多核苷酸序列變異的微陣列型分析的製作方法

2023-09-19 18:02:00 3

專利名稱：多核苷酸序列變異的微陣列型分析的製作方法
相關申請參者本申請要求於2000年3月22日遞交的臨時申請60/191,356的優先權。
近年來，基於雜合寡聚核苷酸陣列(DNA晶片)已完成了大規模序列實驗，實驗的目的是研究基於種群的基因變異，如單核苷酸多態性(SNPs)。例如，美國專利5837832(Chee等)中闡述了包含四組探針陣列的DNA晶片，其中每一組都與其他各組在一個核苷酸位點上有所不同。目標靶聚核苷酸與DNA晶片雜合，並且根據靶聚核苷酸的優選程度和與分散的探針位置的雜合程度來檢測特定的序列變異。美國專利5861242(Chee等)也使用了相同的技術來分析各種HIV病毒的DNA序列。
現在的雜合型序列變異檢測法存在著一些問題，因而限制了其應用。參見Hacia的文章(Nature Genetics Supp.2142-47)例如，雜合檢測法的精確度較差，阻礙了它在雜合突變篩選中的應用。應用在任意兩種序列中的相同實驗方法可能產生有完全不同的精確度的結果。雜合型突變分析的這種假陰性錯誤率需要得到改進。由於這種雜合型方法也受由一個核苷酸引起的雜合差異阻礙，這種雜合型序列分析的專一性也可能明顯受到靶多核苷酸變異和雜合條件變化的影響。當靶多核苷酸在樣品中含量較少時，雜合型突變檢測就更加不可取。
小劑量基因材料的檢測為生物學研究和臨床診斷提出了較大挑戰。聚合酶鏈反應(PCR)為特定聚核苷酸序列的體外擴增提供了有力的工具，這些序列例如基因組DNA，單鏈cDNA或mRNA，並且這種方法具有高靈敏性和專一性。這種方法的一種應用即擴增來自於如環境、食品和藥物源等的生物樣品中的靶基因序列，以識別樣品中引起疾病的汙染或指示微生物的存在。
因而，就需要開發用來分析序列變異的具有高精確度和高敏感性的方法。
一方面，本發明提供了檢測存在於靶聚核苷酸和參照序列之間序列變異的方法，包括單鹼基或多鹼基替代、缺失或插入和其他更複雜的變異。此方法將多組低聚核苷酸引物固定到一固相支持物上，構成陣列，每一組低聚核苷酸引物用來延伸參照序列的一個特定區域，佔據陣列的一個非連續的區域，並且每一組包含至少四組引物1)第一組完全與參照序列互補；2)其他三組引物除在3』端的核苷酸各不相同外，其餘部分與第一組引物是相同的。本發明的陣列可使用於聚核酶擴增反應，在反應中靶聚核苷酸作為模板來合成可檢測的新生多核苷酸，此新生核苷酸是由與靶聚核苷酸完全互補的適當引物擴增來的。這些被固定的引物可以在一固相支持物上「原位」雜合併擴增靶聚核苷酸的某些特定區域。在每一引物位置的新生鏈由於其在擴增過程中已插入標記物，因此在數量上是可以檢測的。在一優選實施例中本發明的實際擴增方法是PCR。處於固相支持物上的微陣列可能包含大約100,000組引物。同樣的，本方法可用於檢測靶聚核苷酸大約100,000個不同的區域。在大部分應用中，雖然清楚存在於支持物上的組數是沒有下限的，大家都希望有高的組數。
根據本發明的一個實施例，單獨用一個固定的引物來作靶聚核苷酸的非對稱PCR，這就造成要在每一個適當的引物位置連接一個單獨的互補鏈到固相載體上，並用插入到鏈中的標記物來進行可見的檢測。根據本發明的另一實施例，每一靶聚核苷酸的另一引物存在於溶液中，以便於靶聚核苷酸的兩條鏈能夠對稱的合成並留在每一個引物位點，用於增強檢測。
本發明能用來通過與參照序列對比來檢測存在於單靶聚核苷酸中的序列變異，在這種情況下，本發明的DNA陣列包含多組與以上描述的參照序列相應和/或有關的引物。或者，當與一個或許多參照序列對比時，本發明同時也可用來檢測多靶聚核苷酸的序列變異。此靶聚核苷酸可能在結構上相關或無關。當非同源序列多靶聚核苷酸根據本發明被檢測時，將DNA微陣列分成不同區域，每一區域都有一特定參照序列與一個特定靶聚核苷酸相對應。多組引物粘附在該區域內的固定支持物上，每一組被用來延伸參照序列的一個特定區域。如同在單靶聚核苷酸的情況下，每一組包含至少四組引物1)第一組完全與參照序列互補；2)其他三組引物除在3』端的核苷酸各不相同外，其餘部分與第一組引物是相同的。
本發明還提供了試劑盒，使用於前面提到的對稱PCR或非對稱PCR方法，用來檢測靶聚核苷酸的序列變異。這種試劑盒包括一個PCR引物的微陣列和其他PCR反應、檢測所需的試劑。此引物微陣列可能包括與特定參照序列對應的100,000個引物組。在本發明的一種實施例中，此試劑盒還包括能在PCR反應中插入到合成鏈中的標記核苷酸。
本發明實施方式本發明為適應高處理量提供了新方法和組分，使靶聚核苷酸序列變異的擴增和檢測敏感度高而簡單。本發明能用於多種基因組分析，這些基因組分析可用於基礎生物研究和醫學診斷和治療。
本發明基於PCR合成和多核苷酸陣列技術的新組合。本發明的基本原理是在模板和相應引物的3』端的單核苷酸錯配會嚴重阻礙新生鏈的延長。因而，靶聚核苷酸只能在引物與靶序列完全相配的位點上進行擴增。引物製備和PCR擴增方法的某些方面是與在懸而未決的美國臨時申請60/173,618(申請日為1999年12月29日)和美國專利5837832(Chee等)中所描述的方式是相同。以上專利在此處作為參考被引用。A.定義「多核苷酸」是任何長度核苷酸不論核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸的聚合形式。這個詞僅指分子的初級結構。因此，這個詞包含雙鏈和單鏈DNA和RNA。它也包括已知的修飾類型，例如，已有技術的標記物，甲基化，「帽(caps)」，一種或更多天然核苷酸被其類似物替代；核苷酸間修飾，例如，不帶電鍵合(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的，包括懸垂部分例如蛋白質(包括如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的，帶嵌入劑的(例如，吖啶、補骨脂素等)，那些包含螯合劑的(例如，金屬、放射性元素等)，那些包含烷基取代物的，那些帶有修飾鍵合(例如，α-異核酸等)；還有聚核苷酸的非修飾形式。
「引物」這個詞在此處用來指能作為多核苷酸合成的起始位點的寡聚核苷酸，當該引物被置於一定條件下時合成會沿著一條互補鏈進行，該條件可催化與多聚核苷酸互補的引物延伸產物的合成。這些條件包括四種不同的核苷酸三磷酸鹽或核苷類似物；一種或多種用來聚合的試劑，例如DNA聚合酶，和/或逆轉錄酶，這些試劑存在於一種適合的緩衝液中(緩衝液包含輔因子替代物，或對pH值、離子強度有作用的物質等)；並處於合適的溫度下。引物必須足夠長，當存在聚合酶時可引起擴增產物的合成。典型的引物在長度上至少包括5個與靶序列很大程度互補的核苷酸，但優選稍長的引物。一般引物包含15-26個核苷酸，有時也可以用長度高達35個核苷酸的引物。
引物中總是含有與靶序列在很大程度上互補的序列，也就是將要擴增的能退火的特定序列。有時引物還可能含有啟動子序列。「啟動子序列」此處是指被RNA聚合酶特定識別的核酸序列單鏈，RNA聚合酶連接在一個被識別序列上，啟動RNA的轉錄過程並產生RNA轉錄物。一般的，可使用任意啟動子序列，只要現已知且可獲得的聚合物能夠識別其起始序列即可。已知有用的啟動子是那些可被某些噬菌體，例如噬菌體T3，T7或SP6的聚合酶識別的啟動子。
在此處，「標誌」、「序列標誌」或「引物標誌序列」是指有特定核酸序列的低聚核苷酸，此特定核酸能用來給含有此標記的一組多核苷酸做出標誌。來自於同樣生物源的多核苷酸用特定序列的標記物共價地標記，以便可在以後的分析中，這樣的多核苷酸能根據它的來源識別它。此序列標誌物也能作為核酸擴增反應的引物。
「微陣列」是指優選不連續區域的線性或二維陣列，每個區都有一個確定的區域形成於固體支持物的表面上。微陣列上的非連續區的密度由位於獨立固相支持物表面上的待檢靶聚核苷酸的總數決定，優選至少大約50/cm2，較優選至少大約100/cm2，更優選至少大約500/cm2，至少大約1,000/cm2也是優選的。此處，DNA微陣列是指低聚核苷酸引物陣列，該陣列位於用來擴增或克隆靶聚核苷酸的晶片或其他表面上。由於陣列上每一個特定引物組的位置是已知的，靶聚核苷酸就能通過它們連接在微陣列上的特定位置來識別。
「連接物」是含有限定位點的合成低聚脫氧核糖核苷酸。連接物可以平端連接到DNA片段的末端形成限定位點，用來在隨後將片段克隆到載體分子中。
「標記物」這個詞是指能產生顯示靶聚核苷酸存在於樣品陣列中的檢測標誌的組分。合適的標記物包括放射性同位素，核酸發色團，酶，底物，螢光分子，化學發光組分，磁組分，生物發光組分等。例如，標記物是任何可通過分光、光化學、生物化學、免疫化學、電、光學、化學的方式檢測的組分。
「支持物」是指常規支持物，例如珠狀物、微粒、探測條、纖維、濾紙、膜、和矽烷或矽酸鹽的支持物如玻璃滑片。
「擴增」用來泛指產生擴增產物，可能包括例如外加靶分子，靶類似分子，與靶分子互補的分子，它產生於存在於樣品中的靶分子。在靶分子是核酸的情況下，擴增產物可由利用DNA或RNA聚合酶或逆轉錄酶的酶學方法產生。
此處，「生物樣品」是指從個體分離的組織或體液，不僅包括如血液，血漿，血清，脊柱液，淋巴液，皮膚外表層，呼吸、腸道、和泌尿生殖器的切片，淚液，唾液、乳液，細胞(包括但不限於血細胞)，腫瘤，器官，還包括體外細胞培養組分。
「生物源」此處是指產生靶聚核苷酸的來源。此來源可以是上述「樣品」的任何形式，不僅包括細胞、組織或體液。「不同的生物源」可以指同一個體的不同細胞/組織/器官，或同一種族不同個體的細胞/組織/器官，或不同種族的細胞/組織/器官。B.參照序列的選擇本發明能用來比較靶聚核苷酸和一個特定參照序列。靶聚核苷酸包含參照序列本身或它的衍生物。所選擇的參照序列可以來自於任何生物源，不僅僅包括細胞、組織或體液。參照序列和靶聚核苷酸可以是不同源的。優選的，參照序列和靶聚核苷酸來源於同一種族的不同個體，或同一種族的不同種群。
參照序列可能含有來自於特定生物源目標基因的至少一部分。優選的，本發明的參照序列佔有一個區域，已知在此區域上至少一個特定核酸位置與某基因的一定功能性有關。例如，此位點可能是某個編碼酶的基因的活性位點，該位點的一個點突變將導致酶活性的喪失。此位點也可以是細菌基因組的抗藥位點，在此點上野生型基因的核酸替代引起細菌對某些抗生素的抗藥性。參照序列也可能包含生物源的全基因組。例如，一種HIV株的全基因組可用來作為參照序列識別不同HIV株的序列變異。
參照序列可來自於特定人群的個體代表，並用來識別不同種群的SNPs。不同人群可以是不同性別、年齡、種族，也可來自不同地理區域，和不同家族。優選的，參照序列選作代表某人群的一定識別特性或表型。關於識別序列變異和表型特性的相互聯繫的進一步研究應在種群基因連接或某些疾病的基因基礎方面提供知識。
參考序列可以是任意長度，常常在5、10、20、50、100、500、1000、5000或10,000個鹼基之間選擇。參照序列本身可以含有與野生型基因相比的變異序列，只要變異位於對本發明目的有重要作用的區域之外就可。參照序列可以從任意序列源中取得，例如公眾容易獲得的或商業上可得到的序列庫。C.低聚核苷酸引物陣列的設計1.選擇引物本發明提供了一種含固相化了的、單獨的低聚核苷酸引物組的固相支持物。每一引物組與含有參照序列的特定區域相對應，並包含至少四組引物第一組完全與參照序列的特定區域互補；其他三組引物除在3』最末端的核苷酸各不相同外，與第一組引物是相同的。例如，對參照序列中的一個核苷酸A，第一組中的相應引物在其3』最末端有一個T，而其他三組引物在它們的3』端則是A、C、或，G，即每一組都有一個不同的核苷酸。雖不是必須，但四組引物的長度最好是相同的。可以用例如標準PCR引物選擇程序來選擇或設計引物，如麻省理工大學設計的Primer3。
固相支持物大約5-100μm2，在此區域上大約可將約100,000組引物根據預定方式固定在不連續區上。準備好的固相支持物可以有在支持物上任意給定區域上的引物或引物對序列的書寫版或電子記錄，並且因此擴增的靶在支持物上的位置也可以被識別。
每一組上與參照序列特定區域相對應的引物數量由微陣列上隨後的計劃擴增反應的需要決定和限制。這樣，例如，微陣列特定位置上引導PCR所必需的引物的數量與尤其以下因素有關，反應體積，所需要的靶模板聚核苷酸分子的數量，建議的PCR循環的次數，這些都可幫助決定準確有多少低聚核苷酸引物在支持物的每一區域上組成引物組來確保反應的順利進行。優選的，引物數量(也就是引物分子數或引物濃度)應與固相支持物上每一給定區域大致相同(例如，在一DNA微陣列版面上有1000-10,000以至100,000組引物來擴增或檢測大約100,000個靶聚核苷酸的區域)。
固相支持物可用具有特定用途的引物序列製備，該特定用途取決個待檢多聚核苷酸。對特定PCR低聚核苷酸引物可以是任意適宜長度，此處特別應考慮將擴增的靶多核苷酸的序列和特性。如引物可是4-30個核酸長度。
本發明中的核酸引物也可以有較小數量的核酸鹼基缺少、添加和/或替代，只要這樣的改變不會對產量和產物有明顯的副面影響即可。
低聚核苷酸引物可包括自然產生於核酸中的雜環鹼基(尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤)，也可包括修飾鹼基和鹼基類似物。任何與靶序列雜合的引物能共存的修飾鹼基或鹼基類似物對本發明的實踐是有用的。
引物的糖或配糖部分可含有脫氧核糖、核糖和/或糖的修飾形式，例如，2』-O-烷基核糖。在一優選例中，糖部分為2』-脫氧核糖，但任何可與雜合到靶序列上的引物相配的糖部分都可用。
在一個實施例中，引物的核苷部分與磷酸二酯主鏈連接，可如現有技術所熟知的。在另外的實施例中，核酸間的鍵合可以包括已有技術中特定的引物雜合相配的鍵合，其中包括，但不僅限於硫代磷酸酯，磷酸甲酯、氨基磺酸酯(例如美國專利54 7 0967)和聚醯胺(也就是肽核酸)。在(1991)Science 2541497-1500Nielsen等，美國專利5714331，和(1999)Curr.Opin.Biotechnol.1071-75 Nielsen等，對肽核酸都有描述。
在特定的實施例中，引物是嵌合分子；也就是可包含多個鹼基或糖亞基，和/或在同一引物中有多種鍵合。
引物可包含使雜合到靶序列上容易的部分，如本領域公知的，例如嵌入劑和/或微溝連接(minor groove binders)。
鹼基、糖、主鏈上核酸間的變異，與引物上任何支鏈(pendantgroup)的存在，應以特定序列方式，與引物的連接能力及它的靶序列相配。已知的和將要論述的大量結構修飾可能存在於這些連接中。而且，用來形成引物的各種雜環鹼基、糖、核苷酸和核酸製備方法，以及特定預定序列低聚核苷酸的製備在已有技術中都有說明。低聚核苷酸的合成方法在美國專利5419966中已有論述。
低聚核苷酸引物可設計成帶有任意特定外加的部分和序列，這些都可使特定PCR或下面的操作容易一些，如擴增靶聚核苷酸的分離。例如，除了與靶聚核苷酸互補的序列外，引物可以包含其他序列。這樣的序列一般是位於引物中靶互補序列的上遊(也就是5』端)。例如，當含一個或更多限制性酶識別位點(稱為「連接」或「結合體」)的序列存在於靶互補序列的上遊時，可使擴增產物克隆或後續操作容易。引物中存在的其他有用序列包括那些與後續引物互補的序列，和那些對噬菌體RNA聚合酶的啟動子起識別作用的序列，例如，T3 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶和/或SP6 RNA聚合酶。
在本發明的一種方式中，微陣列引物定義為通過一種可覆蓋靶聚核苷酸的完整目的區域的覆蓋方法。例如，第一組引物設計成其中每一引物的序列都與目標區域上的5』位置相對應；第二組引物的序列從第一組的核苷酸向本區域的3』端「移動」一個核苷酸；第三組引物的序列從第二組的核苷酸處向本區域的3』端「移動」一個核苷酸，等等。理論上，引物組的數量與目標區域上的核苷酸數量相同。當然，在每一組與該區域上特定區域相對應的引物組中，至少有4組如前所述3』端各不相同的引物。當根據本發明檢測多靶聚核苷酸時，與特定靶聚核苷酸相對應的每一組引物存在於微陣列上的不連續區域上。2.固相支持物本發明的固相支持物可以是任何支持核苷酸雜合和合成的適宜固體材料和結構。優選的，固相支持物至少含一個相當堅硬的表面，在此表面上可以固定引物和完成PCR反應。此固相支持物可由以下材料構成，例如，玻璃，合成聚合物，塑料，硬無孔尼龍或陶瓷製品。其他適宜的固體支持物材料在已有技術中有論述。固相支持物的尺寸可以是任意標準微陣列尺寸，對DNA微陣列技術是有用的，此尺寸應適應用來進行本發明的反應的特定儀器。用來固定低聚核苷酸的固相支持物的衍生方法和材料在已有技術中有描述，例如，美國專利5919523，此發明的公開內容此處作為參考被引用。
固相支持物可以是液體容器的一部分或存在於液體容器中。例如，固相支持物可放置於一帶邊的小室中，因此沿固相支持物的邊就形成一個封口，以便容納在支持物上發生的聚合酶鏈反應(PCR)。在一特定例中，小室矩形支持物的每一側有壁，以確保PCR混合物保存於支持物上，因此對於給定的引物所有的表面都是有用的。3.引物固定本發明的低聚核苷酸引物可使用任何可利用的方式粘附、固定、提供和/或應用在固相支持物表面的特定區域上。例如，可使用影印法(如加拿大Affymetrix，Santa Clara所提供的)應用到晶片或固相支持物上的特定區域中的低聚核苷酸引物中去，如下述美國專利中所述的，US5919523，US5837832，US5831070，US5770722，以上專利在此處作為參考被引用。用Brown和Shalon在美國專利5807522(1998)中描述的方式也可將低聚核苷酸引物固定到固相支持物上。在固相支持物上固定引物可使用機器人系統，如由Genetic MicroSystems(Woburn，MA)，GeneMachines(San Carlos，CA)或Cartesian Technologies(Irvine，CA)製造的系統。D.檢測靶聚核苷酸中的序列變異根據本發明的一種方式，進行來自於一種生物樣品的靶多核苷酸的固相擴增，在此過程中多組低聚核苷酸引物固定於一固相載體上。在一優選的實施例中，一組中的引物至少包括在序列上完全相同的第一組引物，它與靶多核苷酸的指定序列是互補的，能在適宜條件下與靶多核苷酸雜合，並適宜作為核酸合成(也就是鏈延長或擴展)的起始引物。被選擇的覆蓋於參照序列的特定區域上的引物作為一個組固定於一固相支持物的非連續區域上。優選的，組與組之間的距離應比用來檢測擴增產物的方法的解析度高。在一優選的實例中，引物固定成為一微陣列或晶片，它們可通過自動的方式來處理和檢測。被固定的引物用於適宜條件下靶多核苷酸以核酸擴增方式的固相擴增。
據本發明所述，起始靶多核苷酸是雙鏈，一條鏈為意義鏈(「積極鏈」)一條為互補鏈(「消極鏈」)。在引導擴增前，靶多核苷酸已被變性，例如熱變性，由此兩條鏈在反應液中被變性和分離。優選的，本發明中所使用的引物相對於靶多核苷酸的預計濃度是大量過量的，以阻止兩條靶多核苷酸鏈的復性。或者，起始聚核苷酸引物是一單鏈，也就是一條單鏈DNA或RNA。
本發明的一個優選的實施例中，核苷酸的擴增由一聚合酶介導。更優選的，擴增在適宜PCR反應的條件下進行。如已有技術中描述的，PCR反應一般包括在不同反應溫度下進行退火一延伸一變性步驟的多個循環，在此過程中初生鏈的多個複製體以起始靶多核苷酸作為模板被合成。結果是，起始靶序列被線形或指數倍地擴增，它取決於PCR反應的條件和所受的限制。
根據本發明，在PCR反應過程中，固定化的引物陣列與靶聚核苷酸在反應混合體系中接觸，若靶多核苷酸是雙鏈則接下來變性。在退火的適宜條件下，單鏈靶多核苷酸與固定化的單引物雜合，該引物含與單鏈靶多核苷酸指定序列區互補的序列。在鏈延長的適宜條件下(包括但不僅限於存在DNA聚合酶和自由核苷酸dNTPs)，每一靶多核苷酸鏈作為初生互補鏈合成的起始模板，合成從初生引物的3』-羥基處啟動，延伸至靶模板的5』端。當鏈延長已完成後，改變反應條件進行變性，在此過程中，靶鏈和初生鏈分離以便於靶鏈釋放到樣品液中，而初生鏈通過固相引物保存在固體支持物上。
在本發明的實際操作過程中，固相化的引物可以單獨使用或者與反應液中與初生固相鏈3』端序列互補的引物聯合使用。而且，液相引物可以是可擴增所有靶多核苷酸的通用引物，也可以是特定引物的組合，即引物中每一個對特定靶序列都是特有的。
本發明的一個方式中，不使用液相引物。因此，上述的起始擴增反應在每一引物位點產生粘附到固相載體上的初生鏈，它是一單鏈或是與起始靶多核苷酸退火後的鏈，依賴於延長後是否引用退火步驟。初生鏈的存在可用下面介紹的檢測方法檢測。
本發明的另一方式中，液相引物與固相引物共同使用來擴增多核苷酸。起始擴增反應之後將進行另一擴增反應循環，在此過程中先前形成的其3』端與液相引物互補的初生鏈與液相引物退火，並作為第二初生連結下來合成的模板，此初生鏈相當大部分與靶多核苷酸相同。作為結果，形成雙鏈初生多核苷酸並在每一引物位點粘接到固相支持物上。
依照本發明的目的，靶多核苷酸可以是雙鏈DNA，單鏈DNA或RNA。靶多核苷酸的實例包括，但不僅限於基因組DNA、cDNA、mRNA、線粒體DNA、病毒DNA、擴增DNA和病毒RNA。雙鏈靶多核苷酸要經過擴增反應起始階段的變性，以提供單鏈模板。
mRNA靶多核苷酸可直接作為經逆轉錄酶介導的擴增反應的模板。當開始於每一固定引物位置的鏈延長完成後，雜合體RNA模板鏈可通過以下方式破壞，例如RNA酶H，留下初生互補DNA鏈粘接到固相支持物上去。如果第二引物(不論是特定的還是通用的)存在於液相中，第一初生cDNA將作為另一初生鏈合成的模板，因而形成雙鏈初生DNA分子在每一固定引物位置或連接兩固相引物。
或者，樣品中的mRNA靶多核苷酸可首先逆轉錄到互補DNA上，此DNA鏈反過來又作為本發明固相PCR反應的起始模板。逆轉錄可開始於，例如根據本發明可作為PCR擴增反應液相通用引物的聚-T通用引物。起始於多聚-T的cDNA產物在3』端與固定在固相載體上的特定引物退火，並作為模板進行下面初生互補鏈在3』端有聚-A序列的合成。經變性步驟後，固定化單初生鏈可與液相聚-T通用引物雜合，並作為接下來PCR擴增循環的模板，並形成粘接到固相載體上的雙鏈初生多核苷酸。
本發明的靶多核苷酸可來自於單生物源，或多生物源，例如不同物種或組織。例如，從健康個體分離的靶多核苷酸群體在PCR反應中可與來自於疾病患者的靶多核苷酸的另一群體混和，在用以上詳細描述的技術中檢測方法識別兩個來源的擴增產物。因而，本發明可用於靶多核苷酸的交叉種群比較分析。5.PCR反應在本發明的實際操作中，含有適當的靶多核苷酸和引導聚合酶連結反應(PCR)的必須試劑的反應混合物與固體載體上的每一固定引物對或單獨引物群接觸。合適的靶多核苷酸可以是雙鏈DAN，產生於RNA模板的逆轉錄的單鏈cDNA，或mRNA群體。反應混合物含有可使與靶序列互補的多核苷酸的合成容易的酶，例如，聚合酶。適宜的聚合酶包括熱穩定聚合酶，如Taq DNA聚合酶，Tth1 DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。反應混合物也可含有能在聚合酶連結反應中插入到初生鏈中去的標記分子，以便於在PCR後擴增產物在固相支持物上檢測。標記物可根據已有方法直接或間接檢測。直接檢測的適宜標記可以是任意螢光分子，如螢光異硫氰酸鹽，德克薩斯紅，鹼性蕊香紅。容易間接檢測的分子，如生物素、洋地黃毒苷，也能在PCR過程中插入到初生鏈中。之後生物素可通過標記的鏈黴抗生物素或標記的抗生物素抗體檢測。同樣地，插入洋地黃毒苷可通過標記或不標記抗洋地黃毒苷抗體，不標記的抗洋地黃毒苷抗體可通過連接標記的抗-抗洋地黃毒苷抗體檢測出來。
在編導PCR的試劑與微陣列上的固定化引物接觸後，使用如原位PCR儀的自動系統來將微陣列置於PCR容易發生的條件中。PCR過程的反應條件可如原位PCR儀器手冊中介紹的那樣，也可以變化如適應給定使用的模板屬性或適應引物和模板雜合所可能遇到的任何其他困難。溫度和循環數可以如同建議的那樣，與給定引物的選擇和模板序列相適應，或任何其他有關條件。在微陣列上發生的原位型PCR反應基本上已在如下文獻中記述，例如，Embretson等Nature 362359-362(1993)；Gosden等，BioTechniques 15(1)78-80(1993)；Heniford等，Nuc.Acid Res.21(14)3159-3166(1993)；Long等，Histochemistry99151-162(1993)；Nuovo等，PCR Methods and Applications2(4)305-312(1993)；Patterson等，Science260976-979(1993)。6.標記和檢測本發明的PCR方法用來檢測樣品中的多靶聚核苷酸。當存在適宜的標記試劑使PCR完成後，擴增和標記了的靶多核苷酸可在微陣列上每一起始引物位置被檢測出來。可用以前已使用的檢測標記序列的標準方法來檢測擴增或標記靶多核苷酸，包括例如，檢測已插入到擴增或新合成的DNA鏈中去的標記物。因此，例如螢光標記物或放射性標記可以直接檢測。其他的標記技術可能需要如生物素或洋地黃毒苷的標記物在合成過程中插入DNA中並被已標記或連接標記物分子本身的抗體或其他連接分子(如鏈黴抗生物素)，例如被標記的分子可以是如抗-鏈黴抗生物素的抗體或抗洋地黃毒苷抗體，這些抗體連接到螢光分子上(如螢光異硫氰酸鹽，德克薩斯紅和鹼性蕊香紅)或連接到具有酶活性的分子上。不論新合成分子上的標記物是什麼，也不論標記物是直接存在於DNA上還是連接於DNA的附帶分子上(或附帶DNA的附帶分子)標記物(如螢光的，酶的，化學發光的或比色的標記物)可依賴於標記物通過雷射掃描儀，CCD照像儀，X-射線膠片或其他適宜的方式來檢測。
靶多核苷酸可使用在PCR過程中將標記了的核苷酸(例如dNTP螢光標記物來直接標記；dNTP抗生素或dNTP洋地黃毒苷來間接標記)插入到擴增DNA中去的方法檢測。對於間接標記DNA，檢測通過螢光物或其他酶連接的鏈黴抗生素或抗洋地黃毒苷抗體的方式實行的。PCR方法包括通過檢測插入到新合成的與靶多核苷酸互補的鏈中標記物來檢測多核苷酸。為此目的，任何能在DNA合成時插入到其中去的標記物都可以被使用，例如，如上所述的螢光dNTP，生物素dNTP，洋地黃毒苷-dNTP。在溶液中使用一個或多個通用引物引導的PCR擴增為檢測固相支持物上某區域的擴增靶提供了選擇，此方法通過檢測通用引物。因而，在使用多個通用引物處，來自於不同源的靶鏈在固相支持物上可特異性地檢測。
在不同的表達系統中，來自不同生物源的擴增產物可通過對基於它們源的擴增鏈的不同標記來檢測，如「C.來自於不同生物源的基因的不同表達比較」描述的那樣。在一種方式中，此處所用的檢測方法與單源靶的檢測方法不同之處在於，在溶液中將不同標記物(例如紅染料[red dye]和綠染料[green dye])預先插入到引物片段中去，而不是在擴增過程中將引物插入到初生鏈中。或者，除特異引物，第三引物也可在擴增過程中插入到初生鏈中，以便於對特異表達對照的全面敏感性加強了。7.檢測試劑盒本發明還提供了用來實行本發明方法的試劑盒。此試劑盒包括，例如用來檢測其他情況下在固相支持物上難於檢測的大多數靶多核苷酸的材料和試劑。試劑盒還包括固相支持物，對靶多核苷酸組特定的低聚核苷酸引物，聚合酶鏈反應試劑和其他成分，如，DNA合成酶，標記材料，和其他緩衝液和洗脫試劑。試劑盒還可能有使用該試劑盒擴增固相載體上靶分子的說明。試劑盒含有已粘接了引物組的固相支持物，如可擴增特定靶多核苷酸的引物，已製備好的固相支持物的設計和結構如上所述。根據顧客需要檢測的靶多核苷酸可將固體載體製成各不相同的試劑盒。試劑盒中也含引導固相載體上PCR所必需的試劑，例如使用原位或固相型PCR，在此過程中支持物可使用原位型PCR儀進行PCR擴增。支持物能與PCR試劑接觸。潛在含有多靶聚核苷酸的樣品在反應前加入到PCR試劑混合物中。PCR試劑含有常用的PCR緩衝液，熱穩定性的聚合酶(如Taq DNA聚合酶)，核苷酸(如dNTPs)，其他成分和標記分子(如前面所述的直接或間接標記)。固相支持物提供已粘附在其上設定區域上的引物。為引導PCR，帶固定化引物的載體與引導PCR的試劑和靶多核苷酸模板在反應混合物中接觸，反應在PCR(如原位型或固相型PCR)適宜的條件下進行。使用試劑盒的說明可包括，例如，以上描述的方法過程的詳細闡述。試劑盒可用來進行PCR擴增不論單獨使用固相化引物，或者與液相引物一起使用。D.多靶聚核苷酸的高處理量分析上述擴增方法可用於在單獨的固相載體上進行多靶聚核苷酸的高處理量分析。多組引物，不論是以單獨形式還是以成對形式固定於固相支持物上以形成預定形式的微陣列。每一組引物對應於一個特定的靶多核苷酸並佔有微陣列上的一個不連續位置。當含有或可能含有多靶聚核苷酸的樣品與微陣列在上述PCR反應的適宜條件下接觸，每一靶多核苷酸擴增並粘接到有互補引物固定的微陣列上的非連續區上。
根據本發明，可能含有的靶多核苷酸的數量僅受用於生產和分析的小密集微陣列的可用技術的限制。例如，使用已知的技術通過利用固相載體上不連續區的大約100,000組不同的引物對，可分析單固相載體上的上至大約100,000多核苷酸，在此過程中使支持物與PCR溶液接觸，樣品至少含有一套引物可檢測的靶多核苷酸。實例例1.微陣列上G3PDF基因的PCR檢測編碼人G3PDH的基因通過在微陣列上的擴增來檢測，這樣的擴增可以是引物對中的二者都固定於載體上的對稱PCR，也可以是引物對的一個被固定而另一個在溶液中的非對稱PCR。
基於人G3PDH(hG3PDH)的已知序列，設計四組引物用於分析。四組引物除3』端的最後一個鹼基不同外，其餘有著與hG3PDH相同的基因序列，而在3』端每一組都有不同核苷酸A、T、C、G。引物在5』端由胺修飾合成以幫助將引物固定在固體支持物上。引物成對的或單獨以不同濃度設置於由Sigma Chemicals公司(St.Louis，MO)購置的一矽烷化玻璃載片上。
帶有引物的載片室溫下於飽和NaCl液中過夜水合化。用4XSSC漂洗水合化的載片5分鐘，然後再用水洗。載片用SurModics公司(Madison，WI)的封閉液在50℃中止15分鐘，然後用水2X漂洗，室溫中乾燥。然後載片就可以使用了。
PCR反應液的最終濃度為dATP，dGTP，dTTP各200μM，100μM dCTP，100μM生物素-14-dCTP。反應液中還含1X Taq反應緩衝液(含1.5mM MgCl2)，人G3PDH基因質粒作為DNA模板(100ng噬菌粒DNA或500ng單鏈cDNA庫)，2.5單位的Taq聚合酶。70μl反應液的組成如下7μl 2mM d3TP(dATP，dGTP，dTTP)12.5μl 0.4mm dCTP12.5μl 0.4mM生物素-14-dCTP7μl 10X反應緩衝液(含15mM MgCl2)5μl DNA模板25.5μl 水0.5μl 5單位/μl Taq DNA聚合酶將它們配成總體積為70μl的溶液。
HyBaid容器(HyBaid USA，Franklin，MA)置於載片上以保證中間有陣列區，將反應液移入容器中，並用塑料蓋密封。PCR儀已預熱，循環如下所述開始階段 ……94℃5分鐘主循環(階段1-3)重複35X-階段1……94℃30秒-階段2……55℃30秒-階段3……72℃30秒最終擴展階段 ……72℃7分鐘結束階段 ……4℃保存PCR完成後，載片於室溫封閉於Bochringer Mannheim公司(Indianapolis，Indiana)的洋地黃毒苷封閉液中30分鐘。用鏈黴抗生物素(5μg/μl)(1∶250稀釋于洋地黃毒苷封閉液)將載片在室溫下振搖染色30分鐘。用洋地黃毒苷洗液將載片在室溫下洗15分鐘，2次。室溫下將載片用洋地黃毒苷封閉液作用30分鐘。
室溫下將載片與第一抗體(兔抗鏈黴抗生物素)作用保溫1小時，抗體1∶100稀釋于洋地黃毒苷封閉液中。再用洋地黃毒苷洗液於室溫下將載片漂洗15分鐘，2次。室溫下將載片與第二抗體(Cy3共軛羊抗-兔抗抗體)作用保溫30分鐘，抗體1∶100稀釋于洋地黃毒苷封閉液中。再用洋地黃毒苷洗液於室溫下將載片漂洗15分鐘，2次。用基因微系統(Genetic MicroSystems)GMS418的綠光掃描載片。
對稱PCR的結果如圖2所示。50ngG3PDH DNA片段當作PCR模板，從縱行1至6的引物濃度分別是250，125，62，31，15，7.8pmol/μl。依標準規程在有生物素化的dCTP存在下進行15個PCR循環，用鏈黴抗生物素和Cy3共軛抗體檢測信號。顯示的斑點表示此處hG3PDH模板成功擴增，在此點處在3』端有殘基的野生型hG3PDH引物被固定。相反地，未發現靶hG3PDH模板可在有不同3』端核苷酸固定化hG3PDH引物處被檢測。
說明書中引用的所有出版物和專利申請作為參考插入，如同每一篇出版物和專利申請作為一個整體都是明確和獨立的。
上述發明為清楚理解已詳細作了闡述和舉例，本領域普通技術人員對發明所作的一定的改變和修飾在本發明權利要求的範圍和宗旨內的。
權利要求
1.一種通過與參照序列比較識別樣品靶多核苷酸的序列變異的方法，該方法包括如下步驟a)將含一組或多組低聚核苷酸引物的陣列與含樣品和試劑的反應混合物接觸，該試劑是用來進行聚合酶介導的多核苷酸擴增的，其中低聚核苷酸引物陣列通過低聚核苷酸5』端固定於固相支持物上，而且其中每一組低聚核苷酸引物被選作延伸參照序列的一個特定的區域，佔據陣列上的一個非連續區，至少含兩組引物1)第一組與參照序列完全互補；2)其餘一組或更多組除了在3』端的核苷酸互不相同外與第一組引物是相同的；b)進行聚合酶介導的多核苷酸擴增，由此靶多核苷酸作為可檢測的初生多核苷酸合成的模板，該初生多核苷酸是由與靶多核苷酸完全互補的引物組延伸的；c)經相應固定化引物檢測捕獲在固相支持物非連續區上合成的聚核苷酸的存在；和d)根據在固定支持物上合成多核苷酸的檢測型，識別靶多核苷酸的序列變異。
2.根據權利要求1的方法，其中反應混合物還含有多組液相引物。
3.根據權利要求2的方法，其中多組液相引物含有通用引物。
4.根據權利要求3的方法，其中通用引物是寡聚dT引物。
5.根據權利要求3的方法，其中通用引物含T7，T3，和SP6啟動子。
6.根據權利要求2的方法，其中液相多組引物含有每個有特定序列的多個引物。
7.根據權利要求2的方法，其中至少兩個不同靶多核苷酸來自於不同生物源。
8.根據權利要求1的方法，其中反應混合物含有插入到初生多核苷酸的可檢測標記物，由此使初生多核苷酸可被檢測。
9.根據權利要求8的方法，其中可檢測的標記物是螢光分子。
10.根據權利要求8的方法，其中可檢測的標記物至少是放射性dNTP，螢光dNTP，生物素化dNTP或洋地黃毒苷dNTP中的一種。
11.根據權利要求8的方法，其中可檢測的標記物與連接到初生核苷酸上的分子共軛。
12.根據權利要求11的方法，其中可檢測的標記物與連接到插入初生聚核苷酸的第二標記物的分子共軛。
13.根據權利要求1的方法，其中該陣列至少含大約100-100,000組固定化寡聚核苷酸引物。
14.根據權利要求13的方法，其中該陣列至少含大約1,000組固定化寡聚核苷酸引物。
15.根據權利要求14的方法，其中該陣列至少含大約10,000組固定化寡聚核苷酸引物。
16.根據權利要求1的方法，其中固相支持物由以下所選的材料製成玻璃，塑料，合成聚合物，陶瓷製品和尼龍。
17.根據權利要求1的方法，其中聚合酶是Taq聚合酶，TthI聚合酶，Vent聚合酶，Pfu聚合酶或其他任何熱穩定聚合酶。
18.一種通過與參照序列比較識別樣品靶多核苷酸的序列變異的試劑盒，它包括a)由多組固定到固相支持物上的寡聚核苷酸引物組成的陣列，其中每一組寡聚核苷酸引物被選作延伸參照序列的一個特定的區域，佔據陣列上的一個非連續區，至少含四組引物1)第一組與參照序列完全互補；2)其餘三組除了在3』端的核苷酸互不相同外與第一組引物是相同的；b)適宜在陣列上進行聚合酶介導的聚核苷酸擴增反應的試劑；和c)檢測陣列上擴增的聚核苷酸的檢測工具。
19.根據權利要求18的試劑盒，其中檢測工具包括一種在擴增反應中插入到擴增多核苷酸中的可檢測標記物。
20.根據權利要求19的試劑盒，其中可檢測的標記物是螢光分子。
21.根據權利要求19的試劑盒，其中可檢測的標記物是生物素化11-dNTP或洋地黃毒苷dNTP。
22.一種通過聚合酶介導的多核苷酸擴增的參照序列比較，識別樣品靶多核苷酸的序列變異的陣列，該陣列含有一組或多組固定於固相支持物上不連續區內的寡聚核苷酸引物，其中寡聚核苷酸引物組被選作延伸參照序列的一個特定的區域，每一組包括至少含兩組引物1)第一組與參照序列完全互補；2)其餘一組或更多組除了在3』端的核苷酸互不相同外與第一組引物是相同的，由此靶多核苷酸作為可檢測的初生多核苷酸合成的模板，該初生多核苷酸是由與靶多核苷酸完全互補的引物組延伸的。
23.根據權利要求22的方法，其中該陣列至少含大約100-100,000組固定化寡聚核苷酸引物。
24.根據權利要求23的方法，其中該陣列至少含大約1,000組固定化寡聚核苷酸引物。
25.根據權利要求24的方法，其中該陣列至少含大約10,000組固定化寡聚核苷酸引物。
26.根據權利要求22的方法，聚合物固相支持物由以下所選的材料製成玻璃，塑料，合成樹脂，陶瓷製品和尼龍。
27.根據權利要求22的方法，其中該寡聚核苷酸引物陣列適合用來識別兩個或更多靶多核苷酸中的序列變異。
全文摘要
一種用固定於微陣列上的引物進行固相聚合酶介導的擴增的方法，該方法可檢測靶多核苷酸中的序列變異。此處的方法和組合物可用於研究和臨床應用，特別適於目標生物樣品基因信息的大規模分析。
文檔編號C12M1/00GK1426481SQ01801039
公開日2003年6月25日 申請日期2001年3月20日 優先權日2000年3月22日
發明者於在林, 彭早元, 胡前進 申請人:默金有限公司