油菜轉基因的方法

2023-09-19 22:49:10 2

專利名稱：油菜轉基因的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，涉及一種油菜轉基因的方法，該方法適用於所有的油菜品種、品系或種質資源材料。
背景技術：
植物基因轉化技術通過各種不同的轉化系統，把從動物、微生物或植物中分離到的目的基因(外源基因)，通過各種方法轉移到受體植物的基因組上，使得外源基因在受體植物中穩定遺傳，並賦予植物新的農藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等。
油菜(籽用油菜)是重要的油源植物和飼用蛋白源，是我國主要的油料作物。利用生物工程和轉基因的手段進行品種改良和遺傳學研究是油菜基因工程的重要內容。自1985年獲得第一例轉基因甘藍型油菜以來(Ooms G，Bains A，BurrellM，et al.Genetic manipulation in cultivars of oilseed rape(Brassicanapus)using Agrobacterium.Theor Appl Genet，1985，71325-329)，油菜的遺傳轉化方法得到很多改進(潘剛，周永明。2003.甘藍型油菜遺傳轉化的研究進展。中國油料作物學報，25(3)90-98)。
油菜的轉化方法可以分為基於組織培養的遺傳轉化和非組織培養的遺傳轉化。
基於組織培養的遺傳轉化是以外植體為轉基因受體。這些外植體包括下胚軸、子葉柄、莖段、原生質體、小孢子等。這些受體接受外源DNA後都要經過組織培養和植株再生過程，受到植物種類、基因型、外植體類型、培養條件等很多因素的影響。再生過程需要無菌環境、人工光照和控制溫/溼度等培養條件，實驗重複性差。遺傳轉化的成本高、周期長、工作量大、效率低。
最早Ooms等(Ooms G，Bains A，Burrell M，et al.Genetic manipulationin cultivars of oilseed rape(Brassica napus)using Agrobacterium.TheorAppl Genet，1985，71325-329)和Fry(Fry J，Brarnason A，Horsh R B.Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens basedvectors.Plant Cell Rep，1987，6321-325)分別用無菌苗的莖段和花莖建立了根癌農桿菌介導轉化體系，但轉化率不高。1989年Moloney等首次利用甘藍型春油菜品種「westar」的子葉柄建立了高效的根癌農桿菌介導轉化體系，轉化效率達到55％(Moloney，M.M.，J.M.Walker and K.K.Sharma.1989.Highefficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors.Plant Cell Rep.8238-242)。隨後各國科研工作者都以這個體系為標準，但都沒能重複出相同的高頻轉化率。實踐證明「westar」的確易於轉化，但Moloney等的轉化體系的重複性低(郭學蘭，王漢中。甘藍型油菜細胞質雄性不育恢復系轉基因體系的研究，中國油料作物學報，1999，21(3)1-5)。
下胚軸也是常用的甘藍型油菜轉化受體。目前被廣泛使用的下胚軸轉化程序主要根據De Block等人(De Block M，De Brouwer D，Tenning P.Transformationof Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciensand the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants.PlantPhysiol，1989，91694-701)建立的方法。但是這類方法也存在一定的缺限下胚軸一般很難從切口處直接再生出不定芽，必須經過愈傷組織階段的誘導。冬油菜的遺傳轉化還存在外植體褐化的問題，嚴重影響再生和轉化。
原生質體的轉化是針對單個的植物細胞，而不是多細胞的組織和器官，可以避免產生嵌合體。1994年程振東等利用PEG的方法將GUS基因導入甘藍型油菜栽培品種「雲北二號」的原生質體中(程振東，衛志明，許智宏。1994.用PEG法把外源基因導入甘藍型油菜原生質體再生轉基因植株。實驗生物學報，37(3)341-351)。但是這種轉化方法受到諸多因素的影響，如PEG的pH值、原生質體的懸浮液組份、外源DNA加入的時間、抗生素篩選的時間以及轉化品種基因型和原生質體再生能力等。轉化處理會使原生質體受到傷害，因而大大降低細胞分裂的速度。實驗的重複性較差，效率低。
分離的小孢子也可以用來作為外源DNA的導入受體(陳軍，王蘭嵐，劉澄清，方榮祥，宋桂英，徐正平，劉貴珍，張麗華，陳正華。用雷射微束穿刺法轉化甘藍型油菜小孢子的研究。雷射生物學報1998，7(2)103-107)。實驗發現，微束雷射穿刺過程中蔗糖濃度降低後影響小孢子的活力，且從微束雷射穿刺到進入32℃培養需要時間超過2小時，對培養造成不利影響。微束雷射處理已經分裂的小孢子胚，轉化率也只有1％.這種轉化體系不僅要求油菜品種的小孢子有高的胚狀體成胚率，即存在嚴重的基因型依賴，而且還有其它諸多不利因素會導致再生頻率及轉化頻率降低。根癌農桿菌介導的小孢子轉化(王新發，王漢中，劉貴華，胡贊民，鄭元本。2005.導入雙價基因的轉基因雜交油菜親本及其對菌核病抗性的研究。植物學通報，22(3)292-301)無需高精設備，但是農桿菌與小孢子的共培時間難以掌握，小孢子容易發生聚集，不利於成胚，轉化效率低。胚誘導的培養和篩選過程中需要使用抗生素，也對小孢子胚的生長不利。況且小孢子培養只有在花期才能進行，周期長，當年無法得到轉基因種子。轉基因植株小苗的移栽、春化、越夏和結實都需要人工控制溫/溼度，消耗大量電力和人力。
綜上所述，基於組織培養的甘藍型油菜遺傳轉化，主要是以根癌農桿菌作為生物媒介介導外源DNA的轉化。這類轉化方法利用萌發4～12天的子葉柄和下胚軸，或者幼嫩組織的原生質體，或游離小孢子，與帶有雙元載體的根癌農桿菌共培，然後篩選能夠表達報告基因(多為抗生素抗性基因)的再生器官或者胚狀體。在共培後的再生過程中需要不斷抑制農桿菌的生長，結果使得再生效率大大下降。另外，外植體的基因型、發育時期、對農桿菌的敏感程度、再生的條件和頻率都會影響轉基因效率。從收集外植體到獲得轉化植株需要的周期很長，而且要求根癌農桿菌有較高的活力，要求嚴格的無菌操作、適合轉化和再生的培養基、在培養基中添加抗生素、合適的人工氣候室與培養條件，需要不斷地更換新鮮的培養基等等，實驗過程繁瑣複雜，對操作人員的熟練程度有很高的要求，周期也非常長。實踐中還會遇到組織培養苗難以越夏、需要先滿足春化過程才能開花結實等問題。
除此之外也有物理化學媒介介導的遺傳轉化，如微束雷射法(陳軍，王蘭嵐，劉澄清，方榮祥，宋桂英，徐正平，劉貴珍，張麗華，陳正華。用雷射微束穿刺法轉化甘藍型油菜小孢子的研究。雷射生物學報1998，7(2)103-107)、PEG法、電激法(Jardinaud M F，Sourvre A，Alibert G.Transient GUS geneexpression in Brassica napus electroporated microspores.Plant Sci，1993，93177-184)、基因槍法(Nehlin L，Mollers C，Bergman P，et al.Transient beta-gus and gfp gene expression and viability analysis ofmicroptojectile bombarded microsprose of Brassicanapus L.Plant Physiol.，2000，156(2)175-183)和顯微注射法(Nehaus G，Spangeberg G，Scheid O M，et al.Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNAinto microspore-derived embryoids.Theor Appl Genet，1987，75(1)30-36)等方法。這一類方法共同的特點是，要求實現建立起一套高效的外植體(尤其是原生質體)再生系統；各種介質對外植體的再生率有嚴重的不利影響，轉化頻率低，不易重複、周期比較長。從原生質體再生的無性系植株變異比較大。實驗還要求有相應的設備條件，如人工生長室，基因槍、顯微注射儀、雷射器和倒置顯微鏡(雷射微束系統)、電轉化儀等。
非組織培養的遺傳轉化方法，例如種質系統轉化法，則無需建立外植體再生系統。這一類方法以生殖器官或細胞為受體，直接利用植物受體本身的有性生殖過程或者種子發育過程，既免除了離體再生的組織培養，又縮短了獲得可遺傳轉基因種子的時間(王關林，方宏筠主編。2002。植物基因工程，北京，科學出版社350)。近年來這類方法發展很快，其特點可以概括為1、由於具有全能性的生殖細胞能直接為受體細胞，因此具有更強的接收外源DNA的潛能，一旦將外源基因導入這些細胞，猶如正常的受精過程會很容易地遺傳給後代；2、避免了外植體再生系統中存在的基因型依賴問題；3、利用植物自身的授粉過程操作方便、簡單，將現代的分子育種與常規育種緊密結合，因此應用潛力大；4、利用該受體系統進行轉化，只需要在植物本身的生長季節裡開展轉化，無需一年四季地投入工作精力，非常適合於對光溫條件較為敏感的當地優良作物品種。
種質系統轉化法主要包括花粉管通道法、子房和幼胚注射法、種子浸泡、花粉粒浸泡法等(王關林，方宏筠主編。2002。植物基因工程，北京，科學出版社481-496)。但從目前研究進展來看，這些方法都有轉化率低、結實率低等缺點。
在授精和胚胎發育初期是植物接受遠緣遺傳物質的敏感時期，在植物授粉後通過花粉管通道法或子房注射法將外源DNA(目的基因)引入胚囊，外源DNA(目的基因)就會進入尚不具備正常細胞壁的配子、合子或早期胚胎細胞，並整合到基因組中(周光宇，龔蓁蓁，王自芬。遠緣雜交的分子基礎-DNA片段假說的一個論證。遺傳學報，1979，6(4)405-413)。運用這個原理和技術，鄧德旺等(鄧德旺，郭三堆，楊志民。棉花花粉管通道法轉基因的分子細胞學機理研究，雲南大學學報，1999，s3，124-125)，採用雷射共聚焦顯微技術驗證了棉花花粉管通道的可行性外源DNA經過棉花胎座上部傳輸組織進入胚囊，直接轉化處於融合期的無壁生殖細胞。但是轉化操作對幼鈴的大小有很高的要求，對子房的注射嚴重影響幼鈴的生長，落鈴率在一半以上(林棲鳳主編。2004.植物分子育種。北京，科學出版社189-192)。
花粉管通道法在大豆中也有成功報導(崔巖等，2003，提高大豆花粉管通道技術的轉化率研究。大豆科學，22(3)75-77)和相應專利(99123707，劉德璞，等，大豆花粉管通道轉基因及其品種改良技術)。但是這種轉基因方法不易掌握最佳的轉化時機，轉化操作對子房造成傷害，減少結實率。在其它作物中，如小麥(令利軍，倪建福，張正英。花粉管通道轉基因技術及其在小麥分子育種中的作用。分子植物育種，2004，2(3)407-412)、水稻(王才林，趙凌，宗壽餘，龔蓁蓁等。2005.生物技術通報，258)、玉米(專利01113922，授權日2004年12月15日)、番茄(專利98121507，授權日2003年7月23日)，也有花粉管通道法轉基因成功的報導。
甘藍型油菜的種質系統轉化法也是運用花粉管作為外源DNA的通道。梁明山等(梁明山，吳書惠，潘駿玲。1994.外源DNA導入油菜的研究。西南農業學報，7(4)37-42)用消毒刀片切去授粉後24小時柱頭的三分之一，然後在花柱中央顯微注射外源DNA溶液10微升。處理花朵100朵，得到250粒種子，相當於平均每朵花(角果)僅得到2粒種子。轉化操作顯然極大地影響了結實率。這是這種方法體系的缺點之一。
子房注射法也被用於油菜基因轉化。林良斌等以甘藍型油菜湘油13號為試驗材料，將Bt殺蟲蛋白基因導入油菜，在授粉後第20～30小時注射子房中部(林良斌，官春雲，李恂，周小雲，何業華。2000.子房注射法與農桿菌介導法轉化甘藍型油菜的比較研究。生命科學研究，4(3)231-236)。處理25個子房，得到86粒轉基因種子。子房注射對油菜這樣的小花植物傷害很大，而且由於子房小，操作非常不方便。
原位(in planta)轉化和農桿菌浸泡侵染也被用於油菜的轉化(徐光碩，饒勇強，陳雁，張椿雨，孟金陵。用in planta方法轉化甘藍型油菜。作物學報，2004，30(1)1-5)。在一定條件下，用根癌農桿菌菌液浸染甘藍型油菜花序，共收穫約100,000粒受處理的種子，平均轉化效率0.1％左右。實驗獲得大量的種子，因而篩選工作量非常大。由於存留卡那黴素在植株體內而使許多轉基因植株在經卡那黴素篩選移植後死亡，同時由於需要在培養基上用抗生素篩選轉基因植株，然後移栽到田間或者花盆裡，存在操作難度，造成植株死亡。由此可見，合適的篩選標記也是建立高通量轉化體系的關鍵。另外以抗生素為標記的轉基因篩選體系容易產生假陽性的問題(程振東，衛志明。1994.根癌農桿菌對甘藍型油菜的轉化及轉基因植的再生。Acta Botanica Sinica(植物學報英文版)，36(9)657-663)。
以除草劑抗性為篩選標記則不存在這樣的問題。模式植物擬南芥的大規模轉基因方法-Floral-dip法(Clough S and Bent A.Floral dipasimplifiedmetjjodforAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana 1998)和Floral-spray(Chung M，chen M，Pan S.，Floralspray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenicplants 2000)就是利用了除草劑抗性基因bar作為篩選基因，通過對生長2～3周的幼苗噴施除草劑，獲得大量轉基因幼苗，假陽性的植株出現率極低。
綜上所述，不管是基於組織培養的遺傳轉化法，還是非組織培養的轉化法，不管是否需要農桿菌的介導，都存在著轉化效率低、基因型依賴嚴重、從轉化到收穫轉基因種子的周期長、受生長季節的限制、工作量大、操作複雜等缺點中的一項或幾項。長期以來，油菜轉化主要依賴根癌農桿菌介導的轉化方法，該方法依賴於組織培養和抗生素篩選，同樣存在著基因型依賴強，工作量大，轉化效率低的問題，而現有的其它物種中採用的花粉管通道法又存在結實率、抗生素篩選標記、工作量大、容易造成植株死亡等問題。目前還沒有一種油菜轉基因方法實現了高通量、高效率、低成本轉化並解決基因型依賴問題。隨著擬南芥和水稻模式植物基因組序列測定，多種作物的功能基因組研究陸續展開，快速得到大量轉基因插入油菜突變體群體成為一項迫切的任務。本發明提供的轉化體系有望解決限制油菜突變體庫建立的技術瓶頸，並且這種轉化技術也是高通量、高效率轉基因育種的必備條件。發明人為了實現高通量、高效率的油菜基因轉化，發明了油菜轉基因技術。本發明採用柱頭點滴的方法進行油菜的基因轉化，將帶有除草劑抗性基因的外源DNA直接導入油菜配子或合子中。該方法組合了生殖細胞為受體的種質轉化系統的優點和油菜授粉特點，獲得抗除草劑的轉基因種子，平均轉化率2.7％。

發明內容
本發明的目的是在於提供一種油菜轉基因的方法，解決目前常用的油菜遺傳轉化方法中轉化效率低，通量小，依賴組織培養和基因型等問題，該方法不僅轉化效率高、成本低、不存在基因型依賴，而且避免了轉化操作過程中的組培工作，避免了轉基因植株繁殖中的春化和越夏問題。
本發明的技術解決方案是以原位生殖器官(包含花粉管，受精前後的配子和合子)為轉基因受體，先對油菜授粉後的花柱和子房進行細胞學觀察，確定遺傳轉化的操作時間；在該時間內對油菜進行遺傳轉化操作，即在油菜授粉後的2～12小時，削去部分柱頭並滴加外源DNA溶液，使外源目標基因和草胺膦抗性基因(bar)為標記基因的DNA對生殖細胞進行轉化，進而通過自然生長發育，獲得轉基因的T1代種子。這一轉基因方法，可以適用於所有開花結實的油菜品種或品系或種質資源材料。在T1代幼苗早期用低濃度(0.01％~0.5％)的除草劑草胺膦進行噴灑篩選，直接得到轉基因陽性油菜植株。對於不同的油菜品種轉基因的效率在2％～10％。下面分四個步驟對本發明的內容進行詳細說明。
一、觀察受精後花粉管伸長過程以確定最佳外源DNA導入時間在田間或在人工生長室播種油菜，按照正常的栽培管理措施培育油菜。在花期套袋，每隔一小時取授粉後的油菜子房用顯微鏡觀察花粉管伸長和伸長進程，以確定最佳的外源DNA導入時間。
其步驟如下1.花蕾選擇開花期選擇油菜主花序或發育良好的側枝花序，摘除頂部未開放的小花蕾和下部角果及已經開放的花，留下大小適當和即將開放的花蕾用作去雄和轉化。
2.花粉的準備選擇上述處理的單株的一個分枝花序或在同一品種不同單株上(或雄性不育系的保持系)選擇花序，從花序上端向下套上硫酸紙袋或其它油菜自交用的袋子。袋子下端用回形針別住或其它方法封住。防止蜜蜂傳粉，也防止被風吹開或者吹掉。
3.人工去雄用濃度為70％的酒精(乙醇)擦拭尖嘴鉗和手指尖，小心撥開步驟1中花序的花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，不要傷及雌蕊，去除雄蕊。再套上硫酸紙袋，下端用回形針別住。在花序的下部掛上標牌，註明品種和去雄的日期。雄性不育材料則不用去雄。
4.人工授粉人工去雄的第二天上午，打開步驟2(「花粉的準備」)中所套袋子，用鑷子夾取處於散粉狀態的花葯，之後套上原先的袋子。將取下的花朵中花葯點在步驟3(「人工去雄」)的柱頭上，進行授粉，之後套上原先的袋子。
5.採樣從人工授粉後的0.5小時開始，每隔1小時摘取授粉後的子房10枚。一直到授粉後48小時。
6.子房樣品的固定取授粉後不同時期的子房，投入FAA固定液中，在1.5毫升的帶蓋小離心管中室溫(20～25℃)下固定12～48小時。
7.復水取出固定後的樣品依次投入0.8毫升體積的濃度為60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸餾水四種溶液中各浸泡15分鐘。
8.軟化倒掉步驟7的蒸餾水，加0.8毫升的軟化劑即濃度為6摩爾/升(mol/L)的氫氧化鈉(NaOH)溶液淹沒樣品，處理36小時。
9.染色倒掉6mol/L的NaOH溶液，在離心管中加入1毫升蒸餾水漂洗5分鐘，倒掉蒸餾水；再加1毫升蒸餾水漂洗5分鐘，倒掉並吸乾所有水分，在濃度為0.1％苯胺藍染色液中染色1～6小時。
10.壓片用鑷子輕輕的將染色後的子房樣品取出，放在已經事先滴加1滴0.1％苯胺藍染色液的載玻片上。從一側小心蓋上蓋玻片，用拇指輕壓蓋玻片，壓扁子房和柱頭。
11.螢光顯微鏡觀察將壓片好的玻片放在螢光顯微鏡的載物臺上，在可見光下進行聚焦，直到在顯微鏡中能清晰的看到柱頭和子房。用紫外光激發樣品，觀察發亮藍色螢光的花粉管(以沒有授粉的子房作為對照)。萌發的花粉粒和花粉管產生大量胼胝質，在紫外光激發下，能夠發出亮藍色的螢光，很容易與灰藍色的雌性器官組織(柱頭、花柱、子房)區分開來。沒有授粉的柱頭和花柱不會有亮藍色螢光。
所用試劑配方如下FAA固定液(100毫升)取90毫升濃度為50％或70％的酒精，加入5毫升甲醛和5毫升冰醋酸混合均勻。
60％酒精(100毫升)取40毫升蒸餾水加入60毫升無水酒精混勻。
45％酒精(100毫升)取55毫升蒸餾水加入45毫升無水酒精混勻。
20％酒精(100毫升)取80毫升蒸餾水加入20毫升無水酒精混勻。
軟化劑6mol/L的氫氧化鈉(NaOH)稱取24克氫氧化鈉固體顆粒，溶解在80毫升蒸餾水中，待完全溶解後，將溶液定容在100毫升。
0.1％苯胺藍染色液稱取0.1克苯胺藍粉末，溶於100毫升0.14mol/L的K2HPO4(pH8.2)中，攪拌使之完全溶解；其中0.14mol/L(摩爾每升)K2HPO4(磷酸氫二鉀)(pH8.2)配製方法為在100毫升水中加入2.44克K2HPO4，完全溶解後用濃NaOH調節pH值到8.2.
二、外源DNA(質粒pGreen0229)的抽提和酶切待轉化的外源DNA或基因需構建在一個適當的植物表達載體上。在本發明陳述的程序中，待轉化的外源DNA是除草劑草胺膦抗性基因(bar)，構建在質粒pGreen0229植物表達載體上(帶有質粒pGreen0229的大腸桿菌菌株DH5α已經商業化)。質粒pGreen0229的核苷酸序列和限制性內切酶酶切圖譜參見附圖1和http//www.pgreen.ac.uk/jit/pG0229.htm。
待轉化的外源DNA可以為其它基因，如各種植物病原菌抗性基因、作物優良品質和產量相關基因等。這些基因需要與篩選標記基因如bar基因連一起，然後通過基因工程手段構建到適當的質粒載體中。本發明陳述的程序中，bar基因插入在質粒pGreen0229的多克隆位點上(附圖1)。
(一)、外源DNA質粒的抽提步驟如下1.吸取500微升帶有質粒pGreen0229的大腸桿菌DH5α菌液，接入盛有500毫升LB培養基的三角瓶中，37℃恆溫搖床上培養，轉速200轉/分鐘。培養16小時，培養基變得渾濁。
2.質粒pGreen0229的抽提(1)將步驟1中變渾濁的培養基分裝到4支50毫升帶蓋離心管中，4℃下8000轉/分鐘離心5分鐘，倒掉上清液收集菌體。
(2)將收集的菌體用STE溶液重懸，並轉入2毫升離心管，每支離心管裝1.5～1.8毫升重懸菌液。4℃下8000轉/分鐘離心5分鐘，倒掉上清液收集菌體。
(3)用SDS-鹼裂解法抽提菌液中的質粒DNA。在離心管中加入200微升溶液I，室溫(20～25℃)下在渦旋儀上渦旋直到菌體充分散開；接著在室溫(20～25度)加入新配置的400微升溶液II，顛倒離心管混勻，待溶液變得清亮後加入預冷的300微升溶液III，顛倒混勻；放在碎冰中，0℃放置3～5分鐘。
(4)將離心管在4℃下10,000轉/分鐘離心10分鐘，小心吸取上清液於新的2毫升離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，顛倒離心管混勻溶液，室溫(20～25度)放置5分鐘，然後室溫(20～25度)離心15分鐘，轉速10,000轉/分鐘，小心吸取上清液於新的2毫升離心管中。
(5)加入600微升異丙醇，顛倒混勻溶液，室溫(20～25度)離心15分鐘，轉速10,000轉/分鐘，倒掉上清液。用250微升50TE溶液(含有RNA酶即牛胰核糖核酸酶A，濃度為20毫克/升)溶解質粒沉澱並在水浴鍋中37℃水浴1小時。
(6)加入625微升無水乙醇和25微升3mol/L乙酸鈉溶液，顛倒混勻溶液，室溫(20～25度)放置5分鐘，將質粒再沉澱。室溫(20～25℃)下離心5分鐘，轉速10,000轉/分鐘，倒掉上清液。加入1毫升濃度為70％的酒精，上下顛倒10～15次，室溫(20～25度)離心2分鐘，轉速10,000轉/分鐘，倒掉上清液，室溫(20～25度)放置15分鐘使酒精完全揮發。將再沉澱的質粒溶解於250微升0.1～1倍的SSC溶液中。
(二)、質粒溶液的電泳檢測和定量在濃度為0.8％的瓊脂糖膠(即1×TAE緩衝液)中電泳，測定質粒濃度。單酶切(Bgl II)和雙酶切(Bgl II和BspH I)的質粒片段在濃度為1％的瓊脂糖膠(1×TAE緩衝液)中電泳。其方法如下1.瓊脂糖凝膠的製備0.8％或者1％的瓊脂糖(1×TAE緩衝液為溶劑)置於三角瓶中，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置於微波爐中以中火加熱5分鐘至瓊脂糖溶解。
2.膠板的製備取有機玻璃內槽，洗淨、晾乾；取紙膠條，將有機玻璃內槽置於一水平放置的模具上，放好梳子。倒入冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，使膠液緩慢地展開直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫(20～25度)靜置30分鐘左右，待膠凝固完全後，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠後將鋪膠的有機玻璃內槽放在含有1×TAE緩衝液的電泳槽中使用。
3.加樣用微量加樣器將質粒溶液或其酶切產物樣品(各2微升，事先與1微升6×上樣緩衝液混勻)分別加入至膠板的樣品孔內。每加完一個樣品，換一個吸頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約15～20微升。在第一個上樣孔或最後一個上樣孔內加入5微升的分子量標記(如DL2000DNA，濃度為50ng/ul)。
4.電泳加完樣後的凝膠板即可通電進行電泳；建議在80～100V的電壓下電泳；當上樣緩衝液中的溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1釐米處停止電泳；將凝膠放入溴化乙錠工作液(0.5ug/ml左右)中染色約20分鐘。為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不應高於5V/cm(伏特/釐米)(兩電極間的距離)。
5.觀察與拍照在紫外燈(310nm波長)下觀察染色後的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的螢光條帶。在紫外燈下觀察時，應戴上防護眼鏡或有機玻璃防護面罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。採用快速凝膠成像系統拍照電泳圖譜。
6.用0.1～1×SSC溶液調整外源DNA質粒濃度達到50～500ng/μL.4℃冷藏質粒溶液備用。
所用試劑配方如下(1)LB培養基分別稱取10克胰蛋白腖，5克酵母提取物和10克氯化鈉依次溶解於蒸餾水中，定容於1000毫升。分裝於500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高壓消毒15分鐘。加入無菌的卡那黴素溶液，使得終濃度為50毫克每升。4℃冷藏備用。
(2)STE溶液用移液器分別吸取下列溶液1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)1毫升3mol/L氯化鈉(NaCl)溶液3.3毫升0.5mol/L 乙二酸四乙胺二鈉鹽(EDTA，pH8.0)200微升混勻並加蒸餾水至100毫升。
1mol/L Tris-Cl(pH8.0)配製方法為用800毫升蒸餾水溶解121.1克Tris鹼，加濃鹽酸42毫升，使溶液冷卻至室溫後，調整pH值到8.0，加水定容至1升。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
0.5mol/L EDTA(pH8.0)配製方法為用800毫升蒸餾水劇烈攪拌溶解186.1克二水乙二酸四乙胺二鈉(EDTA-Na·2H2O)。用NaOH調解溶液的pH值(約需要20克固體NaOH)，當pH值接近8.0時才會完全溶解。定容於1升。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
3mol/L氯化鈉(NaCl)溶液配製方法為用800毫升蒸餾水劇烈攪拌溶解292克NaCl，定容於1升。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，室溫貯存。
(3)50TE溶液用移液器分別吸取下列溶液1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 5毫升0.5mol/L 乙二酸四乙胺二鈉鹽(EDTA，pH8.0)2毫升加蒸餾水至100毫升。
其中1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二鈉鹽)(pH8.0)的配製方法與所用試劑配方(2)中描述的相同。
(4)溶液I50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液I可成批配製，每瓶約100毫升，分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
其中1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二鈉鹽)(pH8.0)的配製方法與所用試劑配方(2)中描述的相同。
(5)溶液II0.2mol/L NaOH(臨用前吸取10mol/L NaOH貯存液20微升。10mol/L NaOH貯存液的配製方法為稱取40克固體NaOH(氫氧化鈉)溶於100毫升蒸餾水中。)1％SDS(臨用前吸取20％SDS貯存液50微升)定容於1毫升。
(6)溶液III60毫升5mol/L醋酸鉀，5毫升冰醋酸，28.5毫升蒸餾水。
(7)氯仿/異戊醇(24∶1)在24毫升氯仿中加入1毫升異戊醇，混勻後棕色瓶4℃冰箱貯存。
(8)RNA酶(牛胰核糖核酸酶A)稱取25mg的RNase A，在25毫升的緩衝液中(1mmol/L Tris-HCl 250微升，1.5mmol/L NaCl 75微升，雙蒸水25ml)溶解，然後用100度煮沸15分鐘，緩慢冷卻至室溫並分裝為100ul/管，-20度凍存。
(9)SSC溶液在800毫升蒸餾水中溶解175.3克Nacl和88.2克檸檬酸鈉，加入數滴10mol/LNaOH調pH至7.0，加水至1000毫升，配製成20×SSC溶液。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。使用前用高壓滅菌的蒸餾水稀釋成0.1～1×SSC溶液。
(10)1×TAE緩衝液2mol/L Tris鹼，1mol/L乙酸，100mmol/L EDTA
先配製成5×TAE緩衝液稱取242克Tris鹼溶於500毫升蒸餾水中，加入57.1毫升冰乙酸(17.4mol/L)及200毫升0.5mol/L EDTA(pH8.0)混勻，補加蒸餾水至1000毫升，4℃冰箱貯存；使用時用蒸餾水稀釋5倍，配成1×TAE緩衝液。
其中0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二鈉鹽)(pH8.0)的配製方法與所用試劑配方(2)中描述的相同。
(11)0.8％瓊脂糖膠稱取0.4克瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50毫升1×TAE緩衝液。
(12)1％瓊脂糖膠稱取0.5克瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50毫升1×TAE緩衝液。
(13)6×上樣緩衝液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖即稱取0.25克溴酚蘭，40克蔗糖，分別溶解，定容於100毫升蒸餾水中。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
三、油菜的轉化油菜播種于田間(隔離的)或人工生長室中，按照正常的栽培管理措施，在開花期，選擇晴朗的天氣(生長室內則不受此限制)，人工剝蕾去雄。選擇已有幾朵開花的花序，打掉花序的頂端的小花蕾，去掉角果和已經開放的花朵，留下未開放花蕾，每花序留10～15個，人工剝蕾去雄，雄性不育系則不需人工去雄。之後套上大小合適的雜交用袋子(如硫酸紙袋)。同時選取另外的花序，打掉已開放的花朵，套袋，為次日授粉提供開放的花朵和散粉的雄蕊。在花序下方的花序軸上掛牌，註明剝蕾的日期和材料代號。其中花蕾選擇、花粉準備、人工去雄的方法與發明內容一相同。
次日上午，從套袋後新開放的花朵上取花粉，授在人工剝蕾後的柱頭上，油菜授粉後套袋。人工授粉的方法與發明內容一相同。同日下午，油菜授粉後2～12小時進行遺傳轉化操作，用鋒利的手術刀切掉授過粉的柱頭，立即用微量移液器在切口上滴加1～3微升外源DNA溶液(發明內容二中抽提出的質粒溶液)，套袋，花序的牌子上附加註明所轉化的外源DNA代號等信息。如果遇到雨天則不滴加外源DNA溶液，但要掛牌註明已授粉。在轉化和套袋5～14天後取下袋子，待角果自然成熟後收穫種子。
四、轉基因後代的篩選和種植1.轉基因植株篩選在本發明陳述中使用除草劑抗性基因，以篩選轉基因植株，但本發明不限於用除草劑抗性基因。
將發明內容三中收穫的種子倒在乾淨的幹平皿上，選取未破裂完整的種子並計數。每1000顆種子為一份。同時選取來自拜爾公司的抗除草劑油菜種子為陽性對照種子，未轉基因的油菜種子為陰性對照種子。取乾淨的大平皿(直徑15cm)，鋪上潔淨的濾紙，並用雙蒸水溼潤濾紙，將一份種子均勻分散在濾紙上，在生長箱中以18～25℃，光照16小時，黑暗8小時的條件催芽。出芽後將其點種在裝有中性花土的塑料盒中。大約在催芽後的3～4天、絕大部分苗的子葉展開，真葉開始顯露時，噴除草劑。除草劑草胺膦的濃度為0.01％～0.5％。用噴霧瓶將除草劑均勻噴灑到葉子上，除草劑第一次噴灑後5～12天再噴灑一次。每次噴施之後用剪刀剪除已經變黃枯萎的幼苗，和轉基因陽性對照一樣仍能夠保持子葉綠色並繼續生長的幼苗是轉基因植株。待綠苗長到3～5片葉後小心地移栽到溫室或帶土營養缽中。
2.PCR檢測的快速DNA抽提方法如下在抗除草劑的轉基因油菜植株上採集葉片一小片，放入1.5毫升離心管中，加入400微升DNA抽提緩衝液(200mM Tris-Hcl(pH8.0)，250mM NaCl，25mMEDTA(pH8.0)，0.5％ SDS)，用電動勻漿器勻漿20～30秒。隨後在臺式離心機上4℃以13000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，將上清液轉入到乾淨的1.5毫升離心管中。在此離心管中加入等體積預冷的異丙醇並輕輕顛倒混勻，在室溫(20～25度)下靜置2～3分鐘。最後在臺式離心機上，室溫下以12000轉/分鐘的速度離心5分鐘。棄去上清，20～25度開蓋放置15分鐘左右使異丙醇揮發，加30微升無菌雙蒸水溶解DNA沉澱，-20℃保存待用。
DNA抽提緩衝液的配製(100毫升)稱取2.42克Tris鹼，0.093克EDTA-Na2·H2O，1克NaCl和0.5克SDS粉末加雙蒸水混勻，用濃HCl調整pH至8.0，最後用蒸餾水定容至100毫升。
3.外源DNA插入片段的PCR檢測本發明以除草劑抗性基因bar為例，但不限於除草劑抗性基因。
(1)根據除草劑抗性基因bar核苷酸序列，設計PCR引物，從植物總DNA中擴增bar基因片段。PCR擴增的陽性對照為發明內容二中抽提的質粒pGreen0229溶液。
(2)引物序列Bar15』GAA，GTC，CAG，CTG，CCA，GAA，AC；Bar25』AGT，CGA，CCG，TGT，ACG，TCT，CC。
在20微升(μl)PCR體系中分別加入去離子水 13.3μl，10×Buffer 2μl2.5mmol/L dNTP 0.5μl25mmol/L MgCl221.5μlTaq酶0.2μl(1單位)植物總DNA1μl(50～100ng)(3)在PCR儀上採用下列程序進行反應94℃ 5分鐘(min)1個循環→94℃ 30秒(sec)→55℃ 30sec→72℃ 1min，35個循環→72℃ 7min 1個循環→4～10℃維持數小時。
得到的產物在1.2％瓊脂糖電泳檢測(電泳方法如內容二中所述)，大小為284bp，結果如附圖4。
(4)1.2％瓊脂糖配製稱取0.6克瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50毫升1×TAE緩衝液，加熱溶解。
本發明的特點是通量高，而且成本低廉、工作量小、易操作、周期短、直接獲得轉基因種子、沒有基因型效應、避免了轉基因油菜種子繁殖中的春化和越夏問題、結實率高、篩選簡便。
本發明的優點主要體現在以下幾個方面1.本發明提供的油菜授粉後花粉管和子房的細胞學觀察方法，可以對不同的油菜品種的受精過程進行分析，確定油菜不同品種所特有的最佳處理時期以達到提高轉化效率的目的。
2.本發明提供的轉化方法效率高(在油菜花期每個工人可以處理數萬朵花、得到數千粒轉基因種子)、實現高通量基因轉化。
3.在本發明提供的油菜轉化方法中轉化不依賴於油菜基因型，即適合任何品種、品系或種質資源材料，克服了農桿菌介導轉化法中基因型依賴問題，也避免了目前普遍使用的轉化方法中存在的大量組織培養工作，成本低廉，工作量小。
4.本發明中的大田油菜轉化是在油菜生長季節，可直接獲得轉基因種子，避免了目前普遍使用的轉化方法中轉基因油菜種子繁殖需春化和越夏等問題。
5.本發明方法中的轉化操作對結實率和種子萌發率影響小。
6.本發明中的遺傳轉化操作不使用任何細菌菌株，因此避免了細菌帶來的環境風險。


圖1質粒pGreen0229的限制性內切酶酶切圖譜以及主要基因排列順序pGreen II質粒載體是pGreen0229的基本骨架，限制性內切酶Bgl II將骨架切開，連接T-DNA.T-DNA片段上帶有抗除草劑草胺膦的bar基因，該基因連接在nos啟動子後面。LacZ基因中部有多克隆位點。LBT-DNA左邊界；RBT-DNA右邊界圖2.油菜品種「中雙九號」自交授粉後不同時間花粉管在柱頭和子房中伸長的螢光顯微觀察A圖未授粉的雌蕊、柱頭和花柱B圖授粉後7小時雌蕊、柱頭和花柱C圖授粉後12小時雌蕊、柱頭和花柱用0.1％苯胺藍染色後觀察到的中雙九號自交授粉的柱頭、花柱、子房。圖中箭頭所示發亮藍色螢光的是已萌發花粉管，圖中的標尺所代表實際大小為5微米。圖A顯示的未授粉柱頭上沒有亮藍色螢光。授粉後7小時至少十多條花粉管已經進入花柱(圖B)而授粉後12小時進入花柱的花粉管更多(圖C)，而且不少花粉管已經到達子房和胚珠。
圖3.質粒pGreen0229限制性內切酶酶切鑑定泳道1為質粒溶液，分子量大小在4.5kb；經過單酶切(Bgl II)之後，產生兩個片段，分別是1959bp和2495bp(泳道2)；經過雙酶切(Bgl II和BspHI)之後產生4個片段，從大到小依次為1959bp、961bp、809bp、725bp(泳道3)。泳道DL和泳道M分別是分子量標記DL2000和λHindIII+EcoR I雙酶切產物。鑑定結果表明所抽提出來的質粒是pGreen0229圖4.經兩次除草劑噴施之後抗性苗的PCR檢測結果泳道M為分子量標記DL2000，泳道C是陽性對照(質粒pGreen0229)的PCR擴增產物。從這一結果可以看出經過兩次除草劑篩選後的抗性苗基本上呈現PCR陽性結果，說明本發明的除草劑篩選體系有效、可靠。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
對本發明做進一步的說明。
實施例1甘藍型油菜品種「中雙九號」授粉後花粉管伸長過程的觀察甘藍型油菜品種「中雙九號」(中國農業科學院油料作物研究所培育，又名「全能628」)。該品種是雙低(低芥酸低硫甙)優質油菜品種，抗病毒病、耐菌核病，是長江流域主要栽培品種之一。於秋季(9月26日～9月30日)播種「中雙九號」，廂寬2米，行距0.3米。按照正常栽培管理和肥水措施，次年春季開花。開花後對自交授粉後的「中雙九號」子房每隔1小時進行取樣，用於確定花粉管伸長顯微觀察，以確定最佳的質粒導入時間。
花粉管萌發及伸長的染色及螢光觀察參考並改進魏琴(魏琴，周黎軍，陳東林，李旭峰，陳放。十字花科10屬種與油菜蘿蔔胞質不育系雜交的花粉萌發情況觀察，植物學通報，2000，17(3)260-265)方法，主要步驟如下1.花蕾選擇3月下旬，選擇「中雙九號」主花序或者第一次分枝的花序，摘除頂部未開放的小花蕾和下部角果及已經開放的花，留下12個花蕾。
2.花粉的準備選擇「中雙九號」另一枝花序，摘除下部角果和已經開放的花，套上硫酸紙袋，下端用回形針別住，防止蜜蜂傳粉，也防止被風吹開或者吹掉。在花序的下部掛上標牌，註明品種和套袋自交的日期。
3.人工去雄用濃度為70％的酒精(乙醇)擦拭尖嘴鉗和手指尖，小心撥開花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，不要傷及雌蕊，去除雄蕊。套上硫酸紙袋，下端用回形針別住。在花序的下部掛上標牌，註明品種和去雄的日期。
4.人工授粉人工去雄的第二天上午10～11點，打開以上第2步(「花粉的準備」)中所套硫酸紙袋子夾取已經散粉的油菜成熟花葯，套上硫酸紙袋。事先用濃度為70％的酒精(乙醇)擦拭尖嘴鉗。將取下的花葯點在第3步(「人工去雄」)的柱頭上授粉。然後套上硫酸紙袋。
5.採樣從人工授粉後的0.5小時開始，每隔1小時摘取授粉後的子房10枚。一直到授粉後24小時。
6.子房樣品的固定田間採取授粉後不同時期(按照「採樣」步驟)的子房，立即投入FAA固定液中，在1.5毫升的帶蓋小離心管中20～25度固定24小時。
7.復水20～25度，取出固定後的樣品依次投入0.8毫升體積的濃度為60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸餾水四種溶液中各浸泡15分鐘。
8.軟化倒掉蒸餾水，加0.8毫升體積濃度為6mol/L(摩爾每升)的氫氧化鈉(NaOH)淹沒樣品，在20～25度處理12小時。
9.染色倒掉6mol/L的NaOH溶液，在離心管中加入1毫升蒸餾漂洗5分鐘，倒掉；再加1毫升蒸餾漂洗5分鐘，倒掉並吸乾所有水分，在濃度為0.1％苯胺藍染色液中染色3～5小時。
10.壓片用鑷子輕輕的將染色後的子房樣品取出，放在已經事先滴加1滴0.1％苯胺藍染色液的載玻片上。從一側小心蓋上蓋玻片，用拇指輕壓蓋玻片，壓扁子房和柱頭。
11.螢光顯微鏡觀察將壓片好的玻片放在螢光顯微鏡的載物臺上，在可見光下進行聚焦，使得顯微鏡中清晰的看到柱頭和子房。用356nm左右波長的紫外光激發樣品，觀察發亮藍色螢光的花粉管(以沒有授粉的子房作為對照)。在356nm左右的紫外光激發下，萌發的花粉粒和花粉管產生大量胼胝質，能夠發出亮藍色的螢光，很容易與灰藍色的雌性器官組織(柱頭、花柱、子房)區分開來。沒有授粉的柱頭和花柱不會有亮藍色螢光。
通過觀察發現「中雙九號」授粉後，能夠很快在柱頭上萌發。授粉後大約7小時花粉管進入花柱，少數可以到達子房(附圖2)。隨著時間的延長，在花柱中的花粉管更多，並逐漸延伸到子房、開始進入胚珠(附圖2)。由此確定「中雙9號」最佳基因轉化處理時期。
所用試劑配方如下FAA固定液(100毫升)取90毫升濃度為50％或70％的酒精，加入5毫升甲醛和5毫升冰醋酸混合均勻。
60％酒精(100毫升)取40毫升蒸餾水加入60毫升無水酒精混勻。
45％酒精(100毫升)取55毫升蒸餾水加入45毫升無水酒精混勻。
20％酒精(100毫升)取80毫升蒸餾水加入20毫升無水酒精混勻。
軟化劑6mol/L的氫氧化鈉(NaOH)稱取24克氫氧化鈉固體顆粒，溶解在80毫升蒸餾水中，待完全溶解後，將溶液定容在100毫升。
1％苯胺藍染色液稱取0.1克苯胺藍粉末，溶於100毫升0.14mol/L的K2HPO4(pH8.2)中，攪拌使之完全溶解；其中0.14mol/L(摩爾每升)K2HPO4(磷酸氫二鉀)(pH8.2)配製方法為在100毫升水中加入2.44克K2HPO4，完全溶解後用濃NaOH調節pH值到8.2.
實施例2外源DNA質粒的抽提準備和酶切鑑定待轉化的外源DNA是帶有除草劑草胺膦抗性(bar基因)的質粒pGreen0229植物表達載體(帶有質粒pGreen0229的大腸桿菌菌株DH5α由中國農業科學院生物技術研究所劉昱輝惠贈)。質粒pGreen0229的核苷酸序列和限制性內切酶酶切圖譜參見附圖1和http//www.pgreen.ac.uk/jit/pG0229.htm。
(一)、外源DNA質粒的抽提步驟如下1.吸取50微升帶有質粒pGreen0229的大腸桿菌DH5α菌種，接入盛有500毫升LB培養基的三角瓶中，37℃恆溫搖床上培養，轉速200轉每分鐘。培養16小時，培養基變得渾濁。
2.質粒pGreen0229的抽提(1)將步驟1中變渾濁的培養基分裝到4支有蓋50毫升離心管中，4℃下8000轉每分鐘離心5分鐘，倒掉上清液收集菌體。
(2)用STE溶液重懸收集的菌體，並轉入2毫升離心管，每支離心管裝有1.5～1.8毫升重懸菌液。4℃下8000轉每分鐘離心5分鐘，倒掉上清液收集菌體。
(3)用SDS-鹼裂解法抽提菌液中的質粒DNA。在離心管中加入200微升溶液I，室溫(20～25℃)下在渦旋儀上渦旋直到菌體充分散開；接著在室溫(20～25度)加入新配置的400微升溶液II，顛倒離心管混勻，待溶液變得清亮後加入預先冰冷的300微升溶液III，顛倒混勻；放在碎冰中，0℃放置3～5分鐘。
(4)將離心管在4℃下10,000轉每分鐘離心10分鐘，小心吸取上清液於新的2毫升離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，顛倒離心管混勻溶液，室溫(20～25度)放置5分鐘，然後室溫(20～25度)離心，轉速10,000轉每分鐘離心15分鐘，小心吸取上清液於新的2毫升離心管中。
(5)加入600微升異丙醇，顛倒混勻溶液，室溫(20～25度)離心，轉速10,000轉每分鐘離心15分鐘，倒掉上清液。用250微升50TE溶液(含有RNA酶即牛胰核糖核酸酶A，濃度為20毫克每升)溶解質粒沉澱並在水浴鍋中37℃水浴1小時。
(6)加入625微升無水乙醇和25微升3mol/L乙酸鈉溶液，顛倒混勻溶液，室溫(20～25度)放置5分鐘，將質粒再沉澱。室溫(20～25℃)下離心，轉速10,000轉每分鐘離心5分鐘，倒掉上清液。加入1毫升濃度為70％的酒精，上下顛倒10~15次，室溫(20～25度)離心，轉速10,000轉每分鐘離心2分鐘，倒掉上清液，室溫(20～25度)放置15分鐘使酒精完全揮發。將再沉澱的質粒溶解於250微升0.1～1倍的SSC溶液中。
(二)、質粒溶液的電泳檢測和定量在濃度為0.8％的瓊脂糖膠(即1×TAE緩衝液)中電泳，測定質粒濃度。單酶切(Bgl II)和雙酶切(Bgl II和BspH I)的質粒片段在濃度為1％的瓊脂糖膠(1×TAE緩衝液)中電泳。其方法如下1.脂糖凝膠的製備0.8％或者1％的瓊脂糖(1×TAE緩衝液為溶劑)置於三角瓶中，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置於微波爐中以中火加熱5分鐘至瓊脂糖溶解。
2.膠板的製備取有機玻璃內槽，洗淨、晾乾；取紙膠條，將有機玻璃內槽置於一水平位置模具上，放好梳子。倒入冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，使膠液緩慢地展開直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫(20～25度)靜置30分鐘左右，待凝固完全後，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠後將鋪膠的有機玻璃內槽放在含有1×TAE緩衝液的電泳槽中使用。
3.加樣用微量加樣器將質粒溶液或其酶切產物樣品(各2微升，事先與1微升6×上樣緩衝液混溶)分別加入膠板的樣品孔內。每加完一個樣品，換一個吸頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約15～20微升。在第一個上樣孔或最後一個上樣孔內加入5微升的DL2000 DNA分子量標記(濃度為50ng/ul)。
4.電泳加完樣後的凝膠板即可通電進行電泳；建議在80～100V的電壓下電泳；當上樣緩衝液中的溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1釐米處停止電泳；將凝膠放入溴化乙錠工作液(0.5ug/ml左右)中染色約20分鐘。為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不應高於5V/cm(伏特每釐米)(兩電極間的距離)。
5.觀察與拍照在紫外燈(310nm波長)下觀察染色後的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的螢光條帶。在紫外燈下觀察時，應戴上防護眼鏡或有機玻璃防護面罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。採用快速凝膠成像系統拍照電泳圖譜。
6.用0.1～1×SSC溶液調整外源DNA質粒濃度達到50～500ng/μL.4℃冷藏質粒溶液備用。
(三)、質粒溶液的限制性內切酶消化鑑定質粒溶液分別在單酶切(Bgl II)緩衝液和雙酶切(Bgl II+BspH I)緩衝液中處理，處理後的溶液各吸取4微升在濃度為1％的瓊脂糖膠(溶劑為1×TAE緩衝液)中電泳測定，測定結果見附圖3。電泳方法與(二)相同。
所用試劑配方如下(1)LB培養基分別稱取10克胰蛋白腖，5克酵母提取物和10克氯化鈉依次溶解於蒸餾水中，定容於1000毫升。分裝於500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高壓消毒15分鐘。加入無菌的卡那黴素溶液，使得終濃度為50毫克每升。4℃冷藏備用。
(2)STE溶液用移液器分別吸取下列溶液1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 1毫升3mol/L氯化鈉(NaCl)溶液 3.3毫升0.5mol/L 乙二酸四乙胺二鈉鹽(EDTA，pH8.0) 200微升混勻並加蒸餾水至100毫升。
1mol/L Tris-Cl(pH8.0)配製方法為用800毫升蒸餾水溶解121.1克Tris鹼，加濃鹽酸42毫升，使溶液冷卻至室溫後，調整pH值到8.0，加水定容至1升。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
0.5mol/L EDTA(pH8.0)配製方法為用800毫升蒸餾水劇烈攪拌溶解186.1克二水乙二酸四乙胺二鈉(EDTA-Na·2H2O)。用NaOH調解溶液的pH值(約需要20克固體NaOH)，當pH值接近8.0時才會完全溶解。定容於1升。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
3mol/L氯化鈉(NaCl)溶液配製方法為用800毫升蒸餾水劇烈攪拌溶解292克NaCl，定容於1升。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，室溫貯存。
(3)50TE溶液用移液器分別吸取下列溶液1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 5毫升0.5mol/L 乙二酸四乙胺二鈉鹽(EDTA，pH8.0) 2毫升加蒸餾水至100毫升。
其中1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二鈉鹽)(pH8.0)的配製方法與所用試劑配方(2)中描述的相同。
(4)溶液I
50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液I可成批配製，每瓶約100毫升，分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
其中1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二鈉鹽)(pH8.0)的配製方法與所用試劑配方(2)中描述的相同。
(5)溶液II0.2mol/L NaOH(臨用前吸取10mol/L NaOH貯存液20微升。10mol/L NaOH貯存液的配製方法為稱取40克固體NaOH(氫氧化鈉)溶於100毫升蒸餾水中。)1％SDS(臨用前吸取20％SDS貯存液50微升)定容於1毫升。
(6)溶液III60毫升5mol/L醋酸鉀，5毫升冰醋酸，28.5毫升蒸餾水。
(7)氯仿/異戊醇(24∶1)在24毫升氯仿中加入1毫升異戊醇，混勻後棕色瓶4℃冰箱貯存。
(8)RNA酶(牛胰核糖核酸酶A)稱取25mg的RNase A，在25毫升的緩衝液中(1mmol/L Tris-HCl 250微升，1.5mmol/L NaCl 75微升，雙蒸水25ml)溶解，然後用100度煮沸15分鐘，緩慢冷卻至室溫並分裝為100ul/管，-20度凍存。
(9)SSC溶液在800毫升蒸餾水中溶解175.3克Nacl和88.2克檸檬酸鈉，加入數滴10mol/LNaOH調pH至7.0，加水至1000毫升，配製成20×SSC溶液。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。使用前用高壓滅菌的蒸餾水稀釋成0.1～1×SSC溶液。
(10)單酶切(Bgl II)緩衝液和體系限制性內切酶購自NEB(New England Biolabs)公司。
10×buffer3 2微升質粒溶液5微升內切酶Bgl II0.5微升無菌蒸餾水 12.5微升酶切處理方法37℃水浴，過夜或者16小時。
(11)雙酶切(Bgl II+BspH I)緩衝液和體系限制性內切酶購自NEB(New England Biolabs)公司。
10×buffer3 2微升質粒溶液5微升內切酶Bgl II0.5微升內切酶BspH I1微升無菌蒸餾水 11.5微升酶切處理方法37℃水浴，過夜或者16小時。
(12)1×TAE緩衝液2mol/L Tris鹼，1mol/L乙酸，100mmol/L EDTA先配製成5×TAE緩衝液稱取242克Tris鹼溶於500毫升蒸餾水中，加入57.1毫升冰乙酸(17.4mol/L)及200毫升0.5mol/L EDTA(pH 8.0)混勻，補加蒸餾水至1000毫升，4℃冰箱貯存；使用時用蒸餾水稀釋5倍，配成1×TAE緩衝液。
其中0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二鈉鹽)(pH8.0)的配製方法與所用試劑配方(2)中描述的相同。
(13)0.8％瓊脂糖膠稱取0.4克瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50毫升1×TAE緩衝液。
(14)1％瓊脂糖膠稱取0.5克瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50毫升1×TAE緩衝液。
(15)6×上樣緩衝液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖即稱取0.25克溴酚蘭，40克蔗糖，分別溶解，定容於100毫升蒸餾水中。分裝後，在6.859×104Pa的高壓下(121℃下)蒸汽滅菌15分鐘，4℃冰箱貯存。
實施例3甘藍型油菜品種「中雙九號」的轉化及結實率分析於秋季(9月26日～9月30日)播種「中雙九號」，廂寬2米，行距0.3米。按照正常栽培管理和肥水措施，下一年春季開花。
盛花期選擇晴朗的天氣，選擇未開放花蕾，每花序留10～15個，轉化前人工去雄。打掉花序的頂端沒有去雄的小花蕾，去掉角果和已經開放的花朵，套上大小合適的硫酸紙袋。同時選取另外的花序，打掉已開放的花朵，套袋，準備花粉，為次日授粉提供新開放的花朵和散粉的雄蕊。在花序下方的花序軸上掛牌，註明日期和材料代號。其中花蕾選擇、花粉的準備、人工去雄按照「實施例1甘藍型油菜品種「中雙九號」授粉後花粉管伸長過程的觀察」中的步驟1、2和3進行。
次日上午10:00，從套袋後新開放的花朵上取花粉，人工授粉(按照「實施例1甘藍型油菜品種「中雙九號」授粉後花粉管伸長過程的觀察」中的步驟4進行)。下午，用鋒利的手術刀切掉部分授過粉的柱頭，立即用微量移液器將質粒溶液(實施例2抽提出的質粒溶液)2微升滴加在切口上，套袋。花序的牌子上附加註明質粒代號等信息。如果遇到雨天則不滴加外源DNA溶液，但要掛牌註明。在套袋5～7天後取下袋子，待角果自然成熟，然後收穫種子。
比較自交授粉以及授粉後進行轉化處理的油菜花序的結實率，分析本發明對油菜結實率的影響(表1)。
表1「中雙九號」轉化後的結實情況

經過轉化處理的花序一共61個，每個花序可以得到6～7個有效角果，每個角果可以得到17粒種子。與同樣人工去雄、授粉但不作轉化處理的角果相比，轉化操作後每果粒數平均減少2粒，表明新方法的轉化處理對結實率影響較小。
本發明的轉化操作對雌蕊的影響降到最低，保證轉化處理後的植株保持較高的結實率。解決了在其它農作物種上採用類似方法引起的結莢數下降(大豆只有31％，雷勃鈞，尹光初。1991。外源DNA導入大豆的適宜時期與相應方法。中國油料，188-89)和落鈴問題(棉花成鈴率最高只有31.3％，李保成，蒙峰麗，趙紅梅，楊玲。1998.石河子科技，外源DNA導入法提高棉花抗病性效果初報和體會34-5；林棲鳳主編。2004.植物分子育種。北京，科學出版社189-192)。
實施例4轉基因後代的篩選1.用除草劑篩選轉基因種子和幼苗將實施案例3中收穫的種子倒在乾淨的幹平皿上，選取未破裂完整的種子並計數。每1000顆種子為一份。同時選取來自拜爾公司的抗除草劑油菜種子為陽性對照種子，未轉基因的油菜種子為陰性對照種子。取一個乾淨的大平皿(直徑15cm)，鋪上潔淨的濾紙，並用雙蒸水潤溼，將一份種子分散均勻在濾紙上，在生長箱中以18～28℃，光照16小時，黑暗8小時的條件催芽。出芽後將其點種在裝有中性花土塑料盒中。大約在催芽後的3～4天，絕大部分苗的子葉展開，真葉開始顯露時，準備噴除草劑。除草劑草胺膦的濃度為0.01％～0.5％。用噴霧瓶將除草劑均勻噴灑到葉子上，5～12天後再噴灑一次。每次噴施之後用剪刀剪除已經變黃枯萎的幼苗，和轉基因陽性對照一樣仍能夠保持子葉綠色並繼續生長的幼苗是轉基因植株。待綠苗長到3～5片葉後小心地移栽到土中生長，分單株留取約100mg葉片用於DNA抽提和PCR檢測。
2.PCR檢測的快速DNA抽提方法如下採集新鮮的油菜嫩葉一小片，放入1.5毫升離心管中，加入400微升DNA抽提緩衝液(200mM Tris-Hcl(pH8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA(pH8.0)，0.5％ SDS)，用電動勻漿器勻漿20～30秒。隨後在臺式離心機上4℃以13000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，將上清液轉入到乾淨的1.5毫升離心管中。在此離心管中加入等體積預冷的異丙醇並輕輕顛倒混勻，在室溫(20～25度)下靜置2～3分鐘。最後在臺式離心機上室溫以12000轉每分鐘的速度離心5分鐘。棄去上清，20～25度開蓋放置15分鐘左右使異丙醇揮發，加30微升無菌雙蒸水溶解DNA沉澱，-20℃保存待用。
DNA抽提緩衝液的配製(100毫升)稱取2.42克Tris鹼，0.093克EDTA-Na2·H2O，1克NaCl和0.5克SDS粉末加雙蒸水混勻，用濃HCl調整pH至8.0，最後用蒸餾水定容至100毫升。
3.轉基因植株的PCR檢測
(1)根據除草劑抗性基因bar核苷酸序列設計PCR引物，從植物總DNA中擴增bar基因片段。PCR擴增的陽性對照為發明內容二中抽提的質粒pGreen0229溶液。
(2)引物序列Barl5』GAA，GTC，CAG，CTG，CCA，GAA，AC；Bar25』AGT，CGA，CCG，TGT，ACG，TCT，CC。
在20微升(μl)PCR體系中分別加入去離子水 13.3μl，10×Buffer2μl2.5mmol/L dNTP0.5μl25mmol/L MgCl21.5μlTaq酶 0.2μl(1單位)植物總DNA 1μl(50～100ng)(3)在PCR儀上採用下列程序進行反應94℃ 5分鐘(min)1個循環→94℃ 30秒(sec)→55℃ 30sec→72℃ 1min，35個循環→72℃ 7min 1個循環→4～10℃維持數小時。
得到的產物在1.2％瓊脂糖電泳檢測(電泳方法如內容二中所述)，大小為284bp，結果如附圖4。
(4)1.2％瓊脂糖稱取0.6克瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50毫升1×TAE緩衝液。
表2「中雙九號」轉化後代幼苗的除草劑篩選結果

本次實驗收穫的轉化種子共萌發出8809株幼苗，經兩次除草劑篩選後獲得綠苗252株，PCR鑑定結果表明，假陽性率為5％，轉化效率為2.7％.種子的萌發率很高，用除草劑篩選的效率高。
權利要求
1.一種油菜轉基因的方法，它包括下列步驟A、外源DNA導入時間，首先是花蕾選擇，選擇油菜花序，摘除頂部未開放的小花蕾和下部角果及已經開放的花；其次是花粉的準備，選擇上述處理的單株的一個分枝花序或在同一品種不同單株上選擇花序，從花序上端向下套上硫酸紙袋或油菜自交用的袋子；第三是人工去雄，用濃度為70％的酒精擦拭尖嘴鉗和手指尖，剝開第一步中花序的花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，去除雄蕊，套上硫酸紙袋，下端用回形針別住；第四是人工授粉，打開第二步中所套袋子夾取已處於散粉狀態的花葯，套上原先的袋子，將取下的花葯點在第三步的柱頭上授粉；第五是採樣，從人工授粉後的0.5小時開始，每隔1小時摘取授粉後的子房，一直到授粉後48小時；第六是子房樣品的固定將不同時期的子房投入FAA固定液中，在1.5毫升的帶蓋小離心管中室溫下固定12～48小時；第七是復水，取出固定後的樣品依次投入0.8毫升體積的濃度為60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸餾水四種溶液中各浸泡15分鐘；第八是軟化，倒掉第七步的蒸餾水，加0.8毫升體積濃度為6mol/L的氫氧化鈉淹沒樣品，處理12小時；第九是染色，倒掉6mol/L的NaOH溶液，在離心管中加入1毫升蒸餾水漂洗5分鐘，倒掉蒸餾水，再加1毫升蒸餾水漂洗5分鐘，倒掉蒸餾水並吸乾水分，在濃度為0.1％苯胺藍染色液中染色1～6小時；第十是壓片，將染色後的子房樣品取出，放在已經事先滴加1滴0.1％苯胺藍染色液的載玻片上，從一側蓋上蓋玻片，壓蓋玻片，壓扁柱頭、花柱和子房；第十一是螢光顯微鏡觀察，將壓片好的玻片放在螢光顯微鏡的載物臺上，在可見光下進行聚焦，直到顯微鏡中能清晰的看到柱頭、花柱和子房；B、外源DNA質粒的抽提和酶切首先是吸取500微升帶有質粒pGreen0229的大腸桿菌DH5α菌液，接入盛有500毫升LB培養基的三角瓶中，37℃恆溫搖床上培養，轉速200轉每分鐘，培養16小時，培養基變得渾濁；其次是質粒pGreen0229的抽提，將上一步中變渾濁的培養基分裝到離心管中，4℃下8000轉/分鐘離心5分鐘，倒掉上清液收集菌體；然後用SDS-鹼裂解法抽提菌液中的質粒DNA.在離心管中加入200微升溶液I，室溫下在渦旋儀上蝸旋直到菌體散開，接著在室溫下加入400微升溶液II，顛倒離心管混勻，待溶液變得清亮後加入預先冰冷的300微升溶液III，顛倒混勻，放在碎冰中，0℃放置3～5分鐘，再將離心管在4℃下10,000轉/分鐘離心10分鐘，吸取上清液於離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇24∶1，顛倒離心管混勻溶液，室溫下放置5分鐘，然後室溫下離心15分鐘，轉速10,000轉/分鐘，吸取上清液於離心管中，加入600微升異丙醇，顛倒混勻溶液，室溫下離心15分鐘，轉速10,000轉/分鐘，倒掉上清液，用250微升50TE溶液溶解質粒沉澱並在水浴鍋中37℃水浴1小時，最後加入625微升無水乙醇和25微升3mol/L乙酸鈉溶液，顛倒混勻溶液，室溫放置5分鐘，將質粒再沉澱，室溫下離心5分鐘，轉速10,000轉/分鐘，倒掉上清液，加入1毫升濃度為70％的酒精，上下顛倒10～15次，室溫下離心2分鐘，轉速10,000轉/分鐘，倒掉上清液，室溫下放置15分鐘使酒精揮發，將再沉澱的質粒溶解於250微升SSC溶液中；第三是質粒溶液的電泳檢測和定量在濃度為0.8％的瓊脂糖膠/1×TAE緩衝液中電泳測定質粒濃度，經過單酶切/Bgl II和雙酶切/Bgl II+BspHI的質粒片段在濃度為1％的瓊脂糖膠/1×TAE緩衝液中電泳測定，其步驟是a.瓊脂糖凝膠的製備0.8％或1％的瓊脂糖/1×TAE緩衝液置於三角瓶中，瓶口倒扣一個燒杯，將三角瓶置於微波爐加熱5分鐘至瓊脂糖溶解；b.膠板的製備取有機玻璃內槽，洗淨、晾乾，取紙膠條，將有機玻璃內槽置於一水平位置模具上，倒入冷卻至65℃的瓊脂糖凝膠液，使膠液地展開直到在有機玻璃板表面形成均勻的膠層，室溫下靜置30分鐘，待凝固完全後，拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔；c.加樣用微量加樣器將質粒溶液或其酶切產物樣品各2微升，事先與1微升6×上樣緩衝液混溶分別加入膠板的樣品孔內，每加完一個樣品，換一個吸頭，樣品孔容量15～20微升，在第一個上樣孔或最後一個上樣孔內加入5微升的分子量標記/濃度為50ng/ul；d.電泳加完樣後的凝膠板即可通電進行電泳；在80～100V的電壓下電泳；當上樣緩衝液中的溴酚蘭移動到距離膠板下沿1釐米處停止電泳，將凝膠放入溴化乙錠工作液/0.5ug/ml中染色20分鐘，電場強度不高於5V/cm；e.觀察與拍照在紫外燈/310nm波長下觀察染色後的凝膠；f.用SSC溶液調整質粒濃度，4℃冷藏質粒溶液備用；C、油菜的轉化油菜播種于田間或人工生長室中，按照正常的栽培管理措施，在開花期，選擇天氣，人工剝蕾去雄，打掉花序的頂端小花蕾，去掉角果和已經開放的花朵，留下待開放花蕾，每花序留10～15個，套上袋，同時選取另外的花序，打掉已開放的花朵，套袋，為次日授粉提供開放的花朵和散粉的雄蕊，次日，從套袋後開放的花朵上取花粉，授在人工剝蕾後的柱頭上，油菜授粉後套袋，在轉化和套袋5～14天後取下袋子，待角果成熟後收穫種子；D、轉基因植株篩選將收穫的種子倒在乾淨的幹平皿上，選取未破裂完整的種子並計數，每1000顆種子為一份，同時選取抗除草劑油菜種子為陽性對照種子，未轉基因的油菜種子為陰性對照種子；取乾淨的大平皿，鋪上潔淨的濾紙，並用雙蒸水溼潤濾紙，將一份種子均勻分散在濾紙上，在生長箱中以18～25℃，光照16小時，黑暗8小時的條件催芽，出芽後將其點種在裝有中性花土的塑料盒中，在催芽後的3～4天、苗的子葉展開，將除草劑均勻噴灑到葉子上，噴施之後用剪刀剪除已經變黃枯萎的幼苗，待綠苗長到3～5片葉後移栽到溫室或帶土營養缽中。
2.根據權利要求1所述的一種油菜轉基因的方法，其特徵在於SSC溶液的濃度為0.1～1×SSC。
3.根據權利要求1所述的一種油菜轉基因的方法，其特徵在於SSC溶液中外源DNA質粒的濃度為50～500ng/μl。
4.根據權利要求1所述的一種油菜轉基因的方法，其特徵在於油菜授粉後2～12小時進行遺傳轉化操作。
5.根據權利要求4所述的一種油菜轉基因的方法，其特徵在於遺傳轉化操作是切去柱頭，在切口上滴加1～3微升外源DNA質粒溶液。
6.根據權利要求1所述的一種油菜轉基因的方法，其特徵在於除草劑的濃度為0.01％～0.5％。
7.根據權利要求1所述的一種油菜轉基因的方法，其特徵在於除草劑第一次噴灑5～12天後再噴灑一次。
全文摘要
本發明公開了一種油菜轉基因的方法。本方法以原位生殖器官(包含花粉管，受精前後的配子和合子)為轉基因受體。在對油菜授粉後的花柱和子房進行細胞學觀察的基礎上，確定了該方法的轉化時間。在該時間內，削去柱頭，滴加外源DNA溶液，使攜帶外源基因和草胺膦抗性標記基因的DNA轉化生殖細胞，通過生長發育，獲得轉基因的T1代合子(種子)，在T1代幼苗早期用低濃度的除草劑草胺膦進行噴灑篩選，獲得轉基因陽性油菜植株。本發明的轉基因效率為2～10％，轉化通量高，而且成本低廉，工作量小，不存在基因型依賴，不存在轉基因植株種子繁殖中的春化和越夏問題，篩選簡便，結實率高。
文檔編號C12N5/04GK1821415SQ200610018488
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月7日 優先權日2006年3月7日
發明者劉勝毅, 郭學蘭, 董彩華, 劉越英 申請人:中國農業科學院油料作物研究所