一種e2f3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血e2f3影響的方法
2023-09-20 02:06:50 3
一種e2f3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血e2f3影響的方法
【專利摘要】本發明公開了一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，通過免疫組化研究不同前列腺癌組織中E2F3的表達情況，明確E2F3與前列腺癌分級、分期及預後的關係；通過構建針對E2F3的AAV病毒載體，沉默E2F3基因並進行相關的外功能實驗；通過建立裸鼠前列腺癌模型，成功應用AAV病毒載體進行體內實驗並明確E2F3基因沉默前後裸鼠全血中E2F3mRNA表達情況。本發明的E2F3基因作為前列腺癌基因治療的高效靶點，為後續的以E2F3為靶點的前列腺癌基因治療體內實驗奠定基礎；針對E2F3的重組RNA幹擾AAV病毒能夠抑制腫瘤細胞的增殖並能夠促進細胞的凋亡，並有效抑制動物模型腫瘤的生長並降低了外周血標本內E2F3的表達，為以E2F3為靶點的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實驗基礎。
【專利說明】—種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於E2F3基因【技術領域】，尤其涉及一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法。
【背景技術】
[0002]前列腺癌是歐美最常見的男性惡性腫瘤之一，目前在美國前列腺癌的發病率已經超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤，在我國，隨著生活方式的改變、人口的老齡化及診斷技術的提高，前列腺癌的發病率也呈持續增長趨勢，在北京及上海等現代化程度較高的城市，前列腺癌已經超過膀胱癌，成為最為常見的泌尿系統腫瘤。
[0003]腫瘤的發生、發展與細胞周期調節失控密切相關，細胞周期調控發生異常，使受損害的DNA得不到及時修復，細胞繼續分裂，因遺傳不穩定，可轉變為癌細胞，E2F3是E2F轉錄因子家族成員之一，也是細胞周期調控過程中起重要作用的調控蛋白之一，其是細胞由Gl期進入S期最重要的細胞因子，調控著細胞增殖，E2F3聯繫著Cyclins、⑶Ks、Rb及細胞增殖等相關基因，這些基因在細胞周期不同階段起作用，並且隨著細胞的轉變而發生變化，Maddiso等的研究表明，Rb的失活引起E2F表達增多，可引起早期前列腺癌，促進前列腺癌的發展進程和轉移，Foste等應用免疫組化的方法研究發現前列腺癌組織中E2F3的表達率達到67%，而在良性前列腺組織中僅有2.3%細胞核表達E2F3，在正常人前列腺標本中無E2F3的表達，上述的研究結果表明，E2F3在前列腺癌的發病機制中處於非常重要的地位，而有效的沉默E2F3基因的表達為系統的研究E2F3與前列腺癌的關係奠定基礎。
[0004]隨著RNAi技術的出現，基因沉默技術在保持高效的基礎上更為特異的沉默靶mRNA，從而使相應蛋白表達下降，因為RNAi技術通過抑制宿主細胞mRNA轉錄後的基因表達而發揮作用，利用RNAi技術進行抗腫瘤基因治療有望成為癌症治療的新的突破口，當前RNAi技術在疾病診治中應用的困難主要集中在兩方面，即靶目標的有效性以及siRNAs或shRNAs靶點轉運的高效性，其一，靶目標的有效性是進行RNAi應用研究的重要前提，在設計siRNAs或shRNAs時，必須高度重視其靶向有效性的基礎研究；尤其是當進入臨床試驗時，更應當注意其設計的有效性，以避免產生體內的非特異性反應或者更為嚴重的目前還尚未明了的潛在不良反應，其二，siRNAs或shRNAs靶點轉運的高效性包括分子體內穩定性和穿透細胞膜所涉及到的轉運問題，早期的RNAi多應用脂質體進行質粒載體或siRNA直接向細胞內轉染，這種情況常常因為轉染效率的低下而導致基因沉默效果不佳，AAV幹擾載體的出現為更加高效的進行基因沉默奠定了基礎。
[0005]AAV載體具有逆轉錄病毒和腺病毒的許多優點，並且與其它幾種病毒相比，腺相關病毒載體具有安全性好、無致病性、免疫原性低、物理性質穩定、感染細胞譜廣，可介導外源基因長期穩定表達等優點，被視為最有如途的基因治療載體之一，成為目如基因治療載體研究的熱點，由於AAV載體的容量較大,在表達幹擾序列的同時，還能夠同時表達眾多的蛋白，這為多靶點進行前列腺癌基因治療提供便利，由於AAV病毒在人體具有良好的組織相容性，其已成為腫瘤基因治療的高效載體而受到重視，既往的研究表明AAV載體能夠高效的轉染前列腺癌細胞系，但其在體內試驗中AAV病毒載體是否能夠有效的進行RNAi幹擾序列的表達，是否能夠有效的降低靶mRNA的表達，這就需要建立前列腺癌動物模型而得到驗證。
[0006]動物實驗是細胞實驗和臨床實驗之間的重要過渡環節，簡便而實用的動物實驗模型在腫瘤的研究中具有十分重要的作用，由於具有種植方便、成瘤快、腫瘤生長一致性好、便於觀察等特點，裸鼠皮下注射前列腺癌細胞製備移植瘤已經成為探索前列腺的發生、發展與轉歸機理的重要評價方法，但是由於前列腺癌細胞對於前列腺內的微環境及前列腺內的激素水平的影響非常敏感，這使得前列腺癌原位模型能夠更為真是的反映實驗效果，從而越來越多的實驗研究採取前列腺癌原位模型進行體內實驗研究，但前列腺癌原位模型在構建時非常複雜，常需要對裸鼠進行外科操作，這不僅降低了裸鼠的生存率，增加了各種術後併發症的危險，還一定程度上降低了成瘤的一致性，我研究所前列腺癌研究室已經掌握了 LNCaP細胞裸鼠前列腺前葉腫瘤原位模型構建技術，並且專人負責操作，儘量的降低了成瘤大小不一致及腹腔種植等的發生率，動物模型與細胞水平實驗相比較，還具有一個顯著的優勢:實驗動物的血液標本能夠用來進行相關基因及蛋白的檢測，這也便於一些腫瘤標記物更為便捷的應用於臨床，血清PSA(前列腺特異抗原)檢測的發展及其在臨床中的廣泛應用，明顯的提高了前列腺癌的早期診斷率並提高了前列腺癌患者的5年生存率，但PSA存在一定的局限性，PSA在4-10ng/dl時，有近80 %的患者為前列腺良性疾病；而？3八小於4ng/dl時，有15%的患者卻仍被檢查前列腺癌，這就有可能導致一部分患者經受不必要的前列腺穿刺活檢，而另外一部分患者病情延誤，儘管對PSA界值、PSMA、PSA密度、PSA速率等的研究在一定程度上能夠提高前列腺癌的診斷準確性，但臨床急需更為準確的診斷指標，這對於前列腺癌的早期的診斷和預防、病程監測、探索對前列腺癌的治療方法以及評估預後有著重要的意義。
[0007]Jean等的研究發現，前列腺癌患者的全血標本中，E2F3mRNA表達顯著高於前列腺增生患者及正常人群，而通過我們的前期研究也發現E2F3蛋白的表達與前列腺癌的分期及分級密切相關，那麼E2F3是否可以與PSA聯合應用，成為診斷前列腺癌的新的分子標記物，彌補PSA的不足？上述的動物實驗可以使我們在進行E2F3基因沉默前後測定動物全血中的E2F3基因mRNA的表達，從而進一步明確E2F3基因mRNA的表達在臨床應用的潛力及價值。
【發明內容】
[0008]本發明實施例的目的在於提供一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，旨在為前列腺癌基因治療的一個有效的祀點，為前列腺癌的診斷與治療提供理論基礎。
[0009]本發明實施例是這樣實現的，一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，該E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法包括:
[0010]步驟一，通過收集不同前列腺癌石蠟標本，採用real-timePCR、WESTERN、免疫組化，分析E2F3及其所調基因在前列腺癌中的表達情況；
[0011]步驟二，建立以AVV為載體的RNAi平臺，並分析幹擾序列對前列腺癌LNCaP細胞中E2F3基因沉默的影響；
[0012]步驟三，並經體外實驗證實E2F3基因沉默對LNCaP細胞中E2F3及相關調控基因的影響及對細胞增殖及凋亡的影響；應用裸鼠進行原位前列腺癌動物模型的構建；
[0013]步驟四，應用AAV幹擾載體進行腫瘤的局部注射後明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質水平的表達情況及對腫瘤生長抑制情況，最後應用實時定量PCR進行全血E2F3mRNA的檢測，明確作為前列腺癌腫瘤標記物的可能性。
[0014]進一步，該E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法具體包括以下步驟:
[0015]第一步，取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預後之間的關係，根據Gleason分級和評分標準進行病理分級並根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期；
[0016]第二步，合成三對針對於E2F3基因的SiRNA對應模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的幹擾片段；根據篩選結果，將相應shRNA表達框克隆到腺相關病毒載體中，包裝純化病毒後，轉染膀胱移行細胞癌腫瘤細胞株，檢測病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細胞增殖凋亡相關指標；
[0017]第三步，採用LNCaP細胞在裸鼠前列腺前頁進行接種，建立原位前列腺癌動物模型。
[0018]進一步，取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預後之間的關係；根據Gleason分級和評分標準進行病理分級並根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期。
[0019]進一步，針對E2F3的AAV幹擾穿梭質粒的構建及病毒的包裝、濃縮與純化包括以下步驟:
[0020]步驟一，對已製備的E2F3RNAi質粒載體進行雙酶切，插入幹擾片斷後，將U6-RiE2F3序列PCR後克隆進T載體，然後亞克隆至pAAV-MCS ;酶切、PCR、測序驗證載體構建成功並證明ITR的存在；
[0021]步驟二，待AAV-293細胞達到70% _80 %融合後，分別將幹擾穿梭質粒與pRC、pHelper按照1:1:1濃度與細胞電轉，24小時後收集細胞；
[0022]步驟三，採用氯仿處理-PEG/NaCl沉澱-氯仿抽提三個步驟分離、濃縮、純化病毒；
[0023]步驟四，應用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測病毒純度；將純化的病毒經鎢酸鹽染色後，置於150目的鎳網上，掃描電鏡觀察。
[0024]進一步，含有幹擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的方法包括:
[0025]步驟一，對LNCaP細胞進行病毒轉染，通過綠色螢光的觀察、重組病毒載體與質粒載體在轉化效率、沉默效率、細胞毒性；
[0026]步驟二，rAAV幹擾載體對LNCaP細胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質表達水平的影響；
[0027]步驟三，接種LNCaP細胞於24孔板中，待細胞80_90%融合，棄培養液，並向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察幹擾效果，不同濃度及不同作用時間的rAAV-RiE2F3幹擾載體對LNCaP細胞中E2F3沉默的影響及細胞殺傷作用；
[0028]步驟四，應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉染前後LNCaP細胞細胞周期及凋亡的變化情況。
[0029]進一步，裸鼠原位前列腺癌模型的建立包括以下步驟:
[0030]步驟一，將LNCaP細胞進行消化後濃度調整至I X 107個/ml，置於無菌Eppendorf管內，冰塊上送到動物房中；
[0031]步驟二，裸鼠前列腺位置的確定:取仰臥位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮膚，下腹正中切口，從兩側分離到精囊及輸精管，沿著輸精管向下游離至膀胱頸，暴露前列腺；選擇該葉作為LNCaP細胞的種植位置；
[0032]步驟三，應用細胞懸液種植腫瘤細胞後定期觀察裸鼠體重變化，並且進行成瘤情況的判定，應用免疫組化的方法驗證前列腺癌動物模型的成功建立。
[0033]進一步，含有幹擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的方法包括:
[0034]步驟一，應用rAAV幹擾載體進行腫瘤局部注射並於治療後4周處死裸鼠，觀察腫瘤大小及重量的變化；觀察病毒作用後對裸鼠各個臟器組織學影響；
[0035]步驟二，rAAV幹擾載體對原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白質表達水平的影響；檢測E2F3基因沉默後其下遊調控基因的表達情況；
[0036]步驟三，應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3_GFP注射前後腫瘤細胞細胞周期及凋亡的變化情況；應用電鏡技術了解AAV幹擾病毒對腫瘤細胞超微結構的影響；
[0037]步驟四，用摘眼球放血方法收集裸鼠血液標本，應用實時定量PCR比較不同組間全血E2F3基因mRNA表達情況。
[0038]進一步，E2F3在前列腺癌組織中的表達與AR的異常表達具有相關性；構建前列腺原位癌模型並通過腹腔注射幹擾病毒的方法，抽取種植成功小鼠靜脈血檢測mRNA表達情況發現治療組外周血標本中E2F3mRNA表達明顯下降；治療組中前列腺腫瘤提及明顯縮小。
[0039]本發明提供的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，通過免疫組化研究不同前列腺癌組織中E2F3的表達情況，明確E2F3與前列腺癌分級、分期及預後的關係；通過構建針對E2F3的AAV病毒載體，沉默E2F3基因並進行相關的外功能實驗；通過建立裸鼠前列腺癌模型，成功應用AAV病毒載體進行體內實驗並明確E2F3基因沉默前後裸鼠全血中E2F3mRNA表達情況。本發明的E2F3基因可以作為前列腺癌基因治療的高效靶點，為後續的以E2F3為靶點的前列腺癌基因治療體內實驗奠定基礎；針對E2F3的重組RNA幹擾AAV病毒能夠抑制腫瘤細胞的增殖並能夠促進細胞的凋亡，並通過上述機制能有效抑制動物模型腫瘤的生長並降低了外周血標本內E2F3的表達，為以E2F3為靶點的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實驗基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是本發明實施例提供的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法的流程圖；
[0041]圖2是本發明實施例提供的pAAV-MCS及pRNAT_U6.l_siE2F3/Neo質粒及Mlu單酶切電泳結果示意圖；
[0042]圖中:M:DL1, 5000Marker ;1，2:pRNAT_U6.l_siE2F3/Neo 質粒；3:Mlu 單酶切PRNAT-U6.l-siE2F3/Neo 質粒(約 6400bp) ;4:pAAV_MCS 質粒；5:Mlu 單酶切 pAAV-MCS 質粒(4600bp)；
[0043]圖3是本發明實施例提供的以PRNAT-U6.l-siE2F3/Neo質粒為模板的幹擾序列PCR結果不意圖；
[0044]圖中:M:DL2000Marker ;1，2，3:Mlu-U6-MCS-CMV-GFP_Mlu 片段(約 1700bp)；
[0045]圖4是本發明實施例提供的pAAV_siE2F3環狀質粒示意圖；
[0046]圖中:M:DL1,5000Marker ；1, 2:已插入目的片段的 pAAV-MCS ；
[0047]圖5是本發明實施例提供的pAAV_siE2F3質粒BglII單酶切示意圖；
[0048]圖中:Ml: DLl, 5000Marker ；M2: DL2000Marker ; 1，2，3:線性 pAAV_siE2F3 質粒片段(約 6300bp)；
[0049]圖6是本發明實施例提供的pAAV_siE2F3質粒Mlu、BamHl、HandIII酶切效果示意圖；
[0050]圖中:M1:DL1,5000Marker ；M2:DL2000Marker ；l:Mlu 單酶切後出現兩條片段(約1650bp 及 4200bp) ;2:BamHl 單酶切後出現兩條片段(約 2750bp 及 3550bp) ;3:HandIII 單酶切後出現兩條片段(約2750bp及3550bp) ；4:BamHl和HandIII單酶切後出現兩條片段(約 2750bp 及 3550bp)；
[0051]圖7是本發明實施例提供的pAAV_siE2F3質粒PCR鑑定結果示意圖；
[0052] 圖中:Ml:DLl，5000Marker ;1，4:應用Mlu為兩邊酶切位點設計的引物擴增片段(約1700bp) ；2,3:應用ITR引物擴增片段(約3500bp)；
[0053]圖8是本發明實施例提供的轉染病毒後LNCaP細胞RNA提取後進行電泳示意圖；
[0054]圖9是本發明實施例提供的RT-PCR證實LNCaP細胞轉染重組幹擾AAV病毒後E2F3mRNA表達降低示意圖；
[0055]圖10是本發明實施例提供的RT-PCR證實LNCaP細胞轉染重組幹擾AAV病毒後E2F3mRNA表達下降降低情況示意圖；
[0056]圖11是本發明實施例提供的RT-PCR證實LNCaP細胞轉染重組幹擾AAV病毒後ARmRNA表達降低情況示意圖；
[0057]圖12是本發明實施例提供的E2F3在不同組織中的表達情況示意圖；
[0058]圖中:1:DL2000marker ;2_5:1 X PBS 對照組；6_7:重組幹擾病毒組；
[0059]圖13是本發明實施例提供的E2F3蛋白表達在不同前列腺組織中的表達情況示意圖；
[0060]圖中:1:1 XPBS對照組；2:空質粒對照組；3:重組幹擾病毒組。
【具體實施方式】
[0061]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0062]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0063]如圖1所示，本發明實施例的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法包括以下步驟:
[0064]SlOl:通過收集不同前列腺癌石蠟標本，採用real-timePCR、WESTERN、免疫組化等技術手段，分析E2F3及其所調基因在前列腺癌中的表達情況；
[0065]S102:建立以AVV為載體的RNAi平臺，並分析幹擾序列對前列腺癌LNCaP細胞中E2F3基因沉默的影響；
[0066]S103:並經體外實驗證實E2F3基因沉默對LNCaP細胞中E2F3及相關調控基因的影響及對細胞增殖及凋亡的影響；應用裸鼠進行原位前列腺癌動物模型的構建；
[0067]S104:應用AAV幹擾載體進行腫瘤的局部注射後明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質水平的表達情況及其對腫瘤生長抑制情況，最後應用實時定量PCR對不同實驗組進行全血E2F3mRNA的檢測，明確其作為前列腺癌腫瘤標記物的可能性。
[0068]在步驟S104中，實驗結果表明:E2F3與前列腺癌的惡性程度密切相關，其不僅是前列腺癌的診斷與預後指標，而且為前列腺癌的基因靶向治療提供理論依據。本發明明確E2F3及AR在不同病理分級、臨床分期的前列腺癌組織中的表達情況；明確E2F3及AR表達之間的相關性及其與前列腺癌預後的關係；構建以U6為啟動子的AAV幹擾穿梭質粒，並包裝出高純度rAAV-RiE2F3腺相關病毒生物製劑；通過前列腺癌細胞系進行體外實驗，明確E2F3基因沉默後AR及相關基因的表達情況及細胞的生長情況。上述實驗表明E2F3基因可以作為前列腺癌基因治療的高效祀點，這也為後續的以E2F3為祀點的前列腺癌基因治療體內實驗奠定基礎。通過採用LNCaP細胞在裸鼠前列腺前頁進行接種，建立原位前列腺癌動物模型。並進行針對E2F3幹擾病毒的腹腔注射體內實驗研究。針對E2F3的重組RNA幹擾AAV病毒能夠抑制腫瘤細胞的增殖並能夠促進細胞的凋亡，並通過上述機制能有效抑制動物模型腫瘤的生長並降低了外周血標本內E2F3的表達。本發明為以E2F3為靶點的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實驗基礎。
[0069]本發明的工作原理:
[0070]本發明通過免疫組化研究不同前列腺癌組織中E2F3的表達情況，明確E2F3與前列腺癌分級、分期及預後的關係；通過構建針對E2F3的AAV病毒載體，沉默E2F3基因並進行相關的外功能實驗；通過建立裸鼠前列腺癌模型，成功應用AAV病毒載體進行體內實驗並明確E2F3基因沉默前後裸鼠全血中E2F3mRNA表達情況。
[0071]本發明的具體包括以下四個方面:
[0072]1、取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預後之間的關係，根據Gleason分級和評分標準進行病理分級並根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期。
[0073]2、設計合成三對針對於E2F3基因的siRNA對應模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的幹擾片段。根據上述篩選結果，將相應shRNA表達框克隆到腺相關病毒載體中(AAVHelper-FreeSystem, Strategene),包裝純化病毒後,轉染膀胱移行細胞癌腫瘤細胞株，檢測病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細胞增殖凋亡相關指標。
[0074]3、採用LNCaP細胞在裸鼠前列腺前頁進行接種，建立原位前列腺癌動物模型。並進行針對E2F3幹擾病毒的腹腔注射體內實驗研究。
[0075]結合以下的實驗對本發明的原理做進一步的說明:
[0076]1.不同前列腺癌組織中E2F3的表達情況:
[0077]取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預後之間的關係；根據Gleason分級和評分標準進行病理分級並根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期。
[0078]2.針對E2F3的AAV幹擾穿梭質粒的構建及病毒的包裝、濃縮與純化:
[0079]①對已製備的E2F3RNAi質粒載體進行雙酶切，插入幹擾片斷後，將U6_RiE2F3序列PCR後克隆進T載體，然後亞克隆至pAAV-MCS。酶切、PCR、測序驗證載體構建成功並證明ITR的存在；
[0080]②待AAV-293細胞達到70% -80%融合後，分別將幹擾穿梭質粒與pRC、pHelper按照1:1:1濃度與細胞電轉，24小時後收集細胞；
[0081]③採用「氯仿處理-PEG/NaCl沉澱-氯仿抽提」三個步驟分離、濃縮、純化病毒；
[0082]④應用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測病毒純度；將純化的病毒經鎢酸鹽染色後，置於150目的鎳網上，掃描電鏡觀察。
[0083]3.含有幹擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的體外功能實驗:
[0084]①對LNCaP細胞進行病毒轉染，通過綠色螢光的觀察、MTT實驗等研究重組病毒載體與質粒載體在轉化效率、沉默效率、細胞毒性等；
[0085]②研究rAAV幹擾載體對LNCaP細胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質表達水平的影響；
[0086] 接種LNCaP細胞於24孔板中，待細胞80_90%融合，棄培養液，並向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察幹擾效果，研究不同濃度及不同作用時間的rAAV-RiE2F3幹擾載體對LNCaP細胞中E2F3沉默的影響及細胞殺傷作用。
[0087]③應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉染前後LNCaP細胞細胞周期及凋亡的變化情況。
[0088]4.裸鼠原位前列腺癌模型的建立:
[0089]①將LNCaP細胞進行消化後濃度調整至IX 107個/ml，置於無菌Eppendorf管內，冰塊上送到動物房中；
[0090]②裸鼠前列腺位置的確定:取仰臥位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮膚。下腹正中切口，從兩側分離到精囊及輸精管，沿著輸精管向下游離至膀胱頸，暴露前列腺。因裸鼠前列腺前葉位置好，體積較大，所以選擇該葉作為LNCaP細胞的種植位置。
[0091]③應用細胞懸液種植腫瘤細胞後定期觀察裸鼠體重變化，並且進行成瘤情況的判定，應用免疫組化的方法驗證前列腺癌動物模型的成功建立。
[0092]5.含有幹擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的體內功能實驗:
[0093]①應用rAAV幹擾載體進行腫瘤局部注射並於治療後4周處死裸鼠，觀察腫瘤大小及重量的變化；觀察病毒作用後對裸鼠各個臟器組織學影響；
[0094]②研究rAAV幹擾載體對原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白質表達水平的影響；檢測E2F3基因沉默後其下遊調控基因的表達情況；
[0095]③應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP注射前後腫瘤細胞細胞周期及凋亡的變化情況。應用電鏡技術了解AAV幹擾病毒對腫瘤細胞超微結構的影響；
[0096]④用摘眼球放血方法收集裸鼠血液標本，應用實時定量PCR比較不同組間全血E2F3基因mRNA表達情況。
[0097]本發明應用免疫組織化學方法檢測不同病理分期及組織分級的前列腺癌標本和前列腺增生組織中E2F3、AR蛋白的表達情況；通過構建重組病毒幹擾質粒pAAV-siE2F3並包裝重組幹擾病毒後進行相關體內及體外實驗，以明確E2F3在前列腺癌發生機發展機制中的作用。
[0098]本發明結果顯示:E2F3在前列腺癌的發生、發展中起著重要作用。E2F3的高表達提示預後不良；AR在前列腺癌的發生、發展中及進展成激素非依賴型起著重要作用；E2F3在前列腺癌組織中的表達與AR的異常表達具有相關性；E2F3、AR可望成為診斷前列腺癌和評估預後的指標。在前期進行質粒幹擾載體構建的基礎上，構建了針對E2F3基因的AAV幹擾載體穿梭質粒，經過多種限制性內切酶酶切檢測、目的基因PCR檢測及測序證實pAAV-siE2F3重組質粒構建成功。同時，本發明通過PCR證實pAAV_siE2F3重組質粒存在ITR，並在此基礎上成功進行了病毒的包裝與純化。本發明介紹的改造AAVHelper-Free系統進行RNAi的方法操作簡便、價格低廉並且不影響後續實驗。在進一步的體外細胞功能試驗中，證實重組幹擾病毒質粒能夠有效的降低前列腺癌細胞系LNCaP細胞中E2F3基因mRNA表達，並發現E2F3基因表達明顯降低後LNCaP細胞系中ARmRNA的表達明顯降低。成功周建了前列腺原位癌模型並通過腹腔注射幹擾病毒的方法進行體內實驗，抽取種植成功小鼠靜脈血檢測mRNA表達情況發現治療組外周血標本中E2F3mRNA表達明顯下降。治療組中前列腺腫瘤提及明顯縮小。
[0099]實驗數據及結果:
[0100]第一部分:前列腺癌組織中E2F3、AR的表達及其與前列腺癌的關係:
[0101]一、E2F3在前列腺良性增生組織和癌組織中的表達:
[0102]1.E2F3在前列腺良性增生組織和癌組織中的表達(表1):
[0103]E2F3蛋白主要定位在細胞核，偶見於細胞漿，免疫組化產物陽性呈黃或黃棕色顆粒，為灶性或瀰漫狀分布。PCa中的E2F3表達顯著高於BPH ;且在PCa中的表達多著色較深，而在BPH為弱陽性或陽性。經兩兩組間比較表明:E2F3在二者中的表達不同，在BPH與PCa中的表達差異有顯著性(X 2 = 26.67，P = 0.000)，即PCa中E2F3表達水平明顯高於 BPH。
[0104]表1 E2F3在良性前列腺增生和前列腺癌組織中的表達E2F3
[0105]
【權利要求】
1.一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，該E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法包括: 步驟一，通過收集不同前列腺癌石蠟標本，採用real-timePCR、WESTERN、免疫組化，分析E2F3及其所調基因在前列腺癌中的表達情況； 步驟二，建立以AVV為載體的RNAi平臺，並分析幹擾序列對前列腺癌LNCaP細胞中E2F3基因沉默的影響； 步驟三，並經體外實驗證實E2F3基因沉默對LNCaP細胞中E2F3及相關調控基因的影響及對細胞增殖及凋亡的影響；應用裸鼠進行原位前列腺癌動物模型的構建； 步驟四，應用AAV幹擾載體進行腫瘤的局部注射後明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質水平的表達情況及對腫瘤生長抑制情況，最後應用實時定量PCR進行全血E2F3mRNA的檢測，明確作為前列腺癌腫瘤標記物的可能性。
2.如權利要求1所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，該E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法具體包括以下步驟: 第一步，取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預後之間的關係，根據Gleason分級和評分標準進行病理分級並根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期； 第二步，合成三對針對於E2F3基因的siRNA對應模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的幹擾片段；根據篩選結果，將相應shRNA表達框克隆到腺相關病毒載體中，包裝純化病毒後，轉染膀胱移行細胞癌腫瘤細胞株，檢測病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細胞增殖凋亡相關指標； 第三步，採用LNCaP細胞在裸鼠前列腺前頁進行接種，建立原位前列腺癌動物模型。
3.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預後之間的關係；根據Gleason分級和評分標準進行病理分級並根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期。
4.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，針對E2F3的AAV幹擾穿梭質粒的構建及病毒的包裝、濃縮與純化包括以下步驟: 步驟一，對已製備的E2F3RNAi質粒載體進行雙酶切，插入幹擾片斷後，將U6_RiE2F3序列PCR後克隆進T載體，然後亞克隆至pAAV-MCS ;酶切、PCR、測序驗證載體構建成功並證明ITR的存在； 步驟二，待AAV-293細胞達到70% -80%融合後，分別將幹擾穿梭質粒與pRC、pHelper按照1:1:1濃度與細胞電轉，24小時後收集細胞； 步驟三，採用氯仿處理-PEG/NaCl沉澱-氯仿抽提三個步驟分離、濃縮、純化病毒； 步驟四，應用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測病毒純度；將純化的病毒經鎢酸鹽染色後，置於150目的鎳網上,掃描電鏡觀察。
5.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，含有幹擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的方法包括: 步驟一，對LNCaP細胞進行病毒轉染，通過綠色螢光的觀察、重組病毒載體與質粒載體在轉化效率、沉默效率、細胞毒性； 步驟二，rAAV幹擾載體對LNCaP細胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質表達水平的影響； 步驟三，接種LNCaP細胞於24孔板中，待細胞80-90 %融合，棄培養液，並向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察幹擾效果，不同濃度及不同作用時間的rAAV-RiE2F3幹擾載體對LNCaP細胞中E2F3沉默的影響及細胞殺傷作用； 步驟四，應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉染前後LNCaP細胞細胞周期及凋亡的變化情況。
6.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，裸鼠原位前列腺癌模型的建立包括以下步驟: 步驟一，將LNCaP細胞進行消化後濃度調整至I X 107個/ml，置於無菌Eppendorf管內，冰塊上送到動物房中； 步驟二，裸鼠前列腺位置的確定:取仰臥位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮膚，下腹正中切口，從兩側分離到精囊及輸精管，沿著輸精管向下游離至膀胱頸，暴露前列腺；選擇該葉作為LNCaP細胞的種植位置； 步驟三，應用細胞懸液種植腫瘤細胞後定期觀察裸鼠體重變化，並且進行成瘤情況的判定，應用免疫組化的方法驗證前列腺癌動物模型的成功建立。
7.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，含有幹擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的方法包括: 步驟一，應用rAAV幹擾載體進行腫瘤局部注射並於治療後4周處死裸鼠，觀察腫瘤大小及重量的變化；觀察病毒作用後對裸鼠各個臟器組織學影響； 步驟二，rAAV幹擾載體對原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白質表達水平的影響；檢測E2F3基因沉默後其下遊調控基因的表達情況； 步驟三，應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP注射前後腫瘤細胞細胞周期及凋亡的變化情況；應用電鏡技術了解AAV幹擾病毒對腫瘤細胞超微結構的影響； 步驟四，用摘眼球放血方法收集裸鼠血液標本，應用實時定量PCR比較不同組間全血E2F3基因mRNA表達情況。
8.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特徵在於，E2F3在前列腺癌組織中的表達與AR的異常表達具有相關性；構建前列腺原位癌模型並通過腹腔注射幹擾病毒的方法，抽取種植成功小鼠靜脈血檢測mRNA表達情況發現治療組外周血標本中E2F3mRNA表達明顯下降；治療組中前列腺腫瘤提及明顯縮小。
【文檔編號】C12N15/864GK104131088SQ201410334972
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】胡海龍, 孫巖, 陳濤, 謝林國 申請人:天津市泌尿外科研究所