誘導抗獨特型反應增強的修飾抗體的製作方法

2023-09-19 09:51:00 2

專利名稱：誘導抗獨特型反應增強的修飾抗體的製作方法
相關申請的交叉參考本申請要求於1997年11月14日提交的臨時申請號為60/065，716和1998年4月10日提交的臨時申請號為60/081，403的兩份申請的權利，本文將其全文引入作為參考。
1.發明領域本發明涉及修飾的免疫球蛋白及其疫苗組合物，其中用不含巰基基團的胺基酸替代可變區中形成鏈內二硫鍵的一個或多個半胱氨酸殘基，由此不形成二硫鍵。本發明還涉及使用本發明的疫苗組合物治療或預防一些疾病和失調，尤其是癌症和傳染病。
2.發明背景2.1免疫球蛋白結構免疫球蛋白結構的基本單位是四條多肽鏈構成的複合物—兩條一樣的低分子量「輕」鏈，兩條一樣的高分子量「重」鏈，通過非共價鍵和二硫鍵一起構成。在抗體分子的輕重鏈的氨基末端有一個可變區，在羧基末端有一個恆定區(見

圖1)。每個抗體的可變區都是獨特的，含有抗原結合位點。而每個可變區又包括四個相對保守的框架區和三個高度可變的命名為互補決定區或CDRs的區域(見圖2)。大多數情況下，CDRs形成抗體的抗原結合位點並賦予其抗原性。恆定區相對於可變區來說是，保守性強，僅存在由於單倍型不同的輕微變異。
根據胺基酸序列的不同，輕鏈又分為κ和λ型。重鏈恆定區由多個結構域構成(CH1，CH2，CH3…CHx)，具體的結構域數取決於特異抗體的種類。CH1和CH2之間有鉸鏈區分開，鉸鏈區賦予抗體分子伸屈性。輕鏈的可變區和重鏈的可變區排列在一起，輕鏈的恆定區和重鏈的第一恆定區排列在一起。重鏈的CH2-CHx結構域構成了Fc區，該區與免疫球蛋白分子的效應功能相關，如補體結合和與表達在淋巴細胞、粒細胞、單核系細胞、殺傷細胞、肥大細胞以及其它免疫細胞上的Fc受體結合。
如圖3所示，IgG分子的輕鏈和重鏈構成了可變區和恆定區結構域。每個結構域又是由兩個平行伸展的、約100個胺基酸構成的結構，通過單個二硫鍵構成(參見Roitt et al.，免疫學，第三版，London；Mosby，1993，p4.4).結構域的兩個平行伸展的蛋白片層中的每一個又包含兩個反向平行的相鄰的鏈，每個相鄰的鏈又含有一β片層構象結構(Stryer，1975，生物化學，WH Freeman and Co.，p.950)。免疫球蛋白摺疊後，每個結構域都有一個相似的三維結構。
2.2免疫治療與抗獨特型抗體在現代醫學中，免疫治療或疫苗事實上根除了諸如脊髓灰質炎，破傷風，結核，水痘，麻疹，肝炎等。疫病疫苗應用已經證明了免疫系統能夠預防傳染性疾病。
免疫治療同樣也應用於腫瘤的治療。腫瘤免疫紀元開始於PREHN和MAIN所作的實驗，他們的研究表明，用甲基膽蒽(MCA)誘導的肉瘤抗原是腫瘤特異性的，移植檢測在小鼠的正常組織中找不到該抗原(Prehn et al.，1957，J.Natl.Cancer Inst.1879-778)。進一步的證實這一點的實驗是抗MCA的腫瘤特異性的抗性在腫瘤源鼠的固有(autochthonous)宿主也誘導產生(Klein et al.，1990，癌症研究20151-1572)。
腫瘤病人使用免疫治療理由充分。首先，如果手術中病人的免疫反應被抑制，如使用麻醉劑和隨後使用化療的話，免疫抑制可能進一步惡化，在手術前進行免疫治療，可能預防免疫抑制或使之逆轉。這將降低感染並促使傷口癒合。其次，手術與放化療後，腫瘤細胞量變小，此時使用免疫治療將更有效。最後，在手術過程中，腫瘤細胞有可能進入循環系統，此時有效的免疫治療則可清除這些細胞。
免疫治療分為兩種，即「主動免疫」和「被動免疫」。「主動免疫」是用抗原作為疫苗，給病人用藥後誘導病人的保護性免疫反應。「被動免疫」是給患者使用抗體，並不誘導伴隨的免疫反應。當源於某種動物的抗體作為免疫原注射給第二種合適的動物時，將誘導宿主的免疫反應。通常抗體治療是被動免疫的特徵，因為抗體並不是患者自己產生的。但是，被動一詞往往會使人產生誤解，其實病人能夠產生抗獨特型的二抗，能夠激發免疫反應並與原抗原發生交叉反應。在使用抗體後，病人免疫系統的參與，可持續與含特定抗原的細胞反應，故此，產生二抗的病人的免疫治療效果更好。
在抗獨特型反應中，開始產生的抗體或引入機體的抗體帶有機體本身不相容的新表位，因此誘導產生了第二抗體(命名為「Ab2」)，其中部分抗體是針對初始抗體(命名為「Abl」)的獨特型(即抗原結合位點)，初始抗體即初次產生的抗體或外源引入的抗體。這些二抗或二抗樣的抗體也有其獨特型位點，將會誘導第三抗體的產生稱為「Ab3」，其中有一些抗體識別Ab2的抗原結合位點，如此類推。這就是著名的網絡理論。部分二抗的結合位點類似初始抗原，因此將再現初始抗原的「內影像」。識別二抗的抗原結合位點的三抗，同樣識別初始抗原。(見圖4)因此，抗獨特型抗體的結合位點在構象和電荷方面與抗原相似，可誘導出與腫瘤抗原一樣或更強的反應。因此使用能誘導強的抗獨特型抗體的外源性的抗體，通過維持恆定的免疫反應可作為一種有效的疫苗。
由於抗獨特型反應是典型的人抗鼠抗體反應(HAMA)的一部分，所以到面前為止，抗獨特型疫苗包含鼠抗體。但Abl的結構被破壞後，賦予抗體更強的抗原性，可看到強的抗獨特型反應鏈(Madlyalakanet a1.，1995，雜交瘤14199-203)。已經有直接給患者使用外源性的抗獨特型抗體後，產生了抗腫瘤抗體的獨特型抗體(U.S.PulicationNo.4，918，14)。用藥後，機體產生的抗-抗體不僅識別抗獨特型的抗體，而且還識別原腫瘤抗原，並因此直接激活補體反應和其它的對外免疫系統反應，攻擊表達腫瘤抗原表位的腫瘤細胞。
雖然抗獨特型疫苗是理想的目標，而且有成功的範例，然而使用抗體後能重複引發這樣的抗獨特型反應的能力通常是不可能的(Foonet al.，1995，J.Clin.Invest.9334-342；(Madlyalakan etal.，1995，Hybridoma 14199-203)。失敗的原因之一是，雖然產生抗獨特型反應的Ab1是外源性的，但由於抗體分子都非常相似，所以與自身分子很相似，而機體對自身分子產生抗獨特型反應的傾向型有限。因此，本領域需要可靠方法，來產生針對特定抗體的抗獨特型抗體。
3.發明概述本發明基於發明人的實踐，即抗體分子可變區中形成一個或多個二硫鍵的一個或多個的半胱氨酸被不含巰基的胺基酸替代，這樣抗體二硫鍵形不成，該抗體可誘導比可變區中二硫鍵完整的抗體分子更強的抗獨特型反應。
相應地，本發明提供修飾的免疫球蛋白分子或抗體(功能活性片段，衍生物和類似物)和包含這些免疫球蛋白分子的疫苗組合物，其中修飾免疫球蛋白分子的可變區，如斷開鏈內或鏈間的一個或多個二硫鍵，構象緊密性傾向於降低，但並不限於這些方法。本發明提供修飾的免疫球蛋白，包括一個可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白分子免疫特異性結合抗原(即本領域中能確定抗原抗體結合的方法可確定的免疫球蛋白與其抗原的特異性結合，其中不包括與其它抗原的非特異性但又非必要的交叉反應性)，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸。在優選方案中第二免疫球蛋白分子免疫特異性的結合腫瘤抗原；在其它優選方案中，第二免疫球蛋白分子免疫特異性的結合傳染病病原抗原或結合該病原的細胞受體。
本發明還提供了，在受試者應用本發明的修飾免疫球蛋白誘導抗獨特型反應的方法。在特定的方案中，本發明的免疫球蛋白可用於治療或預防腫瘤，尤其是使用來源於免疫特異性結合腫瘤抗原的修飾免疫球蛋白(即按照本發明的修飾方法，用不含巰基的胺基酸替代可變區中形成二硫鍵的一個或多個半胱氨酸)，所說的腫瘤抗原是與特定類型的腫瘤相關表達的腫瘤抗原。此外，在其它方案中，本發明的免疫球蛋白分子可用於治療或預防傳染病，尤其是使用來源於免疫特異性結合傳染病病原抗原或結合引起傳染病的傳染病病原的細胞受體的修飾免疫球蛋白分子。
本發明還提供本發明的修飾免疫球蛋白分子生產方法以及包含本發明的修飾免疫球蛋白分子的疫苗組合物的生產方法。
4.附圖簡述圖1.免疫球蛋白分子的輕重鏈結構示意圖。每條鏈由氨基末端(H2N-)的可變區和羧基末端(-COOH)的恆定區組成。
圖2.IgG分子輕重鏈可變區(相應的標為VL和VH)中四個框架區(FR1，FR2，FR3，FR4)和三個互補決定區(CDR1，CDR2，CDR3)示意圖。輕鏈恆定區標為CL，重鏈恆定區的三個結構域標為CH1，CH2和CH3。Fab是包括輕重鏈可變區和CL和CH1部分的抗體片段。Fc是包括CH2和CH3結構域的恆定區片段。
圖3.抗體結構示意圖。同圖2一樣，但強調由維持三維結構的二硫鍵(黑線所示)所確定的每個結構性結構域(相應地標為VL，VH，CL，CH1，CH2和CH3)(Roitt et al.，免疫學，第二版LondonGowerMedical Publishing，1989，p5.3)。
圖4.在抗獨特型反應鏈中，由抗配基的獨特型抗體(Ab1)引發的抗獨特型抗體(Ab2)和抗抗獨特型抗體(Ab3)的內映象發生過程示意圖。
圖5.用丙氨酸替代可變區中形成二硫鍵的半胱氨酸，斷開可變區二硫鍵的免疫球蛋白可變區修飾示意圖。CH1，CH2，CH3是恆定區，VH是重鏈可變區，VL是輕鏈可變區。
圖6A-C.(A)表達載體pMRR010.1的結構，其中包含人κ輕鏈恆定區序列。(B)表達載體pGammal的結構，其中包含人IgG1重鏈恆定區(CH1，CH2，CH3)和鉸鏈區。(C)表達載體pNEPuDGV的結構，其中包含編碼輕鏈κ恆定區的序列和重鏈恆定區和鉸鏈區的序列。三個載體參見Bebbington et al.，1991，酶學方法2136-145。
圖7A和B.(A)輕鏈可變區ConVL1的共有序列，包括導肽的胺基酸和相應的核酸序列。(B)重鏈可變區ConVH1的共有序列的胺基酸和相應的核酸序列，其中包括導肽序列。
圖8A-B.(A)2CAVLCOL1的胺基酸及相應的核酸序列，其中抗體的輕鏈可變區源於mAb31.1，其中23位和88位的半胱氨酸被丙氨酸替代，用方框框住。(B)2CAVHCOL1的胺基酸及相應的核酸序列，其中抗體的重鏈可變區源於mAb31.1，其中23位和88位的半胱氨酸被丙氨酸替代，用方框框住。
圖9A-D.(A)裝配2CAVHCOL1的寡核苷酸，是針對人結腸癌腫瘤抗原的重鏈可變區基因。(B)裝配2CAVLCOL1的寡核苷酸，是針對人結腸癌腫瘤抗原的輕鏈可變區基因。(C)裝配輕鏈共有區的寡核苷酸，參照ConVL1。(D)裝配重鏈共有區的寡核苷酸，參照ConVL1。
圖10.合成特異識別人結腸癌抗原的修飾抗體基因的裝配步驟示意圖。
圖11.免疫印跡結果。比較了源自mAb31.1而沒有用半胱氨酸替代丙氨酸的抗體和標記生物素的同一抗體與LS-174T細胞製備的抗原的競爭性結合。nM未標記抗體濃度，「blk」帶表示無抗原。
圖12A-D.(A)競爭性結合檢測結果包括生物素標記的抗結腸癌細胞的抗體與用空載體免疫小鼠的血清，識別結腸癌細胞但未經修飾的對照抗體，和CDR1，CDR2，CDR3，CDR4，CDR5，CDR6這些含有緩激肽受體結合位點的CDR區序列的多肽的競爭結果，其中這些多肽是用於表示結合LS-174T細胞的百分比對照。(B)競爭性結合檢測結果包括生物素標記的抗結腸癌細胞的抗體與用空載體免疫小鼠的血清，識別結腸癌細胞但未經修飾的對照抗體，和用2CAVHCOL1和2CAVLCOL1免疫的小鼠血清的競爭結果。(C)生物素標記(用b表示)抗體(倒置的Y)與抗原(實心三角)的結合示意圖。(D)抗獨特型抗體(實心箭頭)抑制生物素標記(用b表示)抗體(倒置的Y)與抗原(實心三角)的結合示意圖。
圖13.輕鏈可變區CDR中包含HMFG-1結合序列的核苷酸序列。
5.發明詳述本發明提供用修飾免疫球蛋白(尤其是抗體和活性功能片段，衍生物和類似物等)比相應的未經修飾的免疫球蛋白誘導較強的免疫反應，尤其是較強的抗獨特型反應。特別是，修飾前可免疫特異性結合抗原的免疫球蛋白分子經修飾後，免疫球蛋白分子可變區構象緊密性降低，優選可變區中參與鏈內二硫鍵形成的半胱氨酸中至少有一個被不含巰基的胺基酸替代，因而形不成二硫鍵，所以可變區構象緊密性降低(圖5)。本發明的優選實施方案中，修飾免疫球蛋白分子源自能免疫特異性結合腫瘤抗原的免疫球蛋白。而其它優選實施方案中，修飾免疫球蛋白源自能免疫特異性結合傳染病病原抗原或結合該抗原的細胞受體的免疫球蛋白。
本發明還提供了含本發明的免疫球蛋白分子的疫苗組合物。此外，本發明還提供了使用本發明的修飾免疫球蛋白，在某一受試者誘導產生抗獨特型反應的方法。
在具體實施方案中，本發明還提供使用本發明的修飾免疫球蛋白分子預防和治療腫瘤的方法，其中所說的免疫球蛋白修飾前，可與某種腫瘤相關的表達抗原免疫特異性的結合。使用該修飾免疫球蛋白能在宿主中誘導受試者產生抗獨特型反應，誘導抗腫瘤抗原的抗體產生。而在另一個具體實施方案中，所說的免疫球蛋白修飾前，可免疫免疫特異性的結合傳染病病原抗原或者結合該抗原的細胞受體。這免疫球蛋白還可用於治療或預防由傳染病病原引起的傳染性疾病。
為使敘述更詳盡，發明詳述分成以下幾個部分，但不是限制本發明。
5.1修飾的抗體本發明的修飾免疫球蛋白，尤其是抗體，至少在修飾前能夠免疫免疫特異性的結合抗原，而修飾後其誘導抗獨特型反應的能力被增強。這種修飾可降低免疫球蛋白可變區構象的緊密性，修飾方法如去除或還原鏈內或鏈間二硫鍵，化學修飾或本領域中任何其它已知的方法。尤其是本發明提供第一免疫球蛋白，除了可變區中一個或多個胺基酸被替代外，其餘胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，該第二免疫球蛋白可免疫特性結合抗原，所述替代是用不含巰基的一個或多個胺基酸替代第二免疫球蛋白分子中形成鏈內二硫鍵的相應位置上的半胱氨酸。本發明還提供了包含編碼本發明修飾免疫球蛋白分子的核酸序列在內的核酸序列。
確定具體抗體分子中形成二硫鍵的半胱氨酸方法，可以是本領域中已知的任何方法。比如眾所周知，形成鏈內二硫鍵的半胱氨酸在抗體各類型和種間高度保守，因此與已知形成鏈內二硫鍵的半胱氨酸位置的抗體分子胺基酸序列比較就可確定未知的抗體分子中的半胱氨酸位置。
表1列出了很多抗體分子中形成鏈內二硫鍵的半胱氨酸的位置。
表1(來自Katal et al，免疫目的蛋白的序列，第5版U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda，Marryland)種類 可變區亞組 形成二硫鍵的半胱氨酸(位置)人κ輕鏈I 23，88人κ輕鏈II23，88人κ輕鏈III 23，88人κ輕鏈IV23，88人λ輕鏈I 23，88
人λ輕鏈II 23，88人λ輕鏈III23，88人λ輕鏈IV 23，88人λ輕鏈V 23，88人λ輕鏈VI 23，88小鼠 κ輕鏈I 23，88小鼠 κ輕鏈II 23，88小鼠 κ輕鏈III23，88小鼠 κ輕鏈IV 23，88小鼠 κ輕鏈V 23，88小鼠 κ輕鏈VI 23，88小鼠 κ輕鏈VII23，88小鼠 λ輕鏈雜合 23，88小鼠 λ輕鏈 23，88黑猩猩λ輕鏈 23，88大鼠 κ輕鏈 23，88大鼠 λ輕鏈 23，88兔κ輕鏈 23，88兔λ輕鏈 23，88狗κ輕鏈 23，88豬κ輕鏈 23，(88)豬λ輕鏈 23，88豚鼠 λ輕鏈 23，(88)綿羊 λ輕鏈 23，88雞λ輕鏈 23，88火雞 λ輕鏈 23，(88)銀鮫 λ輕鏈 23，(88)鯊魚 κ輕鏈 23，88人重鏈 I 22，92人重鏈 II 22，92人重鏈 III22，92小鼠 重鏈 I(A) 22，92
小鼠 重鏈 I(B) 22，92小鼠 重鏈 II(A) 22，92小鼠 重鏈 II(B) 22，92小鼠 重鏈 II(C) 22，92小鼠 重鏈 III(A) 22，92小鼠 重鏈 III(B) 22，92小鼠 重鏈 III(C) 22，92小鼠 重鏈 III(D) 22，92小鼠 重鏈 V(A) 22，92小鼠 重鏈 V(B) 22，92小鼠 重鏈 雜合 22，92大鼠 重鏈 22，92兔重鏈 22，92豚鼠 重鏈 22，92貓重鏈 22，(92)狗重鏈 22，92豬重鏈 22，(92)鼬重鏈 22，(92)海獅 重鏈 22，(92)海豹 重鏈 22，(92)火雞 重鏈 22，92鴨重鏈 22，(92)鵝重鏈 22，(92)企鵝 重鏈 22，(92)火雞 重鏈 22，(92)短吻鱷重鏈 22，92爪蛙 重鏈 22，92Elops 重鏈 22，92金魚 重鏈 22，92銀鮫 重鏈 22、(92)鯊魚 重鏈 22，92( )中的位置號通過與已知序列比較推斷得出的，並非測定的該蛋白位置。
值得注意的是，表1所列出的抗體分子中形成鏈內二硫鍵的半胱氨酸都位於輕鏈可變區的23或88位，位於重鏈可變區的22或92位。所涉及的殘基位置號對應於Katal等(來自Katal et al，免疫目的蛋白的序列第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，Bethesda，Marryland)所定的共有序列殘基或圖7A和B中輕重鏈的可變區序列。(對應的意思是是通過排列指定抗體分子中的共有序列或圖7A或B中輕重鏈的可變區序列。)相應地，本發明實施方案中修飾的免疫球蛋白是一種抗體，其中輕鏈23位和/或88位胺基酸殘基被不含巰基的胺基酸替代，或者重鏈22位和/或92位胺基酸殘基被不含巰基的胺基酸替代。
在本發明的修飾免疫球蛋白中，替代形成二硫鍵的半胱氨酸的胺基酸是不含巰基的任意胺基酸，如丙氨酸，精氨酸，天冬醯胺，天冬氨酸，穀氨酸，穀氨醯胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸絲氨酸蘇氨酸，酪氨酸，色氨酸，或纈氨酸。在優選實施方案中，替代半胱氨酸殘基的是甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺殘基，最優選實施方案中是丙氨酸殘基。
另外，形成二硫鍵的半胱氨酸可用不含巰基的非典型胺基酸或化學胺基酸類似物替代(比如用常規蛋白合成方法，但並不限於這些方法)。非典型胺基酸包括典型胺基酸的右旋胺基酸，α氨基丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基並丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟代-胺基酸，諸如設計的β-甲基胺基酸，Cα-甲基胺基酸，Nα-甲基胺基酸，胺基酸類似物。而且，胺基酸可以是右旋或左旋的。在備選實施方案中，形成二硫鍵的胺基酸殘基可刪除。
在具體實施方案中，重鏈或輕鏈或者輕重兩條鏈可變區中的形成二硫鍵的胺基酸殘基被替代。在另外的實施方案中，形成具體二硫鍵的殘基之一被替代(或刪除)，或者形成二硫鍵的兩個殘基被替代(或刪除)。
在其它實施方案中，本發明提供了免疫球蛋白分子，其中該免疫球蛋白分子中有一個或多個胺基酸替代，其中包括用不含巰基的胺基酸替代對應於第二抗體分子可變區中形成二硫鍵的胺基酸，另外還有一個或多個胺基酸的替代(即用不含巰基的胺基酸替代的不是形成二硫鍵的兩個殘基)。
尤其是，本發明提供了第一免疫球蛋白分子，該分子包含一個可變區，該可變區序列除一個或多個胺基酸替代外，與第二免疫球蛋白序列一致。該第二免疫球蛋白可免疫特異性的結合抗原，其中第一免疫球蛋白中相應於第二免疫球蛋白分子可變區中形成二硫鍵的一個或多個半胱氨酸中，至少有一個或多個被不含巰基的胺基酸替代。
在優選實施方案中，用不含巰基的胺基酸替代形成二硫鍵的半胱氨酸的變化，是不穩定的胺基酸替代。穩定的變化是指那些胺基酸變化導致抗體分子穩定性增強的變化。這些穩定性的胺基酸變化是具體抗體分子中具體位置上，不常見的胺基酸用指定位置上(Katal等在免疫目的蛋白的序列，第5版，U.S.Department of Health andHuman Services，Bethesda，Marryland一書中所定的抗體共有序列號)常用的胺基酸替代，如用抗體分子的共有序列中，該位置上的胺基酸替代(參見PCT Publication WO96/02574，1996，2，1，Steipe etal)。
其它類型的胺基酸替代也是以不改變修飾免疫球蛋白誘導抗-抗-獨特型反應的能力為前提的，比如，已知的5.5中所描述的例子。這種替代包括，比如，用功能相近的胺基酸替代；用極性相同、功能相近的另一個胺基酸替代一個或多個胺基酸。序列中胺基酸的替代可選自其所屬的胺基酸類的其它成員，比如非極性(疏水)胺基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸；極性中性胺基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺。帶正電荷的(鹼性)胺基酸包括精氨酸，賴氨酸，組氨酸；帶負電荷的(酸性)胺基酸包括天冬氨酸，穀氨酸。
本發明的修飾抗體源自可免疫特異性結合任何抗原的抗體。在優選實施方案中，修飾抗體源自可免疫特異性結癌抗原，尤其腫瘤抗原的抗體。在具體實施方案中，修飾抗體來源於能夠結合下列抗原的抗體，包括多態表皮粘蛋白抗原，人結腸癌相關蛋白抗原，人結腸癌相關的碳水化合物抗原，人乳脂肪小球抗原，或者乳腺，卵巢，子宮，前列腺，膀胱，肺，皮膚，結腸，胰腺，胃腸道，B或T淋巴細胞或其它腫瘤標誌性表達抗原，如在5.21中所討論的那些抗原。在優選實施方案中，修飾抗體源自Mab31.1(源自美國典型培養物保藏中心10801，Uinversity Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2201保藏號No.12314)，Mab33.28或(保藏號No.12315 Mab HMFG-1(見PCT Publication W090/0514和PCT Publication W092/04380)。
在另一具體實施方案中，修飾抗體源自可免疫特異性結合傳染病病原抗原或結合該抗原細胞受體的抗體。在優選實施方案中，抗原是細菌抗原，病毒性抗原，或寄生蟲抗原，或者其它的傳染病病原抗原，如在5.22中所討論的那些傳染病病原抗原。
本發明的修飾抗體可以是任何類別、型或亞型的免疫球蛋白分子。優選實施方案中，採用的是抗體分子，優選選自IgG，IgE，IgM，IgD和IgA，更優選是IgG分子。備選實施方案中，免疫球蛋白分子是T細胞或B細胞受體，細胞表面的粘附分子，諸如CD4，CD8或CD19等輔因子，或MHC分子中的不變結構域。
修飾抗體可源自天然抗體，優選單抗、合成抗體或基因工程抗體。一方面，本發明的修飾免疫球蛋白源自某種抗體，其中結合對結合位點或抗原部分的結合位點，插入或替代全部或部分的可變區CDR，如共同未決的美國專利申請號____中所述，題目是，「包含一個合成可變區和修飾特異性的免疫球蛋白分子」，由Burch提供申請，申請日是1998年12月13日(代理人文檔號No.6750-016)本文在此全文引用。
尤其是，合成抗體能夠免疫特異性地結合配對結合體中的第一組份，其中抗體的CDR區中至少有一個CDR區第一組份結合位點，該結合位點源於配對結合體的另一組份的胺基酸序列。本發明中，一方面結合位點胺基酸序列在CDR區中未在天然環境下發現。另外，CDR區中至少有一個區包含抗原部分，尤其是表位部分。
結合位點的胺基酸序列，可用本領域中任何已知的方法確定。比如某些情況下，已經明確知道結合對中的一個組份的具體序列直接參與了與另外組份的結合。在這種情況下，該序列就可用於構建合成抗體的CDR區，該抗體特異識別結合對的第二組份。如果結合對中某一組份與第二組份結合的胺基酸序列未知，可以通過本領域中其它任何已知的方法確定，如用分子模建方法或者實驗方法來確定，如通過檢測與另一組份結合的成份(如肽)，或者通過突變並尋找阻斷結合的突變體確定結合位點。
結合對可以是任何相互作用的兩個分子，包括蛋白，核酸，碳水化合物或脂類，但優選可從中找出結合位點的結合對是相互作用的蛋白。在優選實施方案中，修飾的免疫球蛋白包含腫瘤抗原，傳染疾病病原抗原，病原體細胞受體，或者參與受體-配基相互作用的受體或配基結合序列。
在具體實施方案中，結合對是相互作用的蛋白對，它們可以是同型相互作用(即同種蛋白之間的相互作用)，或者是異型相互作用(即不同蛋白之間的相互作用)。
在具體實施方案中，結合對第一組份是配基-受體中的一種，其中優選配基-受體結合後，能夠誘導出生理性反應的，如細胞內信號傳導。通過例子說明，配基或受體可以是激素，自體有效物質，生長因子，細胞因子或核遞質，或者是激素，自體有效物質，生長因子，細胞因子或神經遞質的受體，或者參與信號傳導的配基或受體(信號傳導途徑的綜述，見Campbell，1997，J.兒科雜誌.131S42-S44；Hamilton，1997，J.Leukoc.Biol.62145-155；Soede-BobokTouw，1997，J.Mol.Med.75470-477；Heldin，1995，細胞80213-223；Kishimoto et al.，1994，細胞76253-262；Miyajima etal.，1992，Annu.Rev.Immunol.10295-331；Cantley et al.，1991，細胞64281-302)，但並不限於舉例的幾個方面。在具體實施方案中，結合對的第一組份是配基，如縮膽囊肽，galanin，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-11，趨化因子，瘦素，蛋白酶，神經肽Y，神經激肽-1，神經激肽-2，神經激肽-3，鈴蟾肽，胃泌素，促腎上腺皮質素釋放激素，內皮素，褪黑激素，促生長素抑制素，血管活性腸肽，表皮生長因子，腫瘤壞死因子，多巴胺，內皮素，或者是這些配基的受體，但並不限於所舉例子。在其它的具體實施方案中，結合對的第一組份是受體，如阿片樣物質受體，葡萄糖轉運蛋白，穀氨酸受體，孤獨素受體，促紅細胞生成素受體，胰島素受體，酪氨酸激酶受體，KIT幹細胞因子受體，神經生長因子受體，胰島素樣生長因子受體，粒細胞克隆刺激因子受體，促生長素受體，膠質細胞來源的神經營養因子受體或gp39受體，G蛋白受體類或β2腎上腺素能受體或者結合這些受體的配基，但並不限於所舉例子。在另外的具體實施方案中，結合對的第一組份是配基門控的離子通道，如鈣離子通道，鈉離子通道，或鉀離子通道，但並不限於所舉例子。在確定的實施方案中，本發明提供修飾免疫球蛋白，免疫特異性結合受體和受體結合的配基的拮抗劑，比如，內啡肽，腦啡肽或者傷害素的拮抗劑，但並不限於所舉例子。在其它實施方案中，本發明提供了合成修飾抗體，該抗體可免疫特異性結合受體，是該受體的激動劑，如內啡肽，腦啡肽或者傷害素的受體，但並不限於所舉例子。優選實施方案中，修飾免疫球蛋白不結合纖維蛋白受體；另一個優選實施方案中，結合序列不是Arg-Gly-Asp，也不是結合序列的多聚體，優選的也不是序列Arg-Gly-Asp的多聚體。
在其它具體實施方案中，修飾免疫球蛋白含一個CDR區，該區含轉錄因子結合位點，其中優選的一面是修飾免疫球蛋白並不結合特異的DNA序列，尤其是不結合轉錄因子的結合位點。
在優選實施方案中，修飾免疫球蛋白中至少有一個CDR區中含腫瘤抗原或癌抗原結合位點的胺基酸序列(如下文5.2.1中詳細說明)，更優選的抗原是人結腸癌相關抗原或表皮粘蛋白抗原。在另外的實施方案中，修飾免疫球蛋白中至少一個CDR區含人乳脂肪小球受體結合位點的胺基酸序列。在其它實施方案中，修飾免疫球蛋白至少有一個CDR區含乳腺，卵巢，子宮，前列腺，膀胱，肺，皮膚，結腸，胰腺，胃腸道，B或T淋巴細胞抗原結合位點的胺基酸序列。
在其它優選實施方案中，修飾免疫球蛋白至少一個CDR區含傳染病病原結合位點的胺基酸序列(詳見5.22，下文)，或者是傳染病病原的細胞受體的胺基酸序列，優選結合位點不是瘧原蟲抗原的胺基酸序列，或不是結合位點Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro。另外的實施方案中，修飾抗體有一個CDR區，含細菌或病毒酶的結合位點。
抗體的合成(即結合位點序列插入CDR區)基於天然或已有抗體分子的序列，或者是合成已知抗體分子的共有序列，如圖7A和B中所示的輕重鏈可變區的共有序列，或其它抗體共有序列或種系(即未重組的基因組序列)序列(如Kabat等所述的抗體共有序列和種系序列，1991，免疫目的蛋白的序列，第5版NIH出版物號91-3242，2147-2172頁)。
每個抗體分子有6個CDR序列，輕鏈有3個，重鏈有3個，其中5個是種系CDR區，(即來源於動物的基因組，未進行重組)，一個是非種系CDR(即與不同於種系基因組序列的CDR區，是由種系序列重組產生的)。是否是種系CDR，可通過對CDR區測序並與已知的種系CDR區序列比較(免疫目的蛋白的序列，第5版NIH出版物號91-3242，2147-2172頁)。與已知種系CDR區序列明顯的不同表明，該CDR區是非種系的。相應地，含有結合位點的或抗原胺基酸序列的CDR區是種系的CDR或非種系的CDR區。
結合位點或抗原序列可以插入到抗體分子的任意CDR區，而且目前本領域的技術完全可以將結合位點插入到抗體的不同CDR區中。然後檢測修飾抗體結合結合對中指定組份的能力，如下文5.5中所述，或者修飾抗體誘導對抗原位點的免疫反應，如下文5.5中所述。這樣就可以確定包含結合位點或抗原位點的最適CDR區。在具體實施方案中，重鏈或輕鏈的CDR可被修飾後，接納含結合位點或抗原序列。在另外的具體實施方案中，重鏈或輕鏈的可變區的第一、第二或第三CDR區接納結合位點或抗原位點的序列。在本發明的另一個實施方案中，不止一個CDR區含有結合位點或抗原位點的序列，或者不止一個CDR區都含有同一分子的不同結合位點序列，或者不止一個CDR區含有不同分子的不同結合位點序列。特別是，2，3，4，5或6個CDR區經改造後，包含結合對中第一組份的結合位點序列。在優選實施方案中，一個或多個CDR區含結合對中第一組份的結合位點，且一個或多個CDR區含免疫細胞如T細胞、B細胞、NK細胞、K細胞TIL細胞或中性粒細胞等表面分子結合位點，但並不限於所列舉的幾種細胞。再比如，修飾抗體含腫瘤抗原結合位點或傳染病病原抗原結合位點和免疫細胞表面分子結合位點，該抗體使免疫細胞定向作用於含腫瘤抗原的腫瘤細胞或作用於傳染病病原。
在本發明具體實施方案中，結合位點或抗原的胺基酸序列可在不必替換任何CDR區本身的胺基酸序列的前提下，插入到CDR區，或者是用結合位點或抗原的胺基酸替換全部或部分的CDR區本身的胺基酸。在具體實施方案中，結合位點胺基酸替換CDR區中1，2，5，8，10，15或20個的胺基酸。
在CDR區中，表現的結合位點或抗原胺基酸序列是結合對組份之一結合必需的最小序列，或者是誘導針對抗原的免疫反應必需的最小序列(這可通過本領域中任何已知的實驗方法經試驗驗證)；備選實施方案是，比結合結合對組份之一必需的最小序列大些的結合位點或抗原胺基酸序列，或者是比誘導針對抗原的免疫反應必需的最小序列大的序列。在具體實施方案中，結合位點或抗原胺基酸長度至少是4個胺基酸，或者至少是6，8，10，15或20個胺基酸。在其它實施方案中，結合位點胺基酸長度不小於10，15，20或25個胺基酸，或者是5-10，5-15，5-20，10-15，10-20或15-20個胺基酸。
另外，CDR區總長度(即結合位點序列和CDR區其餘的序列之和)，適合抗體與抗原的結合的恰當長度。表2列舉了已知的CDR區中有的胺基酸殘基數範圍和CDR區(圖2中標明)的大小。
表2CDR 殘基數L110-17L27L37-11H15-7H29-12H32-25(資料來自Kabat and Wu，1971，紐約科學院年報190382-9)多數的CDR H3區長度為5-9個胺基酸，而有的CDR H3區長度比較長，特別是抗病毒抗體重鏈CDRH3區長度多數為17-24個胺基酸。
相應地，本發明具體實施方案中，含結合位點或抗原部分的CDR區長度範圍在表2列出的CDR區所指範圍之內，即輕鏈的第一CDR區，L1在10-17個胺基酸之間；輕鏈的第二CDR區，L2在7個胺基酸之間；輕鏈的第三CDR區，L3在7-11個胺基酸之間；重鏈的第一CDR區，H1在5-7個胺基酸之間；重鏈的第二CDR區，H2在9-12個胺基酸之間；重鏈的第三CDR區，H3在2-25個胺基酸之間。在其它的具體實施方案中，含結合位點的CDR區長度為5-10，5-15，5-20，11-15，11-20，11-25或16-20個胺基酸。在其它實施方案中，含結合位點的CDR區長度至少為5，10，15或20胺基酸或者不多於10，15，20，25或30個胺基酸。
構建好含修飾CDR區的抗體後，可進一步的修改，篩選以檢出高親和力或免疫特異性的抗體。高親和力或免疫特異性結合靶抗原的抗體，可以通過本領域中任何已知的方法獲得並篩選出來。比如，先合成修飾抗體的核酸序列，然後隨機突變即化學或定點突變，或者在編碼修飾抗體的核酸序列中具體位點突變，然後從突變抗體中篩選高親和力結合具體抗原的抗體。檢測方法可以是測定單個的表達抗體分子，或者是篩選突變文庫，如噬菌體顯示文庫。(參見Ladner提供的美國專利號5,223,409；和5,403,484和5,571,698；McCafferty提供的PCT出版物WO92/01047，或其它本領域中任何已知的顯示技術)。
在具體的實施方案中，本發明提供了修飾免疫球蛋白分子的功能活性片段，衍生物或類似物。功能活性片段，衍生物或類似物可誘導抗-抗-獨特型抗體(即三級抗體或Ab3)，這種抗體識別功能活性片段，衍生物或類似物來源抗體所識別的抗原(如5.5中所述方法)。特別是，在優選實施方案中，免疫球蛋白分子的獨特型抗原性，可通過刪除框架區和CDR區中N端至免疫特異性識別抗原的特殊區的序列來增強。為確定與抗原結合的CDR區，先合成含CDR區序列的抗體，然後利用本領域中任何已知的檢測與抗原的結合性方法就可以確定。相應地，在優選實施方案中，本發明中免疫球蛋白分子中可變區中形成一個二硫鍵的半胱氨酸被不含巰基的一個胺基酸殘基替代，而且CDR區中從N末端至識別具體抗原的CDR之間的序列被刪除。
在本發明其它實施方案中，包括本發明的修飾抗體的片段，如用胃蛋白酶消化抗體分子獲得包含可變區，輕鏈的恆定區及重鏈的CH1區的F(ab』)2，和還原F(ab』)2的二硫鍵進一步獲得Fab片段，但並不限於所列舉的例子。在本發明中還提供本發明修飾抗體的輕重鏈二聚體，或者是諸如Fvs和單鏈抗體(SCAs)的最小片段(如U.S.PatentNo.4，946，778；Bird，1988，科學242423-42；Huston et al.，1988，美國國家科學院院報USA855879-5883；Wards et al.，自然334544-54)或者其它具有修飾抗體的免疫特異性的其它分子。
通過剪切小鼠抗體中特異識別適當抗原的基因，然後與人抗體分子中適當的生物活性片段基因拼接，發展成為生產嵌合抗體(Morrison et al.，1984美國國家科學院院報，81851-855；Neuberger et al.，自然312604-608；Takeda et al.，自然314452-454)的技術。嵌合抗體是一個雜合分子，其不同片段來源於不同的動物種系，如可變區源自鼠單抗，而恆定區源自人的免疫球蛋白，如人源化抗體。
在優選實施方案中，本發明的修飾免疫球蛋白是人源化抗體，更優選的抗體是可變區中框架區也是人抗體的，CDR區不是人抗體的，優選的是小鼠抗體(見國際專利申請號PCT/GB8500392，Neubergeret al和Celltech Limited提供)。
CDR區移植是另一種人源化抗體的方法。涉及鼠抗體的重新塑造，目的是將其全部的抗原特異性性和結合親和力轉至人抗體框架區(Winter et al.，美國專利號5,225,539.)。已經成功構建了針對不同抗原的CDR區移植抗體，如Queen1989，提供的抗IL-2受體(美國國家科學院院報，8610029)，Riechmann提供的抗細胞表面受體-CAMPATH(1988，自然，332323)，Cole抗B肝病毒抗原抗體及病毒性抗原(美國國家科學院院報，882869)，Tempest氣管合胞體病毒的抗體(1991，生物技術9267)。CDR區移植抗體的製備方法是，移植鼠單克隆抗體的CDR區至人抗體。由於框架區殘基是維持CDR區構象所必需的，並且有證據表明某些框架區部分參與了抗原結合位點，所以移植後，多數抗體能從框架區胺基酸變化到親和力維持中獲益。然而，為了確保框架區不至於引進新抗原位點，需通過計算機模擬，並比較構建序列與穩定的種系序列。
在其它實施方案中，本發明提供修飾免疫球蛋白是融合蛋白(或功能活性片段)，比如通過共價健方式(如肽鍵)，將其融合至另一個非修飾免疫球蛋白(或其中部分，最好是至少10，20或25個胺基酸的蛋白片段)的N末端或C末端。優選共價連接在其它蛋白的恆定區N末端的修飾免疫球蛋白或其片段。在優選實施方案中，本發明提供的融合修飾免疫球蛋白，是共價連接在至IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，γ-幹擾素，MHC衍生肽，G-CSF，TNF，打孔素，NK細胞抗原或細胞內化受體上的修飾免疫球蛋白。
本發明的修飾免疫球蛋白包括修飾的類似物和衍生物，即共價連接至任何類型、任意長度的分子，這些分子不妨礙修飾免疫球蛋白誘導抗獨特型反應(如下文5.5中所述方法鑑定)。比如，修飾免疫球蛋白的衍生物，類似物需要進一步的修飾，包括諸如糖基化，醯基化，聚乙二醇化，磷酸化，醯胺化或已知的保護或封閉基團的衍生化，蛋白水解性切割，與細胞配基或其它蛋白的連接等，但並不限於這些修飾。通過已知的技術方法，可實現大部分的化學修飾，包括但不限於特異化學切割，醯基化，甲基化，衣黴素的代謝合成等。另外，類似物或衍生物可包含一個或多個非典型胺基酸，如本部分所列出的胺基酸。
修飾免疫球蛋白，片段，類似物和衍生物的生成方法在下文5.4中詳述。
5.2治療應用本發明提供，在某一受試者中應用治療劑(這裡命名為治療劑)，誘導產生抗獨特型抗體、抗抗獨特型抗體的方法。這些治療劑包括本發明的修飾免疫球蛋白，功能活性片段，類似物和由此獲得的衍生物(如前面5.1中所述)，和編碼本發明修飾抗體，功能活性片段，類似物和由此獲得的衍生物的基因(如，前面5.1所述)。
總的說來，最好是使用與受試者一致的種源或種活性的產品。因此，優選實施方案，本發明方法使用的修飾抗體來源於人抗體。在其它實施方案中，本發明方法使用的修飾抗體來源於嵌合抗體或人源化抗體。
特別是，包含本發明修飾抗體的疫苗組合物，給受試者使用誘導抗獨特型抗體(即抗獨特型抗體或Ab2)，該抗獨特型抗體識別修飾抗體的獨特型，然後該抗體又誘導出特異識別Ab2獨特型的抗抗獨特型抗體(Ab3)，這樣Ab3就具有與修飾抗體一致或相似的識別和結合活性。
本發明提供了給受試者使用修飾抗體，誘導抗獨特型反應的方法，即產生Ab2和Ab3抗體。本發明還提供了給受試者使用修飾抗體後，誘導產生並分離Ab2，然後給第二受試者使用Ab2以產生Ab3抗體。
相應的，本發明提供了在受試者中誘導出抗獨特型反應的方法，方法是使用足量的第一免疫球蛋白(或功能活性片段，類似物或衍生物)誘導，其中所說的第一免疫球蛋白含一個可變區，而且該免疫球蛋白除可變區中一個或多個的胺基酸替代外，其餘的與第二免疫球蛋白分子一致，所說的第二免疫球蛋白分子能夠免疫特異性的結合抗原，所說的一個或多個胺基酸替代是用不含巰基的胺基酸替代第二免疫球蛋白分子中形成二硫鍵的相應位置上的一個或多個半胱氨酸。在另一個實施方案中，進一步提供了分離識別該第二免疫球蛋白分子獨特型的抗獨特型抗體的方法，然後給第二受試者使用。
在本發明隨後的部分中詳細論述的特殊實施方案中，修飾免疫球蛋白可以用於誘導抗傳染病病原或異常細胞，比如細菌，寄生蟲，病毒，腫瘤和癌症的抗獨特型反應，當然，應用方面不限於這幾種。使用本發明的修飾免疫球蛋白誘導出對具體抗原的抗抗獨特型反應，進而可以治療或預防其它的疾病或失調。
在其它實施方案中，修飾抗體可用於治療自身免疫性疾病，比如類風溼性關節炎，紅斑狼瘡，潰瘍性結腸炎，或牛皮癬，或者變態反應的治療，但應用方面不限於這幾種。本發明的方法與疫苗組合物，可用於誘導機體產生對修飾免疫球蛋白的體液和/或細胞介導的反應。在一具體實施方案中，本發明的方法與疫苗組合物，用於誘導機體體液免疫反應。在一具體實施方案中，本發明的方法與疫苗組合物，用於誘導機體產生細胞介導的免疫反應。在優選實施方案中，本發明的方法與疫苗組合物，用於誘導機體產生對修飾免疫球蛋白的體液和/或細胞介導的反應。
可以使用本發明的受試者，可以是哺乳動物或脊椎動物，包括但並不限於以下幾種動物，牛，馬，綿羊，豬，家禽(如雞)，山羊，貓，狗，倉鼠，小鼠，大鼠，猴，兔，黑猩猩和人。優選實施方案中，受試者是人。本發明的方法和組合物能夠用於預防疾病或失調，或者是治療具體的疾病或失調，其中針對具體免疫球蛋白分子的抗獨特型反應是治療或預防疾病或失調中有效的反應。
5.2.1癌症的預防與治療癌症，包括但並不限於螯生物腫瘤，轉移瘤或其它以細胞生長失控為特徵的疾病或失調，都可以使用本發明的修飾免疫球蛋白(功能活性片段，衍生物或類似物)來預防或治療，或者是使用編碼修飾免疫球蛋白分子(功能活性片段，衍生物或類似物)的核酸序列，其中修飾免疫球蛋白來源於免疫特異性識別要預防或治療的癌症細胞相關的一個或多個抗原分子。具體的治療劑是否能夠有效的預防或治療某具體類型的癌症，可用本領域中任何已知的方法來確定，比如，5.5中詳述的方法，但不限於這些方法。
通過本發明的方法修飾抗癌症抗原的抗體，可用於預防或治療癌症的癌症相關抗原舉例如下，但並不限於所舉例子KS1/4泛-癌抗原(PerezWalker，1990，免疫學雜誌.14232-37；Burn，1989，雜交瘤7(4)407-415)，卵巢癌抗原(CA125)(Yu et al.，1991，癌症研究。51(2)48-475)，前列腺酸磷酸(Tailor et al.，1990，核酸研究通訊18(1)4928)，前列腺特異抗原(Henttu和Vihko，1989，生物化學生物物理研究通訊10(2)903-910；Israeli et al.，1993，癌症研究53227-230)，黑色素瘤相關抗原p97(Estin et al.，1989，國家癌症研究院雜誌81(6)445-44)，黑色素瘤抗原p75(Vijayasardahl et al.，1990，實驗醫學雜誌171(4)1375-1380)，高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali et al.，1987，癌症5955-3；Mittelman et al.，1990，臨床研究雜誌862136-2144)，前列腺特異的膜抗原，癌胚抗原(CEA)(Foon et al.，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13294)，多態內皮細胞粘蛋白抗原，人乳脂肪球蛋白抗原，結腸癌相關抗原如CEA，TAG-72(Yokataet al.，1992，癌症研究523402-3408)，CO17-1A(Ragnhammar et al.，1993，國際癌症雜誌53751-758)，GICA19-9(Herlyn et al.，1982，臨床免疫雜誌2135)，CTA-1，LEA，伯特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19(Ghetie et al.，1994，血液831329-1 336)，人B淋巴瘤抗原-CD20(Reff et al.，1994，血液83435-445)，CD33(Sgouros etal.，1993，J.Nucl.Med.34422-430)，黑色素瘤特異抗原如神經節苷脂GD2(Saleh et al J.Immunol.，151，3390-3398).，，神經節苷脂GD3(Shitara et al.，Cancer Immunol.Immunother.36373-380)，神經節苷脂GM2(Livingston et al.，1994，臨床腫瘤學雜誌121036-1044).，神經節苷脂GM3(Hoon et al.，1993，癌症研究535244-5250)，腫瘤免疫特異性移植型細胞表面抗原(TSTA)，如病毒誘導的腫瘤抗原包括DNA腫瘤病毒T抗原，RNA腫瘤病毒的胞膜抗原，膀胱癌癌胚抗原(Hellstrom et a1.，1985癌症研究452210-2188)，分化抗原如肺腫瘤抗原L6，L20，(Hellstrom et al.，1985癌症研究463917-3923)，纖維瘤抗原，人白血病T細胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjec et al.，1988，免疫雜誌1411398-1403)，新糖蛋白，神經鞘脂類，乳腺癌抗原如EGFR(表皮生長因子受體)，HER2抗原(p185HER2)，多態表皮粘蛋白(PEM)(Hilkenset al.，1992，生物化學趨勢Sci.17359)，，人惡性腫瘤淋巴細胞抗原-APO-1(Bernhard et al.，1989，科學245301-304)，分化抗原如在胚胎紅細胞和初級內胚層中發現的I抗原，在胃腺癌中發現的I(Ma)，在乳腺表皮中發現的M18和M39，在髓樣細胞中發現的SSEA-1，在結直腸癌中發現的D156-22，VEP8，VEP9，Myl，VIM-D5，和，TRA-1-85(血型H)，C14，在肺腺癌中發現的F3，Y半抗原，胃癌中發現的AH6，胚胎型癌細胞中發現的Ley，TL5(血型A)，在A431細胞中發現的EGF受體，在胰腺癌中發現的E1系列(血型B)，胚胎型癌細胞和胃腺癌中發現的FC10.2，腺癌中發現的CO-514(血型LEa)，NS-10，在結腸腺癌中發現的C0-43(血型LEb)，G49，EGF受體，結腸癌發現的19.9，胃癌粘蛋白，在髓樣細胞中發現的T5A7，黑色素瘤中發現的R24，4.2，GD3，D1.1，OFA-1，GM2，OFA-2，GD2，，在胚胎型癌細胞中發現的M122258，在4-8胚胎細胞期發現的SSEA-3，SSEA-4。在另一方案中的抗原是源於皮膚T細胞淋巴瘤肽的T細胞受體。(參閱Edelson，1998，癌症雜誌462)在本發明的其它實施方案中，使用修飾免疫球蛋白治療受試者疾病，可選擇性地與其它的腫瘤治療方法如手術，放療、化療聯合使用。尤其是，本發明的治療劑可與其它一種或多種化療試劑聯合使用，化療試劑包括但並不限於氨甲喋呤，紫杉酚，巰基嘌呤，硫代嘌呤，羥基尿，阿糖胞苷，環磷醯胺，異環磷醯胺，亞硝基尿，順鉑，卡鉑，達卡巴嗪，鹽酸丙卡巴肼，鬼臼2叉式，喜樹鹼，博萊黴素，阿黴素，伊達比星，道諾紅菌素，放線菌素，普卡黴素，米託蒽醌，天冬醯胺酶，長春花鹼，長春新鹼，維諾利賓，紫杉酚，paclitaxel Docetaxel，絲裂黴素。
5.2.1.1惡性腫瘤可用本發明的治療劑預防和治療惡性腫瘤及相關疾病。表3列出了可治療和預防的腫瘤及相關疾病，但並不限於這些疾病。(對於相關疾病，參閱)Fishman等，1985，醫學，第二版J.B.Lippincotl Co.，Philadelphia)表3腫瘤及相關疾病白血病急性白血病急性淋巴細胞白血病急性髓細胞白血病原粒細胞前髓細胞髓單核細胞單核細胞紅白血病慢性白血病慢性髓細胞(顆粒)白血病慢性淋巴細胞白血病真性紅細胞增多淋巴瘤何杰金氏病非何杰金氏病多發性骨髓瘤瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症重鏈病實體瘤肉瘤與癌纖維肉瘤粘液肉瘤脂肪肉瘤軟骨肉瘤骨原性肉瘤脊索瘤血管肉瘤內皮肉瘤淋巴管肉瘤淋巴管內皮肉瘤滑膜瘤間皮瘤尤文氏瘤平滑肌肉瘤橫紋肌肉瘤結腸癌胰腺癌乳腺癌卵巢癌前列腺癌鱗狀細胞癌基底細胞癌腺癌汗腺癌皮脂腺癌乳頭狀癌乳頭狀腺癌囊腺癌髓狀癌支氣管癌腎細胞癌肝癌膽管癌絨毛膜癌精原細胞癌胚胎性癌維爾姆斯瘤宮頸癌子宮癌睪丸癌肺癌小細胞肺癌膀胱癌上皮內瘤神經膠質瘤星形細胞瘤神經成管細胞瘤顱咽管瘤室管膜瘤松果體瘤成血管細胞瘤聽覺神經瘤間膠質瘤腦膜瘤黑色素瘤成神經細胞瘤成視網膜細胞瘤在具體實施方案中，卵巢，膀胱，乳腺，結腸，肺，皮膚，胰腺，子宮器官或組織中的惡性腫瘤或增殖不良性病變(組織變形和發育不良)，或者增生，都可治療或預防。在其它具體實施方案中，肉瘤，黑色素瘤，或白血病可預防或治療。
5.2.1.2癌前期本發明的治療劑，可用於癌前期或阻斷其惡化或進入腫瘤或惡性腫瘤狀態，包括但不限於表3所述的疾病。在已知或懷疑癌變時，可進行預防性或治療性的用藥，尤其是非腫瘤性的細胞如增生，轉化或者大多數的發育不良時(關於非正常生長綜述，參見Robbins和Angell，197，基礎病理學第2版 Ed.，W.B.SaundersCo.，Philadelphia，pp.8-79)的增殖。增生是一種處於控制下的細胞，在組織和器官中數量上的增加，而沒有明顯的結構或功能的改變。其中一個例外的例子，是子宮內膜增生經常演變為子宮內膜瘤。轉化是處於控制下的細胞增殖，其中一種成熟或完全分化的細胞替代了另一種成熟的細胞。轉化常發生在內皮或連接組織。非典型的轉化涉及某種程度上的病理性上皮轉化。發育不良通常是癌變的前奏，多在上皮組織中發現；多數的非腫瘤細胞病變性增生，涉及個體細胞一致性和細胞結構定位性的喪失。發育不良的細胞通常細胞增大，核染色較深，細胞形態多樣化。發育不良特徵性的發生在有慢性騷癢和炎症的部位，常見於子宮頸，氣管，口腔和膽囊。
另外，在體內、外，病人血液標本中出現以增生，轉化或發育不良為特徵的非正常細胞增生，出現以細胞表形轉化為特徵的異常細胞增殖或惡性化表型，表明需要使用疫苗組合物進行預防或治療。上面所述細胞表型轉化特徵，包括形態學變化，基質結合鬆散，接觸抑制喪失，錨定依賴性缺失，蛋白酶釋放，糖運輸增加，血清需求降低，癌胚抗原表達，250,000道爾頓的細胞表面蛋白丟失等。(參見同上與轉化或腫瘤表型相關的特徵)。
在具體實施方案中，黏膜白斑病，良性表型的增生或表皮發育不良，或鮑恩病，原位瘤，都表明是需要進行預防性用藥的腫瘤前期預兆。
在另外的實施方案中，纖維細胞疾病(囊性增生，乳腺發育不良)，尤其是，腺病(良性表皮增生)，都需要進行預防性用藥。
在另外的實施方案中，有下列預示腫瘤惡性化的特徵因子之一的，用本發明的有效劑量的治療劑可以進行治療。包括與腫瘤惡性化相關的染色體轉位(如慢性白血病的費城染色體，淋巴節淋巴瘤t(1418))，家族性息肉瘤或加德娜綜合症(結腸癌的可能前兆)，良性單克隆γ球蛋白病(多發性骨髓瘤的可能前兆)，那些可遺傳(符合孟德爾遺傳規律)的腫瘤或腫瘤早期疾病患者的直系親屬(如家族性結腸息肉瘤、加德納綜合症、遺傳性外生骨疣、多分泌腺腺瘤病伴隨澱粉產物的骨髓樣癌、嗜鉻細胞瘤、普氏-傑格氏綜合症、馮雷克林霍曾氏病的神經纖維瘤病，成視網膜細胞瘤，頸動脈體瘤，皮膚黑色素癌，眼內黑色素癌，著色性幹皮病，運動失調性毛細血管擴張症、切迪阿克-東綜合症、白化病、範尼可再生障礙性貧血和勃路姆綜合症；參見Robbins and Angell，197，基礎病理學，第2版，W.B.Saundrers Co.，Philadelphia，pp.112-113)在其它具體的實施方案中，本發明的治療劑給病人使用，可預防卵巢，乳腺，結腸，肺，胰腺，皮膚，前列腺，胃腸道，B淋巴細胞，T淋巴細胞或子宮癌黑色素瘤或肉瘤。
5.2.2傳染性疾病治療本發明還提供使用本發明的治療劑預防或治療傳染性疾病，尤其是使用源於可免疫特異性結合引起傳染性疾病的病原抗原或結合這些病原的細胞受體的修飾免疫球蛋白(或功能活性片段，衍生物或類似物，或編碼免疫球蛋白或功能活性片段，衍生物或類似物的核酸)。正如下面將詳細討論的傳染病病原，包括病毒，細菌，真菌，瘧原蟲和寄生蟲，但並不限於這幾種。
在具體實施方案中，使用本發明的免疫球蛋白(或功能活性片段，衍生物或類似物，或編碼這些蛋白的核酸)，該免疫球蛋白源於可特異性識別下列傳染病病原抗原，包括流感病毒血凝素(GenBank登記號J02132；Air，1981，美國國家科學院院報78739-743；Newton etal.，1983，病毒學128495-501)，人氣管合胞體病毒G糖蛋白(GenBank登錄號Z33429；Garcia et al.，1994，J Virol.；Collinset al.，1984，美國國家科學院院報81783；)，登革病毒核心蛋白、基質蛋白和其它蛋白(GenBank登錄號M19197；Hahn et al.，1988病毒學1217-180)，麻疹病毒血凝素(GenBank登錄號M81899；Rotaet al.，1992病毒學188135-142)，II型單純皰疹病毒糖蛋白GB(GenBank登錄號M14923；Bzik et al.，198病毒學155322-333)，I型脊髓灰質炎病毒VP1(Emini et al.，1983，自然30499)，I型人類免疫缺陷型病毒包膜糖蛋白，如GP120(Putney et al.，198，科學2341392-1395)，B肝表面抗原(Itoh et al.，198，自然30819；Neurath et al.，198，疫苗434)，白喉毒素(Audibert etal.，1981，自然289543)，鏈雙球菌24M表位(Beachey，1985，實驗實驗醫學生物學進展Biol.185147)，淋球菌菌毛蛋白(Rothbard andSchoolnik，1985，實驗醫學生物進展Biol.185247)，假狂犬病病毒g50(gpD)，假狂犬病病毒糖蛋白II(gpB)，假狂犬病病毒糖蛋白gIII(gpC)，假狂犬病病毒糖蛋白H，假狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質蛋白，豬輪狀病毒糖蛋白38，豬微小病毒衣殼蛋白，豬痢瘧小蛇菌保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新城病病毒血凝素-神經氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經氨酸酶，口蹄疫病毒，豬霍亂病毒，豬流感病毒，非洲豬熱病病毒，豬肺炎衣原體，感染性牛鼻氣管病毒(如感染性牛鼻氣管病毒糖蛋白E或G)，感染性咽氣管炎病毒(如感染性咽氣管炎病毒糖蛋白G或I)，LA CROSSE病毒糖蛋白(Gonzales-Scarano et al.，1982，病毒學12042)，新生小牛腹瀉病毒(Matsuno and Inouye，1983，感染和免疫39155)，委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Mathews and Roehrig，1982，免疫學雜誌129273)，punta toro病毒(Darlrymple et al.，1981，免鏈病者的複製，Bishop and Compans(eds.))，鼠白血病病毒(Steeves，et al.，1974，病毒學雜誌14187)，小鼠乳腺癌病毒(Massey and Schochetman，1981病毒學11520)，，B肝病毒核心蛋白和/或表面抗原(英國專利申請號No.GB 2034323A，發表於1980，6，4；Ganem and Varmus，1987，生物化學年評.551-93；Tiollais et al.，1985，自然317489-495)，馬流感病毒的抗原或馬皰疹病毒(馬流感病毒A型/阿拉斯加91神經氨酸酶，馬流感病毒A型/邁阿密63神經氨酸，馬流感病毒A型/肯塔基81神經氨酸，I型馬皰疹病毒糖蛋白B，I型馬皰疹病毒糖蛋白D)，牛氣管合胞體病毒或牛副流感病毒抗原(牛氣管合胞體病毒結合蛋白(BRSV G)，牛氣管合胞體病毒核衣殼蛋白(BRSV N)牛氣管合胞體病毒III型融合蛋白，牛副流感病毒III型血凝素-神經氨酸酶)，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48或53。在其它的具體實施方案中，使用本發明的修飾免疫球蛋白(或功能活性片段，衍生物或類似物，或編碼這些蛋白的核酸)可治療或預防傳染性疾病，該免疫球蛋白識別抗傳染病病原的細胞受體，比如，但並不限於表4所列舉的病原及相應的受體。
表4
使用本發明的方法可以治療或預防的病毒性疾病，包括A肝病毒，B肝病毒，C肝病毒，流感病毒，水痘病毒，腺病毒，I型單純皰疹病毒(HSV-I)，II型單純皰疹病毒(HSV-II)，牛痘病毒，鼻病毒，人腸道細胞病變弧病毒，輪狀病毒，氣管合胞體病毒、乳頭瘤病毒，乳多孔病毒，巨胞病毒，，刺狀病毒，蟲媒病毒，漢塔病毒，柯薩奇病毒，流行腮腺炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，脊髓灰質炎病毒，I型人類免疫缺陷型病毒(HIV-I)，II型人類免疫缺陷型病毒(HIV-II)，任一種細小RNA病毒，腸道病毒，萼狀病毒，諾渦病毒，外衣病毒(如登革病毒)，阿爾發病毒，黃熱病病毒，冠狀病毒，狂犬病病毒，馬爾堡病毒，埃波拉病毒，副流感病毒，正粘病毒，本雅病毒，沙粒病毒，呼腸弧病毒，輪狀病毒，環狀病毒，人類I型T細胞白血病病毒，人類II型T細胞白血病病毒，類人猿免疫缺陷病毒，慢病毒，多瘤病毒，細小病毒，EB病毒，人類皰疹病毒-，I型獼猴皰疹病毒(B病毒)，痘病毒，腦炎病毒但並不限於這些疾病。
使用本發明的方法可以治療或預防的細菌性疾病，包括革蘭氏陰性和陽性細菌，分支桿菌立克次體，支原體，萘瑟氏菌(如萘瑟氏淋球菌，萘瑟氏雙球菌)，軍團桿菌，霍亂弧菌，鏈球菌屬如肺炎鏈球菌，白喉棒狀桿菌，破傷風梭狀芽胞桿菌，百日咳桿菌，嗜血桿菌(如流感)，衣原體，埃希氏大腸桿菌，志賀氏菌，或梅毒或萊姆病病原體，但並不限於這些疾病。
使用本發明的方法可以治療或預防的寄生蟲疾病，包括瘧原蟲屬，艾美球蟲屬，利什曼蟲屬，可可地亞蟲屬(Kokzidioa)，錐蟲屬和真菌如念珠菌，但並不限於這些疾病。
在本發明的具體實施方案中，使用的治療劑可與適當的抗生素，抗真菌，抗真菌或在治療或預防傳染性疾病有用的其它藥物聯合使用。
5.3基因治療預防或治療疾病的基因治療，是通過給得病並表達相關的抗原的受試者使用編碼修飾性免疫球蛋白分子的核酸，所說的修飾免疫球蛋白來源於識別所說抗原的抗體。比如，疾病或失調可能是表達特異腫瘤或癌抗原的腫瘤，或者是表達特異的傳染病病原抗原的傳染性疾病，或者是結合該抗原的細胞表面受體。在本發明的實施方案中，治療劑的核酸編碼胞內(無導肽)或胞外(含導肽)的修飾免疫球蛋白分子。
關於基因治療方法的全面綜述，參看Goldspiel，1993，臨床藥學12488-505；Wu Wu，1991，生物治療387-95；Tolstoshev，1993，藥理學毒理學年評32573-596；Mulligan，1993，科學260926-932；morgan Anderson，1993，生物化學年評62191-127)。本領域中所用的眾所周知的重組DNA技術，參看Ausbel，(eds)1993分子生物學現代技術，John Wileysons，NY；Kriegler，1990，基團轉移和表達，實驗室手冊，Stockton Press，NY；Dracopoli etal.，(eds)，1994，人類遺傳學現代技術John Wileysons，NY第12、13章)。
一方面，作為治療劑的核酸，包括表達修飾免疫球蛋白分子的表達載體。
將核酸介入到病人的方法，可以是直接的，在這種情形下，患者直接暴露於核酸或攜帶核酸的載體中；或者是傳輸複合體的，或稱間接的方法，在這種情形下，首先要在體外用核酸轉化細胞，然後將該細胞移植給患者。這兩種治療方法，分別稱為體內基因治療和體基因治療。
具體實施方案中，核酸是直接在體內使用並在體內產生抗體。本領域中使用的方法多種多樣，如構建合適的核酸表達載體，然後導入細胞中，如通過缺陷型或減毒的逆轉錄病毒或其它病毒(參見美國專利號4,980,286)，或直接注射裸露的DNA，或者使用微粒體(如基因槍；Biolistic，Dupont)或者使用脂質體或細胞表面受體或轉染試劑包裹，生物聚合體膠囊(多聚-β-1-4-N-醯基葡糖胺多糖；參見美國專利號5,635,493)脂質體囊，微粒體，微囊，或者將其連接到能進入核內的肽段上，或者將其連接到能進入核內的配基上，或者將其連接到受體介導的細胞攝粒作用的配基上等(如Wu andWu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)。在另一實施方案中，構建一個核酸-配基複合物，其中配基含有一段融合的病毒肽基因，該基因表達產物可裂解內質網而避開溶酶體的降解。在其它實施方案中，核酸可被特異的受體定向到免疫特異性細胞吸收表達(PCT出版物WO92/06180，提交日期16，1992，4月16日(wu et al.)；WO92/22635，dated，提交日期1992年12月23日(Wilson，et al.)；WO92/20316，提交日期1992年11月26日(Findeis et al.)；WO93/14188，提交日期1993年6月22日(Young)。備選實施方案中，核酸序列可被引入細胞內，通過同源重組整合入宿主細胞DNA中表達(Koller and Smithies，1989，美國國家科學院院報868932-8935；Zijlstra et al.，1989，自然342435-438)。
或者，還可使用單鏈抗體，如結合胞內表位的中和抗體。使用方法是，比如，利用Marasco等的方法(Marasco et al.，1993，美國國家科學院院報907889-7893)構建編碼單鏈抗體分子的核酸，然後在靶細胞中表達。腺病毒載體是另一個應用於基因治療的載體。腺病毒是一種非常有吸引力的載體，能夠將病毒導入氣管上皮，並在那裡引起輕度疾病。腺病毒載體的其它靶標是肝細胞，中樞神經系統，內皮細胞和肌肉細胞。腺病毒載體的優點是可以感染非分裂的細胞。Kozarsky與Wilson等發表了一篇關於腺病毒載體進行基因治療的綜述現代遺傳和發育評論3499-503。Bout等證明了用腺病毒載體可將基因轉入恆河猴氣管上皮細胞1994，人類基因治療53-10。其它使用腺病毒載體進行基因治療的例子有Rosenfeld et al.，1991，科學252431-434；Rosenfeld et al.，1992，細胞68143-155；Mastrangeli et al.，1993，臨床研究雜誌91225-234.提及使用腺病毒載體進行基因治療的例子(Walsh et al.，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300)使用治療劑核酸的預期方式及劑量，主要依賴於疾病類型及其效果的嚴謹性，病人的狀態等，可由和本領域技術人員確定。
5.3疫苗製劑和施用本發明提供了包括本發明的治療劑的疫苗配方，其中疫苗製劑適用於可誘導針對具體抗原的保護性免疫反應(體液和/或細胞反應)，如疾病的治療和預防。
製作疫苗適用的製劑，包括可注射的液體試劑或懸液；使用前可溶解成溶液或懸液的固體製劑。製劑還可以是乳化形式的或者裝入脂質體膠囊的多肽。活性免疫原性的組份，通常可與藥學上可接受的並與活性組份相容的成型劑混合使用。適用的成型劑是諸如水，生理鹽水，緩衝液，葡萄糖，甘油，乙醇，無菌等滲的液體緩衝液或種類溶液和聯合溶液。另外，願意的話，疫苗製劑還包括少量的附加物，如保溼劑或乳化劑，pH緩衝試劑和/或能夠增強疫苗效應的佐劑。
有效的佐劑包括氫氧化鋁，N-乙醯-胞壁醯-L蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)，N-乙醯-胞壁醯-L丙氨醯-D-異穀氨醯胺，N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯-L-丙氨醯-2(1』-2』二棕櫚醯-sn-甘油基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺，但並不限於如下的例子。
佐劑的效果測定方法是，測定使用具體佐劑後修飾免疫球蛋白誘導的抗獨特型抗體的反應。
組合物可以是液體溶液，懸液，乳化劑，片劑，丸劑，膠囊，緩釋型或粉劑。口服製劑可以包括諸如藥學級的甘露醇，乳糖，硬脂酸鎂，蔗糖，纖維素，碳酸鎂等載體。
總之，單位劑量的組份可以是單獨的，也可以是混合的，如裝在密封安瓶中的冷凍乾燥粉劑，或無水濃縮的粉末，並標明活性成份含量。使用注射劑型的組合物時，提供裝在稀釋安瓶中的溶液，以備用前溶解。
在具體的實施方案中，第一個容器中裝冷凍的修飾免疫球蛋白製劑；第二個容器裝稀釋液，其組成為50％甘油，0.25％的酚和抗菌劑(如0.005％亮綠)。
本發明還提供了藥盒或試劑盒，該藥盒包括一個或多個容器，裝有一種或多種本發明的疫苗製劑組份。與藥盒相關的是一個政府機構規定的生產、使用或銷售藥品或生物製品的條款，該條款反應了批准人體用藥的生產、使用或銷售機構。
願意的話，組合物可以是單獨包裝或分配裝置包裝，裝有一次或多次使用劑量活性成份。包裝可能是包含金屬或塑料薄膜的包裝，諸如發泡包裝。各包裝或分配裝置包裝，應有一份使用說明。本發明製劑與醫學上接受的載體配製成混合物，放置在合適的容器中，並標明治療的使用條件。
使用本發明疫苗的受試者，優選哺乳動物，最好是人，也可是除人以外的牛，馬，羊，豬，家禽(如雞)，山羊，貓，狗，倉鼠，鼠和大鼠，但並不限於這些動物。
本發明的疫苗製劑使用方法有多種，包括口服、腦內、真皮層、肌肉、腹膜內以及靜脈用藥皮下、鼻內、劃痕(如用分叉的針頭劃傷皮膚表層)或其它的標準免疫途徑，但並不限於這些方法。在具體實施方案中使劃痕接種。
使用製劑中，修飾免疫球蛋白的精確劑量取決於接種的途徑及每個病人的情況，應根據醫生的診斷及臨床標準技術對病人情況的診斷來用藥。有效的免疫劑量，足以誘導宿主對使用的修飾免疫球蛋白疫苗製劑的免疫反應(即抗獨特型反應)。有效的免疫劑量也可以從模型動物試驗系統的劑量依賴性曲線中推斷。
5.4生產修飾免疫球蛋白的方法本發明中的修飾免疫球蛋白的生產方法，包括本領域中任何已知的免疫球蛋白合成法，尤其是用化學合成法或重組蛋白表達法，優選重組蛋白表達法。
重組表達本發明的修飾免疫球蛋白或片段衍生物或類似物，需要構建編碼修飾免疫球蛋白的核酸。如果編碼修飾免疫球蛋白的核苷酸序列已知，可以通過化學合成的方法合成該序列(如Kutmeier etal.，1994，生物技術17242所述)，簡而言之，其中涉及編碼修飾免疫球蛋白寡核苷酸的合成，而且寡核苷酸之間有部分序列重疊，因此這些寡核苷酸經過退火、連接和PCR擴增，即可獲得編碼免疫球蛋白的基因，如下文第6部分的例子。
另一種獲得編碼免疫球蛋白的核酸序列的方法，是先獲得修飾免疫球蛋白來源的免疫球蛋白分子的核酸序列。如果沒有編碼免疫球蛋白的核酸基因序列，但基因序列已知，那麼通過合成基因的3』和5』引物，用PCR方法，從適當的來源(如抗體cDNA文庫或表達免疫球蛋白的細胞或組織的cDNA文庫)獲得該基因。
如果特異識別特定抗原的免疫球蛋白無法獲得(或無法得到編碼該免疫球蛋白的cDNA文庫)，那麼，首先藉助本領域中任何已知的手段獲得該特異抗原的免疫球蛋白，比如免疫兔子一類的動物獲得多克隆抗體，較優選的是獲得單抗如Kohler和Milstein(1975，自然256495-497)或Kozbon et al(1983，今日免疫學472)或Cole etal(1985單克隆抗體和癌症治療，Alan R.Liss，Inc，pp77-96)所述。另一種方法是篩選Fab表達文庫(Huse et al.，1989，科學2461275-1281)或抗體文庫(Clackson et al.，1991，自然352624；Hane et al.，1997美國國家科學院院報944937)，獲得至少是編碼免疫球蛋白的Fab片段的部分基因。
獲得至少是編碼免疫球蛋白可變區的基因後，將其插入克隆載體和含有編碼免疫球蛋白恆定區基因的載體中(如PCT PublicationWO86/05807；PCT Publication WO89/01036；US PatentNo5，122，1464；Bebbington，1991，酶學方法2136-145；PCTPublication WO86/05807)。也可以獲得包括完整輕鏈基因或重鏈基因的表達載體，共表達後形成出完整抗體分子。然後，用核酸替代或刪除技術修飾編碼免疫球蛋白的核酸序列，必需的替代(或刪除)是用不含巰基的胺基酸替代參與可變區中鏈內二硫鍵形成的半胱氨酸，還可以有其它的胺基酸或替代，刪除或插入。這些修飾，可藉助本領域中任何已知的方法引入突變或核酸序列刪除，比如化學誘變、體外定點突變(Hutchinson et al.，1978，J.Biol.Chem..1536551)、PCR方法等實現，但並不限於這些方法。
此外，拼接小鼠抗體的免疫特異性片段與具有適當的生物活性的人抗體基因技術，也可用於獲得嵌合抗體(Morrison et al.，1984，美國國家科學院院報81851-855；Neuberg er et al.，1984，自然312604-608；Takeda et al.，1985，自然314452-454)。正如上所述，嵌合抗體是一種包括不同物種的不同片段的分子，如源於鼠單抗的可變區與源於人免疫球蛋白恆定區，如人源化抗體。
另一種技術是單鏈抗體的製備方法(美國專利4,694,778；Bird，1988，科學242423-42；Huston et al.，1988，Proc.美國國家科學院院報855879-5883；Ward et al.，1989，自然334544-54)。單鏈抗體的製備方法是，經胺基酸鍵連接Fv段的輕、重鏈而構成的單鏈多肽。還應用了大腸桿菌表達有功能的Fv片段(Skerra et al.，1988，科學2421038-1041)。
識別特定抗原表位的抗體片段，可通過已知的技術手段來獲得。如用胃蛋白酶消化獲得抗體分子的F(ab』)2片段，還原F(ab)2片段的二硫鍵獲得Fab片段，當然不止這些方法。
獲得編碼修飾免疫球蛋白分子的核酸序列後，應用本領域重組DNA技術可獲得表達免疫球蛋白的載體。然後重組表達與分離修飾後的免疫球蛋白，方法是本領域中已知的任何方法，比如第6部分中所述方法(也可參見Bebbington，1991，酶學方法2136-145)。簡而言之，就是將編碼修飾免疫球蛋白的表達載體瞬時性或非瞬時性轉染COS細胞或者其它合適的培養細胞中，然後培養適當的時間來表達免疫球蛋白，蛋白分泌性的表達在培養上清中，然後收集培養上清。
本領域的技術人員熟知的技術，都可用於構建包含免疫球蛋白分子基因序列及適當的轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外DNA重組技術，合成技術和體內基因重組技術，參看，Sambrook等規範的技術(1990，分子克隆，實驗室手冊，第2版冷泉港實驗室，紐約)和Ausubel et al.，eds.，1988，分子生物學現代技術，John Wileysons，紐約)。
生產本發明的免疫球蛋白用的表達載體轉染宿主細胞技術和培養轉染成功的細胞技術是常規技術。
表達本發明重組抗體的宿主細胞，可以是大腸桿菌的細菌細胞優選的真核細胞，尤其是表達完整的重組免疫球蛋白分子。特別是，象CHO這樣的哺乳動物細胞與含有人巨胞病毒的極早期啟動子元件的載體連用，是表達免疫球蛋白有效的系統。Foecking et al.，198，基因45101；Cockett et al.，1990，生物技術82表達本發明的修飾免疫球蛋白的宿主-表達載體系統有多種。這些宿主-表達載體系統，體現在載體能夠表達目的蛋白，隨後純化，宿主細胞在轉化或轉染適當的核酸序列後，可原位表達本發明的修飾免疫球蛋白。這些宿主-表達載體系統包括能夠轉化重組噬菌體DNA，質粒DNA，粘粒DNA的大腸桿菌(如埃希氏大腸桿菌，枯草桿菌)，所用轉化的表達載體含有免疫球蛋白編碼序列；能夠轉化重組酵母表達載體的酵母(釀酒酵母屬、畢赤酵母屬)系統，所用轉化的表達載體含有免疫球蛋白編碼序列；能夠轉化重組病毒表達載體(杆病毒)的昆蟲細胞系統，所用轉化的表達載體含有免疫球蛋白編碼序列；能夠轉化重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒；菸草花葉病毒)或重組質粒表達載體(Ti質粒)的植物細胞系統所用轉化的表達載體含有免疫球蛋白編碼序列；哺乳動物細胞表達系統(COS，CHO，BHK，293，3T3細胞)，這些系統含有源於哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒的啟動子(如腺病毒晚期啟動子，牛痘病毒7.5K啟動子)。
在細菌系統中，根據表達的目的，優先選用一系列的載體來表達免疫球蛋白分子。比如要生產大量的這種蛋白，用於生產免疫球蛋白分子的藥物組合物，那麼優先選用表達融合蛋白水平高且易於純化的表達載體。這些載體包括大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther etal.，1983，EMBO J21791)，編碼免疫球蛋白的基因序列可克隆至LacZ編碼區來表達融合蛋白；pIN載體InouyeInyuoye，1985，核酸研究133101-3109；Van Heekechuster，1989，生物化學雜誌245503-5509)等。pGEX載體也可用於表達外源蛋白，表達產物是與穀胱甘肽S轉移酶融合的融合蛋白。總體來講，融合蛋白是可溶性的，細胞裂解後，用穀胱甘肽-葡聚糖凝膠珠吸附、結合，然後簡單用無穀胱甘肽洗脫即可純化。pGEX載體中還設計有包含凝血酶或Xa因子消化位點的載體，這樣就可獲得不含GST的目的蛋白。
在昆蟲表達載體中，用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)表達外源基因。該病毒在草地夜蛾細胞內生長，而編碼免疫球蛋白的基因序列可克隆至病毒的非必需區(如多角體蛋白基因)並置於AcNPV啟動子的控制之下(如多角體蛋白啟動子)。
哺乳動物表達系統中，使用的大多是基於病毒的表達系統。假如使用腺病毒載體為表達載體，那麼編碼免疫球蛋白的目的序列可連接至腺病毒的轉錄/翻譯控制元件下，如晚期啟動子和三聯前導序列下。通過體內或體外重組技術，可將這種融合基因插入到腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必需區(如E1和E3區)，將獲得有活性的重組病毒體並能夠在感染的宿主中表達免疫球蛋白(參見Loganhenk，1984，美國國家科學院院報81355-359)。為使插入的免疫球蛋白基因有效翻譯，需要插入確定的起始信號，該起始信號包括ATG起始密碼子及附近的核酸序列，而且起始密碼子讀框應與表達的目的序列讀框一致，以保證插入片段全長翻譯。這些外源性的翻譯調控信號和起始密碼子可以是各種來源的，包括天然和合成的。酶學方法表達效率的提高，可通過引入適當的轉錄增強子，轉錄終止子等(參看Bittner et al.，1987，Methods in Enzymology 15351-544)。
另外，宿主細胞株的選擇，應該是能夠調控目的基因片段的表達，或根據具體的要求修飾加工基因產物。此類蛋白修飾(如糖基化)與加工(如切割)對於蛋白的功能是很重要的。不同的宿主細胞有自身特徵性的獨特的蛋白和產物的翻譯後加工與修飾機制。選擇適當的細胞系或宿主系統，可確保表達的外源蛋白可被正確的修飾與加工處理。說到底，能夠正確的加工轉錄初始產物，對產物進行糖基化和磷酸化真核宿主細胞才是可選的。這類哺乳動物宿主細胞包括CHO，VERO，BHK，HeLa，COS，MDCK，293，3T3，W138，但並不僅僅有這幾種。
對於需要長期高效表達的重組蛋白，優選穩定表達。比如，穩定表達免疫球蛋白分子的細胞系可以是基因工程化的細胞系。與用含病毒複製子的表達載體相比，宿主細胞可用DNA轉化，所用DNA有適當的表達調控元件(如啟動子、增強子、序列和轉錄終止子以及PolyA加尾位點)和選擇性標記。引入外源性DNA後，基因工程細胞在營養豐富的培養基上培養1-2天，然後轉至選擇性培養基。重組質粒中的選擇性標記賦予細胞抗性，允許質粒穩定整合至宿主細胞染色體，生長形成集落，這些集落又可被克隆並擴成細胞系。優先使用這些方法建立表達免疫球蛋白的工程細胞。在篩選和評估那些與免疫球蛋白分子直接或間接作用的化合物時，這些細胞系特別有用。
多種篩選系統可供選擇，包括單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(Wiggler et al.1977，細胞11223)，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(SzybalskaSzybalski，192，美國國家科學院院報48202)和磷酸核糖轉移酶轉移酶可在相應tk-，hgprt-或aprt-細胞中使用。代謝物抗性是下列基因選擇性的基礎DHFR，賦予細胞抗氨甲喋呤抗性(Lowy et al.，1980，細胞22817)；GPT，賦予細胞抗黴酚酸抗性(Wiggler et al.，1980，，77357；O』Hare et al.，1981，美國國家科學院院報781527)；Neo，賦予細胞抗新黴素G-418抗性(Mulligan Berg，1981，美國國家科學院院報782072臨床藥理學12488-505；Wu and Wu，1991，生物治療387-95；Tolstoshev，1993，藥理學毒理學年評，32573-596；Mulligan，1993，科學260926-932；Morgan and Anderson，1993，生物化學年評62191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)155-215)。Ausubel等撰寫了本領域中常識性的重組DNA技術(1988，分子生物學現代技術，John wileysons，NY；Kriegler，1990，基因轉移和表達，實驗室手冊Stocktonpress，NY；Dracopoli et al.，(eds)，1994，人類遺傳學現代技術第12和13章，John WileySons，NY；Colberre-Garapin etal.，1981，生物化學雜誌1501)。
利用免疫特異性識別表達的融合蛋白抗體，可以簡單的純化融合蛋白。比如Janknecht等描述的一個系統，可以容易的純化在人細胞系表達的非變性融合蛋白(Janknecht etal.1991，美國國家科學院院報888972-897)。該系統是將目的基因亞克隆至重組痘苗載體，這樣在其開放閱讀框架的氨基端融合了六個組氨酸的標籤，該標籤是純化融合蛋白的基質結合域。收集轉染重組痘苗表達的細胞抽提物，過次氮基乙酸鎳-瓊脂糖凝膠柱，然後用含咪唑的緩衝液選擇性的洗脫，獲得含組氨酸標籤的蛋白。
免疫球蛋白分子的表達水平的提高，可通過載體擴增方法(見綜述Bebbington and Hentschel，在DNA克隆中，基於基因擴增的載體在哺乳動物細胞中表達克隆基因的用途cloning，Vol.3，(學術出版社，紐約，1987))。在宿主細胞培養基中存在一定量的抑制因子時，表達免疫球蛋白分子的載體系統中某一標誌基因的擴增將使標誌基因的拷貝數增加，而擴增的基因區域與免疫球蛋白基因相連，最終免疫球蛋白產量也就升高。(Crouse et al.，1983，分子細胞生物學.3257)宿主細胞可以用本發明的兩個表達載體共轉染，其中第一個載體是表達重鏈衍生多肽的載體，第二個是表達輕鏈衍生多肽的載體，兩個載體含有相同的選擇性標記物，能夠等量的表達輕重鏈多肽。備選方案是，同一載體編碼輕重鏈多肽，這種情況下輕鏈基因位於重鏈基因前，以避免游離毒性重鏈的過量的表達(Proudfoot，1986，自然32252；Kohler，1980，美國國家科學院院報772197)。編碼重鏈和輕鏈的基因序列應包括cDNA或基因組DNA。
一旦本發明的修飾免疫球蛋白獲得重組表達，就可以用本領域中任何已知的純化免疫球蛋白分子的方法進行純化，比如柱層析(如離子交換，親和層析，特別是用蛋白A純化，分子篩層析)，離心，溶解度差異或者其它任何的純化蛋白的標準技術。
5.5治療應用舉例用本發明的修飾抗體檢測治療和預防特殊疾病的效率，可有多種方法檢測或測試。
第一、包含修飾免疫球蛋白的疫苗的免疫潛能，可檢測疫苗免疫的試驗動物中抗獨特型反應來確定。產生的體液免疫反應的情況可代表總的免疫反應情況，其它的免疫組份，尤其是細胞免疫，在疾病的預防方面十分重要。試驗動物包括小鼠，兔，黑猩猩以及最終的人。本發明生產的疫苗，可用於試驗性感染疾病的黑猩猩。但是黑猩猩是保護性動物，所以針對本疫苗的抗體反應首先在一些小而廉價的動物體上作實驗，尋找最佳候選免疫球蛋白分子或最佳組合分子用於黑猩猩的效率研究。
測試試驗動物的免疫反應方法有多種途徑，如免疫血清對抗體的反應性可用已知的酶聯免疫吸附法(ELISA)，免疫印跡，放射性免疫沉澱等；或通過預防感染和/或緩解免疫宿主的疾病症狀。
動物測試例子之一是，用本發明的疫苗組合物免疫兔子，測試其誘導抗修飾免疫球蛋白獨特型反應的能力。比如用雄性、無病的(SPF)年輕成年紐西蘭大白兔。測試組每隻兔子接受足量的疫苗，對照組注射天然抗體，該抗體溶解於1mM的Tris-HCl pH9.0。每一或兩周採血，分析血清對修飾免疫球蛋白分子的抗獨特型反應以及抗抗獨特型抗體對修飾抗體識別的抗原的特異識別。比如用放射性免疫檢測法(Abbott Laboratories)。抗獨特型抗體，也可以用ELISA方法檢測。由於兔子的遠交品系所造成的反應波動，也換用小鼠來測試。
另外，本發明的修飾性抗體測試測試方法還可以是，首先給測試動物用藥，無論是動物還是人，然後分離作為抗獨特型反應一部分的抗抗獨特型抗體(即Ab3抗體)。然後測試其結合指定抗原的能力(如腫瘤抗原，感染性疾病病原抗原)，方法可以是本領域中任意已知的免疫檢測方法，如放射性免疫檢測，ELISA，夾心免疫檢測法凝膠擴散反應，免疫擴散反應，免疫印跡法，沉澱法，凝集檢測法，補體結合法，免疫螢光檢測，蛋白A檢測法，免疫電泳檢測法等等。
假如修飾抗體與腫瘤或癌抗原結合，那麼分離的Ab3治療腫瘤、癌或其它腫瘤疾病效率檢測方法是，培養來自患者的腫瘤或癌細胞，然後檢測Ab3抗體與細胞的結合，並比較結合與未結合抗體細胞的增殖或存活率來確定其效率。如果結合抗體細胞的增殖或存活率較低，就表明Ab3(由使用本發明的修飾抗體誘導)對該病人的腫瘤治療有效。本領域中增殖或存活率的多種檢測方法可用於評估存活和/或增殖；比如用3H胸腺嘧啶摻入法來測定細胞的增殖，用直授細胞計數，用已知的某種基因的轉錄活性的變化來檢測，如原癌基因(如fos，myc)或者細胞周期標誌基因；細胞死活可用苔盼蘭染色判定，或通過細胞形態學變化來確定細胞分化等。如果修飾抗體識別傳染病病原，那麼在體外用結合指定抗原的活性來評價分離的Ab3活性。
此外，本發明的修飾抗體還抗可在體內直接測定。為監測本發明治療藥物的療效，可以在治療前，治療中或治療後適當的間隔檢測修飾抗體結合的抗原量。抗原量的變化或無變化都可以檢測到，抗原量的變化或無變化與患者的療效有關。
特別是腫瘤治療劑，血清中抗原量與腫瘤的嚴重程度，如乳腺癌，和預後差直接相關。總之，抗原量的降低與有效的治療是相關的。
當修飾抗體是識別傳染病病原時，其效率也可以通過在治療前，治療中或治療後適當的間隔檢測傳染病病原量，病原量降低提示修飾抗體有效。
方法上，優選不同的時間點上確定抗原水平，然後與本底比較。本底是指正常、無病個體中存在的指標量；和/或治療前的水平，或緩解時的水平，或穩定期的水平。這些指標與疾病病程和治療結果相關。
用本領域中已知的方法可確定抗原量。如通過已知的免疫學診斷方法諸如免疫印跡、免疫沉澱確定抗原量。
體內針對修飾免疫球蛋白的免疫反應強度，可通過本領域中已知的任何方法確定，如皮膚延遲超敏反應，和體外T淋巴細胞毒活性檢測，但並不限於這幾種方法。
皮膚延遲超敏反應在評價機體總的免疫潛力和對抗原的細胞免疫方面具有重要意義。皮膚反應測試的技術，要求使用前抗原應避光保存於4℃，臨用前配製。使用25號或27號針頭確保用藥在真皮層而不是皮下，用藥後24-48小時，用尺子測量紅斑的最大直徑和持續時間。對指定抗原或抗原組的反應性的減退測試方法是使用高濃度抗原，或在模稜兩可的情況下用中等劑量重複測試法。
測試T淋巴細胞毒活性的方法是，分離自免疫受試者的T淋巴細胞，如用常規淋巴細胞分離液分離的淋巴細胞，直接培養在含10％胎牛血清的3毫升RPMI培養基中，用表達修飾抗體識別的抗原的細胞再刺激。某些試驗中要求含33％的淋巴細胞培養上清或在培養基中添加IL-2作為T細胞生長因子。測定免疫後毒性T淋巴細胞的初次反應時，分離的T細胞應與含或不含抗原的細胞一起培養。6天後，上清進行4小時的51Cr釋放檢測，以檢測毒性。免疫有效時，自發的51Cr釋放指標不小於20％。(Heike et al.，免疫療法雜誌1515-174)另一方面，修飾免疫球蛋白效率，可通過監測免疫受試者從疾病狀態回復或改善，或者修飾抗體識別的抗原情況測定。修飾抗體識別腫瘤或癌抗原時，腫瘤或癌症的病程可通過已知的診斷或監測腫瘤技術來確定。比如測定腫瘤患者血清中與具體腫瘤或癌症相關抗原的水平(或另一種與該腫瘤或癌症相關的抗原)或者注射特異識別該抗原的標記抗體來確定。另外，其它圖象技術如計算機斷層CT、超聲或別的圖象技術，也可用於腫瘤或癌症病程的監測，當然，不限於這些方法。活檢法同樣可以用於監測。但在人身上作這些試驗之前，須先在特定腫瘤或癌症動物模型上測試修飾免疫球蛋白的效率。
如果是治療傳染性疾病，修飾抗體的效率監測方法是，先給受試者用藥(人或者疾病的動物模型)，然後檢測機體中特定病原體的水平或該傳染性疾病的症狀。傳染病病原測試方法可以是本領域中任何已知的測定方法，如檢測病毒時使用病毒滴度，細菌量(如培養病人標本)等。也可以測定修飾免疫球蛋白識別的抗原的量或該傳染病的另一抗原。傳染病病原的下降或其症狀的緩解都表明修飾抗體是有效的。
6.實施例誘導抗結腸癌獨特型疫苗實施例敘述了用單抗Mab31.1構建的修飾抗體(分泌Mab31.1單抗的雜交瘤細胞來源於美國典型培養物保藏中心，編號HB12314)。Mab31.1識別人結腸癌表達的抗原。在Mab31.1基礎上，通過基因工程，將該抗體的輕重鏈可變區中的半胱氨酸用丙氨酸替代後，改造成本發明的修飾抗體。因此，獲得的修飾抗體輕重鏈可變區鏈內二硫鍵缺失。
6.1修飾抗體的構建構建修飾抗體的策略是，構建編碼輕、重鏈可變區的基因，其中對形成鏈內二硫鍵十分重要的特定半胱氨酸變為丙氨酸。在源於Mab31.1抗體的抗體中，用丙氨酸殘基替代半胱氨酸，位置是重鏈可變區的23和92位，輕鏈可變區的23和88位。為構建這些工程基因，裝配一組寡核苷酸(如下面所討論的)，然後插入到提供恆定區的合適載體中。
構建無鏈內二硫鍵的CDRs的可變區基因的策略如下。
首先，單鏈寡核苷酸退火形成粘性末端的雙鏈DNA片段(如圖10步驟1所示)。特別是，與目的序列相應的寡核苷酸序列是用GenoSysBiotech Inc公司的自動合成儀合成，其長度為80個核苷酸，其中有20個鹼基是相互重疊的。每段寡核苷酸都是特定的，如圖9A和9B所示。圖9A列出了一組十個寡核苷酸片段，用於構建稱為2CAVHCOL1的重鏈可變區基因。2CAVHCOL1與重鏈可變區基因相比無半胱氨酸。圖9B列出了一組十二個寡核苷酸片段，用於構建稱為2CAVLCOLl的輕鏈可變區基因。2CAVLCOL1與輕鏈可變區基因相比無半胱氨酸。為將寡核苷酸連接成目的基因，10個或12個寡核苷酸按照下面的方法連接，如圖10所示，其中圖10中的1-10號寡核苷酸在表5中有詳述。結合之前，每條寡核苷酸的5『端通過如下步驟磷酸化在T4多核苷酸聚合酶的催化下，25μl的寡核苷酸與30mM的ATP37℃反應一小時；70℃孵育5分鐘終止反應，然後用乙醇沉澱。磷酸化後，互補的寡核苷酸(寡核苷酸1＋10，寡核苷酸2＋9，寡核苷酸3＋8，寡核苷酸4＋7，寡核苷酸5＋6，)如圖10所示，在無菌的微量離心管中混合，65℃水浴5分鐘，室溫退火30分鐘。結果形成短的、帶粘性末端雙鏈DNA。
下一步，粘性雙鏈DNA片段連接成長的鏈(如圖10，第二步至第四步)，直至組裝成可變區工程基因。需要指出的是，粘性雙鏈DNA片段連接方法是在T4 DNA連接酶的作用下，在10mM的ATP存在下16℃水浴反應2小時；退火後的寡核苷酸1/10與寡核苷酸2/9混合，寡核苷酸3/8與寡核苷酸4/7混合，反應終產物標記為寡核苷酸1/10/2/9和3/8/4/7。然後寡核苷酸3/8/4/7與寡核苷酸5/6連接，形成寡核苷酸3/8/4/7/5/6；寡核苷酸1/10/2/9和3/8/4/7/5/6連接形成全長的可變區基因同樣，用12個寡核苷酸合成全長的重鏈可變區基因，反應順序如下1＋12＝1/12，2＋11＝2/11，3＋10＝3/10，4＋9＝4/9，5＋8＝5/8，6＋7＝6/7，1/12＋2/11＝1/12/2/11，3/10＋4/9＝3/10/4/9，5/8＋6/7＝5/8/6/7，1/12/2/11＋3/10/4/9＝1/12/2/11/3/10/4/9，1/12/2/11/3/10/4/9＋5/8/6/7＝全長可變區基因。用於構建基因的寡核苷酸在表5中全部列出。可變區基因修飾後的重鏈標記為2CAYHCOLl，可變區基因修飾後的輕鏈標記為2CAVLCOLl。
修飾的可變區基因純化方法是凝膠電泳。為去除多餘未連接的寡核苷酸和其它非完整的DNA片段，連接產物在1％的低熔點瓊脂糖凝膠中，恆壓110V電泳2小時。然後切出全長DNA的主帶，放入1.5ml微量離心管。用f3-瓊脂糖酶I40℃作用3小時，以使DNA從瓊脂糖中釋放出來。加0.3M NaOAc和異丙醇，-20℃放置1小時，12,000rpm離心15分鐘，沉澱純化的DNA並重懸於50μlTE緩衝液,pH8.0。最後，通過PCR方法擴增可變區基因。取100ng工程可變區基因與25mMdNTPs，200ng引物和5U高保真熱穩定酶pfu DNA聚合酶及緩衝液混合。PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分析。
純化的可變區DNA片段，插入pUC19細菌載體。pUC19載體，全長2686青黴素個鹼基對，是一高拷貝的大腸桿菌質粒載體，其中包括LACZ基因上的54個鹼基的多克隆位點和氨苄抗性基因。插入可變區基因前，製備線性化的載體方法如下用HinCII酶(50U)處理10μg的pUC19，37℃作用3小時。為防止載體自身環化，用25U的小腸鹼性磷酸酶(CIP)，37℃去磷酸化1小時。取0.5μg的去磷酸化線性載體與3μg磷酸化的可變區基因片段混合，加T4連接酶(1000U)，16℃反應12小時。
用插入工程可變區基因片段的重組質粒轉化細菌。具體方法是新鮮製備DH-5α感受態細菌50μl與1μg的含工程可變區基因的pVC19質粒混勻，轉移至電轉化儀的槽中(0.2cm間隙；Bio-Rad)。在電轉化儀(Bio-Rad Gene Pulset)中，2.5kV/200ohm/25μF條件下脈衝作用。處理後，每個槽中立即加入1mlSOC培養基，37℃培養1小時使細胞回復。取出轉化的細胞，按1∶100稀釋後取100μl塗至含氨苄青黴素的LB平板上(40μg/ml)，37℃培養過夜。只有含pUC19質粒的轉化細菌才能在平板上生長。
挑選單菌落，接種於3ml LB/Atp無菌培養基中，37℃搖床培養過夜。用純化柱(Parmacia Biotech)純化質粒，並溶於100μlTE緩衝液中，pH7.5。鑑定pUC19中基因插入，每個克隆取25μl，37℃限制產生核酸內切酶切1小時，然後用1％的瓊脂糖凝膠電泳分析。使用本方法後，重組質粒DNA中酶切位點(5』..GTCGAC..3』)喪失，對酶抗性，在膠中其遷移率與環化(CC)DNA接近的質粒。而未重組質粒可被酶切，其遷移率與線性雙鏈DNA片段(L)相近。
為了確保插入的基因序列是工程可變區基因，並剔除在構建過程中可能出現的未料到的突變，用M13/pUC反向引物(5』AACAGCTATGACCATG3』)和5』端含20個鹼基的引物(5』GAATTCATGGCTTGGGTGTG3』)測序，測序儀是ABI377DNA測序儀。證明所有克隆都含有正確的序列。
表5編碼源自Mab31.1抗體的含CDRs的修飾抗體的構建Oligo1 Oligo2 Oligo3 Oligo4 Oligo5 Olig6 Oligo7 Oligo8 Oligo9 Oligo102CAVHCOLl VHC1 VHC2 VHC3 VHC4 VHC5 VHC VHC7 VHC8 VHC9 VHC102CAVLCOL1 VLC1 VLC2 VLC3 VLC4 VLC5 VLC VLC7 VLC8 VLC9 VLC106.3基因工程可變區基因插入哺乳動物表達載體完整的抗體輕鏈有可變區和恆定區。完整的抗體重鏈包括一個可變區、一個恆定區和一個鉸鏈區。修飾過的可變區基因2CAVHCOL1或2CAVLCOL1插入含合適的恆定區基因載體中。無半胱氨酸的輕鏈可變區基因插入pMRR10.1載體，如圖6A，該載體含人κ型輕鏈的恆定區。可變區基因插入後，構成完整的輕鏈基因。同樣，無半胱氨酸的重鏈可變區基因插入pGammal載體，如圖6B。該載體含人IgG1的恆定區和鉸鏈區基因，重鏈可變區基因插入後構成完整的重鏈基因。
構建包含輕鏈與重鏈基因的哺乳動物表達載體方法是將完整的輕重鏈基因插入哺乳動物表達載體pNEPuDGV中，如圖6C所示(Bebbington，C.R.，1991，In METHODSA Companion To Methods InEnzymology，vol.2，pp136-145)。重組質粒編碼修飾抗體的輕鏈和重鏈。方法酶學方法的相應方法。
6.4合成修飾抗體基因在哺乳動物細胞中的表達為了檢測裝配的抗體基因表達，用哺乳動物載體轉染COS細胞。COS細胞(一種非洲綠猴腎細胞系，CV-1，由SV-40複製缺陷型病毒轉化而來)，因為該細胞能使含SV-40複製啟動子的環化質粒複製到非常高的拷貝數，可用於合成的抗體短期的瞬時表達。抗體表達載體轉染COS7細胞(源於美國典型培養物保藏中心)。轉染後，細胞培養於改良Eagle’s培養基中，轉染用鈣共沉澱方法(Sullivan etal，.FEBS Lett.285120-123)。轉染細胞培養72小時，收集上清。用ELISA方法檢測裝配的IgG。ELISA方法包括96孔酶聯板上包被的抗人IgG Fc抗體對樣品和標準品的捕獲。用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人κ型輕鏈抗體，檢測捕獲的裝配IgG，底物是四甲基聯苯胺(TMB)。反應顏色深淺正比於樣品中存在的抗體量。
6.5修飾抗體免疫特異結合人結腸癌細胞及該細胞表達的抗原修飾抗體的表達與純化如同6.4中所述，用LS-174TWiDR細胞(一種人結腸癌細胞系)，檢測修飾抗體與該細胞及表達抗原的結合力與特異性。
檢測Mab31.1抗體的結合力和特異性方法為免疫印跡法(見圖11)。從LS-174T細胞製備的膜樣品，用Bio-Blot儀器(Bio-Rad)將樣品加載至硝酸纖維素膜。點樣的膜用脫脂牛奶封閉非特異結合位點。然後用生物素化Mab31.1抗體孵育。0.003nM-20nM的未標記的抗體然後作用。未結合的抗體通過洗滌被洗脫，然後加鹼性磷酸酶標記的抗人IgG作用。最後，加入鹼性磷酸酶底物作用，結果膜上顯示黑紫色沉澱，表明標記的抗體結合在膜上。圖11是免疫印跡的結果，結果表明標記抗體結合至LS-74T細胞。同樣，未標記的抗體可與標記的抗體競爭，表明源於Mab31.1的修飾抗體可與腫瘤細胞抗原特異性結合。
6.6抗獨特型反應修飾抗體的結合效應檢測方法是競爭性結合試驗方法。LS-174T細胞是表達Mab31.1抗體識別的抗原的人結腸癌細胞。製備了包含Mab31.1抗體的一個CDRS序列的多肽。用這些多肽和修飾性抗體以及對照抗體免疫小鼠，獲得抗Mab31.1 CDRs區和抗體的抗血清，免疫後兩周和四周採血，然後用這些抗血清作競爭性結合試驗，結果見圖12A和12B。
檢測了抗血清和生物素化抗體與LS-174T細胞結合力。如圖12A和12B所示，抗CDR3和CDR4區的抗血清明顯的競爭對照抗體(來自Mab31.1)與LS-174T細胞的結合。此外，抗CDR1和CDR2區的抗血清也能夠明顯的競爭對照抗體與LS-174T細胞的結合。而來自免疫2CAVHCOL1和2CAVLCOL1的抗體(即可變區中用丙氨酸替代半胱氨酸的修飾抗體)的小鼠抗血清，同來自免疫Mab31.1抗體的抗血清，與生物素化抗體的競爭性更強。(見圖12B)。該結果提示使用可變區中丙氨酸替代半胱氨酸的修飾抗體能誘導出識別結腸癌抗原的抗獨特型抗體，而且比可變區含二硫鍵的抗體誘導出的抗獨特型抗體更強。
表6源於Mab31.1單抗的CDR序列的生物素化標記多肽序列COL311 L1生物素-N-Thr-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-AlaCOL311 L2生物素-N-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Arg-Tyr-ThrCOL311 L3生物素-N-Phe-Ala-Gln-Glngaspltyr-Ser-Ser-Pro-Leu-ThrCOL311 H1生物素-N-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-AshCOL311 H2生物素-N-Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-GlyCOL311 H3生物素-N-Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr實施例7含HMFG-1序列的合成修飾抗體的表達構建了免疫特異性結合HMFG-1抗體的抗獨特型抗體。HMFG-1是一種已知可結合多態表皮細胞粘蛋白(PEM)的抗體(Stewart etal.，1990，臨床腫瘤雜誌81941-50；Kosmas et al.，1994，癌症733000-3010)。PEM的抗原決定簇序列ProAspThrArgPro，用本發明的方法將其插入到抗體的可變區。該短序列是人多態表皮細胞粘蛋白中高免疫原性區域(Gendl er et al.，198，生物化學雜誌16312820-12823)。HMFG-1的27A-27E(SerLeuLeuTyrSer)殘基(表6)，用第6部分所述的寡核苷酸合成方法替換為ProAspThrArgPro，見圖10。用HMFG-1抗體的輕重鏈可變區已知基因序列，生產免疫特異性結合HMFG-1抗體的抗獨特型抗體。寡核苷酸加入順序如下1＋8＝1/8，2＋7＝2/7，3＋6＝3/6，4＋5＝4/5，1/8＋2/7＝1/8/2/7，3/6＋4/5＝3/6/4/5，1/8/2/7＋3/6/4/5＝1/8/2/7/3/6/4/5。表7列出了HMFG-1和不同的CDR區共有序列的比較。關於HMFG-1和相關單抗資料參見WO09/05142(帝國癌症研究技術有限公司)，人源化抗體資料參見WO92/04380(Unilever)。
聚合酶鏈反應(PCR)用於擴增裝配基因，見圖13。編碼HMFG-1抗體序列的可變區基因構建見圖13。構建的可變區基因插入合適的載體，如pNEPuDGV載體，表達抗體，方法同第六部分所述。其它的構建方法同樣適，包括Jayaraman et al.，1989，核酸研究.174403；Sandhu et al，1992，Biotechniques 1214；Barnett andErifie，1990，H.，核酸研究.183094；Ciccarelli et al.，1991，核酸研究.196007；Michaels et al.，1992，生物技術1245所述的方法，這裡引為參看文獻，但並不限於這裡列舉的參考方法。
表7HMFG-1抗體與不同的CDRS共有序列的比較VH1 CDR1序列殘基 31 32 33 3435 35A35B人I Ser Tyr Ala Ile Ser人II Ser Tyr Ser/Tyr Trp SerTrpAsn人III Ser Tyr Ala Met Ser小鼠IASer Tyr Tyr Trp AsnAsnSer小鼠IBSer Tyr Gly Val HisValSer小鼠IIA Asp/Ser Tyr Tyr Met AsnAsn小鼠IIB Ser Tyr Trp Met His小鼠IIC Asp/Ser Tyr Tyr Met His小鼠IIIA Asp/Ser Phe/Tyr Tyr Met Glu小鼠IIIB Arg Tyr Trp Met Ser小鼠IIIC Arn Tyr Trp Met Asn小鼠IIID Ser Tyr Ala Met Ser小鼠VASer Tyr Gly Ile Asn小鼠VBSer Tyr Gly Leu TyrHMFG-1Ala Tyr Trp Ile GluVH1 CDR2序列殘基 50 51 52 52A 52B 52C 5354 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65人ITrp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly人II Arg Ile Tyr Tyr Arg Ala Tyr Ser Gly Ser Thr Asp/ Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerAsn人III Val Ile Ser Gly Lys Thr Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly小鼠IA Tyr Ile Ser +Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser小鼠IB Val Ile Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser小鼠IIA Asp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly小鼠IIB Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser小鼠IIC Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lyr Phe Gln Gly小鼠IIIA Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly小鼠IIIB Glu Ile Asn Pro Lys Ala Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp小鼠IIIC Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly小鼠IIID Thr Ile Ser Ser Lys Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly小鼠VA Tyr Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly小鼠VB Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ala Tyr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln GlyHMFG-l Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys GlyVH1 CDR3序列殘基95 96 97 98 99 100 100A 100B 100C 100D 100E 100F 100G 100H 100I 100J 100K 101 102人IAla Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly Asp Tyr + Phe Asp Tyr人II Glu Leu Pro Gly Gly Tyr +Gly Asp Asp Tyr Tyr Tyr ++ Gly Phe Asp Val人III + Arg +++ Ser Leu Ser Gly + Tyr Tyr Tyr Tyr His Tyr Phe Asp Tyr小鼠IA Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp + Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr小鼠IB Asp Arg Gly Arg Tyr Tyr Tyr+ Ser Gly +++ Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr小鼠IIA Gly + Tyr Tyr Ser Ser Ser Tyr Met + Ala ++ Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr
殘基95 96 97 98 99 100 100A 100B 100C 100D 100E 100F 100G 100H 100I 100J 100K 101 102小鼠IIB Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser ++ Val Tyr +Tyr Trp Tyr Phe Asp Tyr小鼠IIC Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Ser + Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr小鼠IIIA Asp Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Glu Gly Pro Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Val小鼠IIIB Leu Gly Gly Tyr Gly Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr小鼠IIIC Gly Gly Tyr Gly Gly + Arg Arg Ser+ Trp Phe Ala Tyr小鼠IIID Gly Gly Tyr Tyr Tyr Leu + Gly Ser Ala Pro Phe Asp Tyr Ala Met Asp Tyr小鼠VA Ser Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr + Phe Ala Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr小鼠VB Arg Val Ile Ser Arg Tyr PheAsp GlyHMFG-1 Ser Tyr Asp Phe Ala Trp PheAla TyrVL CDR1 序列殘基 24 25 26 27 27A 27R 27C 27D 27E 27F 28 29 303132 33 34人κIArg Ala Ser Gln Ser Leu Val ++Ser Ile Ser Asn/SerTyr Leu Ala人κII Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser + Asp Gly Asn/Asp Asn/ThrTyr Leu +人κIII Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser SerTyr Leu Ala人κIV Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys AsnTyr Leu Ala小鼠κI Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys AsnTyr Leu小鼠κII Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn ThrTyr Leu Gln小鼠κIIIArg Ala Ser Glu Ser Val Asp SerTyr Gly Asn SerPhe Met His小鼠κIV Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser SerTyr Leu His小鼠κV Arg Ala Ser Gln Asp Asp Ile Ser AsnTyr Leu Asn小鼠κVI Ser Ala Ser Ser Ser Val SerTyr Met His小鼠κVIIHMFG-1 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys IleTyr Leu AlaVLCDR2序列殘基 50515253545556人κIAla Ala Ser Ser Leu Glu Ser人κII Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser人κIII Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr人κIV Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser小鼠κITrp Arp Ser Thr Arg Glu Ser小鼠κII Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser小鼠κIII Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser小鼠κIV Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser小鼠κVTyr Ala Ser Arg Leu His Ser小鼠κVI Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser小鼠κVIIHMFG-1 Trp Ala Ser Thr Arg Glu SerVLCDR3序列殘基 89909192939495 95A95B95C 95D 95E 95F9697人κIGln Gln Tyr+Ser Leu Pro Glu Trp Thr人κII Met Gln Ala Leu Gln+Pro Arg +Thr人κIII Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Leu Thr人κlV Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro +Thr小鼠κIGln Asn Asp Tyr Ser Tyr ProLeu Thr小鼠κII Phe Gln Gly Thr His Val Pro Pro Tyr Thr小鼠κIII Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Trp Thr小鼠κIV Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro+GlyLeu Thr小鼠κVGln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Arg Thr小鼠κVI Gln Gln Trp Ser Ser Aro Pro Pro Met Pro Leu Thr
殘基 89 90 91 92 93 94 95 95A 95B 95C 95D 95E 95F96 97小鼠κVII Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Ala Tyr ThrHMFG-1 Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
本發明在範圍上並不限於這裡所舉的具體方案。事實上，除了本發明這些方法外，根據前面的描述和所附的圖解，對本領域的技術人員來說顯而易見可作出本發明的各種修飾。
文獻內容公開的相關文獻，這裡作為文獻全文引用。
權利要求
1.一種疫苗組合物，包括一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白分子含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸；和藥學上可接受的載體。
2.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說抗原是腫瘤抗原。
3.根據權利要求2的疫苗組合物，其中所說抗原是癌抗原。
4.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原是多態內皮細胞粘蛋白抗原。
5.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原是結腸癌相關蛋白抗原。
6.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原是結腸癌相關的碳水化合物抗原。
7.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說可變區是輕鏈可變區，所說的不含巰基胺基酸殘基對應於第二免疫球蛋白輕鏈可變區的23或88位胺基酸。
8.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說可變區是重鏈可變區，所說的不含巰基胺基酸殘基對應於第二免疫球蛋白重鏈可變區的22或92位胺基酸。
9.根據權利要求1，7或8的疫苗組合物，其中所說的不含巰基胺基酸殘基是丙氨酸。
10.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的第二免疫球蛋白是Mab31.1，Mab33.28或Mab HMFG-1，其中所說的一或多個胺基酸替代是包括用丙氨酸替代輕鏈可變區基因的23和/或88位的胺基酸。
11.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的第二免疫球蛋白是Mab31.1，Mab33.28或Mab HMFG-1，其中所說的一或多個胺基酸替代是包括用丙氨酸替代重鏈可變區基因的22和/或92位的胺基酸。
12.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原是人乳脂肪小球抗原。
13.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原是乳腺癌，卵巢癌，子宮癌，前列腺癌，膀胱癌，肺癌，皮膚癌，結腸癌，胰腺癌，胃腸道癌，B細胞癌或T細胞癌抗原。
14.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原選自KS1/4泛-癌抗原，卵巢癌抗原，前列腺酸磷酸，前列腺特異抗原，黑色素瘤相關抗原p97，黑色素瘤抗原p75，高分子量黑色素瘤抗原，前列腺特異的膜抗原，癌胚抗原，多態內皮細胞粘蛋白抗原，人乳脂肪小球蛋白抗原，結腸癌相關抗原TAG-72，C017-1A，GICA 19-9，CTA-1，LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19，人B淋巴瘤抗原-CD20，CD33，神經節苷脂GD2，神經節苷脂GD3，神經節苷脂GM2，神經節苷脂GM3，腫瘤特異性移植型細胞表面抗原，癌胚抗原-α-胚胎蛋白L6，人肺癌抗原L20，人白血病T細胞抗原-Gp37，新糖蛋白，神經鞘脂類，EGFR，HER2抗原，多態表皮粘蛋白，人惡性腫瘤淋巴細胞抗原-APO-1，I抗原M18，M39，SSEA-1，VEP8，VEP9，Myl，VIM-D5，D156-22，TRA-1-85，C14，F3，AH6，Y半抗原，Ley，TL5，FC10.2，胃腺癌抗原，CO-514，NS-10，CO-43，MH2，結腸癌中19.9，胃癌粘蛋白，T5A7，R24，4.2，GD3，D1.1，OFA-1，GM2，OFA-2，GD2，M122258，SSEA-3，SSEA-4和源自T細胞受體的肽。
15.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說抗原是傳染病病原抗原。
16.根據權利要求15的疫苗組合物，其中所說抗原選自流感病毒血凝素，人氣管合胞體病毒G糖蛋白，登革病毒核心蛋白，登革病毒基質蛋白，麻疹病毒血凝素，II型單純皰疹病毒糖蛋白gB，I型脊髓灰質炎病毒VP1，I型人類免疫缺陷型病毒包膜糖蛋白，B肝表面抗原，白喉毒素，鏈雙球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，假狂犬病病毒g50，假狂犬病病毒糖蛋白H，假狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質蛋白，豬輪狀病毒糖蛋白38，豬微小病毒衣殼蛋白，豬痢疾小蛇菌保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新城病病毒血凝素-神經氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經氨酸酶，感染性牛鼻氣管病毒糖蛋白E，感染性咽氣管炎病毒糖蛋白G或I，La Crosse病毒糖蛋白，新生小牛腹瀉病毒，B肝病毒核心蛋白，B肝病毒表面抗原，馬流感病毒A型/阿拉斯加91神經氨酸酶，A型馬流感病毒/邁阿密63神經氨酸酶，A型馬流感病毒/肯塔基81神經氨酸酶，I型馬皰疹病毒糖蛋白B，I型馬皰疹病毒糖蛋白D，牛氣管合胞體病毒粘附蛋白，牛氣管合胞體病毒融合蛋白，牛氣管合胞體病毒核衣殼蛋白，III型牛副流感病毒融合蛋白，III型牛副流感病毒血凝素-神經氨酸酶蛋白，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白53。
17.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說抗原是傳染病病原的細胞受體。
18.根據權利要求17的疫苗組合物，其中所說細胞受體選自LPV受體，腺苷酸環化酶，BDV表面糖蛋白，N-乙醯-9-0-乙醯神經氨酸受體，CD4+，高度硫酸化型硫酸肝素，P65，含Gal-α1-4-異受體，CD16b，整合素VLA-2受體，EV受體，CD14，糖偶聯物受體，T細胞受體α/β，衰變加速因子受體，胞外包膜糖蛋白受體，免疫球蛋白Fc受體，痘病毒M-T7，GALV受體，CD14受體，Lewis(b)血型抗原受體，T細胞受體，硫酸肝素糖胺聚糖受體，纖維細胞生長因子受體，CD11a，CD2，G蛋白偶聯受體，CD4，硫酸肝素蛋白聚糖，鈣磷脂結合蛋白II，CD13(神經氨肽酶N)，人神經氨肽酶N受體，血凝素受體，CR3受體，蛋白激酶受體，半乳糖N-乙醯半乳糖胺-抑制性凝集素受體，趨化因子受體，鈣磷脂結合蛋白I，actA蛋白，CD46受體，腦膜炎雙球菌毒性相關的opa受體，CD46受體，癌胚抗原家族受體，癌胚抗原家族βglA受體，γ幹擾素受體，糖蛋白gp70，rmc-1受體，人整合素受體αvβ3，硫酸肝素蛋白聚糖受體，CD66受體，整合素受體，膜輔因子受體，CD46，GM1，GM2，GM3，CD3，神經醯胺，血凝素-神經氨酸酶蛋白，紅細胞P抗原受體，CD36受體，血型糖蛋白A受體，幹擾素γ受體，KDEL受體，粘蛋白歸巢α4/β7受體，表皮生長因子受體，α5/β1整合素蛋白，非糖基化J774受體，CXCR1-4受體，CCR1-5受體，CXCR3受體，CCR5受體，gp46表面糖蛋白，TNFRp55受體，TNFp75受體，可溶性白介素-1受體β。
19.根據權利要求15或17的疫苗組合物，其中所說的傳染病病原是細菌。
20.根據權利要求19的疫苗組合物，其中所說細菌選自分支桿菌立克次體，支原體，萘瑟氏菌類，軍團桿菌，志賀氏菌類，霍亂弧菌，鏈球菌屬，白喉棒狀桿菌，破傷風梭狀芽胞桿菌，百日咳桿菌，嗜血桿菌類，衣原體類，大腸埃希氏桿菌，或梅毒或感柒色關節炎病原體。
21.根據權利要求15或17的疫苗組合物，其中所說的傳染病病原是病毒。
22.根據權利要求21的疫苗組合物，其中所說病毒選自A肝病毒，B肝病毒，C肝病毒，流感病毒，水痘病毒，腺病毒，I型單純皰疹病毒，II型單純皰疹病毒，牛瘟病毒，鼻病毒，艾可病毒，輪狀病毒，呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒，乳多孔病毒，巨胞病毒，刺狀病毒，蟲媒病毒，漢塔病毒，柯薩奇病毒，流行腮腺炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，脊髓灰質炎病毒，I型人類免疫缺陷型病毒，II型人類免疫缺陷型病毒，細小RNA病毒，腸道病毒，萼狀病毒，諾沃克病毒(Norwalk)組，外衣病毒，阿爾發病毒，黃熱病病毒，冠狀病毒，狂犬病病毒，馬爾堡病毒，埃波拉病毒，副流感病毒，正粘病毒，本雅病毒，沙粒病毒，呼腸弧病毒，輪狀病毒，環狀病毒，I型人類T細胞白血病病毒，II型人類T細胞白血病病毒，類人猿免疫缺陷病毒，慢病毒，多瘤病毒，細小病毒，EB病毒，人類皰疹病毒-6，I型獼猴皰疹病毒，痘病毒。
23.根據權利要求15或17的疫苗組合物，其中所說傳染病病原是寄生蟲。
24.根據權利要求23的疫苗組合物，其中所說寄生蟲選自瘧原蟲屬，艾美球蟲屬，利什曼蟲屬，可可地亞蟲屬，錐蟲屬和真菌。
25.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的第一免疫球蛋白分子類型選自IgG，IgE，IgM，IgD和IgA。
26.一種疫苗組合物，包括一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白片段含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸；和藥學上可接受的載體。
27.根據權利要求26的疫苗組合物，其中所說片段是單鏈免疫球蛋白。
28.根據權利要求26的疫苗組合物，其中所說片段是Fab片段，(Fab』)2片段，重鏈二聚體，輕鏈二聚體或Fv片段。
29.根據權利要求26的疫苗組合物，其中所說片段還包括恆定區。
30.根據權利要求26的疫苗組合物，其中可變區來源於鼠免疫球蛋白，恆定區則來源於人免疫球蛋白。
31.根據權利要求1的疫苗組合物，其中可變區有源於人抗體的框架結構區和源於小鼠的免疫球蛋白互補決定區(CDRs)。
32.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說第一免疫球蛋白抗體分子被共價連接至下列蛋白之一的胺基酸序列中IL-2，IL-4，IL-5，IL-，IL-7，IL-10或MHC衍生肽，G-CSF，TNF，打孔素，NK細胞抗原或細胞內容作用受體。
33.根據權利要求26的疫苗組合物，其中所說第一免疫球蛋白分子的片段共價連接至選自下列蛋白之一的胺基酸序列中IL-2，IL-4，IL-5，IL-，IL-7，IL-10或、ν幹擾素MHC衍生肽，G-CSF，TNF，打孔素，NK細胞抗原或細胞內容作用受體。
34.在受試者中產生抗獨特型反應的方法，包括給受試者施用一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸。
35.根據權利要求34的方法，還進一步的包括從該受試者中分離抗體，所述抗體識別所說第二免疫球蛋白分子的抗體，然後將該抗體給第二受試者使用。
36.根據權利要求34的方法，其中所說抗原為腫瘤抗原。
37.根據權利要求34的方法，其中所說抗原為癌抗原。
38.根據權利要求36的方法，其中所說抗原為多態內皮細胞粘蛋白抗原。
39.根據權利要求36的方法，其中所說抗原為人結腸癌相關蛋白抗原。
40.根據權利要求36的方法，其中所說抗原為結腸癌相關碳水化合物抗原。
41.根據權利要求35的方法，其中所說可變區是輕鏈可變區，所說的不含巰基胺基酸殘基對應於第二免疫球蛋白輕鏈可變區的23或88位胺基酸。
42.根據權利要求35的方法，其中所說可變區是重鏈可變區，所說的不含巰基胺基酸對應於第二免疫球蛋白重鏈的22或92位胺基酸。
43.根據權利要求34的方法，其中所說的不含巰基胺基酸殘基是丙氨酸。
44.根據權利要求34的方法，其中所說的第二免疫球蛋白是Mab31.1，Mab33.28或Mab HMFG-1，其中所說的胺基酸他替代包括用丙氨酸替代輕鏈可變區基因的23和/或88位的胺基酸。
45.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的第二免疫球蛋白是Mab31.1，Mab33.28或Mab HMFG-1，其中所說的胺基酸他替代包括用丙氨酸替代重鏈可變區基因的22和/或92位的胺基酸。
46.根據權利要求34的方法，其中所說抗原是人乳脂肪小球蛋白。
47.根據權利要求34的方法，其中所說抗原是乳腺，卵巢，子宮，前列腺，膀胱，肺，皮膚，結腸，胰腺，胃腸道，B細胞或T細胞癌抗原。
48.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所說抗原選自KS1/4泛-癌抗原，卵巢癌抗原，前列腺酸磷酸，前列腺特異抗原，黑色素瘤相關抗原p97，黑色素瘤抗原p75，高分子量黑色素瘤抗原，前列腺特異的膜抗原，癌胚抗原，多態內皮細胞粘蛋白抗原，人乳脂肪小球蛋白抗原，結腸癌相關抗原TAG-72，C017-1A，GICA 19-9，CTA-1，LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19，人B淋巴瘤抗原-CD20，CD33，神經節苷脂6D2，神經節苷脂GD3，神經節苷脂GM2，神經節苷脂GM3，腫瘤特異性移植型細胞表面抗原，癌胚抗原-α-胚胎蛋白L6，人肺癌抗原L20，人白血病T細胞抗原-Gp37，新糖蛋白，神經鞘脂類，EGFR，HER2抗原，多態表皮粘蛋白，人惡性腫瘤淋巴細胞抗原-APO-1，I抗原M18，M39，SSEA-1，VEP8，VEP9，Myl，VIM-D5，D156-22，TRA-1-85，C14，F3，AH6，Y半抗原，Ley，TL5，FC10.2，胃腺癌抗原，C0-514，NS-10，C0-43，MH2，結腸癌中19.9，胃癌粘蛋白，T5A7，R24，4.2，GD3，D1.1，OFA-1，GM2，OFA-2，GD2，M122258，SSEA-3，SSEA-4和源自T細胞受體的肽。
49.根據權利要求34的方法，其中所說抗原是傳染病病原抗原。
50.根據權利要求15的疫苗組合物，其中所說抗原選自流感病毒血凝素，人氣管合胞體病毒G糖蛋白，登革病毒核心蛋白，登革病毒基質蛋白，麻疹病毒血凝素，II型單純皰疹病毒糖蛋白gB，I型脊髓灰質炎病毒VP1，I型人類免疫缺陷型病毒包膜糖蛋白，B肝表面抗原，白喉毒素，鏈雙球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，假狂犬病病毒g50，假狂犬病病毒糖蛋白H，假狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質蛋白，豬輪狀病毒糖蛋白38，豬微小病毒衣殼蛋白，豬痢疾小蛇菌保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新城病病毒血凝素-神經氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經氨酸酶，感染性牛鼻氣管病毒糖蛋白E，感染性咽氣管炎病毒糖蛋白G或I，La Crosse病毒糖蛋白，新生小牛腹瀉病毒，B肝病毒核心蛋白，B肝病毒表面抗原，馬流感病毒A型/阿拉斯加91神經氨酸酶，A型馬流感病毒/邁阿密63神經氨酸酶，A型馬流感病毒/肯塔基81神經氨酸酶，I型馬皰疹病毒糖蛋白B，I型馬皰疹病毒糖蛋白D，牛氣管合胞體病毒粘附蛋白，牛氣管合胞體病毒融合蛋白，牛氣管合胞體病毒核衣殼蛋白，III型牛副流感病毒融合蛋白，III型牛副流感病毒血凝素-神經氨酸酶蛋白，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白53。
51.根據權利要求34的方法，其中所說抗原是傳染病病原的細胞受體。
52.根據權利要求17的疫苗組合物，其中所說細胞受體選自LPV受體，腺苷酸環化酶，BDV表面糖蛋白，N-乙醯-9-0-乙醯神經氨酸受體，CD4+，高度硫酸化型硫酸肝素，P65，含Gal-α1-4-異受體，CD16b，整合素VLA-2受體，EV受體，CD14，糖偶聯物受體，T細胞受體α/β，衰變加速因子受體，胞外包膜糖蛋白受體，免疫球蛋白Fc受體，痘病毒M-T7，GALV受體，CD14受體，Lewis(b)血型抗原受體，T細胞受體，硫酸肝素糖胺聚糖受體，纖維細胞生長因子受體，CD11a，CD2，G蛋白偶聯受體，CD4，硫酸肝素蛋白聚糖，鈣磷脂結合蛋白II，CD13(神經氨肽酶N)，人神經氨肽酶N受體，血凝素受體，CR3受體，蛋白激酶受體，半乳糖N-乙醯半乳糖胺-抑制性凝集素受體，趨化因子受體，鈣磷脂結合蛋白I，actA蛋白，CD46受體，腦膜炎雙球菌毒性相關的opa受體，CD46受體，癌胚抗原家族受體，癌胚抗原家族BglA受體，γ幹擾素受體，糖蛋白gp70，rmc-1受體，人整合素受體αvβ3，硫酸肝素蛋白聚糖受體，CD66受體，整合素受體，膜輔因子受體，CD46，GM1，GM2，GM3，CD3，神經醯胺，血凝素-神經氨酸酶蛋白，紅細胞P抗原受體，CD36受體，血型糖蛋白A受體，幹擾素γ受體，KDEL受體，粘蛋白歸巢α4/β7受體，表皮生長因子受體，α5/β1整合素蛋白，非糖基化J774受體，CXCR1-4受體，CCR1-5受體，CXCR3受體，CCR5受體，gp46表面糖蛋白，TNFRp55受體，TNFp75受體，可溶性白介素-1受體β。
53.根據權利要求49或51的方法，其中所說的傳染病病原是細菌。
54.根據權利要求19的疫苗組合物，其中所說細菌選自分支桿菌立克次體，支原體，萘瑟氏菌類，軍團桿菌，志賀氏菌類，霍亂弧菌，鏈球菌屬，白喉棒狀桿菌，破傷風梭狀芽胞桿菌，百日咳桿菌，嗜血桿菌類，衣原體類，大腸埃希氏桿菌，或梅毒或感染色關節炎病原體。
55.根據權利要求49或51的方法，其中所說的傳染病病原是病毒。
56.根據權利要求21的疫苗組合物，其中所說病毒選自A肝病毒，B肝病毒，C肝病毒，流感病毒，水痘病毒，腺病毒，I型單純皰疹病毒，II型單純皰疹病毒，牛瘟病毒，鼻病毒，艾可病毒，輪狀病毒，呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒，乳多孔病毒，巨胞病毒，刺狀病毒，蟲媒病毒，漢塔病毒，柯薩奇病毒，流行腮腺炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，脊髓灰質炎病毒，I型人類免疫缺陷型病毒，II型人類免疫缺陷型病毒，細小RNA病毒，腸道病毒，萼狀病毒，諾沃克病毒(Norwalk)組，外衣病毒，阿爾發病毒，黃熱病病毒，冠狀病毒，狂犬病病毒，馬爾堡病毒，埃波拉病毒，副流感病毒，正粘病毒，本雅病毒，沙粒病毒，呼腸弧病毒，輪狀病毒，環狀病毒，I型人類T細胞白血病病毒，II型人類T細胞白血病病毒，類人猿免疫缺陷病毒，慢病毒，多瘤病毒，細小病毒，EB病毒，人類皰疹病毒-6，I型獼猴皰疹病毒，痘病毒。
57.根據權利要求49或51的方法，其中所說傳染病病原是寄生蟲。
58.根據權利要求57的方法，其中所說寄生蟲選自瘧原蟲屬，艾美球蟲屬，利什曼蟲屬，可可地亞蟲屬，錐蟲屬和真菌。
59.根據權利要求34的方法，其中所說的第一免疫球蛋白分子類型選自IgG，IgE，IgM，IgD和IgA。
60.在某一受試者中產生抗獨特型反應的的方法，包括一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸。
61.根據權利要求60的方法，還進一步的包括從該受試者中分離抗體，所述抗體識別所說第二免疫球蛋白分子，並且將該抗體給第二受試者使用。
62.根據權利要求60的方法，其中所說抗原為腫瘤抗原。
63.根據權利要求60的方法，其中所說抗原為癌抗原。
64.根據權利要求60的方法，其中所說抗原為多態內皮細胞粘蛋白抗原。
65.根據權利要求62的方法，其中所說抗原為人結腸癌相關蛋白抗原。
66.根據權利要求62的方法，其中所說抗原為人結腸癌相關碳水化合物抗原。
67.根據權利要求60的方法，其中所說可變區是輕鏈可變區，所說的不含巰基胺基酸殘基對應於第二免疫球蛋白輕鏈可變區的23或88位胺基酸。
68.根據權利要求60的方法，其中所說可變區是重鏈可變區，所說的不含巰基胺基酸殘基對應於第二免疫球蛋白重鏈的22或92位胺基酸。
69.根據權利要求60，67或68的方法，其中所說的不含巰基胺基酸殘基是丙氨酸。
70.根據權利要求63的方法，其中所說抗原是人乳脂肪小球蛋白。
71.根據權利要求63的方法，其中所說抗原是乳腺癌，卵巢癌，子宮癌，前列腺癌，膀胱癌，肺癌，皮膚癌，結腸癌，胰腺癌，胃腸道癌，B細胞癌或T細胞癌抗原。
72.根據權利要求60的方法，其中所說抗原是傳染病病原抗原。
73.根據權利要求15的疫苗組合物，其中所說抗原選自流感病毒血凝素，人氣管合胞體病毒G糖蛋白，登革病毒核心蛋白，登革病毒基質蛋白，麻疹病毒血凝素，II型單純皰疹病毒糖蛋白gB，I型脊髓灰質炎病毒VP1，I型人類免疫缺陷型病毒包膜糖蛋白，B肝表面抗原，白喉毒素，鏈雙球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，假狂犬病病毒g50，假狂犬病病毒糖蛋白H，假狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質蛋白，豬輪狀病毒糖蛋白38，豬微小病毒衣殼蛋白，豬痢疾小蛇菌保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新城病病毒血凝素-神經氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經氨酸酶，感染性牛鼻氣管病毒糖蛋白E，感染性咽氣管炎病毒糖蛋白G或I，La Crosse病毒糖蛋白，新生小牛腹瀉病毒，B肝病毒核心蛋白，B肝病毒表面抗原，馬流感病毒A型/阿拉斯加91神經氨酸酶，A型馬流感病毒/邁阿密63神經氨酸酶，A型馬流感病毒/肯塔基81神經氨酸酶，I型馬皰疹病毒糖蛋白B，I型馬皰疹病毒糖蛋白D，牛氣管合胞體病毒粘附蛋白，牛氣管合胞體病毒融合蛋白，牛氣管合胞體病毒核衣殼蛋白，III型牛副流感病毒融合蛋白，III型牛副流感病毒血凝素-神經氨酸酶蛋白，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白53。
74.根據權利要求60的方法，其中所說抗原是傳染病病原的細胞受體。
75.根據權利要求1 7的疫苗組合物，其中所說細胞受體選自LPV受體，腺苷酸環化酶，BDV表面糖蛋白，N-乙醯-9-0-乙醯神經氨酸受體，CD4+，高度硫酸化型硫酸肝素，P65，含Gal-α1-4-異受體，CD16b，整合素VLA-2受體，EV受體，CD14，糖偶聯物受體，T細胞受體α/β，衰變加速因子受體，胞外包膜糖蛋白受體，免疫球蛋白Fc受體，痘病毒M-T7，GALV受體，CD14受體，Lewis(b)血型抗原受體，T細胞受體，硫酸肝素糖胺聚糖受體，纖維細胞生長因子受體，CD11a，CD2，G蛋白偶聯受體，CD4，硫酸肝素蛋白聚糖，鈣磷脂結合蛋白II，CD13(神經氨肽酶N)，人神經氨肽酶N受體，血凝素受體，CR3受體，蛋白激酶受體，半乳糖N-乙醯半乳糖胺-抑制性凝集素受體，趨化因子受體，鈣磷脂結合蛋白I，actA蛋白，CD46受體，腦膜炎雙球菌毒性相關的opa受體，CD46受體，癌胚抗原家族受體，癌胚抗原家族BglA受體，γ幹擾素受體，糖蛋白gp70，rmc-1受體，人整合素受體αvβ3，硫酸肝素蛋白聚糖受體，CD66受體，整合素受體，膜輔因子受體，CD46，GM1，GM2，GM3，CD3，神經醯胺，血凝素-神經氨酸酶蛋白，紅細胞P抗原受體，CD36受體，血型糖蛋白A受體，幹擾素γ受體，KDEL受體，粘蛋白歸巢α4/β7受體，表皮生長因子受體，α5/β1整合素蛋白，非糖基化J774受體，CXCR1-4受體，CCR1-5受體，CXCR3受體，CCR5受體，gp46表面糖蛋白，TNFRp55受體，TNFp75受體，可溶性白介素-1受體β。
76.根據權利要求72或74的方法，其中所說的傳染病病原是細菌。
77.根據權利要求19的疫苗組合物，其中所說細菌選自分支桿菌立克次體，支原體，萘瑟氏菌類，軍團桿菌，志賀氏菌類，霍亂弧菌，鏈球菌屬，白喉棒狀桿菌，破傷風梭狀芽胞桿菌，百日咳桿菌，嗜血桿菌類，衣原體類，大腸埃希氏桿菌，或梅毒或感染色關節炎病原體。
78.根據權利要求72或74的方法，其中所說的傳染病病原是病毒。
79.根據權利要求21的疫苗組合物，其中所說病毒選自A肝病毒，B肝病毒，C肝病毒，流感病毒，水痘病毒，腺病毒，I型單純皰疹病毒，II型單純皰疹病毒，牛瘟病毒，鼻病毒，艾可病毒，輪狀病毒，呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒，乳多孔病毒，巨胞病毒，刺狀病毒，蟲媒病毒，漢塔病毒，柯薩奇病毒，流行腮腺炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒，脊髓灰質炎病毒，I型人類免疫缺陷型病毒，II型人類免疫缺陷型病毒，細小RNA病毒，腸道病毒，萼狀病毒，諾沃克病毒(Norwalk)組，外衣病毒，阿爾發病毒，黃熱病病毒，冠狀病毒，狂犬病病毒，馬爾堡病毒，埃波拉病毒，副流感病毒，正粘病毒，本雅病毒，沙粒病毒，呼腸弧病毒，輪狀病毒，環狀病毒，I型人類T細胞白血病病毒，II型人類T細胞白血病病毒，類人猿免疫缺陷病毒，慢病毒，多瘤病毒，細小病毒，EB病毒，人類皰疹病毒-6，I型獼猴皰疹病毒，痘病毒。
80.根據權利要求72或74的方法，其中所說傳染病病原是寄生蟲。
81.根據權利要求80的方法，其中所說寄生蟲選自瘧原蟲屬，艾美球蟲屬，利什曼蟲屬，可可地亞蟲屬，錐蟲屬和真菌。
82.根據權利要求60的方法，其中所說片段是單鏈免疫球蛋白抗體。
83.根據權利要求82的方法，其中所說片段是Fab片段，(Fab』)2片段或Fv片段。
84.根據權利要求60的方法，其中所說片段包括恆定區。
85.根據權利要求84的方法，其中可變區來源於鼠免疫球蛋白，恆定區則來源於人免疫球蛋白。
86.根據權利要求60的方法，其中可變區有源於人抗體的框架結構區和來源於鼠的免疫球蛋白互補決定區(CDRs)。
87.在某一需要進行癌症治療或預防的受試者中，進行癌症預防與治療的方法，包括給該受試者使用疫苗組合物，包括一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白分子含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白分子免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸；和藥學上可接受的載體。
88.在需要進行傳染病預防和治療的受試者中，預防與治療傳染病的方法，包括給該受試者使用疫苗組合物，包括一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白分子含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性識別傳染病病原抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸；和藥學上可接受的載體。
89.在需要進行傳染病治療或預防的受試者中預防與治療傳染病的方法，包括給該受試者使用疫苗組合物，包括一定量的足以誘導抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性識別傳染病病原細胞結合受體，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸；和藥學上可接受的載體。
90.根據權利要求88或89的方法，其中所說的傳染病病原選自梅毒，淋病，AIDS，瘧疾，志賀氏菌感染，沙門氏菌感染，A肝，C肝，感染色關節炎，腦炎，皰疹，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌感染，肺炎雙球菌感染。
91.製備足以誘導抗獨特型反應第一免疫球蛋白分子的方法，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸，所說方法包括步驟(a)通過用編碼不含巰基的一或多個殘基的核苷酸取代第二免疫球蛋白核酸中編碼一或多個半胱氨酸殘基的核苷酸從而構建編碼所述第一免疫球蛋白分子的核酸；(b)將步驟(a)構建的核酸序列的引入細胞，並由該細胞表達所說的第一免疫球蛋白；(c)回收表達的第一免疫球蛋白。
92.根據權利要求91的方法，其中核酸置換採用定點突變。
93.製備足以誘導抗獨特型反應第一免疫球蛋白分子的方法，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸的替換指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含巰基的胺基酸替換半胱氨酸，包括步驟；(a)合成含編碼所述第一免疫球蛋白分子的人工基因的核酸；(b)將步驟(a)構建的核酸序列引入細胞，並由該細胞表達所說的第一免疫球蛋白；(c)回收表達的第一免疫球蛋白分子。
94.根據權利要求91或93的方法所說的第二免疫球蛋白抗體分子是Mab31.1，或Mab33.28
95.根據權利要求91或93的方法，其中所說的第二免疫球蛋白抗體分子是HMFG-1。
96.一種疫苗組合物，包括一定量的足以引發抗獨特型反應的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸替換中的至少一些指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含疏基的胺基酸替換半胱氨酸，其中如果胺基酸替代不是上述的替代的話，則替代是不穩定的，上述的替換是指在所述第二免疫球蛋白對應的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸殘基的一或多個位點用一或多個不含巰基的胺基酸進行替換；和藥學上可接受的載體。
97.在某一受試者中產生抗獨特型反應的方法，包括給所述受試者施用足以誘導抗獨特型反應量的第一免疫球蛋白分子，該第一免疫球蛋白含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸替換中的至少一些指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含疏基的胺基酸替換半胱氨酸，其中如果胺基酸替代不是上述的替代的話，則替代是不穩定的，上述的替換是指在所述第二免疫球蛋白對應的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸殘基的一或多個位點用一或多個不含巰基的胺基酸進行替換。
98.第一免疫球蛋白分子，包括含一段可變區，除可變區中一個或多個胺基酸被取代外，其餘的胺基酸與第二免疫球蛋白分子一致，其中所說第二免疫球蛋白免疫特異性結合抗原，所說的一或多個胺基酸替換中的至少一些指在所說第二免疫球蛋白分子的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸的對應的一或多個位點用不含疏基的胺基酸替換半胱氨酸，其中如果胺基酸替代不是上述的替代的話，則替代是不穩定的，上述的替換是指在所述第二免疫球蛋白對應的形成二硫鍵的一或多個半胱氨酸殘基的一或多個位點用一或多個不含巰基的胺基酸進行替換。
全文摘要
本發明涉及修飾免疫球蛋白分子,其中用不含巰基基團的胺基酸替代可變區中形成鏈內二硫鍵的一個或多個半胱氨酸殘基,因此不形成二硫鍵。這此修飾免疫球蛋白分子誘導抗獨特型反應的能力被增強。本發明還進一步提供了,使用本發明的修飾免疫球蛋白治療或預防腫瘤和或傳染性疾病的方法。
文檔編號A61P31/04GK1327388SQ98813119
公開日2001年12月19日 申請日期1998年11月13日 優先權日1997年11月14日
發明者R·M·布爾克 申請人:歐洲細胞技術有限公司