGAGCATGCAAAGCTCACTAACTGG-3' (SEQ ID NO :39)和5' -GGAAAAGGTACCTGAGTCTATGGGCAACGTG-3' (SEQ ID NO :40)，二者在核苷酸位 置7-12具有限制性核酸內切酶位點。擴增後，用以上顯示的限制性核酸內切酶消化PCR產物，凝膠純化並連接入類似 消化的 pLybAL12-l，從而分別產生質粒 pLybAL15(SEQ ID NO :44)、pLybAL16 (SEQ ID NO: 45)、pLybAL17(SEQ ID NO :46)、pLybAL18 (SEQ ID NO :47)、pLybAL19 (SEQ ID NO :48)、 pLybAL21(SEQ ID NO :49)和 pLybAL21 (SEQ ID NO :50)。將連接產物轉化入電感受態 ΝΕΒ5α (麻薩諸塞州伊普斯威奇新英格蘭生物實驗室)，30°C下，在補加了 100微克/毫升 氨苄青黴素、34微克/毫升氯黴素和5%蔗糖的LB瓊脂上作選擇。30°C下，在補加了 100 微克/毫升氨苄青黴素、34微克/毫升氯黴素和5%蔗糖的LB中培養所選的候選物以便小 量製備，通過限制性核酸內切酶消化分析，然後利用以下寡核苷酸通過序列分析驗證5' -GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3' (SEQ ID NO :42)和5 『 -ATGGGTCTGAATGTGCAGAATGTAGAG-3 『 (SEQ ID NO 43)。分別為質粒 pLybAL15(SEQ ID NO :44)、pLybAL16 (SEQ ID NO :45)、pLybAL17 (SEQ ID NO :46)、 pLybAL18(SEQ ID NO :47)、pLybAL19 (SEQ ID NO :48)、pLybAL21 (SEQ ID NO :49)禾口 pLybAL21 (SEQ ID NO :50)選擇候選物 6 和 7 (pLybAL15-6 和 pLybAL15_7)、2 (pLybAL16_2)、 4 和 5 (pLybAL17-4 和 pLybAL17-5)、1 和 2 (pLybAL18-l 和 pLybAL18-2)、1 和 2 (pLybAL19-l 和 pLybAL19-2)、3 和 5 (pLybAL21-3 和 pLybAL21_5)及 4 和 8 (pLybAL22-4 和 pLybAL22_8)，在補加了蔗糖和兩種抗生素的LB上選擇和生長這些質粒對於獲得克隆是必要 的。最初在只補加氨苄青黴素的LB上進行選擇，但不能分離含有啟動子的質粒。分離物或者僅是載體的重新連接，或者大小不一併且在氯黴素存在下缺乏增殖的能力。據認為，不斷 產生的內部蔗糖對細胞產生滲透壓休克，從而導致阻止蔗糖產生的缺失。隨後的實驗表明， 一旦分離，質粒在沒有蔗糖存在下穩定，可能通過最終誘導滲透應激機制和/或蔗糖消耗 酶。實施例7 集胞藍細菌和聚球藍細菌的轉化除非利用表述，與 Elhai，J.和 Wolk，C. P. 1988. Methods in Enzymologyl67, 747-754所述一樣，通過三親代接合(triparental conjugation)將含啟動子的質 粒 pLybAL15(SEQ ID NO :44)、pLybAL16 (SEQ ID NO :45)、pLybAL17 (SEQ ID NO :46)、 pLybAL18(SEQ ID NO :47)、pLybAL19 (SEQ ID NO :48)、pLybAL21 (SEQ ID NO :49)禾口 pLybAL21(SEQ ID NO :50)以及無啟動子的 pLybAL12_l 載體(SEQ ID NO :20)(參見實施例 5-6)置於集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC 7942中。離心沉澱在30°C培養的負荷菌株(cargo strain)(攜帶帶轉移質粒的NEB5 α )的 過夜培養物以及攜帶輔助質粒pRK2013(ATCC 37159)的HB101的過夜培養物，用LB洗滌兩 次，然後以1/10的原始體積重懸在LB中。30°C下，在恆定照射下用BGll-A使各藍細菌生長 至OD73tl約為0. 5，所述BGl I-A與BGl 1相同，除了痕量元素替換為Nitsch痕量元素(Nitsch， J. P.和 Nitsch，C. 1956. American Journal of Botany 43，839_851)。離心沉澱的細胞成 小團，用BGll-A洗滌兩次，重懸在含濃度增加7. 5-倍的BGll-A中。製備BGll-A的藍細菌 10倍系列稀釋液直至10_5。將100微升各稀釋液的藍細菌與各50微升的大腸桿菌負荷和 輔助菌株混合。然後將150微升的各混合物塗布到補加5% LB的BGll-A瓊脂(1. 5% )平 板上。在沈_281，恆定照射下溫育諸平板16-M小時。抬起各平板上的瓊脂(約30ml)， 加入300微升100X氯黴素溶液。對於集胞藍細菌PCC 6803氯黴素的終濃度是25 μ g/ml, 對於細長聚球藍細菌PCC 7942是7. 5 μ g/ml。繼續溫育8_12天。在補加了適當量的氯黴 素的BGll-A上反覆劃線從汙染大腸桿菌中純化轉化接合子的各菌落，從而再次獲得分離 的菌落。實施例8 :pLybALl 1-5中的啟動子文庫以下實施例描述了利用pLybALll_5(SEQ ID NO :19)(參見實施例5)構建藍細 菌DNA文庫以選擇啟動子。採用改進、放大的Wilson，K. (1997. Preparation of Genomic DNA from Bacteria(製備細菌的基因組 DNA) ·幹Ij於 Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學方法).約翰威利父子公司(John Wiley and Sons)第1卷，第 2. 4. 1-2. 4. 5頁)的染色體DNA分離方案，其中主要的不同在於溫育時間更長和用肌氨醯 (Sarkosyl)替代SDS。分離的DNA數量足以進行部分Sau3AI消化以插入pLybALll_5的 BamHI位點。如圖8所示，一些片段具有啟動子，而另一些沒有。在文庫構建過程中，在基因asf內發現可能的啟動子。要起到啟動子克隆載體的 作用，當啟動子插入asf基因之前時，質粒pLybALll-5(SEQ ID NO 19)應只耐受氯黴素， 因為該標記缺乏其正常的啟動子並且不包括asf上遊的啟動子。然而，一旦構建，在大腸杆 菌中檢查該質粒賦予的氯黴素抗性。在37°C下，在補加了 34微克/毫升氯黴素的LB瓊脂 (1.5% )上培養攜帶pLybALll-5的ΝΕΒ5α時，觀察到生長。然而，在補加了 34微克/毫 升氯黴素的液體LB培養基中培養時，生長几乎未觀察到至未觀察到。攜帶pLybAL12-l (SEQ ID NO 20)的ΝΕΒ5α在有氯黴素存在時，在固體和液體LB培養基中生長。
為驗證asf基因上遊沒有缺失的啟動子，而在轉錄終止子下遊，利用盧西根公司 的克隆輕鬆試劑盒(Lucigen CloneSmart kit)與大腸桿菌的盧西根菌株(E. cloni 10G) 感受態細胞將置於PMMB67EH中以製備pLybALll的插入物克隆入威斯康星州米德爾頓的盧 西根公司(Lucigen Corp.，Middleton，WI)的pSMART-LCKan平端克隆載體(參見圖9)。由 於是平端克隆，該插入物可以任一方向與質粒連接，從而產生pLybAL13f (SEQ ID NO :51)和 pLyAL13r(SEQ ID NO :52)。通過用終止子圍繞克隆位點將該載體專門設計成從載體消除轉 錄通讀。作為對照，用於構建pLybAL12的插入物也置於該載體中，從而產生pLybAL14f (SEQ ID NO 53)和pLybAL14r(SEQ IDNO :54)。這些質粒在瓊脂糖凝膠上看起來大小合適，但插 入物未經DNA測序驗證來證實克隆的完整性。然而，攜帶pLybAL13和pLybAL14 (攜帶以正 向或反向連接的克隆DNA)的E. clonilOG觀察到類似結果，分別與攜帶pLybALll (SEQ ID NO 19)和pLybAL12(SEQ ID NO :20)的NEB5 α觀察到的一樣。這表明該啟動子在大腸杆 菌中的活性弱。許多大腸桿菌啟動子在藍細菌中不起作用，反之亦然。可能是該啟動子活性在集 胞藍細菌PCC 6803或細長聚球藍細菌PCC 7942中觀察不到。為檢查這一點，如上所述通 過接合將pLybALll-5(SEQ ID NO :19)插入兩種有機體中。在補加了氯黴素(對於集胞藍 細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC 7942分別是25 μ g/ml和7. 5 μ g/ml)的BGll-A瓊 脂(1.5%)上觀察到生長。檢測攜帶pLybALll_5(SEQ ID NO 19)的這些有機體在含氯黴素的液體BGll-Ai 的生長。該活性可能非常弱，僅在存在於多拷貝質粒上時觀察到。對於大腸桿菌可能是這 種情況，但對於藍細菌可能不是。RSF1010是較低拷貝的質粒，在大腸桿菌中僅有12拷貝 (Frey, J. , Bagdasarian, Μ. M.和 Bagdasarian，M. 1992). Gene 113，101—106)。經歷快速分 裂的大腸桿菌具有最多2拷貝的其染色體，因此拷貝數增加至少6-倍。該質粒在藍細菌中 可能有相當的拷貝數。集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC 7942的染色體拷貝數 類似，分別是 10-12 和 16(Labarre，J.，Chauvat，F.和 Thuriaux，P. 1989. J Bacteriol 171， 3449-57)。以上結果提示藍細菌的asf基因中存在啟動子。圖10顯示asf基因中啟動子(或多個啟動子)可能的位置。Curtis，S. E. [1994. The transcription apparatus and the regulation of transcriptioninitiation ( 錄裝置和轉錄起始的調控).刊於The Molecular Biology ofCyanobacteria(藍細菌的 分子生物學).Bryant，D. Α.(編).克魯維學術出版社(Kluwer Academic Publishers) 第 613-699 頁]描述了轉錄起始元件。Sazuka，Τ.和 Ohara，0. (1996. DNA Research 3, 225-232)限定了翻譯起始元件。根據與已知SPS酶的比對和終止密碼子僅存在於上遊兩個密碼子處，預計asf基 因的翻譯起始開始於GTG起始密碼子處。雖然ATG起始密碼子是最常用的，GTG和TTG是 較不常用的，但不是罕用的。除了間隔略遠一些，還存在與16S rRNA的3』 -端互補的典型 大腸桿菌-樣Siine-Delgarno序列(GGAG或GAGG)，其中腺嘌呤核苷酸最好離也存在的起 始密碼子的第一個核苷酸9_12bp。該序列見於Mzuka和Ohara研究的約一半基因中。略 差的最適間隔並不罕見，但常導致表達水平降低。Siine-Delgarno序列上遊但在MfeI位點 下遊的序列太短從而不能引入啟動子。可能引入部分啟動子，但啟動子的其餘部分必須由 所有三種質粒(pLybALll-5(SEQ ID NO :19) ；pLybAL13f (SEQ ID NO :51)禾口 pLybAL13r (SEQID NO 52))的載體序列產生，這是不可能的。因此，啟動子活性可能位於asf基因內。如果該啟動子在asf基因內，一個可能的 位置是在asf的SPP結構域之前。這樣會得到細長聚球藍細菌PCC 7942的蔗糖生物合成 酶，其四級結構類似於集胞藍細菌PCC 6803的那些。各有機體具有彼此可能相互作用(或 不相互作用)的兩種蛋白質，帶翻譯稠合的SPP或SPP樣結構域的SPS結構域以及不同的 SPP。首先測定asf的SPP結構域是否甚至分別翻譯。從圖10和表1可以看出，TTG起 始密碼子緊鄰SPP結構域上遊，其前是aiine-Delgarno序列。表1 直接圍繞提出的spp起始密碼子的核苷酸。直接圍繞提出的spp起始密碼子 的核苷酸與72個藍細菌基因的共有序列比較。匹配共有序列的核苷酸以斜體字顯示，而與 共有序列不匹配的核苷酸以下劃線顯示。相對於起始密碼子的第一核苷酸給核苷酸編號。
NT#-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 123 4 5 6
共有序列A/G A/G Α/Τ Α/Τ Α/Τ Α/Τ Α/Τ A/T C/T T/C ATG A/G C C/T
Selo7942asfTGACTAGCGC GTG G CA
Selo7942sppTCGCAAACGC TTG A T T圍繞起始密碼子的區域幾乎與Mzuka和Ohara測定的72個藍細菌基因的共有序 列以及天然起始密碼子匹配。雖然根據大腸桿菌啟動子建立的規則測定了藍細菌啟動子， 但仍檢索了典型的-35和-10元件，因為啟動子確實在大腸桿菌顯示活性。鑑定了兩種可 能的啟動子，如圖10所示。asf中其它處還可能有其它啟動子。實施例9 將質粒從大腸桿菌轉移至藍細菌採用接合將基於PMMB67EH的質粒轉移入藍細菌。已有方法轉化這些有機 體(Zang, X. , Liu, B. , Liu, S. , Arunakumara, K. K. I. U.禾口 Zhang, Χ. 2007. Journal of Microbiology 45, 241-245 ;Golden,S. S.禾口Sherman,L. A. 1984. Journal of Bacteriology 158，36-42)，但這些方法未能採用天然轉化將這些質粒成功置於集胞藍細菌PCC 6803和 細長聚球藍細菌PCC 7942中。驗證藍細菌中是否存在質粒。通過asf/cat基因與以下寡核苷酸的組合的PCR產 生3. Ikb產物來分析轉化接合子中是否存在質粒5 『 -AGACTACAATTGGGGCGTTTTCTGTGAG-3 『(SEQ ID N0:7)和 5' -GGTGGTTGTGTTTGACAGCTTATC-3『 (SEQ ID NO :5 。此外，分離 並分析質粒。離心沉澱在補加了氯黴素(濃度如上所述)的BGll-A中生長的細胞培養物， 在TE中重懸，熱處理並利用普羅美加大師SV+小量製備試劑盒(Promega Wizard SV Plus miniprep kit)小量製備。但由於產量差，難以直接分析質粒。如此，分離的DNA轉化入大 腸桿菌ΝΕΒδα，利用普羅美加大師SV+小量製備試劑盒再分離，然後進行限制性核酸內切 酶分析。實施例10 蔗糖產生測定和分析測定用pLybAL19或pLybAL17轉化的聚球藍細菌(參見實施例7)的蔗糖累積 情況。利用加利福尼亞州山景市的生物視點公司的蔗糖測定試劑盒(BioVision，Inc., Mountain View, CA)檢測蔗糖。誘導4小時後進行測定(對於pLybAL17 (SEQ ID NO :46) 將光照從50微愛因斯坦增加至180微愛因斯坦，對於pLybAL19 (SEQ ID NO :48)將溫度從26增加至39°C )。根據細胞中存在的背景葡萄糖校正數據。結果顯示用pLybAL19 (SEQ ID NO :48)轉化的聚球藍細菌累積0. 78納摩爾蔗糖/ 毫克幹生物量。結果還顯示用pLybAL17(SEQ ID NO :46)轉化的聚球藍細菌累積0. 95納摩
爾蔗糖/毫克幹生物量。進一步分析大腸桿菌、集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC7942中基於質 粒的蔗糖產生。由於細菌可消耗蔗糖，檢測可能困難。因此，在抑制條件下培養細胞，然後在 誘導後立刻測定。可利用尿嘧啶培養來抑制PyrR啟動子，並通過轉移缺乏尿嘧啶的培養基 誘導。可利用銨離子作為氮源培養來抑制nirA啟動子，並通過轉移至硝酸鹽作為氮源的培 養基誘導。可將psbAII啟動子從低光移至高光。可將暗階段啟動子從光亮移至黑暗。可 將λ ρκ啟動子從低溫(25°C )移至高溫(39°C )。實施例11 通過穩定染色體整合的表達插入蔗糖生物合成基因可對細胞生長產生負面影響，導致難以完全分離10-16個 染色體。對於抗生素抗性標記的常規選擇，具有額外拷貝的標記不會顯著影響細胞在有抗 生素存在下的存活。因此，但面臨負表型時，採用抗生素選擇難以獲得完全染色體分離。在大多數有機體中，刪除upp基因(編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶)導致對其它 情況中毒性5-氟尿嘧啶有抗性。為獲得完全抗性，必須刪除所有拷貝的upp基因。因此， 整合入集胞藍細菌PCC 6803 (SEQ ID NO 56)和細長聚球藍細菌PCC 7942 (SEQ ID NO 58) 的upp基因座將導致5-氟尿嘧啶抗性並能正選擇完全分離，即使有負表型存在。實施例12 =UPP/卡那黴素抗性表達盒利用upp/卡那黴素抗性表達盒的基因組操作的通用方案概述於圖11。描述了基 因刪除，但該方案不難在插入和突變的「替代」步驟作改變。構建了 upp/卡那黴素抗性表達盒。按照生產商的方案，用埃匹中心生物技術公司 的拷貝控制克隆試劑盒(Epicentre Biotechnologies CopyControlcloning kit)，以平端 克隆載體PCCl和大腸桿菌菌株EPI300構建該表達盒。利用以下寡核苷酸從全細胞擴增枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的upp基因從而產生SEQ ID NO 62所示產物5' -AAGAAGCAAGACAGCGTGTAGCTGCTCTGACTG-3' (SEQ ID NO :60)和5' -TCCCGGGATTTGGTACCTTATTTTGTTCCAAACATGCGGTCACCCGCATC-3'(在核苷酸 位置2-7和12-17具有限制性核酸內切酶位點)(SEQID NO 61)。如埃匹中心生物技術公司方案所述，將PCR產物克隆入pCCl，利用補加了氯黴素 的LB選擇攜帶插入物的那些。相對於lacZ，通過限制性核酸內切酶消化作正向篩選，產生 pLybAL7f(SEQ ID NO :65)。利用候選物 3 和 8 (pLybAL7_3 和 pLybAL7_8)的以下寡核苷酸， 通過DNA測序驗證插入物的確切序列5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3『 (SEQ ID NO 63) 和 5' -CACACAGGAAACAGCTATGACCAT-3『 (SEQ ID NO :64)。利用以下寡核苷酸擴增Lybradyn載體pLybAAl [最初衍生自pACYC177 (Rose， R. Ε. 1988. Nucleic Acids Res. 16,356]的卡那黴素抗性標記，從而產生 SEQ ID NO :68 所 示產物5 『 -GTCAGTGCACTGCTCTGCCAGTGTTACAACC-3 『(在核苷酸位置 5-10 處具有 ApaLI 限制性核酸內切酶位點)(SEQ ID NO 66)和 5' -CTCAGTGGCGCCAAAACTCACGTTAAGGGATTTTG GTC-3' (SEQID NO 67)(在核苷酸位置7_12處具有NarI限制性核酸內切酶位點)。用ApaLI和NarI消化PCR產物，連接入類似消化的pLybAL7f，從而產生pLybAL8f(SEQ ID NO :69)。用補加了 50 μ g/ml新黴素的LB選擇合適的質粒，並通過限制 性核酸內切酶消化檢查。實施例13 =UPP缺失迫使染色體插入物分離以表達包括蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖的 糖的一種方案採用刪除染色體的upp，從而導致耐受5-氟尿嘧啶。雖然已在許多有機體中 (例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)建立了該方案，但對於藍細菌，例如集胞藍細菌PCC 6803 和細長聚球藍細菌PCC 7942，以前未建立該方案。測試顯示1 μ g/ml 5-氟尿嘧啶完全抑制這些有機體各自的生長。0. 5 μ g/ml5-氟 尿嘧啶完全抑制集胞藍細菌PCC 6803的生長，該藍細菌對低至0. 1 μ g/ml的5-氟尿嘧啶 亦敏感。用寡核苷酸kpupp-F(SEQ ID NO :96)和 Sspupp-R(SEQ ID NO :97)擴增集胞 藍細菌PCC 6803的upp基因和周圍序列。用寡核苷酸kloupp-F(SEQ ID NO :98)和 Seloupp-R(SEQ ID NO 99)擴增細長聚球藍細菌PCC7942的upp基因和周圍序列。然後按 照生產商的使用說明書，將PCR產物(集胞藍細菌PCC 6803的upp，SEQ ID NO :100;細長 聚球藍細菌PCC 7942的upp，SEQ ID NO :101)克隆入威斯康辛州麥迪遜市埃匹中心生物技 術公司的平端克隆載體PCCl。雖然將PCR產物(SEQ ID NO :100或SEQ ID NO :101)可以任一方向連接入pCCl， 但選擇相當於lac啟動子的正向，從而分別產生pLybAL3f(SEQ ID NO :102)(含有集胞藍細 菌 PCC 6803 的 upp)和 pLybAL5f (SEQ IDNO 103)(含有細長聚球藍細菌 PCC 7942 的 upp)。 利用寡核苷酸T71ong(SEQ ID NO 104)和M13rev (SEQ ID NO :105)測序插入物。集胞藍 細菌PCC 6803的upp的核苷酸序列如SEQ ID NO :111所示，多肽序列如SEQ IDNO :112所 示。細長聚球藍細菌PCC 7942的upp的核苷酸序列如SEQ ID NO :113所示，多肽序列如 SEQ ID NO 114 所示。通過除去BlpI和ApaLI片段，用T4DNA聚合酶填平末端，然後用T4DNA連接酶再 環化而從 pLybAL3f (SEQ ID NO :102)產生質粒 pLybAL4f (SEQ ID NO :106)。然後用 AvrII 和SgfI消化pLybAL4f，用T4DNA聚合酶填平末端，隨後用T4DNA連接酶再環化刪除集胞藍 細菌 PCC 6803 的部分 upp 基因，從而產生 pLybAL9f(SEQ ID NO :107)。從 pLybAL9f (SEQ IDN0:107)切下攜帶藍細菌DNA的SacI/SphI片段(SEQ ID NO 108)，連接入類似消化 的 pAR0180 (序列未完全知曉；Parke, D. 1990. Construction ofmobilizable vectors derived from plasmids RP4, pUC18 and pUC19 (衍生自質粒 RP4、pUC18 和 pUC19 的可移 動載體的構建).Gene 93 :135-137 ；ATCC77123)，從而產生pLybAL25。通過除去SapI和 ApaLI片段，用T4DNA聚合酶填平末端，然後用T4DNA連接酶再環化而從pLybAL5f產生質粒 pLybAL6fb (SEQ ID NO :109)。然後用 BssHII 和 BsaI 消化 pLybAL6fb，用 T4DNA 聚合酶填 平末端，隨後用T4DNA連接酶再環化刪除細長聚球藍細菌PCC 7942的部分upp基因，從而 產生 pLybAL10fb(SEQ ID NO :110)。從 pLybALlOfb 切下攜帶藍細菌 DNA 的 &icI/SphI 片 段(SEQ ID NO :138)，連接入類似消化的pAR0180，從而產生pLybAI^6。將質粒pLybAL25和pLybAL26置於大腸桿菌S17-1 (ATCC 47055)中。質粒 pLybAL25和pLybAI^6有待通過雙親接合轉移至集胞藍細菌PCC6803和細長聚球藍細菌 PCC 7942。由於這些質粒不在藍細菌中複製，它們應能起到自殺載體的作用，橫穿進入染色體，從而刪除染色體拷貝之一上的upp。優化方案能加速分離而不會因過早接觸太多的 5-氟尿嘧啶而殺傷細胞。實施例14 蔗糖降解酶的修飾進一步工程改造用asf轉化的藍細菌以便通過調控蔗糖降解活性來提高蔗糖產量。本發明人鑑定了集胞藍細菌PCC 6803 (核苷酸序列SEQ ID NO 70 ；多肽序列SEQ ID NO 71)和細長聚球藍細菌PCC 7942(核苷酸序列SEQ IDNO -J2 ；多肽序列SEQ ID NO 73)中編碼轉化酶同源物的基因。集胞藍細菌PCC 6803還編碼蔗糖酶鐵氧還蛋白-樣蛋白 (核苷酸序列 SEQ ID NO 74 ；多肽序列 SEQ ID NO 75) (Machray G. C.等.1994. FEBS Lett 354，123-127)。採用圖11所述的無標記刪除方案刪除這些基因。實施例15 蔗糖降解酶的修飾進一步工程改造用asf轉化的藍細菌以促進細胞分泌蔗糖。當處於低滲環境中時，蔗糖可以從細胞中自動除去，如一些生物從高鹽轉入低 鹽環境時滲透保護劑所做的那樣(Schleyer, M.，Schmidt, R.和Bakker，E. P. 1993. Arch Microbiol 160，424-43 ；Koo, S.P.，Higgins, C. F.和 Booth，I. R. 1991. J Gen Microbiol 137,2617-2625 ；Lamark, Τ. ，Styrvold, 0. B.禾口 Strgim，A. R. 1992.FEMS Microbiol. Lett 96,149-154).工程改造藍細菌可促進該過程。進一步工程改造用asf轉化的藍細菌以表達蔗糖通透酶，例如大腸桿菌和沙門 氏菌所用或將蔗糖轉運至某些藍細菌的固氮孢囊中所用的那些(Jahreis K.等.2002. J Bacteriol 184,5307-5316 ；Cumino, A. C. 2007. Plant Physiol 143，1385-97)。按照上述技 術將這些基因克隆並轉化入藍細菌。實施例16 通道蛋白轉化的藍細菌的蔗糖分泌可用蔗糖通道蛋白轉化來促進集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC 7942 的蔗糖分泌。克隆阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)ATCC BAA-894的編碼蔗糖通道蛋白 的基因(scrY)以便在集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC7942中表達。該基因 的功能是從其序列及其鄰近序列推導得到。利用寡核苷酸hsCrTOamHI-F(SEQ ID NO :88) 和EsscrYSacI-R (SEQ ID NO 89)，通過PCR從染色體DNA擴增阪崎腸桿菌scrY。用BamHI 和SacI消化PCR產物(SEQ ID NO 90)，連接入類似消化的pLybAL19並克隆入NEB5 α，從 而產生 pLybAL32(SEQ ID NO :91)。然後用寡核苷酸 EsscrYmidseq-F (SEQ ID NO :92)禾口 EsscrYmidseq-R(SEQ ID NO 93)測序 scrY 基因(核酸 SEQ ID NO :94 ；多肽序列，SEQ ID N0:95)。引入宿主中時，該構建物在溫度誘導型啟動子的控制下能共同表達基因scrY和 asf。通過三-親代接合(如上所述)將該質粒轉移入集胞藍細菌PCC 6803中。檢驗轉化 的集胞藍細菌PCC 6803蔗糖分泌的效率。隨後對細長聚球藍細菌PCC 7942作類似轉化和 檢驗。實施例17 海藻糖累積性藍細菌生成大腸桿菌的編碼海藻糖磷酸合酶和海藻糖磷酸磷酸酶的海藻糖生物合成基因 (分別是otsA和otsB)發現在雙基因操縱子otsBA (SEQ ID N0:115)中。利用寡核苷酸EcotsBA-F (SEQ ID NO :116)和 EcotsBA-R (SEQ ID NO :117)，通過 PCR 擴增大腸桿菌 K12 基 因組DNA來克隆該操縱子。用Af III和NheI消化PCR產物，將其克隆入pLybAL19 (SEQ ID N0:48)中，從而替代大多數asf基因。新質粒pLybAL23(SEQ ID NO :118)將海藻糖生物合成 基因置於溫度誘導型入^啟動子的控制下。用寡核苷酸ECOtsBAmidseq-F(SEQ ID NO 119) 和ECOtsBAmidseq-R(SEQ ID NO :120)測序這些基因以驗證它們的完整性。然後通過將攜 帶otsBA操縱子的pLybAL23的Af III (用T4DNA聚合酶填平)/NheI片段連接入用McI (用 T4DNA 聚合酶填平)和 NheI 消化的 pLybAL15、pLybAL17、pLybAL21 和 pLybAL22 中，分別產 生 pLybAL28 (SEQ ID NO 121)、pLybAL29 (SEQ ID NO 122)、pLybAL30 (SEQ ID NO :123)和 pLybAL31(SEQ ID NO : 1 )，從而將 otsBA 操縱子的表達置於 pyrR、psbAII、dnaK 和 kiaA 啟 動子的控制下(如上所述)。通過三-親代接合將質粒pLybAI^8(SEQ ID NO 121)、pLybAL29 (SEQ ID NO :122)、 pLybAL30 (SEQ ID NO :123)和 pLybAL31 (SEQ ID NO :124)各自移入集胞藍細菌 PCC 6803 中(如上所述)。採用與其它啟動子所述相同的方法，PLybAL23的otsBA操縱子的表達置於 pLybAL16和pLybAL18中集胞藍細菌PCC 6803和細長聚球藍細菌PCC 7942nirA啟動子 (如上所述)的控制下，從而分別產生pLybAL36(SEQID NO :125)和pLybAL37 (SEQ ID NO: 126)。實施例18 海藻糖測定有必要通過離心分開生物量和培養液，經0. 2微米濾器過濾從澄清培養液中除去 殘留的生物量。減壓蒸發將培養液濃縮成殘留物。將該濃縮的培養液溶解於Iml去離子 水中，然後在海藻糖測定中取樣10微升溶液。將離心收集的生物量轉移至稱重碟，加熱至 100°C以除去殘留的水分。稱重幹生物量，然後將IOOmg樣品溶解於Iml去離子水中。然後 研磨該混合物，離心除去固體。用去離子水將澄清上清液的10微升樣品稀釋100倍，檢驗 10微升稀釋樣品的海藻糖。海藻糖測定利用可從生物生物視點公司獲得的商品化提供的蔗糖測定試劑盒的 改進方法。標準方法的改進之處是用海藻糖酶取代試劑盒提供的轉化酶溶液。該試劑盒包 括用海藻糖酶水解海藻糖以釋放葡萄糖。該葡萄糖經葡萄糖氧化酶氧化以產生過氧化氫， 過氧化氫在有著色指示劑存在下通過過氧化物酶作用檢測。通過其在570nm處的特徵性吸 光度定量檢測著色指示劑，從而得到樣品中最初存在的葡萄糖濃度。通過 Gutierrez C, Ardourel Μ, Bremer Ε, Middendo rf A, Boos W, Ehmann U. Mol Gen Genet. 1989年6月；217 (2-3) =347-54所述的相似方法，從工程改造入質粒並轉化入 大腸桿菌宿主的重組大腸桿菌treA基因製備海藻糖酶(treA核酸SEQ ID NO :134編碼海 藻糖酶多肽SEQ ID NO :135)。從大腸桿菌K12克隆treA編碼的周質海藻糖酶。用AflII/ ^CbaI消化treA PCR產物(SEQ ID NO 127)，然後連接入類似消化的pLybCB6 (含有組成型 強大腸桿菌trp啟動子的專有質粒)中，從而產生pLybALM(SEQ ID NO :130)。通過寡核 苷酸EctreAmidseq-F和EctreAmidseq-R測序分析插入物的完整性。構建C-末端His6_標記的海藻糖酶。利用寡核苷酸EctreA_F2(SEQ IDNO 131) 和EctreA-R2 (SEQ ID NO 132)，通過PCR擴增該基因。然後用Af ΙΙΙ/XbaI消化該PCR產 物(SEQ ID NO :136)，隨後連接入類似消化的pLybALM中，從而產生pLybAL33(SEQ ID NO:133)。周質海藻糖酶的組成型表達強對細胞有害，在37°C下導致強烈的生長缺陷。這可 通過在30°C下培養細胞顯著減輕。該蛋白在攜帶質粒pLYBAL24(SEQ ID NO :130)的大腸桿菌BW25113中表達，所述 大腸桿菌在含有卡那黴素的^cYT培養基中培養。該蛋白利用Trp啟動子組成型產生並含 有使該蛋白轉運至周質的信號肽。發酵和生物量收穫後，用在50mM Tris緩衝液pH 8中的 2% ν/ν 二氯甲烷處理經洗滌和重懸的細胞團，通過選擇性周質釋放純化該酶。離心分離裂 解液與細胞碎片，利用裝有10，000道爾頓膜的Amicon超濾器濃縮作進一步加工。濃縮的 裂解液可直接用於測定，或者可利用該酶C-末端上的工程改造6Χ多聚組氨酸標籤(SEQ ID NO :137)，通過金屬離子親和層析進一步純化該酶。實施例19 固相海藻糖產生固體複合織物覆蓋的由基底泡沫(substrate foam)構成的親水性泡沫用作培養 基/水分儲器(FA公司O^amex Aquazone))，將該泡沫粘合於用作15cmX15cm見方生長表 面的織物層(DuPont Sontara)。將該複合材料浸在70%乙醇水溶液中滅菌，然後懸掛在垂 直生物反應器中，該生物反應器垂直懸掛以將溶液遞送至複合材料的頂部。該溶液因重力 滲濾過生長複合表面。將1升滅菌的去離子水以0. 2毫升/分鐘流過來除去滅菌的生長表 面中的殘留乙醇。將0. 5升含10微克/毫升氯黴素的BGllA生長培養基以0. 2毫升/分 鍾流過該複合材料以用培養基平衡該生長表面。通過用質粒pLYBAL23轉化的集胞藍細菌PCC 6803的IOml 4天預培養物注滿平 衡的滅菌生長表面以接種該表面。溫育30分鐘後，將反應器轉成垂直位置，開始發酵。用 白色LED陣列的80微愛因斯坦光照射該反應器。利用與生物反應器相連的電阻加熱裝置 (resistive heating device)將溫度維持在。用0. 2微米過濾的空氣以0. 2升/分 鍾連續吹掃反應器，每6小時供應新鮮的培養基，用泵和經生長複合物的泡沫層重力滲濾， 速度為0. 2毫升/分鐘，持續30分鐘。反應器持續操作4-7天，在此期間，複合物的生長表 面鋪滿了稠密的藍細菌菌苔。最初的培養期後，將生物反應器的溫度提高至40°C，在該溫度 再維持M小時。在升溫期間，收集用過的培養基，經處理以作海藻糖測定。發酵結束時，用 去離子水洗滌生長表面來收集生物量，可對其加工以便用於海藻糖測定。產生的和保留在固體表面生長的生物量內的海藻糖量佔溫度誘導後從生物反應 器中回收的生物量總乾重的多達2. 5重量％。溫度誘導後，從培養基回收0. 8重量％的幹 生物量當量海藻糖。實施例20 海藻糖產生液相在Bioflow反應器中製備1升無菌的BGllA培養基，向其中加入氯黴素至10微克 /毫升的濃度。然後用5體積％的質粒PLYBAL23轉化的集胞藍細菌PCC 6803的4天預培 養物接種該反應器。該反應器的運行條件如下d8°C，300RPM，0. 2升/分鐘的0. 2微米過 濾空氣吹掃，利用螢光燈陣列的80微愛因斯坦光照射。培養維持4-7天，然後取200ml樣 品用於加工和海藻糖測定。然後將發酵溫度升高至40°C，持續M小時。隨後從生物反應器 中取出200ml樣品用於加工和海藻糖測定。溫度誘導後，乾燥的生物量產生多達3重量％海藻糖，而相對於生物量，用過的培 養基含有0. 3重量％當量的海藻糖。
參考文獻就如同各出版物、專利、專利申請或其它參考文獻專門而單獨表明出於所有目的 通過引用全文納入本文的程度一樣，本申請引用的所有出版物、專利、專利申請和其它參考 文獻出於所有目的通過引用全文納入本文。本文引用參考文獻不應理解為承認其是本發明 的現有技術。
權利要求
1.一種培養光合微生物的光生物反應器，該光生物反應器包括非膠狀的固體培養支持物，該支持物適於為在其表面的至少一部分上的光合微生物提 供營養物和水分，其中當該表面的所述部分非水平定位時，該表面的所述部分的形狀允許 光合微生物與其粘附；以及覆蓋該培養支持物表面的至少所述部分的物理屏障，其中該物理屏障設置成允許接種 該培養支持物表面的所述部分，形成並維持適於培養這種光合微生物和收穫這種培養的光 合微生物的環境。
2.如權利要求1所述的光生物反應器，其特徵在於，在培養支持物表面的所述部分上 還包括光合微生物。
3.如權利要求1或2所述的光生物反應器，其特徵在於，培養支持物表面的所述部分能 以每升當量至少約50克幹生物量的密度培養光合微生物。
4.如權利要求1-3中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述培養支持物是柔 性的。
5.如權利要求1-3中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述培養支持物包含 一種或多種剛性材料。
6.如權利要求1-5中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述培養支持物包含 至少兩層，第一層毗連第二層，其中所述至少兩層的材料是相同或不同的材料。
7.如權利要求6所述的光生物反應器，其特徵在於，所述第一層包含高表面積生長材 料，所述第二層包含可滲透型材料。
8.如權利要求1-7中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述培養支持物包含 柔性連接的剛性部分，其中所述剛性部分由一種或多種剛性材料構成。
9.如權利要求1-8中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述物理屏障對於固 體顆粒和液體至少是基本上不可滲透的，但不阻止氣體或蒸氣向和從培養支持物表面的所 述部分附近的空間運輸，也不阻止培養支持物表面的所述部分的光化射線。
10.如權利要求1-9中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器還 包括位於培養支持物和物理屏障之間的光化射線源。
11.如權利要求1-9中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述物理屏障在培養 支持物和光化射線源之間，其對於這種光化射線足夠透明並具有足夠的氣體透過性從而光 合微生物在培養期間能進行光合作用。
12.如權利要求1-11中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述物理屏障對水 蒸氣充分不滲透，從而潤溼後所述培養支持物將保留足夠的水分，因此光合微生物在培養 期間能維持充分的水合。
13.如權利要求1-12中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述屏障設置成包 含所述培養支持物和其上的任何光合微生物，以及設置成在光合微生物的至少部分培養期 間可鬆脫地密封。
14.如權利要求1-13中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器 包含單個培養支持物。
15.如權利要求1-13中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器 包含多個培養支持物。
16.如權利要求1-15中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述物理屏障是柔 性的。
17.如權利要求1-16中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述物理屏障還包 含對於固體顆粒、液體、氣體和蒸氣至少基本上不可滲透的第一部分，和對於氣體和蒸氣可 滲透，但對於固體顆粒和液體至少基本上不可滲透的第二部分。
18.如權利要求17所述的光生物反應器，其特徵在於，所述屏障的第二部分的氣體或 蒸氣交換率是至少約5葛爾萊秒到不超過約10，000葛爾萊秒。
19.如權利要求17所述的光生物反應器，其特徵在於，所述屏障的第二部分包含選擇 性膜，該選擇性膜含有烯烴纖維或聚乙烯纖維材料、聚四氟乙烯過濾介質、纖維素過濾材 料、纖維玻璃過濾材料、聚酯過濾材料、聚丙烯酸酯過濾材料、聚碸膜或尼龍膜。
20.如權利要求17-19中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述第一部分對於 光化射線至少是基本上透明的，且所述第二部分對於光化射線至少基本上不透明，所述第 一和第二部分相對於彼此和培養支持物表面的至少所述部分的設置具有充足量的光化射 線和氣體交換從而支持光合微生物的光合作用。
21.如權利要求1-20中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述培養支持物包 含織物。
22.如權利要求21所述的光生物反應器，其特徵在於，所述織物由天然的、改性天然 的、合成的纖維或它們的組合構成。
23.如權利要求21所述的光生物反應器，其特徵在於，所述織物是紡織織物、編織織 物、氈、交聯纖維聚合物構成的篩網或它們的組合。
24.如權利要求22所述的光生物反應器，其特徵在於天然纖維選自棉花、羊毛、大麻纖維、樹纖維、其它纖維素纖維和它們的組合；改性天然纖維選自硝酸纖維素、醋酸纖維素、磺酸纖維素、交聯的澱粉和它們的組合；合成纖維選自聚酯、聚丙烯酸酯、聚胺、聚醯胺、聚碸和它們的組合。
25.如權利要求1-24中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述培養支持物包 被有水分吸附聚合物。
26.如權利要求21-25中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述織物、織物的 纖維或二者包被有水分吸附聚合物。
27.如權利要求25-26中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述水分吸附聚合 物選自瓊脂、聚丙烯酸酯、聚醯胺、聚胺、聚乙二醇、改性澱粉和它們的組合。
28.如權利要求1-27中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器 還在培養支持物上、其內或同時在其上和其內包含水、營養物或它們的組合。
29.如權利要求1-28中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器 還包括一個或多個連接點以連接所述光生物反應器與一構件。
30.如權利要求1-29中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述固體培養支持 物還包括一個或多個連接點以連接該培養支持物。
31.如權利要求1-30中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器 還包括液體供應系統、營養物供應系統、氣體供應系統和微生物供應系統中的至少一種。
32.如權利要求1-31中任一項所述的光生物反應器，其特徵在於，所述光生物反應器 還包含權利要求42-55中任一項所述的細胞，其中所述細胞粘附於所述固體培養支持物。
33.一種培養光合微生物的裝置，包括至少一個權利要求1-32中任一項所述的光生物反應器；和與所述至少一個光生物反應器相連的構件，該構件將所述至少一個光生物反應器的至 少一個培養支持物非水平地定位。
34.如權利要求33所述的裝置，其特徵在於，所述至少一個光生物反應器懸掛在該構 件上。
35.如權利要求33-34中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述構件基本上被所述物理屏障覆蓋。
36.如權利要求33-35中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述構件包括傳送系統或其 組件，從而所述至少一個培養支持物能沿著該傳送系統的路徑傳送。
37.如權利要求36所述的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括接種站，其在各培養支持物沿著傳送系統的路徑傳送時可用光合微生物接種；培養站，其在各培養支持物沿著傳送系統的路徑傳送時培養各接種的培養支持物上的 光合微生物；和收穫站，將培養支持物傳送到此處，從而可自各培養支持物收穫培養的光合微生物的 至少一部分。
38.如權利要求37所述的裝置，其特徵在於，所述接種站和收穫站基本上彼此毗連或 者基本上是共存的。
39.如權利要求33-38中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括誘導站以誘 導各培養支持物上的光合微生物合成可發酵糖。
40.如權利要求33-39中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括液體供應系 統、營養物供應系統、氣體供應系統或微生物供應系統中的至少一種。
41.如權利要求33-40中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述裝置還包含權利要求 42-55中任一項所述的細胞，其中所述細胞粘附於所述固體培養支持物。
42.一種包含人工DNA構建物的轉基因光合微生物細胞，所述構建物包含以5』到3』的 轉錄方向操作性相連的以下組分在所述光合微生物細胞中起作用的啟動子；包含編碼具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽選自二糖 磷酸合酶或二糖磷酸磷酸酶；和轉錄終止序列；其中與不含DNA構建物的光合微生物細胞相比，所述轉基因光合微生物細胞累積的二 糖水平升高。
43.如權利要求42所述的細胞，其特徵在於，所述細胞包含(i)含有第一核苷酸序列和 第二核苷酸序列的多核苷酸，所述第一核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性的多肽，而 所述第二核苷酸序列編碼具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽，或(ii)含有核苷酸序列的多 核苷酸，所述核苷酸序列編碼具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。
44.如權利要求42-43中任一項所述的細胞，其特徵在於，包含編碼具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸選自如下(a)包含編碼選自如下的多肽的核苷酸序列的多核苷酸具有蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO :2或與其有95%相同 的序列；具有蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO :4或與其有95%相同的序列； 具有蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO 6與其有95%相同的序列； 具有海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO 77或與其有95%相同的序列； 具有海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO 79或與其有95%相同的序列； 具有葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO 81或與其有95%相同的序列； 具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 83或與其有95%相同的序列； 具有甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO :85或與其有95%相同的序列；和具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO :87或與其有95%相同的序列；(b)分離的多核苷酸，其包含編碼蔗糖磷酸合酶/蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO :1或與其有95%相同 的序列；編碼蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO 3或與其有95%相同的序列； 編碼蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO 5或與其有95%相同的序列； 編碼海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO 76或與其有95%相同的序列； 編碼海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO 78或與其有95%相同的序列； 編碼葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO 80或與其有95%相同的序列； 編碼葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO 82或與其有95%相同的序列； 編碼甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO :84或與其有95%相同的序列；和編碼甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO :86或與其有95%相同的序列；(c)在嚴格條件下與選自如下的核酸序列雜交的分離多核苷酸SEQIDNO:1，其中該分離多核苷酸編碼具有ASF活性的多肽;SEQIDNO:3，其中該分離多核苷醒編碼具有SPS活性的多肽;SEQIDNO:5，其中該分離多核苷酸編碼具有SPP活性的多肽；SEQIDNO:76，其中該分離多核苷5睃編碼具有TPS活性的多肽SEQIDNO:78，其中該分離多核苷5睃編碼具有TPP活性的多肽SEQIDNO:80，其中該分離多核苷5睃編碼具有GPS活性的多肽SEQIDNO:82，其中該分離多核苷5睃編碼具有GPP活性的多肽SEQIDNO:84，其中該分離多核苷5睃編碼具有MPS活性的多肽SEQIDNO:86，其中該分離多核苷5睃編碼具有MPP活性的多肽其中所述嚴格條件包括65°C下，在包含6X SSC(0.9M氯化鈉和0.09M檸檬酸鈉)的溶 液中溫育；和(d)與(a)、(b)或(c)所示多核苷酸序列互補的分離的多核苷酸。
45.如權利要求42-44中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述累積二糖的單體對於細 胞是內源性的。
46.如權利要求42-45中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是藍細菌細胞、光 合細菌或綠藻。
47.如權利要求42-46中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是藍細菌細胞。
48.如權利要求42-47中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是選自聚球藍細菌 或集胞藍細菌的藍細菌。
49.如權利要求42-48中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述啟動子是誘導型啟動子。
50.如權利要求42-49中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述啟動子選自carB、 nirA、psbAII、dnaK、kaiA 禾口 λ PR。
51.如權利要求42-50中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述DNA構建物包含選自 如下的核苷酸序列SEQ ID NO :19(編碼asf的pLybALll) ；SEQ ID NO :20 (編碼asf的 pLybAL12) ；SEQ ID NO :44(編碼 asf 的 pLybAL 15) ；SEQ ID NO :45(編碼 asf 的 pLybAL 16) ；SEQ ID NO 46 (編碼 asf 的 pLybAL17) ；SEQ ID NO 47 (編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO 48(編碼 asf 的 pLybAL19) ；SEQ ID NO 49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQID NO 50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID NO 51 (編碼 asf 的 pLybAL13f) ；SEQ ID NO 52 (編 碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQ ID NO 53(編碼 asf 的 pLybAL 14f) ；SEQ ID NO 54(編碼 asf 的 pLybAL 14r) ；SEQ ID NO :65(編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69(編碼 asf 的 pLybAL8f) ；SEQ IDNO :118 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL23) ；SEQ ID NO :121 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO 122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO 123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQ ID NO :124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO :125(編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO 126 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ ID NO 130 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24)；禾口 SEQ ID NO 133 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33)。
52.如權利要求42-51中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞累積至少約0.1微 克二糖/分鐘/克幹生物量。
53.如權利要求42-52中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞累積至少約0.1微 克二糖/分鐘/克幹生物量至多達約10微克二糖/分鐘/克幹生物量。
54.如權利要求42-53中任一項所述的細胞，其特徵在於，至少滿足以下一條所述細胞不包含選自如下的核苷酸序列SEQ ID NO 70, SEQ ID N0:72和SEQ ID NO: 74，或與它們有至少95%相同，且具有轉化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋白活性的核苷酸變 體；所述細胞不表達選自如下的多肽序列:SEQ ID N0:71、SEQ ID N0:73和SEQ ID NO :75， 或與它們有至少95%相同，且具有轉化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋白活性的多肽變體；或所述細胞表達對選自如下的核苷酸序列有特異性的小幹擾RNA =SEQ IDNO :70、SEQ ID NO 72和SEQ ID NO :74，或與它們有至少95%相同，且具有轉化酶活性或蔗糖酶鐵氧還蛋 白活性的核苷酸變體。
55.如權利要求42-54中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞還包含編碼活性通道蛋白多肽的分離的多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID N0:94或與其有 95%相同的序列；編碼多肽的分離多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO :95或與其有95%相同的序列並具 有通道蛋白活性；或包含SEQ ID NO 91的分離多核苷酸(編碼通道蛋白的pLybAL32)；其中累積的二糖是蔗糖，所述細胞表達通道蛋白，且表達的通道蛋白將累積的蔗糖從 細胞中分泌。
56.一種人工DNA構建物，其包含至少一條選自如下的序列SEQ ID N0:19(編碼 asf 的 pLybALll) ；SEQ ID NO 20(編碼 asf 的 pLybAL12) ；SEQID NO 44(編碼 asf 的 pLybAL15) ；SEQ ID NO :45 (編碼 asf 的 pLybAL16) ；SEQ ID NO :46 (編碼 asf 的 pLybAL17)； SEQ ID NO :47(編碼 asf 的 pLybAL18) ；SEQ ID NO :48 (編碼 asf 的 pLybAL19) ；SEQ ID N0:49(編碼 asf 的 pLybAL21) ；SEQ ID NO :50 (編碼 asf 的 pLybAL22) ；SEQ ID N0:51(編 碼 asf 的 pLybAL13f) ；SEQ ID NO 52(編碼 asf 的 pLyAL13r) ；SEQID NO :53(編碼 asf 的 pLybAL14f) ；SEQ ID NO 54(編碼 asf 的 pLybAL14r) ；SEQ ID NO 65(編碼 asf 的 pLybAL7f) ；SEQ ID NO :69(編碼 asf 的 pLybAL8f) ；SEQ ID NO :118(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL23) ；SEQID NO 121 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL28) ；SEQ ID NO 122 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL29) ；SEQ ID NO :123 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL30) ；SEQ ID N0:124(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL31) ；SEQ ID NO 125 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL36) ；SEQ ID NO :126 (編 碼 tps 和 tpp 的 pLybAL37) ；SEQ ID NO 130 (編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL24) ；SEQ ID NO 133(編碼 tps 和 tpp 的 pLybAL33) ； SEQ ID NO :91 (編碼通道蛋白的 pLybAL32) ； SEQ ID NO: 102 (編碼 SS-UPP 的 pLybAL3f) ； SEQ ID NO 103 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL5f) ； SEQ ID NO: 106 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL4f) ； SEQ ID NO 107 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL9f) ； SEQ ID NO 109 (編碼 SE-UPP 的 pLybAL6fb) ；SEQ ID NO :110 (編碼 SE-UPP 的 pLybALlOfb)；和 SEQ ID NO 91(編碼通道蛋白的pLybAL32)。
57.一種培養光合微生物的方法，所述方法利用權利要求1-41中任一項所述的光生物 反應器或裝置，所述方法包括用光合微生物接種培養支持物；在接種的培養支持物上培養該光合微生物；和從該培養支持物上收穫至少一部分培養的光合微生物。
58.如權利要求57所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括接種該培養支持物後密 封該光生物反應器的物理屏障，從而在培養光合微生物的全部或實質性部分的同時密封該物理屏障。
59.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述物理屏障可鬆脫地密封。
60.如權利要求57-59中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將各培養支 持物輸送至接種站、培養站和收穫站。
61.如權利要求57-60中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括以下的至少 一種為培養支持物供水；為培養支持物供應營養物；或為培養支持物供氣。
62.如權利要求57-61中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物培養至每升 當量至少約50克幹生物量的密度。
63.如權利要求57-62中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物包含權利要 求42-55中任一項所述的細胞。
64.一種產生可發酵糖的方法，所述方法利用權利要求1-41中任一項所述的光生物反 應器或裝置，所述方法包括用能累積可發酵糖的光合微生物接種培養支持物；在接種的培養支持物上培養該光合微生物；分離累積的可發酵糖。
65.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述可發酵糖在所述光合微生物內累積。
66.如權利要求64-65中任一項所述的方法，其特徵在於，所述分離累積的可發酵糖包括從培養支持物上收穫至少一部分培養的光合微生物；和從收穫物回收可發酵糖。
67.如權利要求64-66中任一項所述的方法，其特徵在於，累積的可發酵糖從所述光合 微生物分泌，並從培養基中分離。
68.如權利要求64-67中任一項所述的方法，其特徵在於，分離累積的可發酵糖包括從 培養基分離累積的可發酵糖。
69.如權利要求64-68中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括在接種培養 支持物後可鬆脫地密封該光生物反應器的物理屏障，從而在培養光合微生物的全部或實質 性部分的同時密封該物理屏障。
70.如權利要求64-69中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括以下的至少 一種為培養支持物供應液體；為培養支持物供應營養物；或為培養支持物供氣。
71.如權利要求64-70中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將培養支持 物傳送至接種站、培養站和收穫站中的至少一個。
72.如權利要求64-71中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括誘導光合微 生物合成可發酵糖。
73.如權利要求72所述的方法，其特徵在於，誘導可發酵糖合成包括使光合微生物接 觸選自以下的誘導因素溫度、PH、代謝物、光、滲透劑、重金屬和抗生素。
74.如權利要求72-73中任一項所述的方法，其特徵在於，誘導可發酵糖合成包括用鹽 化合物處理所述光合微生物。
75.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，所述鹽化合物是氯化鈉。
76.如權利要求74-75中任一項所述的方法，其特徵在於，所述鹽化合物的添加濃度是 約 0. OlmM-L 5M 或約 0. 2-0. 9M。
77.如權利要求73-76中任一項所述的方法，其特徵在於，通過氣溶膠噴霧將誘導劑施 加於生長表面。
78.如權利要求64-77中任一項所述的方法，其特徵在於，將所述光合微生物培養至每 升當量至少約50克幹生物量的密度。
79.如權利要求64-78中任一項所述的方法，其特徵在於，所述可發酵糖包括選自如下 的至少一種糖葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。
80.如權利要求64-79中任一項所述的方法，其特徵在於，所述可發酵糖包括選自蔗糖或海藻糖的至少一種糖。
81.如權利要求64-81中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物包括天然光 合微生物。
82.如權利要求64-81中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物包括遺傳修 飾的光合微生物。
83.如權利要求64-82中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物包括藍細菌。
84.如權利要求64-83中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物包括選自聚 球藍細菌或集胞藍細菌的藍細菌。
85.如權利要求64-84中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光合微生物包含權利要 求42-52中任一項所述的細胞。
全文摘要
本文提供工程改造以累積碳水化合物，例如二糖的轉基因細菌。還提供培養光合微生物的光生物反應器，其包括適合於為光合微生物提供營養物和水分的非凝膠的固體培養支持物和覆蓋所述培養支持物表面的至少一部分的物理屏障。還公開了整合有光生物反應器的大規模和連續培養光合微生物的裝置以及使用方法。還公開了利用本發明的光生物反應器從光合微生物產生可發酵糖的方法。
文檔編號C12N1/13GK102149809SQ200980107937
公開日2011年8月10日 申請日期2009年1月5日 優先權日2008年1月3日
發明者J·艾肯斯, R·J·特納 申請人:普羅特羅公司