一種新的10個y染色體短串聯重複序列位點及其分型方法

2023-09-19 20:49:30

專利名稱：：一種新的10個y染色體短串聯重複序列位點及其分型方法
技術領域：
：本發明涉及一種核酸檢測方法，涉及檢測人體基因組中具有多態性的遺傳標記，特別涉及一種新的IO個Y染色體STR基因位點及其分型方法。適用於法醫學、人類學、遺傳學和疾病等領域的個體識別、親子鑑定以及基因診斷等方面研究，同時也為遺傳製圖、基因分離、疾病連鎖分析及法醫學個體識別和親權鑑定等領域的理論與應用研究提供基礎數據。
背景技術：
：短串聯重複序列(ShortTandemR印eat，STR)由26個鹼基重複排列組成特異序列，STR是一類在人類基因組中分布廣泛並且具有高度多態性的遺傳標記。短串聯重複序列在研究與應用中具有以下顯著的優點片段長度小，易通過PCR擴增及電泳分型；分型檢測靈敏度高、所需檢材量少，尤其適合各種陳舊、降解檢材的檢測；PCR擴增結果穩定，產生的附加帶及影子帶少；分型方法簡便、快速，重複性好等優點，是繪製人類遺傳圖、疾病基因連鎖分析、遺傳病診斷、個體識別及親權鑑定等分析工作的重要工具。目前，STR是法醫DNA分析中最常用的一類遺傳標記。STR主要由於核心重複單位數目的變化形成了STR基因位點的遺傳多態性。STR等位基因片段可採用PCR技術擴增，其等位基因可用銀染、螢光標記和放射自顯影等技術分型。人類基因組中，平均每6-10kb就存在有一個STR基因位點，為法醫個人識別和親子鑑定提供了高信息基因位點的豐富來源。Y染色體為男性所特有的染色體，在減數分裂的過程中不與X染色體發生重組交換，遺傳物質由父親毫無變化(除突變外)的傳遞給兒子，即具有單倍體父系遺傳的特點。以往Y染色體僅被用在性別鑑定，直到二十世紀九十年代，才對Y染色體特有的STR序列及多態性進行了較深入的研究,人們對Y染色體遺傳標記的遺傳多態性和應用有了新的認識。研究Y染色體的兩個主要原因在於其一，Y染色體遺傳標記對混合DNA中男性成分的鑑定有獨特的優勢；其二，通過Y染色體遺傳標記可以追溯父系袓先。由於Y染色體STR位點具有擴增片段短、等位基因多、分型方法簡單和多態信息含量高的優點，有些Y-STR位點已被列入常規法醫檢驗項目，用於個體識別和親子鑑定。Y染色體STR的應用主要有以下幾個方面(1)用於大量人群的個人識別，其中包括性侵犯案件中混合斑的DNA分析、走失人員的尋找以及親子鑑定，特別適用於法醫學實踐中父方缺(如去世或失蹤)情況下的親權鑑定和強(輪)奸案中混合斑的個人認定，尤其對認定患無精症或少精症的犯罪嫌疑人更具有獨到之處；(2)用於研究人類起源、進化、遷移及部族關係、作為家系研究的有機補充；(3)用於臨床醫學疾病關聯分析，相關基因的定位和發病的分子遺傳機理的闡明以及環境因子易感基因的檢出等；(4)用於研究男性不育的遺傳學原因；對異性別及非血緣的供、受者異基因骨髓移植進行植活診斷的監測。由於Y染色體遺傳標記自身的遺傳特點，要提高Y染色體的鑑別能力，就需要不斷地增加新的Y染色體遺傳標記，尋找更多的能應用於法醫學等領域的Y染色體STR位點並進行群體遺傳學研究，是本領域亟待解決的問題。STR的分型，目前最常用的是應用PCR擴增STR，將擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacryamidegelelectropHoresis，PAGE),根據片段的大小決定基因型並計算等位基因頻率及遺傳距離並構建系統發育樹。對於PCR產物的檢測可用自顯影技術，PAGE結合銀氣以及螢光標記序列儀自動分析系統等方法。Y染色體STR基因位點的研究在國內還處於初期，目前國際上科學家們對Y-STR的研究形成了一個新的高潮，尤其在法醫遺傳學方面，已發現200多Y染色體STR和SNP遺傳標記，已有商品化試劑盒研製成功，並已在歐洲廣泛應用。目前國際上Y-STR商品化檢測試劑盒多由生物公司研製生產，試劑盒名稱、生產廠家及所包括Y-STR基因位點信息如下(1)Y-PLEX12kit(ReliageneTechnologiesInc.,NewOrleans,LA):DYS19,DYS389I，DYS389II，DYS390,DYS391,DYS392,DYS393,DYS385a，b，DYS438,DYS439;(2)Y-PLEX6kit(ReliageneTechnologiesInc.,NewOrleans,LA):DYS19,DYS389II，DYS390,DYS391,DYS393,andDYS385;(3)Y-PLEX5kit(ReliageneTechnologiesInc.，NewOrleans,LA):DYS389I,DYS389II，DYS438,DYS439,DYS392;(4)PowerPlex吸YSystemkit((Promega，USA):DYS19,DYS389I,DYS389II,DYS390,DYS391,DYS392,DYS393,DYS385a，b，DYS437,DYS438andDYS439。(5)AmpFLSTRY-filerkit(AppliedBiosystems，FosterCity,CA，USA):DYS456,DYS389I,DYS390'DYS389II,DYS458,DYS19，DYS385a，b:DYS393，DYS391，DYS439'DYS635，DYS392'YGATAHA,DYS437,DYS438,DYS448)。但是，該類試劑盒在法醫學應用實踐中存在以下問題(1)商品化試劑盒僅包括了既定的Y-STR位點，採用這類試劑盒需要增加遺傳標記時遇到困難；(2)這些Y-STR基因位點都是基於中國群體以外的群體(主要是白種人群體)資料而開發的，其中有些基因位點，在中國群體的基因頻率分布較表三。表三名稱類別加入量(質量百分比)萘磺酸鈉減水劑0.5%聚磷酸鈉分散劑0.04%娃統慣"W絡合劑0.04%腐植酸鈣穩定劑0.02%對所製得的水煤焦漿的質量指標進行檢測，各質量指標如下:漿濃度63-68%(以質量計)；細度平均粒度50um:粘度600-lOOOmpa.s:穩定性在正常條件下，3個月不發生硬沉澱。tableseeoriginaldocumentpage8上述新的10個Y-STR位點，除DYS392位點的核心重複序列是三核苷酸，DYS438位點的核心重複序列是五核苷酸外，其餘位點的核心重複序列均是四核苷酸。其中，擴增片段最小的是DYS459位點，片段長度為140-152bp，擴增片段最大的位點是DYS38911，片段長度為359-383bp，所有位點片段長度均適宜PCR擴增。上述新的IO個Y染色體STR基因位點的分型方法，其特徵在於，包括下列步驟1.採用PCR分別擴增10個Y染色體STR基因位點的DNA，並設計位點的上下遊引物序列，將上下遊引物稀釋成100pM0L/L，作為母液，取出10"l稀釋到5uMOL/L，作為工作液；PCR擴增體系的體積為20pL，含1X反應緩衝液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uM0L/LdNTP，DNA20200ng。2.PCR擴增參數為94"預變性3min，94"C變性lmin，根據位點的不同復性溫度進行30秒、72。C延伸lmin，共計30個循環，最後72。C延伸15min;3.擴增產物使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，採用銀染顯色方法，結合等位基因分型標準物進行標準化分型。上述等位基因分型標準物的製備方法包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產物分別與載體pGEM—T進行連接反應。2)連接反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a;3)塗布在氨苄青黴素瓊脂平板上，過夜培養；4)挑菌，大搖，提取質粒DNA，備用；5)以質粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑑定；注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大小；6)確定片段大小後大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。本發明所需儀器和設備簡單，是一種簡便、快速、靈敏、經濟的可行方法，適合在基層單位普及，對於中國目前的情況可以得到良好的效果。本發明所述技術方法可填補國內沒有實用化的Y-STR檢測技術和方案的空白，並在中國多個民族的遺傳多態性研究中獲得了滿意的結果。利用這種技術製備的Y染色體段串聯重複序列分型試劑盒，可進行商業化生產並推廣為國內各個實驗室使用，該技術克服了使用國外試劑盒無法反映中國多民族遺傳特點的缺陷，可應用於法醫學、人類學、遺傳學和疾病等領域的個體識別、親子鑑定以及基因診斷等方面，具有廣泛的應用前景。特別適用於法醫學實踐中父方缺如(去世或失蹤)情況下的親權鑑定和強(輪)奸案中混合斑的個人認定，對患有無精症或少精症的犯罪嫌疑人的認定更具獨到之處。具體實施方式本發明提供的10個新的Y染色體STR基因位點，分別為DYS459、DYS456、DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392;上述10個Y染色體STR基因位點採用PCR擴增樣本DNA，擴增產物使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，銀染顯色技術，結合等位基因分型標準物進行標準化分型。1.引物序列DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392八個位點的引物序列設計參照Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，DYS456和DYS459兩個位點的引物序列設計參考AlanJRedd等的報導，10個Y-STR基因位點上下遊引物序列見表2。將5.00D的上下遊引物稀釋成100uMOL/L，作為母液；取出10u1稀釋到5"M0L/L，作為工作液，備用。表2IO個Y-STR位點的引物序列tableseeoriginaldocumentpage102.PCR擴增PCR擴增體系推薦體積為20(iL，含IX反應緩衝液，1.5mM0L/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。使用PE9600擴增儀，PE9700擴增儀。目前各種方法提取的DNA模板，均適合Y染色體STR的擴增。PCR擴增參數為94"C預變性3min，94'C變性lmin，不同的復性溫度進行30秒、72。C延伸lmin，共計30個循環，最後72。C延伸15min。相關參考文獻中復性溫度多為57°C，申請人在實踐摸索中發現並證實了IO個Y-STR位點應選用不同的復性溫度(見表3)。本實驗PCR反應試劑均為國產試劑，結果均取得了滿意的效果，為試劑的國產化進行了有益的探索。表310個Y-STR位點不同的復性溫度tableseeoriginaldocumentpage113.變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離擴增產物A:玻璃板的處理1)電泳所用長板42.0x30.5cm;短板39.0x30.5cm;2)戴好乳膠手套，將清洗乾淨的長板放置在水平臺上，用一水平儀將水平臺調水平。將0.03ml親水劑倒在玻璃板中央，取適量脫脂棉球，將整塊玻璃板塗勻，在兩邊放好夾條(spacer),放置備用。3)將短玻璃板放置在另一水平臺上，取0.2ml配製好的疏水劑倒在玻璃板中央，用適量脫脂棉球，將整塊玻璃板塗勻，然後將玻璃板放置一邊晾乾備用。B:聚丙烯醯胺凝膠的製備(6%)1)用100ml的小燒杯稱取42克超純的尿素，依次加入54ml的lx丁BE溶液、12ml40%丙烯醯胺和亞甲基雙丙稀醯胺膠液(19:1)，放在磁力加熱攪拌器上，56'c促進尿素完全溶解。2)尿素完全溶解冷卻至室溫後，加350|il的10%APS和35pl的TEMED，搖勻後開始灌膠。3)將膠液快速倒在長玻璃板上，短玻璃板置長玻璃板上水平推動膠液，使膠液流動充滿兩塊玻板，避免j^^^m:灌好膠後，將鯊魚齒梳反向插入膠板之間封口，注意封膠梳插入的深度(約6mm左右)。用六個燕尾夾將兩塊玻璃板一起固定住。灌好的膠室溫聚合約2小時待用。C:預電泳、上樣和電泳1)凝膠聚合後將梳子取出，用水衝洗膠板去除多餘的凝膠碎片，用純水將加樣槽衝洗乾淨。將膠板加到電泳槽上，短板向裡，向下壓緊海綿墊，將四個螺旋鈕扭緊固定住膠板，關閉上槽電極液排放開關。在上槽倒入適量電極液(lxTBE)沒過短板，在下電泳槽中倒人適量電極液，將梳子用純水衝洗乾淨插入加樣槽中(梳子尖插入凝膠約12mm)，關閉上下電泳槽蓋，接通電流，預電泳約l小時，使凝膠溫度達到5(TC左右。2)將PCR管做好標記，每管加入3.(^1的2x加樣緩衝液(2xloadingsolution),然後分別加入3.0^1擴增好的樣品(包括待檢樣本和標準細胞株GM9947A)及等位基因分型標準物，混勻後放入PE9600型擴增儀中95°C變性10分鐘，取出後立即放入冰浴中，準備上樣。3)結束預電泳後，用5ml吸管吹打加樣槽，去除氣泡。然後取3.0|_il製備好的樣品加到鯊魚齒梳子中，加樣過程應避免產生氣泡並儘可能減少加樣時間。4)樣品加完後，立即接通電流，40W恆功率進行電泳。電泳時間根據不同擴增產物大小而定，大約2小時到4小時(具體電泳時間可參考染料移動的位置確定)。4、凝膠的銀染及顯色1)電泳結束後，取出膠板，將梳子取出，用適當的工具將兩玻璃板分開，將粘有膠的長板放入水平搖床上的染色盤中。2)向染色盤中加入1000ml固定液(10%乙酸)，沒過凝膠，室溫搖動20分鐘。將固定液倒出並回收，加入純水，沒過凝膠洗三次，每次2-5分鐘。3)加人1000ml染色液，室溫下避光搖動30分鐘。將染色液倒出，加入純水，10秒鐘後將膠板取出，用純水衝洗膠板的背面，倒掉純水，將膠板重新放入染色盤中。4)加入1000ml顯色液(預冷至41(TC)，用肉眼進行觀察，直到電泳條帶清晰後，倒去顯色液，加入1000ml停顯液(10%乙酸)，IO分鐘後取出膠板，晾乾，放在X光觀片燈上觀察並記錄結果，用掃描儀將結果保存到計算機中。5.等位基因分型標準物的製備利用基因克隆(Clone)方法製備包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產物分別與T-載體(pGEM—T)進行連接反應。2)連接反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a。3)塗布在氨苄青黴素瓊脂平板(60ug/ml)上，過夜培養。4)挑菌，大搖，提取質粒DNA，備用。5)以質粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑑定。注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大小。6)確定片段大小後大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。本發明選用的10個Y-STR基因位點，採用PCR擴增樣本DNA，擴增產物使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，銀染顯色技術，結合等位基因分型標準物進行標準化分型，所需儀器和設備簡單，操作方便，適合在基層單位普及，對於中國目前的情況有良好的推廣應用效果。本發明填補了國內沒有實用化的Y-STR檢測技術和方案的空白，申請人己應用該發明所述的10個Y-STR基因位點在中國多個民族遺傳多態性研究中獲得滿意結果，利用這種技術製備的Y染色體短串聯重複序列分型試劑盒，可進行商業化生產並推廣，為國內各實驗室及研究機構使用該技術提供標準化的技術和方案，同時克服了使用國外試劑盒無法反映中國多民族遺傳特點的缺陷。權利要求1.一種新的10個Y染色體STR基因位點，其特徵在於，該10個Y染色體STR基因位點分別為DYS459、DYS456、DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392；上述STR基因位點，除DYS392位點的核心重複序列是三核苷酸，DYS438位點的核心重複序列是五核苷酸外，其餘位點的核心重複序列均是四核苷酸。其中，擴增片段最小的是DYS459位點，片段長度為140-152bp，擴增片段最大的位點是DYS389II，片段長度為359-383bp，所有位點片段長度均適宜PCR擴增。2.權利要求1所述的新的10個Y染色體STR基因位點的分型方法，其特徵在於，包括下列步驟採用PCR分別擴增10個Y染色體STR基因位點的DNA，並設計位點的上下遊引物序列，將上下遊引物稀釋成100uMOL/L，作為母液，取出lOyl稀釋到5uM0L/L，作為工作液；PCR擴增體系的體積為20pL，含1X反應緩衝液，1.5mM0L/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。PCR擴增參數為94"C預變性3min，94"C變性lmin，根據位點的不同復性溫度進行30秒、72'C延伸lmin，共計30個循環，最後72。C延伸15min;擴增產物使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，採用銀染顯色方法，結合等位基因分型標準物進行標準化分型。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的等位基因分型標準物的製備包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產物分別與載體pGEM—T進行連接反應。2)連接反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a;3)塗布在氨苄青黴素瓊脂平板上，過夜培養；4)挑菌，大搖，提取質粒DNA，備用；5)以質粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑑定；注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大小；6)確定片段大小後大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。全文摘要本發明公開了一種新的10個Y染色體STR基因位點及其分型方法，用聚丙烯醯胺凝膠電泳分型，結合銀染顯色方法篩選出可應用於法醫學等領域的10個Y染色體STR位點，並製備了各位點等位基因分型標準物(AllelicLadder)，對Y染色體STR位點的PCR引物和擴增條件進行了優化，其中對PCR引物和擴增條件的優化和等位基因分型標準物的製備，可以做到標準化和簡單化並適合基層單位普及。可應用於法醫學、人類學、遺傳學和疾病等領域的個體識別、親子鑑定以及基因診斷等方面，具有廣泛的應用前景。特別適用於法醫學實踐中父方缺失(如去世或失蹤)情況下的親權鑑定和強(輪)奸案中混合斑的個體認定，對患有無精症或少精症的犯罪嫌疑人的認定更具獨到之處。文檔編號C12N15/12GK101225386SQ200810017379公開日2008年7月23日申請日期2008年1月22日優先權日2008年1月22日發明者李生斌,麗楊,沈春梅,賴江華,駿馬申請人:西安交通大學