禽類及禽蛋中表達的外源蛋白質的製作方法

2023-09-19 23:32:00 2

專利名稱：禽類及禽蛋中表達的外源蛋白質的製作方法
發明人R.D.伊瓦瑞，A.J.哈維，J.A.莫裡斯，G.劉和J.C.拉普背景技術a)發明領域本發明涉及將外源遺傳物質導入禽類細胞以及使外源遺傳物質在細胞中表達的載體和方法。本發明還涉及轉基因禽類，包括雞和火雞，以及含有外源蛋白質的禽蛋。
b)相關領域描述很多天然和合成的蛋白質已用於診斷和治療性應用；很多其他蛋白質正處於開發或臨床試驗階段。現有的蛋白質生產方法包括從天然來源中分離以及在細菌和哺乳動物細胞中重組生產。然而，因為這些蛋白質生產方法的複雜性和高成本，人們正在開發其他的方法。例如，已報導了在豬、綿羊、山羊和牛的奶中生產外源蛋白質的方法。這些方法有幾個局限性，包括創始動物和產生轉基因動物群體之間長時間傳代次數，大量的管理和醫療成本，以及由於基因組中轉基因插入位點的位置效應所致表達水平的變化。也正在利用大麥和黑麥的碾磨和麥芽工藝生產蛋白質。然而，植物的翻譯後修飾與脊椎動物的翻譯後修飾有所不同，這種不同常對外源蛋白質的功能產生決定性影響。
將輸卵管作為生物反應器如組織培養和乳腺生物反應器一樣，禽類的輸卵管也可能作為生物反應器。修飾禽類遺傳物質使高水平分泌外源蛋白質並包裝於禽蛋中的方法成功使得能便宜地生產大量蛋白質。這種方法有幾個優點a)減少了傳代次數(24周)和通過人工授精可快速建立轉基因群體；b)容易通過增加群體大小擴大生產規模以滿足產品需求；c)所表達蛋白質可經歷翻譯後修飾；4)可自動餵養和收集蛋；d)卵清天然無菌；和e)由於卵清中蛋白質的濃度高從而降低了工藝成本。
禽類包括雞的生殖系統已有很好的描述。母雞的蛋由經過輸卵管時被分泌於卵黃上的幾層組成。蛋的產生開始於母雞卵巢中大卵黃的形成。然後未受精的卵母細胞定位於卵黃囊上部。隨著排卵或卵黃從卵巢中排出，卵母細胞進入輸卵管漏鬥時，如果有精子，卵母細胞受精，然後進入有管狀腺體細胞排列的輸卵管蛋白分泌部(magnum)。這些腺體細胞可向蛋白分泌部腔中分泌卵清蛋白質，包括卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白、伴白蛋白和卵粘蛋白，在腔中這些蛋白質沉積於禽胚胎和卵黃上。
卵白蛋白基因編碼一種在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞中特異表達的45kD的蛋白質，(Beato，Cell56335-344(1989))。卵白蛋白是含量最豐富的卵清蛋白質，包括50％以上的管狀腺體細胞產生的總蛋白質，或每個大A級蛋約有4克蛋白質(Gilbert，「蛋的白蛋白及其形成」，Physiology and Biochemistry of theDomestic Fowl，Bell和Freeman，主編，科學出版社，倫敦，紐約，1291-1329頁)。已經克隆和分析了卵白蛋白基因及其每側區域20kb以上的序列(Lai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA752205-2209(1978)；Gannon等，Nature 278428-424(1979)；Roop等，Cell 1963-68(1980)；和Royal等，Nature279125-132(1975))。
對卵白蛋白基因的調控給予了很大關注。該基因響應甾體激素，例如雌激素、糖皮質激素和黃體激素，這些激素可誘導未成熟仔雞每個管狀腺體細胞累積產生約70,000個卵白蛋白mRNA轉錄物，和誘導成熟產蛋母雞每個管狀腺體細胞100,000個卵清蛋白mRNA轉錄物(Palmiter，J.Biol.Chem.2488260-8270(1973)；Palmiter，Cell 4189-197(1975))。轉染的管狀腺體細胞中的DNA酶超敏性分析和啟動子-報告基因試驗確定了一個7.4kb的區域含有卵白蛋白基因表達所需的序列。此5』側翼區含有四個從中心算起距離轉錄起始位點-0.25、-0.8、-3.2和-6.0kb的DNA酶I超敏感位點。這些位點分別稱為HS-I、-II、-III和-IV。這些區域反映了染色質結構的改變，並且與輸卵管細胞中卵白蛋白基因的表達特異性相關(Kaye等，EMBO 31137-1144(1984))。HS-II和-III的超敏性是雌激素誘導的，支持了這些區域在卵白蛋白基因表達的激素誘導中具有作用(的觀點)。
HS-I和-II都是卵白蛋白基因轉錄的甾體誘導所必需的，在移植的管狀腺細胞中，含有這些元件的5』區的一個1.4kb部分足以驅動甾體依賴的卵清蛋白表達(Sanders和McKnight，Biochemistry 276550-6557(1988))。HS-I稱為負響應元件(「NRE」)，因為它含有幾個在缺少激素時能抑制卵白蛋白表達的負調控元件(Haekers等，Mol.Endo.91113-1126(1995))。蛋白因子結合於這些元件，包括一些只在輸卵管核中發現的因子，提示這些因子在組織特異性表達中有作用。HS-II稱為甾體依賴的響應元件(「SDRE」)，因為它對啟動甾體誘導的轉錄是必需的。它可結合稱為Chirp-I的蛋白質或蛋白質複合體。Chirp-I受雌激素誘導並在環己胺的存在下迅速轉換(Dean等，Mol.Cell.Biol.162015-2024(1996))。利用移植的管狀腺體細胞培養系統進行的實驗確定了一套附加的以甾體依賴方式結合SDRE的因子，包括NFκB類似因子(Nordstrom等，J.Biol.Chem.26813193-13202(1993)；Schweers和Sanders，J.Biol.Chem.26610490-10497(1991))。
關於HS-III和-IV的功能了解極少。HS-III包括功能性雌激素響應元件，當它與雌激素受體cDNA共轉染入HeLa細胞時使卵清蛋白近端啟動子或異源啟動子具有雌激素誘導性。這些數據提示，HS-III可能在卵白蛋白基因的總體調控中起功能性作用。關於HS-IV的功能了解很少，只知道它不含有功能性雌激素響應元件。(Kato等，Cell 68731-742(1992))。
通過導入外源遺傳物質和/或打斷特定基因來修飾真核基因組引起了人們很大的興趣。已證明某些真核細胞可能是生產外源性真核蛋白質的優良宿主。導入編碼某些蛋白質的基因還可能產生具有更高經濟價值的新表型。此外，通過導入能使遺傳缺陷型細胞表達其不能產生的蛋白質的外源基因，可治療一些遺傳疾病。最後，通過插入或去除遺傳物質對動物基因組進行修飾，有助於基因功能的基礎研究，並可能最終導入用於治療疾病的基因，或者改進動物的表型。
轉基因動物已用幾種不同的方法實現了哺乳動物的轉基因。第一，在哺乳動物包括小鼠、豬、山羊、綿羊和牛中，將轉基因顯微注射入受精卵的原核，然後將受精卵放於代孕母體的子宮內，在其中受精卵發育成其種系中攜帶有轉基因的創始動物。用工程方法改造的轉基因攜帶有含特定調控序列指導外源蛋白質在特定類型細胞中表達的啟動子。因為轉基因是隨機插入基因組的，所以轉基因插入基因組位點的位置效應可能不同程度地引起轉基因表達水平的下降。該方法還要求對啟動子進行鑑定，以使指導在所需類型細胞中表達轉基因的必要序列得以確定並包含在轉基因載體中(Hogan等，小鼠胚胎操作，Cold Spring Harbor Laboratory，紐約(1988))。
產生動物轉基因的第二種方法是靶向基因打斷，該方法中，將攜帶側接有選擇標記基因的目的基因序列的靶向載體導入胚胎幹(「ES」)細胞。通過同源重組，該靶向載體替代了目的基因序列在染色體上的位置或插入序列內部阻止目標基因產物的表達。選出攜帶有正確打斷的基因的ES細胞克隆，然後將其注射入早期胚泡產生嵌合性創始動物，其中一些創始動物種系中攜帶有該轉基因。如果該轉基因刪除了目標位點，則該目標位點被轉基因載體中的外源DNA所替代，該外源DNA含有編碼用於選擇培養中經轉染ES細胞的選擇性標記基因的DNA，還可能含有編碼外源蛋白質的插入並替代被刪除基因，以使目標基因啟動子驅動該外源基因表達的DNA序列(美國專利Nos.5,464,764和5,487,992(M.P.Capecchi和K.R.Thomas))。該方法的局限性在於，ES細胞在很多動物中是不能獲得的，包括山羊、牛、綿羊和豬。而且，當被刪除的基因對於該生物或細胞型的生存或正常發育是必需時，此法不可行。
最近，禽類轉基因的發展已使我們可對禽類基因組進行修飾。可將複製缺陷型逆轉錄病毒注射入新產蛋的雞胚盤胚下腔中產生種系轉基因雞(美國專利號5,162,215；Bosselman等，Science243533-534(1989)；Thoraval等，TransgenicResearch 4369-36(1995))。可將攜帶有外源基因的逆轉錄病毒核酸隨機插入胚胎細胞的染色體中產生轉基因動物，其中一些轉基因動物種系中攜帶有轉基因。已有描述利用該插入融合基因構建物5』或3』區的絕緣子元件來克服插入位點的位置效應(Chim等，Cell 74504-514(1993))。
在另一種方法中，將轉基因顯微注射入受精卵胚盤中產生穩定的能將基因轉遞給F1代的轉基因創始禽(Love等，Bio/Technology1260-63(1994))。然而，該方法有幾點不足。為收集受精卵必須犧牲母雞，轉基因創始禽的份數低，注射的卵需要在代孕殼中花費大量勞動力體外培養。
在另一種方法中，將含有假定的原生殖細胞(「PGCs」)的胚盤細胞從供體卵切下，用轉基因轉染並導入受體胚的胚下腔。將該轉染的供體細胞摻入受體胚產生轉基因胚，預期其中一些胚的種系中攜帶有轉基因。轉基因通過非同源重組隨機插入染色體位點。然而，用該方法還沒有產生轉基因創始禽類。
Lui，Poult.Sci.68999-1010(1995)，用含有卵黃原蛋白基因側接DNA序列的靶向載體刪除培養的雞胚盤細胞的部分固有基因。然而，還沒有證明這些細胞有助於形成種系並因此產生轉基因胚。此外，當被刪除的基因對於該生物或細胞型的生存或正常發育是必需的，此法不可行。
因此可見，需要一種能將可操作性連接有合適啟動子的外源DNA導入禽類基因組中的方法以實現外源基因有效表達的方法。而且，需要創建能在輸卵管中表達外源基因並將表達的外源蛋白質分泌到蛋中的種系修飾的轉基因禽類。
幹擾素1957年發現幹擾素時，它作為一種重要的抗病毒製劑受到歡迎。70年代後期，幹擾素開始與重組基因技術相結合。今天，幹擾素是癌症生物過程的複雜性以及對付這種複雜性的忍耐性和毅力價值的象徵。
引起癌症的異常基因包括至少三種類型第一種是癌基因，當其改變時促進了癌症特徵性的異常生長和分裂。第二，腫瘤抑制基因，當其改變時不能控制這種異常生長和分裂。第三，DNA修復基因，當其改變時不能修復致癌的突變。研究者推測體內大約有30-40種腫瘤抑制基因，各編碼產生一種蛋白質。這些蛋白質可能受到「主」腫瘤抑制蛋白質例如Rb(成視網膜細胞瘤，首先與其相關聯)和p53(與很多不同的腫瘤相關)的控制。實驗室證據提示，僅使這些腫瘤抑制基因之一回復到正常功能就可顯著降低惡性腫瘤的侵襲性。
發現幹擾素可抑制細胞生長時，激起了科學家們對幹擾素的極大興趣。另外，還發現幹擾素對免疫系統有某些正面作用。現在認為幹擾素與腫瘤抑制蛋白質類似它能抑制細胞尤其是惡性細胞的生長；阻抑許多癌基因和生長因子的作用；與其他生物製劑不同，它能抑制對於癌轉移過程很關鍵的細胞移動能力。
細胞間通信依賴於組織中所有結構組分發揮正常功能，信息通過以下結構組分傳遞基質、細胞膜、細胞骨架以及細胞自身。在癌中，細胞間的通信網絡受到破壞。如果細胞骨架被破壞，信息就不能傳輸到核中，核開始功能異常。因為核是癌基因或腫瘤抑制基因開啟或關閉的部位，這種功能異常可導致惡性腫瘤。當發生這種情況時，細胞開始不規則生長並且不分化。它們還可能開始移動並打擾其它細胞。據認為幹擾素可能與其他細胞外或細胞物質協同，恢復平衡和自身穩定，確保信息正確傳輸。幹擾素抑制生長、抑制移動能力、通過粘附分子增強細胞對環境響應的能力。它還糾正細胞骨架的缺陷和損傷。已發現幹擾素可阻抑新血管形成，新血管形成的起始步驟是惡性腫瘤生長非常所必需的。而且，它能阻抑纖維化，纖維化是對刺激很多不同類型細胞促進細胞生長所致傷害的一種反應，(KathrynL.Hale，Oncolog，幹擾素一種生物治療的演化，對細胞生物學的新看法)。
幹擾素是當動物細胞受到病毒侵犯時產生的，被釋放到血流或細胞間的液體中，誘導健康的細胞產生抗擊感染的酶。很多年以來，用於研究的人幹擾素的供應受到高成本提取技術的限制。然而1980年，通過遺傳工程可獲得更大量的這種蛋白質(即這種蛋白質的重組形式)。科學家們還確定體內可產生三種不同類型的幹擾素，分別稱為α(α)、β(貝塔)和γ(伽瑪)幹擾素。起初認為幹擾素是高度物種特異性的，但是現在知道，各種幹擾素可能在其他物種裡具有不同的活性範圍。α幹擾素(α-IFN)已被批准用於毛細胞白血病和C型肝炎的治療。還發現α-IFN對肝癌和肝硬化主要原因的慢性B型肝炎和生殖道疣及一些罕見的血和骨髓癌症有效。含有α-IFN的鼻噴霧劑可提供抗鼻病毒引起的感冒的某些保護力。人α-IFN屬於一個細胞外信號傳遞蛋白質家族，具有抗病毒、抗增殖和免疫調節活性。IFN-α蛋白質由人9號染色體上成簇的13個基因組成的多基因家族編碼。白細胞中大多數IFN-α基因受仙臺(Sendai)病毒誘導在mRNA水平上表達。另外，還發現在蛋白質水平至少能產生九種不同亞型的蛋白質。表達幾種類似的IFN-α蛋白質的生物學意義還不知道，然而，認為它們在抗病毒、生長抑制和自殺細胞刺激活性方面具有劑量上不相同的模式。現在，兩種IFN-α變體，IFN-α2a和IFN-α2b，已通過重組技術在大腸桿菌中大量生產並投入市場作為藥物。與天然的IFN-α不同，已發現這些重組的IFN-α產品在某些患者中具有免疫原性，這可能是因為IFN-α蛋白質的非天然形式所致。因此，對於IFN-α藥物的發展，不但需要鑑定正常人白細胞中表達的IFN-α亞型和變體，而且需要特徵分析它們可能的翻譯後修飾(Nyman等(1998)Eur.J.Biochem.253485-493)。
Nyman等(見上)研究了天然人IFN-α的糖基化。他們發現，仙臺病毒誘導後白細胞產生的九種亞型中有兩個是糖基化的，稱為IFN-α14c和IFN-α2b，與以前的研究一致。IFN-α14是唯一一個有潛在N-糖基化位點的IFN-α亞型，所述潛在糖基化位點為Asn2和Asn72，但實際上只有Asn72發生糖基化。IFN-α2在蘇氨酸106(Thr106)位發生O-糖基化。令人感興趣的是，其他的IFN-α亞型在這個位置不含有Thr。在該研究中，Nyman等釋放和分離了這些寡糖鏈並用質譜法和特異性糖苷酶消化分析了它們的結構。IFN-α2b和IFN-α14c在反相高效液相色譜(RP-HPLC)中均解析為三個峰。對RP-HPLC產生的IFN-α2b諸組分做電噴離子質譜(ESI-MS)分析顯示它們的分子量有所不同，提示這些組分代表了不同的糖形。每個組分釋放的O-聚糖的質譜分析證實了這一點。據估計，IFN-α2b含有約20％的核心2型五糖，約50％雙唾液酸和30％單唾液酸的核心1型聚糖。Nyman等的數據與以前的IFN-α2b糖基化的部分特徵一致(Adolf等，(1991)Biochem.J.276511-518)。IFN-α14c和IFN-α2b中糖基化的作用還不是很清楚。根據Nyman等(見上)，碳氫鏈對於其生物活性不重要，但是糖基化可能會影響該蛋白質的藥物動力學和穩定性。
人類基因組中至少有15種功能基因編碼IFN-α家族的蛋白質。胺基酸序列相似性一般位於90％的區域，這些分子在結構上緊密相關。IFN-α蛋白質含有166個胺基酸(IFN-α2除外，它有165個胺基酸)，特徵是含有四個保守的可形成兩個二硫橋的半胱氨酸殘基。諸IFN-α類的特徵為輕微酸性，缺少天門冬醯胺相連的糖基化識別位點(IFN-α14除外，它含有天門冬醯胺相連的糖基化識別位點)。已知有三種IFN-α2變體，它們在第23位和34位上胺基酸不同IFN-α2a(Lys-23，His-34)、IFN-α2b(Arg-23，His-34)和IFN-α2c(Arg-23，Arg-34)。其他兩種稱為IFN-ω1和IFN-β的人IFN是N-糖基化的，與IFN-α關係更遠。IFN-α、-β、-ω合起來稱為I類IFNs，它們能結合相同的高親和性細胞膜受體(Adolf等，(1991)，Biochem.J.276511-518)。
Adolf等(見上)利用單克隆抗體的特異性從人白細胞IFN中分離得到了天然的IFN-α2。他們通過免疫親和層析得到了具有期望的抗病毒活性純度95％的IFN-α2蛋白質。用反相HPLC分析天然的IFN-α2表明，該天然蛋白質可以分辨為親水性均比大腸桿菌產生的IFN-α2高的兩種成分。SDS/PAGE顯示，該蛋白質在分子質量上也是異質性的，可產生三條帶，所有條帶的電泳遷移率都低於相等的大腸桿菌產生的蛋白質。
Adolf等(見上)還推測天然的IFN-α2攜帶有O-連接的糖殘基。用鹼切割假定的多肽-糖鍵斷裂，產生的蛋白質是均質的，與重組蛋白質的分子量相同，證實了他們的假說。在蛋白水解斷裂後，分離和分析產生的片段，將天然和重組的蛋白質作進一步比較，使他們確定了一種候選的糖肽。該多肽的序列分析鑑定了Thr-106為O-糖基化位點。所有已發表的IFN-α2種類的胺基酸序列比較顯示，這個蘇氨酸殘基是IFN-α2獨有的。在其他所有IFN蛋白質中的相應位置上(107)為甘氨酸、異亮氨酸或穀氨酸。
大腸桿菌產生的IFN-α2製品缺少O-糖基化並且已在很多國家註冊為藥物。然而，缺少糖基化可能會影響治療應用的大腸桿菌產生的IFN-α2的免疫原性。研究顯示，16位接受酵母生產的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的患者中，4位產生了該蛋白質的抗體。令人感興趣的是，發現這些抗體能與在內源性粒細胞巨噬細胞集落刺激因子中受O-連接的糖基化保護但在該重組因子中暴露的表位反應(Adolf等，見上)。
類似地，描述了在患者長期治療之後誘導了針對重組大腸桿菌IFN-α2的抗體，據推測，天然IFN-α2比重組IFN-α2蛋白質的免疫原性低(Galton等，(1989)Lancet 2572-573)。
發明概述本發明提供用於將外源核酸序列穩定導入禽類基因組以表達外源序列來改變禽類表型或產生所需蛋白質的載體和方法。具體說，生產了在輸卵管中表達外源序列並使外源蛋白質沉積到蛋中的轉基因禽類。本發明包括含有外源蛋白質的禽蛋。本發明進一步提供可在轉基因禽類輸卵管中有效表達並沉積於禽蛋中的新形式幹擾素和促紅細胞生成素。
本發明的一個方面提供在禽類特定組織中產生外源蛋白質的方法。外源蛋白質可在禽類輸卵管血液和/或其他細胞和組織中表達。將轉基因導入胚胎胚盤細胞中，優選接近X期的胚盤細胞，產生轉基因禽類，從而在輸卵管蛋白分泌部的管狀腺體細胞中表達感興趣的蛋白質，分泌入腔中，沉積於硬殼蛋的卵清中。如此產生的轉基因禽類在其種系中攜帶有轉基因。因此，可通過將外源基因人工導入禽類胚胎細胞中和以孟德爾方式可將外源基因穩定傳遞給禽類後代，將外源基因轉入禽類。
本發明包括一種在禽類輸卵管中產生外源蛋白質的方法。該方法包括，第一步，提供含有編碼序列和操作性連接於該編碼序列的啟動子以使啟動子可影響該核酸在禽類輸卵管中表達的載體。下一步，創建轉基因細胞和/或組織，其中，將所述載體導入新分離的、培養中或胚胎中的禽胚胎胚盤細胞，以使該載體序列隨機插入禽基因組。最後，由轉基因的細胞和/或組織產生成熟的在輸卵管中表達外源蛋白質的轉基因禽類。當輸卵管中表達的外源蛋白質也被分泌到輸卵管腔並沉積於硬殼蛋的卵清中時，該方法也可用於生產含有外源蛋白質的禽蛋。
一方面，通過載體隨機插入到禽類基因組染色體產生轉基因雞，可任選地包括用DNA轉染胚胎胚盤細胞，然後將這些細胞注射入受體胚盤下的胚下腔。該方法所用的載體含有融合於外源編碼序列並指導該編碼序列在輸卵管管狀腺體細胞中表達的啟動子。
本發明的另一方面，通過在逆轉錄病毒載體的5』和3』LTRs之間攜帶有轉基因遺傳密碼的複製缺陷型或可複製型逆轉錄病毒顆粒轉導胚胎胚盤細胞，獲得隨機染色體插入和產生轉基因禽類。例如，可利用含有經修飾的含有插入到啟動子區段下遊的外源基因的pNLB質粒的禽白血病病毒(ALV)逆轉錄病毒載體或鼠白血病病毒(MLV)逆轉錄病毒載體。可用包裝在病毒顆粒中的經修飾的逆轉錄病毒載體的RNA拷貝感染胚胎胚盤發育為轉基因禽類。或者，將能產生逆轉錄病毒轉導顆粒的輔助細胞導入胚胎胚盤。
本發明的另一方面提供一種含有編碼序列和操作及位置上相關可使該編碼序列在禽類輸卵管中表達的啟動子的載體。此載體包括，但不限於，禽白血病病毒(ALV)逆轉錄病毒載體、鼠白血病病毒(MLV)逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。該啟動子能充分驅動此編碼序列在禽類輸卵管中的有效表達。此編碼序列編碼可沉積於硬殼蛋卵清中的外源蛋白質。此編碼序列編碼的外源蛋白質可以是如轉基因禽可產生的幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)或轉基因禽類可產生的促紅細胞生成素(TPDEPO)。本發明方法中所用的載體含有尤其適於外源蛋白質在禽類和禽蛋中表達的啟動子。這樣，此外源編碼序列的表達發生在轉基因禽類的輸卵管和血液中以及禽蛋的卵清中。所述啟動子包括但不限於，巨細胞病毒(CMV)啟動子，MDOT啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子，鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子，卵白蛋白啟動子，溶菌酶啟動子，伴白蛋白啟動子，卵類粘蛋白啟動子，卵粘蛋白啟動子和卵轉鐵蛋白啟動子。任選地，該啟動子可以是至少一種啟動子區的一個區段，例如，卵白蛋白啟動子，溶菌酶啟動子，伴白蛋白啟動子，卵類粘蛋白啟動子，卵粘蛋白啟動子和卵轉鐵蛋白的啟動子區的一個區段。
本發明的一個方面包括將卵白蛋白啟動子截短和/或將卵白蛋白啟動子的關鍵調控元件壓縮使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞中表達所需的序列，同時使其足夠小而易於摻入載體。例如，可利用卵白蛋白啟動子區的一個區段。卵白蛋白啟動子區段的總長度約0.88kb-7.4kb，優選長0.88kb-1.4kb。優選該區段含有卵清蛋白基因甾類依賴性調控元件和負調控元件。任選地，此區段也可包括卵白蛋白基因的5』非翻譯區(5』UTR)殘基。或者，該啟動子是溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類粘蛋白基因、卵粘蛋白基因和卵轉鐵蛋白基因啟動子區的一個區段。此類啟動子的一個例子是合成的含有卵類粘蛋白(MD)啟動子和卵轉鐵蛋白(OT)啟動子元件的MDOT啟動子。
本發明的另一方面，整合入禽類基因組的載體含有操作上連接於外源編碼序列的組成型啟動子(例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子)。或者，可使用非組成型啟動子例如鼠乳腺腫瘤(MMTV)啟動子。
本發明的其他方面提供在其種系組織的遺傳物質中攜帶有轉基因的轉基因禽類。更具體說，該轉基因包含外源基因和操作及位置上與外源基因相關的啟動子以表達此外源基因。所述外源基因在轉基因禽的輸卵管和血液中表達。該外源基因編碼外源蛋白質例如TPD IFN-α2b或TPD EPO。該外源蛋白質可沉積於硬殼蛋的卵清中。
本發明的另外一方面提供的禽蛋含有對於該禽類為外源性的蛋白質。利用本發明可使外源蛋白質在輸卵管細胞中表達，分泌到輸卵管蛋白分泌部腔並沉積於禽蛋的卵清中。包在禽蛋中的蛋白質量可達到每隻蛋1克或更多。所述外源蛋白質包括，但不限於，TPD IFN-α2b和TPD EPO。
本發明的另外一方面提供分離的包含人幹擾素-α2b(IFN-α2b)最佳編碼序列，即編碼轉基因禽可產生的幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)的重組轉基因禽產生的幹擾素-α2b編碼序列的多聚核苷酸序列。本發明還包括分離的包含TPDIFN-α2b多肽序列的蛋白質，其中該蛋白質的Thr-106位被N-乙醯基-氨基半乳糖、半乳糖、N-乙醯基-葡糖胺、唾液酸和其組合物O-糖基化。
本發明還設想一種包含TPD IFN-α2b多肽序列的藥物組合物，其中的蛋白質在Thr-106位被N-乙醯基-氨基半乳糖、半乳糖、N-乙醯基-葡糖胺、唾液酸和其組合物O-糖基化。
本發明的另外一方面提供一種分離的包含人促紅細胞生成素(EPO)最佳編碼序列，即編碼轉基因禽類可產生的促紅細胞生成素(TPD EPO)的重組轉基因禽產生的促紅細胞生成素編碼序列的多聚核酸序列。
本發明的另外一方面提供一種含有第一和第二編碼序列及操作和位置上與該第一和第二編碼序列相關的可在禽類輸卵管中表達該第一和第二編碼序列的啟動子的載體。該載體還包含位於該第一和第二編碼序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)元件，其中，第一編碼序列編碼蛋白質X，第二編碼序列編碼蛋白質Y，蛋白質X和蛋白質Y沉積於硬殼蛋的卵清中。例如，蛋白質X可以是單克隆抗體的輕鏈(LC)，蛋白質Y可以是單克隆抗體的重鏈(HC)。或者，第二編碼序列編碼的蛋白質(例如，酶)能對第一編碼序列編碼的蛋白質進行翻譯後修飾。該載體任選地可含有其它的編碼序列和其它IRES元件，通過IRES元件將載體中的每個編碼序列與其他編碼序列分開。
本發明還涉及一種生產含有蛋白質如單克隆抗體、酶或其他蛋白質的禽蛋的方法。這種方法包括提供含有啟動子、編碼序列和至少一個IRES元件的載體；通過將該載體導入禽類胚胎胚盤細胞產生轉基因細胞或組織，其中，該載體序列隨機插入禽類基因組；由轉基因細胞或組織產生成熟的轉基因禽類。如此產生的轉基因禽類能在其輸卵管中表達所述編碼序列，將產生的蛋白質分泌入輸卵管腔中，從而沉積於硬殼蛋的卵清中。
附圖簡要說明

圖1A和1B，顯示卵白蛋白啟動子表達載體，該載體含有卵白蛋白啟動子片段和編碼序列即編碼外源蛋白質X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質。
圖2A、2B、2C和2D，顯示本發明的逆轉錄病毒載體，該載體含有卵白蛋白啟動子和編碼序列即編碼外源蛋白質X的基因X。X代表感興趣的任何外源基因或外源蛋白質。
圖2E，顯示擴增用於插入2A和2B載體中外源基因的方法。
圖2F，顯示逆轉錄病毒載體，該載體含有控制編碼序列，基因X表達的卵白蛋白啟動子。該載體還包含內部核糖體進入位點(IRES)元件，以使第二編碼序列，基因Y能夠表達。X和Y代表感興趣的任何基因。
圖3A和3B，分別顯示ALV衍生的載體pNLB和pNLB-CMV-BL的示意圖。因為NLB還沒有完全測序，bp(鹼基對)的測量是從已發表的數據(Cosset等，1991；Thoraval等，1995)和本文討論的數據估計的。因為整合入雞的基因組時將出現這兩個載體，所以顯示了它們。
圖4A和4B，顯示嵌合和轉基因雞血清中β-內醯胺酶(內醯胺酶)的量。圖4A中，孵化後8個月測定的以NLB-CMV-BL轉基因轉導的G0雞血清中生物活性內醯胺酶濃度。示出了世代、性別和翅圈號碼。測定了孵化後6至7個月G1轉基因雞的內醯胺酶血清濃度。箭頭表示從公雞2395繁殖產生的G1雞。在圖4B中，測定了G1和G2轉基因雞的內醯胺酶血清濃度。箭頭表示從母雞5657或公雞4133繁殖產生的G2雞。雞4133、5308和5657的樣品與圖4A中的相同。收集5657繁殖的G2雞的孵化後3至60天的樣品。收集4133繁殖的G2雞孵化後3個月的樣品。
圖5，顯示具有母雞5657(圖5A)或公雞4133(圖5B)所帶轉基因位點的雞的譜系。2395是攜帶有多個轉基因位點的公雞。將2395與一個非轉基因母雞交配，產生了3個各在其基因組的唯一位點攜帶有轉基因的後代。簡單起見，將未顯示表達數據的轉基因後代和非轉基因後代從譜系中略去。以下面的符號表示翅圈號碼○母雞；□公雞；●攜帶有NLB-CMV-BL轉基因的母雞；■攜帶有NLB-CMV-BL轉基因的公雞。
圖6，顯示母雞5657及其後代卵清中的β-內醯胺酶(內醯胺酶)量。圖6A中，檢測了5657及其轉基因後代卵清中的活性內醯胺酶。對照取自於未處理的母雞，連產雞(clutchmate)是從母雞5657繁殖的非轉基因G2雞。2000年三月收集雞蛋。箭頭表示從母雞5657繁殖的G2雞。圖6B中，將攜帶有一拷貝轉基因(半合子)的G2轉基因母雞的卵清樣品與攜帶有兩拷貝轉基因(純合)的G3母雞6978的卵清樣品進行了比較。2001年二月收集雞蛋。左邊標明了世代和翅圈號碼。
圖7，顯示從公雞4133繁殖的G2和G3母雞卵中的β-內醯胺酶(內醯胺酶)。圖7A中，檢測了從公雞4133繁殖的四個代表性半合子轉基因母雞卵清的活性內醯胺酶。收集蛋的時間分別是1999年10月，2000年3月和2001年2月，每次收集後一個月一隻母雞至少檢測4隻蛋。對照代表未處理母雞的卵清。左邊標明了翅圈號碼。計算每個時期四隻母雞的平均值。圖7B中，將半合子G2轉基因母雞的卵清與半合子和純合子轉基因G3母雞的卵清作比較。2001年2月收集雞蛋。每隻母雞的世代和轉基因拷貝數列於數據欄中。攜帶一個或兩個拷貝的母雞的平均濃度見該圖底部。
圖8A和8B，分別顯示用於在雞中表達IFN-α2b的pNLB-CMV-IFN載體和用於在雞中表達促紅細胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。
圖9，顯示轉基因禽產生的幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)的新糖基化模式，包括所有的6條帶。
圖10，顯示人外周血白細胞產生的幹擾素-α2b(PBL IFN-α2b或天然的hIFN)和轉基因禽產生的幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b或卵清hIFN)的比較。
圖11A，顯示優化的人幹擾素-α2b(IFN-α2b)的合成核酸序列(cDNA，殘基1-498)，即重組TPD IFN-α2b(SEQ ID NO1)。圖11B，顯示轉基因禽產生的幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)的合成核酸序列(殘基1-165)(SEQID NOS2)。
圖12A，顯示優化的人促紅細胞生成素(EPO)的合成核酸序列(cDNA，殘基1-579)，即重組TPD EPO(SEQID NO3)。圖12B，顯示轉基因禽產生的促紅細胞生成素(TPD EPO)的合成核酸序列(殘基1-193)(SEQID NO4)。(對於天然的人EPO，又見NCBI登錄號NP_000790)。
圖13，顯示與IFN-MM CDS相連接的合成MDOT啟動子。MDOT啟動子包含雞卵類粘蛋白基因(卵類粘蛋白啟動子)的-435bp至-166bp(見NCBI登錄號J00894)和雞伴白蛋白基因(卵轉鐵蛋白啟動子)的-251至+29bp(見NCBI登錄號Y00497，M11862和X01205)的元件。
圖14提供主要卵清蛋白質的小結。
圖15A和15D，顯示pCMV-LC-emcvIRES-HC載體，其中，為檢測單克隆抗體的表達，通過放置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES使該載體能表達人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)。與之相比，圖15B和15C分別顯示獨立的載體pCMV-HC和pCMV-LC，其中，這些載體也用於檢測單克隆抗體的表達。
發明詳述a)定義和一般參數提出下面的定義用於闡述和明確描述本發明所用的各種術語的含義和範圍。
「核酸或多聚核苷酸序列」包括，但不限於，真核生物的mRNA、cDNA、基因組DNA以及合成的DNA和RNA序列，包括天然的核苷鹼基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該術語還包括含有一個或多個經修飾鹼基的序列。
「編碼序列」或「開放閱讀框」指當置於合適的調控序列控制下可在體外或體內被轉錄和翻譯(如果是DNA)或翻譯(如果是mRNA)成多肽的多聚核苷酸或核酸序列。編碼序列的邊界由5』(氨基)末端翻譯起始密碼子和3』(羧基)末端翻譯終止密碼子界定。轉錄終止序列一般位於編碼序列的3』端。編碼序列的5』和/或3』末端可側接有非翻譯區。
「外顯子」指基因的一部分，當基因轉錄為核轉錄物時，該部分在核剪接除去內含子或間插序列後表達在細胞質mRNA中。
核酸「控制序列」或「調控序列」指啟動子序列、翻譯起始和終止密碼子、核糖體結合位點、聚腺苷酸信號、轉錄終止序列、上遊調控區、增強子等，它們對於在特定宿主細胞中轉錄和翻譯某給定編碼序列是必需的和充分的。適合真核細胞的控制序列例如有啟動子、聚腺苷酸信號和增強子。重組載體中不一定存在所有的這些控制序列只需存在對於所需基因的轉錄和翻譯必需和充分的控制序列，。
「可操作性或操作性連接於」指可發揮所需功能的編碼和控制序列的配置。因此，操作性連接於編碼序列的控制序列可影響該編碼序列的表達。在細胞中，編碼序列可操作性連接於或受控於轉錄調控區，在此區DNA聚合酶結合於啟動子序列，將編碼序列轉錄為可翻譯成蛋白質的mRNA。控制序列可不必與編碼序列毗連，只要它們可發揮功能指導編碼序列的表達。因此，例如，啟動子序列和編碼序列之間可以有間插的不翻譯但可轉錄的序列，而該啟動子序列仍認為是「可操作性連接於」該編碼序列。
對於核酸序列例如編碼序列和控制序列，術語「異源的」和「外源的」指正常情況下不與重組構建物的某區域或特定染色體位點相關的序列，和/或正常情況下不與特定細胞相關的序列。因此，核酸構建物的「外源」區域是在自然狀態下未發現與其相關連的其它核酸分子內或與該分子相連的核酸的可鑑定區段。例如，構建物的外源區域可包含與自然狀態下未與之相關連的序列相連的編碼序列。外源編碼序列的另一個例子是編碼序列本身是自然界中未發現的構建物(例如，合成的含有與天然基因不同的密碼子的序列)。類似地，用某宿主細胞正常情況下不存在的構建物轉化的該宿主細胞，對本發明而言認為是外源的。
本文所用「外源蛋白質」指自然狀態下不存在於特定組織或細胞中的蛋白質，外源表達構建物或轉基因表達產物是這種蛋白質，或在特定組織或細胞自然狀態下不以某確定數量存在的蛋白質。
「內源基因」指自然發生的因此正常情況下與特定細胞相關的基因或片段。
本文所述的表達產物可包括具有確定化學結構的蛋白質物質。然而，精確的結構取決於很多因素，尤其是對於蛋白質很普遍的化學修飾。例如，因為所有的蛋白質都含有可電離的氨基和羧基基團，所以可獲得酸性或鹼性鹽形式或中性形式的蛋白質。例如，可用糖分子(糖基化)或其它化學方法包括例如與脂、磷酸、乙醯基團等共價結合或離子結合，經常通過與糖連接的化學衍生方法來產生一級胺基酸序列。這些修飾可發生在體外或體內，後者是宿主細胞通過翻譯後加工系統進行的。這些修飾可增加或降低分子的生物活性，這些化學修飾的分子也包括在本發明的範圍內。
克隆、擴增、表達和純化的其他方法對本領域技術人員是顯而易見的。代表性方法見Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室指南，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)。
「載體」指包括單鏈、雙鏈、環狀或超螺旋DNA或RNA的多聚核苷酸。一個典型載體可包含以下操作性連接於適宜位置能使功能基因表達的元件複製起始位點、啟動子、增強子、5’mRNA引導序列、核糖體結合位點、核酸盒(Nucleic acidcassette)、終止位點和聚腺苷酸位點以及選擇性標記序列。在具體應用時可省略一個或多個此類元件。核酸盒可包含供待表達核酸序列插入的限制性位點。在功能性載體中，核酸盒包含含有翻譯起始位點和終止位點的待表達核酸序列。構建物中可任選地包含內含子，優選地距編碼序列5』≥100bp。構建載體時要使特定的編碼序列和合適的調控序列位於該載體中，編碼序列相對於調控序列的位置和方向應使得編碼序列在調控序列或調控序列的控制下轉錄。為實現這一目的，可能需要對編碼特定感興趣蛋白質的序列進行修飾。例如，在有些情況下可能需要修飾該序列使其以正確方向與控制序列相連，或使其保持讀碼框。在插入載體之前將控制序列和其他調控序列與編碼序列連接。或者，將編碼序列直接克隆到已含有控制序列和該控制序列調控下的合適的讀碼框中的限制性位點的表達載體。
「啟動子」是DNA上可與RNA聚合酶結合從而啟動基因轉錄的位點。在有些實施方式中，通過添加或刪除序列來修飾啟動子，或者以其它序列包括天然和合成序列以及這兩種序列的組合物來替代啟動子。很多真核啟動子含有兩種類型的識別序列TATA盒和上遊啟動子元件。前者，位於轉錄起始位點上遊，參與指導RNA聚合酶在正確的位置啟動轉錄，而後者似乎決定了轉錄速率，位於TATA盒上遊。增強子也可促進相連啟動子的轉錄，但很多增強子只在特定細胞型中發揮功能。很多增強子/啟動子元件來源於病毒，例如，SV40啟動子，巨細胞病毒(CMV)啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和鼠白血病病毒(MLV)啟動子均在很多細胞型中有活性，被稱為「組成型」或「遍在型」啟動子。或者，本發明中也可採用非組成型啟動子例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子。插入克隆位點的核酸序列可含有編碼感興趣多肽的任何開放讀碼框，條件是當該編碼序列編碼感興趣的多肽時，它應該沒有可阻礙產生正確mRNA分子和/或產生異常剪接的或異常mRNA分子的隱蔽剪接位點。
「標記基因」指編碼使正確轉染的細胞得以鑑定和分離的蛋白質的基因。適宜的標記基因包括，但不限於綠色、黃色和藍色螢光蛋白基因(分別為GFP、YFP、BFP)。其他適宜的標記基因包括胸苷激酶(tk)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因。後者引入對氨基甙類抗菌素如卡那黴素、新黴素和硫酸慶大黴素的抗性。可將這些和其他標記基因例如編碼氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(β-gal)的基因，與表達所需蛋白質的基因一起整合入一級核酸盒，或者選擇標記可能包含在獨立的載體上共轉染。
「報告基因」是通過其編碼的蛋白質的存在來「報告」其在細胞中的活性的一種標記基因。
「逆轉錄病毒顆粒」，「轉導顆粒」(transducing particle或transductionparticle)指能夠將非病毒的DNA或RNA轉導入細胞的複製缺陷型或可複製的病毒。
術語「轉化」、「轉導」和「轉染」都表示將多肽導入禽類胚盤細胞。
「蛋白分泌部」(Magnum)是含有能合成和分泌禽蛋的卵清蛋白質的管狀腺體細胞的輸卵管漏鬥和峽之間的部分。
本文所用「MDOT啟動子」是在輸卵管蛋白分泌部而非其它組織的管狀腺體細胞中有活性的合成啟動子。MDOT包含卵類粘蛋白(MD)和卵轉鐵蛋白(OT)啟動子的元件(圖13)。
在「優化的編碼序列」中用到術語「優化的」，其中，可利用在卵清蛋白質卵清蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白的各特定胺基酸最常用的密碼子設計優化的人幹擾素-α2b(IFN-α2b)的多聚核苷酸序列將其被插入本發明載體中。更具體地，優化的人幹擾素-α2b的DNA序列可根據母雞輸卵管優化密碼子的使用率通過Wisconsin Package 9.1版(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創建。例如，在這四種卵清蛋白質中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，將GCU作為優化的人IFN-α2b編碼序列中的大多數丙氨酸的密碼子。用含有編碼優化的人IFN-α2b基因的載體來產生轉基因禽，其能在組織和卵中表達轉基因禽產生的IFN-α2b(TPD IFN-α2b)。類似地，用以上方法設計優化的人促紅細胞生成素(EPO)多聚核苷酸序列來產生轉基因禽類，其能在組織和蛋中表達轉基因禽產生的促紅細胞生成素(TPD EPO)。
b)新載體和胚盤細胞的轉基因通過本發明的方法，可將轉基因導入禽類胚胎胚盤細胞，產生在其種系組織的遺傳物質中攜帶有該轉基因的轉基因雞或火雞或其他禽類。胚盤細胞是典型的VII-XII期細胞，或與之相等的細胞，優選的是近X期的細胞。可用於本發明的細胞包括胚胎生殖細胞(EG)、胚胎幹細胞(ES)和原生殖細胞(PGCs)。胚胎胚盤細胞可以是新分離的、保持在培養中的或胚胎中的。
本文描述了可用於實施本發明方法的載體。可用這些載體將外源編碼序列穩定導入禽類基因組。或者，可用這些載體在禽類特定組織尤其是輸卵管中生產外源蛋白質。還可將這些載體用於生產含有外源蛋白質的禽蛋的方法中。在一個優選實施方式中，所述載體是逆轉錄病毒載體，編碼序列和啟動子均位於逆轉錄病毒載體的5』和3』LTRs之間。在另一個優選實施方式中，該逆轉錄病毒載體來源於禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病毒(MLV)或慢病毒。在另一個優選實施方式中，該載體包含操作性連接於編碼序列的信號肽編碼序列，從而在細胞中翻譯後該信號肽將指導該載體表達的外源蛋白質分泌入硬殼蛋的卵清中。在另一個優選實施方式中，該載體還包含標記基因，其中所述標記基因操作性連接於該啟動子。
在有些情況下，將本發明的載體導入胚胎胚盤細胞是用新分離的或培養中的胚胎胚盤來進行的。然後，一般是將轉基因細胞注射入蛋的受體胚盤下的胚下腔。然而在有些情況下，可將載體直接送入胚盤胚的細胞。
在本發明的一個實施方式中，用於轉染胚盤細胞並產生隨機穩定整合入禽基因組的載體含有某編碼序列和操作及位置上相關的啟動子，以在禽類輸卵管蛋白分泌部的管狀腺體細胞中表達該編碼序列，其中，該編碼序列編碼一種可沉積於硬殼蛋卵清中的外源蛋白質。任選地，啟動子可以是卵白蛋白啟動子區的一個足夠大的區段以指導編碼序列在管狀腺體細胞中表達。本發明包括將卵白蛋白啟動子截短和/或將卵白蛋白啟動子的關鍵調控元件壓縮，以使其保留在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞中表達所需的序列，同時使其足夠小易於與載體整合。在一個優選實施方式中，可利用卵白蛋白啟動子區的一個區段。該區段包含卵清蛋白基因的5』側翼區域。卵白蛋白啟動子區段的總長度為0.88kb-7.4kb，優選0.88kb-1.4kb。優選該區段含有卵清蛋白基因甾類依賴性調控元件和負調控元件。任選地，該區段也包含卵白蛋白基因的5』非翻譯區(5』UTR)殘基。因此，該啟動子可來源於卵白蛋白基因、溶菌酶基因、伴白蛋白基因、卵類粘蛋白基因、卵轉鐵蛋白基因或卵粘蛋白基因的啟動子區(圖.14)。此類啟動子的一個例子是包含卵類粘蛋白啟動子和卵轉鐵蛋白啟動子元件的合成性MDOT啟動子(圖.13)。該啟動子也可以是很大程度上但是不完全是對輸卵管蛋白分泌部特異性的，例如溶菌酶啟動子。該啟動子也可以是鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子。或者，該啟動子可以是組成型啟動子(例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子，羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子等)。在本發明的一個優選實施方式中，該啟動子是巨細胞病毒(CMV)啟動子、MDOT啟動子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠白血病病毒(MLV)啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子和卵轉鐵蛋白啟動子。任選地，該啟動子可以至少是啟動子區的至少一個區段，例如卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子和卵轉鐵蛋白啟動子區的一個區段。在一個更優的實施方式中，該啟動子是CMV啟動子。
圖.1A和1B說明了卵白蛋白啟動子表達載體例子。基因X是編碼外源蛋白質的編碼序列。彎曲箭頭表示轉錄起始位點。在一個實施例中，此載體含有卵白蛋白基因1.4kb的5』側翼序列(圖.1A)。圖.1A「-1.4kb啟動子」序列對應於從卵白蛋白基因轉錄起始位點上遊約1.4kb開始延伸到卵白蛋白基因5』非翻譯區約9個殘基的序列。這個約1.4kb長的區段含有兩個關鍵調控元件，甾類依賴性調控元件(SDRE)和負調控元件(NRE)。之所以稱為NRE是因為它含有幾個在缺少激素(例如雌激素)時可阻斷基因表達的負調控元件。一個更短的0.88kb區段也可含有這兩種元件。在另一個實施例中，此載體含有卵白蛋白基因約7.4kb的5』側翼序列並含有兩個附加元件(HS-III和HS-IV)，已知其中一個含有可使該基因響應雌激素誘導的功能區(圖.1B)。一個更短的6kb區段也含有這四個元件，可任選地用於本發明。
用於本發明隨機整合的每個載體優選包含至少一個1.2kb的雞β-珠蛋白基因位點元件，該元件可使基因在插入基因組的位點既不活化也不失活。在一個優選的實施方式中，將兩個絕緣子元件加入到卵白蛋白基因構建物的一端。在β-珠蛋白位點中，此絕緣子元件作用是阻止遠端位點控制區(LCR)活化珠蛋白基因區上遊的基因，並且已顯示可克服轉基因蠅中的位置效應，表明它們可防止插入位點的正效應和負效應。只有在該基因的5』或3』末端才需要絕緣子元件，因為轉基因是以多拷貝串聯形式整合有效產生了一系列側翼連接有相鄰轉基因的絕緣子的基因。在另一個實施方式中，絕緣子元件不連於該載體而是和該載體共轉染。這種情況下，所述載體和元件通過隨機整合入基因組的過程在細胞中串聯連接。
任選地，每個載體還可包含標記基因以鑑定和富集已穩定整合表達載體的細胞克隆。用能驅動各類細胞型高水平表達的遍在啟動子驅動該標記基因的表達。在本發明的一個優選實施方式中，該標記基因是受溶菌酶啟動子驅動的人幹擾素(基因)。在另一個實施方式中，是受蟾蜍延伸因子1-α(ef-1α)啟動子(Johnson和Krieg，Gene 147223-26(1994))驅動的綠色螢光蛋白(GFP)報告基因(Zolotukhin等，J.Virol 704646-4654(1995))。蟾蜍ef-1α啟動子是一種能在各類細胞中都表達的強啟動子。GFP含有能增強螢光的突變並且已被人源化或修飾以使其密碼子符合人基因的密碼子使用特點。因為事實上禽類的密碼子使用率和人的一樣，所以該基因的人源化形式也能在禽類胚盤細胞中高表達。在其他可選的實施方式中，該標記基因可操作性連接於遍在啟動子HSV tk，CMV，β-肌動蛋白或RSV中的一個。
人和禽類的密碼子使用率相配很好，當用無脊椎動物的基因作為轉基因中的編碼序列時，可修飾無脊椎動物的基因序列以改變適當的密碼子從而使密碼子使用率與人和禽類的相似。
可採用本領域普通技術人員所知的任何幾種方法轉染胚盤細胞。首先將核酸與聚賴氨酸或陽離子脂混和以促進載體穿過細胞膜從而幫助將載體導入細胞。然而，優選通過採用輸送運運載體例如脂質體或病毒將載體導入細胞。用於將本發明載體導入胚盤細胞的病毒包括，但不限於，逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒和牛痘病毒。
在轉染胚盤細胞的一種方法中，用包裝的逆轉錄病毒載體將該載體運送進胚胎胚盤細胞以使該載體整合入禽類基因組。
向胚胎中的胚胎胚盤細胞運送逆轉錄病毒轉導顆粒的另一種方法，可將能產生逆轉錄病毒的輔助細胞運送入胚盤。
用於將轉基因隨機插入禽類基因組的優選逆轉錄病毒是複製缺陷型禽類白血病病毒(ALV)、複製缺陷型鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。為了產生合適的逆轉錄病毒載體，將卵白蛋白啟動子的一個區域和一個或多個外源基因插入逆轉錄病毒基因組的5』和3』長末端重複(LTRs)之間以修飾pNLB載體。因為卵白蛋白啟動子驅動卵清蛋白的表達且在輸卵管管狀腺體細胞中有活性，所以置於卵白蛋白啟動子下遊的任何編碼序列都將能在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞中表達。雖然在培養的輸卵管管狀腺體細胞中檢測時，發現7.4kb的卵白蛋白啟動子產生活性最高的構建物，然而用於逆轉錄病毒載體時優選將卵白蛋白啟動子縮短。在一個優選的實施方式中，所述逆轉錄病毒載體含有卵白蛋白啟動子的1.4kb片段；0.88kb區段也是足夠的。
任選地，本發明的任何載體也可任選包含信號肽的編碼序列，該信號肽可指導載體中編碼序列表達的蛋白質從輸卵管管狀腺體細胞分泌出來。本發明的這一方面有效地擴大了利用本發明方法可沉積於禽蛋的外源蛋白質的範圍。當一種外源蛋白質不能分泌時，可修飾攜帶其編碼序列的載體使其含有溶菌酶基因的60bp編碼信號肽的DNA序列。可將編碼該信號肽的DNA序列插入載體中並使其位於該cDNA編碼蛋白質的N端。
圖.2A-2D說明合適的逆轉錄病毒載體構建物例子。此載體構建物與5』和3』LTRs一起插入禽類基因組。Neo是新黴素磷酸轉移酶基因。彎曲箭頭表示轉錄起始位點。圖.2A和2B說明LTR和攜帶有編碼溶菌酶信號肽(LSP)的序列的輸卵管轉錄物，而圖.2C和2D說明沒有這種序列的轉錄物。逆轉錄病毒載體策略有兩部分。可將含有真核生物信號肽的任何蛋白質克隆入圖.2B和2D所示載體中。可將通常不能分泌的任何蛋白質克隆入圖.2A和2B所示載體以使其能由管狀腺體細胞分泌。
圖.2E說明將外源蛋白質克隆入溶菌酶信號肽載體的策略。用一對含有可使擴增的基因在雙酶切後插入質粒中限制性酶切位點的寡聚核苷酸作為引物，利用聚合酶鏈式反應擴增編碼序列，基因X的一個拷貝。5』和3』寡聚核苷酸分別含有Bsu36I和Xba1限制性位點。
本發明的另一方面包括在本發明的任何載體中利用內部核糖體進入位點(IRES)以從雙順反子或多順反子mRNA中翻譯兩種或多種蛋白質(實施例15)。將IRES單元融合於一種或多種其它的編碼序列的5』末端，然後插入載體中原始編碼序列的末端，從而通過IRES使這些編碼序列彼此分開(圖.2F，15A和15D)。按照本發明的這一方面，有利於產物的翻譯後修飾，因為一個編碼序列編碼的酶能夠修飾另一個編碼序列的產物。例如，第一個編碼序列編碼的膠原可能被第二個編碼序列編碼的酶羥基化和活化。在圖.2F的逆轉錄病毒載體例子中，內部核糖體進入位點(IRES)元件位於兩個外源編碼序列(基因X和基因Y)之間。IRES可使得由卵白蛋白啟動子指導的同樣的轉錄物翻譯出蛋白質X和蛋白質Y。彎曲箭頭表示轉錄起始位點。基因X編碼蛋白質的表達預期在管狀腺體細胞中是最高的，該細胞特異性表達但不分泌。基因Y編碼的蛋白質也在管狀腺體細胞中特異表達，但因為它被有效分泌，所以蛋白質Y被包裝入蛋中。圖.15A和15D的逆轉錄病毒載體例中，由於放置了腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES，一個載體pCMV-LC-emcvIRES-HC可表達人單克隆抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)。可用CMV啟動子驅動轉錄。(又見Murakami等(1997)「通過含有內部核糖體進入位點的可複製逆轉錄病毒載體高水平表達外源基因」Gene 20223-29；Chen等，(1999)「更有效的禽類複製缺陷型逆轉錄病毒載體的產生和設計」Dev.Biol.214370-384；Noel等(2000)「通過遺傳修飾的皮膚成纖維細胞持續系統地輸送單克隆抗體」J.Invest.Dermatol.115740-745)本發明的另一方面，本發明任何方法中所用載體的編碼序列都含有一個3』非翻譯區(3』UTR)以保證產生的RNA的穩定性。當將3』UTR添加到逆轉錄病毒載體時，該融合的卵白蛋白啟動子、基因X和3』UTR在構建物中的方向必須反轉，以使3』UTR的加入不影響全長基因組RNA的轉錄。在一個優選實施方式中，該3』UTR可以是卵白蛋白或溶菌酶基因的3』UTR，或是在蛋白分泌部細胞中有功能的任何3』UTR，如SV40的晚期區域。
在本發明的另一實施方式中，用組成型啟動子(例如CMV)在禽類輸卵管蛋白分泌部中表達轉基因的編碼序列。這種情況下，表達不局限於蛋白分泌部；在禽類的其他組織中也有表達(例如，血液)。利用這種含有組成型啟動子和編碼序列的轉基因，尤其適合於影響蛋白質在輸卵管中的表達和其後分泌入卵清中(見圖.8A，以CMV驅動的構建物為例，如在雞中表達IFN-α2b的pNLB-CMV-IFN載體)。
圖3A顯示基於複製缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB，一種適合用於本發明的此種實施方式的載體。在pNLB載體中，用新黴素抗性基因(Neo)和編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因替代了ALV的大部分基因組。圖.3B顯示載體pNLB-CMV-BL，其中，用CMV啟動子和β-內醯胺酶編碼序列(β-La或BL)取代lacZ基因。在具體實施例(實施例1，見下)中報導了該載體的構建。由CMV啟動子表達β-內醯胺酶，並且在其3』長末端重複序列(LTR)有聚腺苷酸信號(pA)。β-內醯胺酶蛋白質含有天然信號肽；因此，它存在於血液和卵清中。
以pNLB-CMV-BL載體轉導禽類胚胎(實施例2，見下)。產生的穩定轉導的母雞每隻卵的卵清含有高達60微克(μg)的分泌的活性β-內醯胺酶(實施例2和3，見下)。
圖8A和8B分別顯示用於表達幹擾素-α2b(IFN-α2b)的pNLB-CMV-IFN載體和用於表達促紅細胞生成素(EPO)的pNLB-MDOT-EPO載體。這兩種外源蛋白質(EPO，IFN)可在禽類中表達，優選的是雞和火雞。
pNLB-MDOT-EPO載體是以EPO編碼序列替代BL編碼序列而創建的(實施例10，見下)。在一個實施方式中，採用稱為MDOT的合成啟動子來驅動EPO的表達。MDOT含有卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白啟動子元件。人EPO的DNA序列可根據母雞輸卵管優化密碼子使用率，通過Wisconsin Package 9.1版(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序，利用由雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創建的。合成EPO DNA序列並將其克隆入載體產生質粒pNLB-MDOT-EPO(又名pAVIJCRA145.27.2.2)。在一個實施方式中，產生了此載體的轉導顆粒，滴定這些轉導顆粒以確定可用於注射胚胎的合適濃度。然後以轉導顆粒注射蛋，其後孵化蛋21天。可用採集於孵化後一周的仔雞血清樣品做ELISA試驗來測定外源蛋白質例如EPO的水平。選擇雄雞用於交配，其中篩選出精子中含有EPO轉基因的G0公雞。優選通過人工授精使精子樣品中轉基因水平最高的公雞與非轉基因母雞交配。篩選血DNA樣品是否存在該轉基因。常能發現一些仔雞是轉基因的(G1禽)。檢測仔雞血清是否存在人EPO(例如ELISA試驗)。也可檢測G1母雞蛋的卵清是否存在人EPO。本發明中蛋中的EPO(即，來源於優化的人EPO編碼序列)具有生物活性(實施例11)。
類似地，以IFN編碼序列替代BL編碼序列可得到pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)(實施例12，見下)。在一個實施方式中，用組成型巨細胞病毒啟動子(CMV)驅動IFN表達。更具體地，用巨細胞病毒啟動子立即早期啟動子/增強子和SV40 polyA位點控制IFN編碼序列。圖8A說明用於在禽類中表達IFN的pNLB-CMV-IFN，優選的禽類為雞和火雞。創建了人IFN-α2b的優化編碼序列，其中，用在卵清蛋白質卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白中的各特定胺基酸最常使用的密碼子來設計人IFN-α2b序列其插入本發明載體。更具體地，優化的人IFN-α2b DNA序列(圖11A)可根據母雞的輸卵管優化使用密碼子，通過BACKTRANSLATE程序(見上)利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創建。例如，在這四種卵清蛋白質中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，將GCU作為優化的人IFN-α2b序列匯總絕大多數丙氨酸的密碼子。可用含有優化的人IFN-α2b序列的基礎的載體來產生在其組織和蛋中表達TPD IFN-α2b的轉基因禽類。
產生此載體的轉導顆粒並滴定這些轉導顆粒以確定可用於注射胚胎的合適濃度(實施例2，見下)。這樣就產生了嵌合的禽類(又見實施例13，見下)。依據Speksnijder工藝(美國專利號5,897,998)將禽蛋放於窩中，以轉導顆粒注射蛋。注射後孵化蛋約21天。採集孵化後一周的仔雞血清樣品測定其中hIFN的水平(例如ELISA試驗)。與EPO類似(見上)，選擇雄雞用於交配。為篩選精子中含有IFN轉基因的G0公雞，提取公雞精子樣品的DNA。通過人工授精，使精子樣品中轉基因水平最高的公雞與非轉基因母雞交配。檢測轉基因公雞的血清是否存在hIFN(例如用ELISA試驗)。如果證實有該外源蛋白質，用轉基因公雞的精子人工授精非轉基因母雞。一定比率的後代將攜帶有該轉基因(例如，大於50％)。當本發明的蛋中存在IFN(即，來源於優化的人IFN編碼序列)時，要檢測IFN的生物活性。與EPO類似，這些蛋中通常含有有生物活性的IFN，例如TPD IFN-α2b(圖11B)。c)轉基因禽類和禽蛋中外源蛋白質的生產本發明提供在禽類輸卵管中生產外源蛋白質和生產含有外源蛋白質的蛋的方法，該方法還包括一個附加後續步驟，即提供合適的載體及將此載體導入胚胎胚盤細胞從而使載體整合入禽類基因組。該後續步驟包括從前面步驟產生的轉基因胚盤細胞得到成熟的轉基因禽類。任選地，從胚盤細胞產生成熟的轉基因禽類任選包括將轉基因胚盤細胞轉移到胚胎並使該胚胎充分發育，從而隨著該胚胎的發育所述細胞整合入禽類。然後使產生的仔雞生長成熟。在一個優選實施方式中，直接用胚胎中的載體轉染或轉導胚盤細胞(實施例2)。使產生的胚胎發育，使仔雞成熟。
在這兩種情況下，轉基因胚盤細胞產生的轉基因禽類稱為創始禽。有些創始禽在其輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞中攜帶有轉基因，這些禽將在其輸卵管中表達轉基因編碼的外源蛋白質。除輸卵管之外，外源蛋白質也可能在其他組織中表達(例如，血液)。如果外源蛋白質含有適當的信號序列，它將會分泌到輸卵管腔和蛋的卵清中。有些創始禽為種系創始禽(實施例8和9)。種系創始禽是在其種系組織的遺傳物質中攜帶有轉基因的創始禽，它們也可在輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞中攜帶有表達外源蛋白質的轉基因。因此，根據本發明，轉基因禽類將含有表達外源蛋白質的管狀腺體細胞，轉基因禽的後代也將含有表達外源蛋白質的輸卵管蛋白分泌部管狀腺體細胞。或者，後代禽可在禽的特定組織中表達該外源基因表達而決定的某種表型(實施例6，表2)。在本發明一個優選實施方式中，所述轉基因禽是雞或火雞。
可用本發明高產量低成本表達各種所需蛋白質，包括可用作人類和動物的藥物、診斷劑以及家畜飼料添加劑的蛋白質。蛋白質例如幹擾素(IFN)、促紅細胞生成素(EPO)、人生長激素、溶菌酶和β-酪蛋白是根據本發明需要在輸卵管中表達並沉積於蛋中的例子(實施例2，3和5)。其他可能生產的蛋白質包括，但不限於，白蛋白、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、膠原、因子VIII，IX，X(等)、纖維蛋白原、透明質酸、胰島素、乳鐵蛋白、蛋白質C、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、組織型血纖蛋白溶酶原活化子(tPA)、促生長素和胰凝乳蛋白酶。也可表達遺傳工程抗體，例如能結合人腫瘤細胞表面抗原並破壞腫瘤的免疫毒素，用做藥物或診斷試劑。
d)轉基因禽產生的幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)
本發明包括禽類產生的轉基因禽幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)。TPD IFN-α2b顯示正常情況下人外周血白細胞產生的幹擾素-α2b(PBL IFN-α2b)中不存在的新糖基化模式並含有兩種新糖形(條帶4和5是α-Gal延伸的二糖；見圖9)。TPDIFN-α2b還含有與人PBL IFN-α2b相似的在雞中比人中更有效產生的O-連接的碳水化合物結構。
本發明設想一種含有人IFN-α2b優化的多聚核苷酸序列，即重組轉基因禽幹擾素-α2b(TPD IFN-α2b)編碼序列(SEQ ID NO1)的分離的多聚核苷酸。優化的人IFN-α2b編碼序列包含498個核酸165個胺基酸(見SEQ ID NO1和圖11A)。類似地，天然的人IFN-α2b編碼序列包含498個核酸(NCBI登錄號AF405539和GI15487989)和165個胺基酸(NCBI登錄號AAL01040和GI15487990)。可利用在卵清蛋白質卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白中各特定胺基酸最常使用的密碼子來設計優化的人幹擾素-α2b編碼序列將其插入本發明載體。更具體地，優化的人幹擾素-α2bDNA序列可根據母雞輸卵管優化密碼子使用率，通過Wisconsin Package 9.1版(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白編譯的密碼子使用率表來創建。例如，在這四種卵清蛋白質中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，可將GCU作為優化的人IFN-α2b編碼序列大多數丙氨酸的密碼子。用含有優化的人IFN-α2b基因的載體來產生在組織和卵中表達TPD IFN-α2b的轉基因禽類。
如在實施例13中(見下)所述的，可在雞中生產TPD IFN-α2b。然而，也可在火雞或其他禽類中生產TPD IFN-α2b。在本發明的一個優選實施方式中，在雞和火雞以及它們的硬殼蛋中表達TPD IFN-α2b。碳氫化合物分析(實施例14，見下)包括單糖分析和FACE分析，可揭示糖的組成或蛋白質的新糖基化模式。TPD IFN-α2b顯示如下的單糖殘基N-乙醯基-氨基半乳糖(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙醯基-葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。然而，在TPD IFN-α2b中沒有N-連接的糖基化，而是在Thr-106 O-糖基化。這種類型的糖基化與人IFN-α2的相似，其中，106位的Thr殘基是IFN-α2獨有的。與天然IFN-α相似，TPD IFN-α2b沒有甘露糖殘基。FACE分析顯示代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是α2-3與半乳糖(Gal)和α2-6與N-乙醯基-氨基半乳糖(NAcGal)連接。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBL IFN-α2b或天然的人IFN(天然hIFN)中未發現的α-半乳糖(α-Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPD IFN-α2b(卵清hIFN)和人PBL IFN-α2b(天然hIFN)的比較。TPD IFN-α2b(見下)中條帶3和4，條帶4和5之間還有次帶。
本發明設想TPD IFN-α2b的一種分離的多肽序列(SEQID NO2)(又見圖11B)及它的藥物組合物，其中該蛋白質在Thr-106位以特定殘基O-糖基化。這些殘基如下(i)Gal-NAcGal-(ii)SA-Gal-NAcGal-(iii)SA-Gal-NAcGal-|SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal-(vi)Gal-Gal-NAcGal-|SA其中，Gal＝半乳糖NAcGal＝N-乙醯基-氨基半乳糖NAcGlu＝N-乙醯基-葡糖胺SA＝唾液酸在本發明的一個優選實施方式中，百分比如下(i)Gal-NAcGal- 約20％(ii)SA-Gal-NAcGal- 約29％(iii)SA-Gal-NAcGal- 約9％|SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal- 約6％|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal- 約7％
(vi)Gal-Gal-NAcGal-約12％|SA條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶，在TPD IFN-α2b中約佔17％。
e)實施例以下具體實施例是為闡述本發明而不應對本發明範圍的限制。
實施例1載體構建用由巨細胞病毒(CMV)啟動子和報告基因β-內醯胺酶組成的表達盒替代複製缺陷型禽白血病病毒(ALV)的載體pNLB(Cosset等，1991)的lacZ基因。圖3A和3B分別圖示了pNLB和pNLB-CMV-BL載體構建物。
為了用轉基因有效替代pNLB的lacZ基因，首先創建了一個中間銜接子質粒，pNLB-銜接子。將鈍化的pNLB ApaI/ApaI片段(Cosset等，J.Virol.653388-94(1991))(pNLB中5』ApaI殘基位於lacZ上遊289bp，3』ApaI殘基位於3』LTR和Gag區段的3』端)插入到鈍化的pBluescriptK(-)KpnI/SacI位點得到pNLB-銜接子。將填平的pCMV-B MluI/XbaI區段(Moore等，Anal.Biochem.247203-9(1997))插入鈍化的pNLB-銜接子的KpnI/NdeI位點，以CMV啟動子和BL基因替代lacZ(在pNLB中，KpnI殘基位於lacZ上遊67bp，NdeI殘基位於lacZ終止密碼子上遊100bp)，這樣，得到了pNLB-銜接子-CMV-BL。為了創建pNLB-CMV-BL，用pNLB-銜接子-CMV-BL的HindIII/BlpI插入片段替換pNLB的HindIII/BlpI插入片段(含有lacZ)。因為未知的原因直接將鈍端片段連接入pNLB的HindIII/BlpI位點大多數可產生重排的亞克隆，因此這個兩步克隆是必要的。
實施例2NLB-CMV-BL創始禽群的創建將Sentas和Isoldes在含有以下成分的培養基中培養F10(Gibco)，5％新生牛血清(Gibco)，1％雞血清(Gibco)，50μg/ml腐草黴素(Cayla Laboratories)和50μg/ml潮黴素(Sigma)。如Cosset等(1993)所述產生轉導顆粒，引入本文作為參考，但以下例外。逆轉錄病毒載體pNLB-CMV-BL(得自實施例1，如上)轉染9×105Sentas兩天後，收集6-16小時新鮮培養基中的病毒並滴定。用所有的培養基轉導添加了終濃度為4μg/ml的聚凝胺的3個100mm平板中的3×106Isoldes。接下來一天中，將此培養基替換為含有50μg/ml腐草黴素，50μg/ml潮黴素和200μg/ml G418(Sigma)的培養基。10-12天後，分離單個的G418r克隆並轉移到24孔板中。7-10天後，通過轉導Sentas然後進行G418篩選來測定每個克隆的效價。一般，60個克隆中有2個效價為1-3×105。擴增這些克隆，將病毒濃集到2-7×106，如Allioli等，Dev.Biol.16530-7(1994)所述，引入本文作為參考。檢測NLB-CMV-BL轉導顆粒所轉導的細胞培養基中的β-內醯胺酶確證了CMV-BL表達盒的完整性。
將轉導載體NLB-CMV-BL注射入546個未孵育的SPF白來杭雞(White Leghorn)胚胎的胚下腔中，其中孵出了126隻小雞，檢測這些小雞是否向血液中分泌β-內醯胺酶(內醯胺酶)。為測定未知樣品中活性內醯胺酶的濃度，採用了動態比色測定法，在該方法中，一種紫色底物PADAC被內醯胺酶特異性轉化為黃色化合物。通過監測標準反應時間內OD570nm的降低定量測定內醯胺酶的活性，與有不同水平純化內醯胺酶的標準曲線作比較(稱為「內醯胺酶試驗」)。也可通過觀察測試樣品過夜後或幾天後紫色轉變為黃色的評分來確定樣品中是否存在內醯胺酶(「過夜內醯胺酶試驗」)。後一方法適用於檢測很低水平的內醯胺酶或篩選大量樣品。在一至四周齡時，檢測小雞血清樣品是否存在內醯胺酶。27隻小雞血清中有很低水平的只能在過夜內醯胺酶試驗中檢測到的內醯胺酶，這些小雞成熟後，不再檢測到內醯胺酶。如下表1和圖4A所示，在孵化後六到七個月還有另外9隻雞(3雄，6雌)的血清內醯胺酶水平在11.9-173.4ng/ml。
表1NLB-CMV-BL轉導的雞中β-內醯胺酶的表達
1NA不適用。
2對照取自未處理母雞3代表5至20個蛋的平均值實施例3β-內醯胺酶在G0母雞卵清中的表達57隻以NLB-CMV-BL逆轉錄病毒載體轉導的小母雞發育到性成熟，在八月齡時檢測每隻母雞卵清的活性β-內醯胺酶(內醯胺酶)。57隻雞中，有6隻內醯胺酶水平顯著，範圍為56.3至250.0ng/ml(表1，見上)。即使在PADAC與樣品培育幾天之後，該組中仍沒有其他母雞的卵清中可檢測到內醯胺酶。在24隻模擬注射的母雞和用不攜帶有內醯胺酶轉基因的NLB載體轉導的42隻母雞的卵清中未檢測到內醯胺酶。在初始試驗6個月後，有表達的6隻雞的卵清中仍能檢測到穩定的內醯胺酶表達(表1，見上)。
用抗β-內醯胺酶抗體進行Western印跡試驗在所有這6隻母雞的卵清中都檢測到了β-內醯胺酶。該卵清內醯胺酶與用作標準品的純化的細菌產生的內醯胺酶大小相同。以Western分析卵清中檢測到的量與酶學試驗檢測到的相一致，表明卵清內醯胺酶的很大一部分是有生物活性的。即使在4℃儲存幾個月後，母雞卵清中產生的內醯胺酶也不會喪失活性，分子量也沒有改變。這一發現使得含有內醯胺酶的蛋可儲存更長的時間直到分析。
實施例4G1和G2轉基因雞中β-內醯胺酶轉基因的種系傳遞及血清表達抽提收集自56隻G0公雞的精子DNA，選擇定量PCR檢測到的精子DNA中轉基因含量水平顯著的三隻雞來交配。這些公雞是同樣的在其血液中β-內醯胺酶(內醯胺酶)水平最高的三隻(公雞2395、2421和2428)。公雞2395產生了3隻G1轉基因後代(在422隻後代中)，而其他兩隻在總共630隻後代中未產生轉基因後代。對三隻G1轉基因雞各自的血DNA做Southern分析證實了轉基因是完整的並且整合在唯一的隨機位點。孵化後6-11周時，G1轉基因雞5308、5657和4133的血清分別含有0.03、2.0和6.0μg/ml的內醯胺酶。在6-7月齡再對這些雞進行檢測時，內醯胺酶的水平降到了0.03、1.1和5.0μg/ml(圖4A)。
將母雞5657和公雞4133與非轉基因雞交配得到轉基因半純合後代。圖5顯示從公雞4133或母雞5657繁育的轉基因雞及其後代的譜系。也繁殖轉基因公雞5308，但其後代血清和卵清中的內醯胺酶濃度很低或檢測不到。在孵化後3-90天測定隨機選擇的G2轉基因雞血清中活性內醯胺酶濃度。從母雞5657繁育的五隻G2轉基因雞中，活性內醯胺酶濃度都在1.9-2.3μg/ml(相較於親代1.1μg/ml的表達，圖4B)。所有的樣品都在相同的時期收集，因此，由於母雞5657的內醯胺酶濃度在其成熟後相應地下降了，預期其後代血清中內醯胺酶濃度比親代高。類似地，從公雞4133繁育的五隻隨機挑選的轉基因雞血清內醯胺酶濃度都與其親代的相似但高於親代(圖4B)。
實施例5轉基因母雞卵清中β-內醯胺酶的表達G1母雞5657的蛋含有每毫升卵清130ng的活性β-內醯胺酶(內醯胺酶)。內醯胺酶濃度在最初產的一些蛋中較高，然後達到至少可穩定九個月的平臺期。母雞5657和非轉基因公雞繁育的轉基因母雞蛋的內醯胺酶濃度與親代相似(圖6A)。經定量PCR和Southern分析檢測，G2母雞8617和同科G2公雞8839繁育的母雞6978是轉基因純合子。正如預期的那樣，在雞6978的蛋中內醯胺酶濃度高於其半合子親代將近兩倍(圖6B)。沒有分析其他的由母雞5657繁育的G3母雞，因為母雞6978是其連產雞中唯一的雌性。重要的是，應注意母雞8867、8868和8869的蛋是相隔11個月收集的並且具有相似的內醯胺酶濃度(圖6A和6B)，又一次表明，卵清中的表達水平在產卵期中是一致的。
將公雞4133與非轉基因母雞交配得到半合子G2母雞。分析了15隻轉基因母雞，卵清中都含有濃度範圍在0.47-1.34μg/ml的內醯胺酶。圖7A顯示四隻代表性的母雞。6個月後檢測時，平均表達水平已經從大約1.0μg/ml降到0.8μg/ml(圖7A)。在最初的蛋中表達水平高，其後幾個月中水平降低。然後，蛋中內醯胺酶濃度保持恆定。
G2母雞8150和同科G2公雞8191雜交產生半合子和純合子G3母雞。所有G3母雞卵清中表達了濃度範圍在0.52-1.65μg/ml的內醯胺酶(圖7B)。G3純合母雞的平均表達水平比半合子G2和G3母雞高47％。公雞4133及其後代繁育的G2和G3母雞蛋中內醯胺酶的量差別很大(圖7A和7B)，雖然此組中任何給定母雞蛋中的內醯胺酶水平相對恆定。預期對於純合基因型，內醯胺酶的平均表達加倍。Western印跡分析證實轉基因在G2轉基因雞的蛋中正確地產生完整的內醯胺酶。Western印跡檢測到的內醯胺酶水平與酶活試驗檢測到的內醯胺酶水平密切相關，表明卵清內醯胺酶的大部分具有生物活性。因此，成功地利用逆轉錄病毒載體在雞中進行了轉基因穩定和可靠的表達。
可檢測到卵黃中內醯胺酶的沉積但比卵清中低。分析了公雞4133系的七隻G2或G3母雞，卵黃中內醯胺酶的濃度範圍在107-375ng/ml或卵清中濃度的20％。某給定母雞的卵黃和卵清內醯胺酶水平無相關性(Harvey等，「外源蛋白質在轉基因雞卵清中的表達」(2000年4月)Nat.Biotechnol.20396-399)。
實施例6創始雄禽的產生用新產的自來杭雞受精卵進行NLB-CMV-BL轉導。將7-10微升濃縮顆粒注射入開窗蛋的胚下腔中，封閉窗口後孵化出仔雞。注射了546隻卵。提取血DNA並通過Taqman試驗採用檢測新黴素抗性(neor)基因的探針-引物對，分析是否存在轉基因。如下表2所示，在所有仔雞約25％的血DNA中可檢測到轉基因。
表2用NLB-CMV-BL載體進行的轉基因小結
實施例7轉基因的種系傳遞用Taqman檢測精子DNA中的neor基因來鑑定用於交配的候選G0雄性。鑑定到三隻G0雄性，其中每隻雞的精子DNA中NLB-CMV-BL轉基因均高於背景水平。將精子中轉基因為陽性的所有G0雄雞與非轉基因母雞交配以鑑定完全轉基因的G1後代。
對於NLB-CMV-BL，分別繁育了1026隻仔雞，每種轉基因獲得了三隻G1仔雞(表2，見上)。所有G1後代都來自精子DNA中轉基因水平最高的雄性，而且每隻雄性繁育出相等數目的仔雞。
實施例8G1和G2的Southern分析為證實插入的載體序列的整合和完整性，對G1和G2轉基因的DNA進行Southern印跡分析。以HindIII消化血DNA，將其與neor探針雜交以檢測NLB-CMV-BL載體內部HindIII位點形成的接頭片段(圖3B)和整合位點側翼的基因組位點。攜帶有NLB-CMV-BL的3隻G1雞中的每隻都含有獨特長度的接頭片段，表明轉基因已整合到三個不同的基因組位點。將G1與非轉基因母雞交配得到半合子G2。如表2(見上)所示，如單個轉基因整合的孟德爾分離所預期的那樣，攜帶有NLB-CMV-BL的G1公雞的後代50.8％是轉基因的。G2後代HindIII消化的DNA的Southern分析，檢測到與它們的轉基因親代大小相似的接頭片段，表明轉基因被完整傳遞。
實施例9篩選轉基因純合子G3後代為獲得轉基因純合子轉基因雞，將相同位點整合有NLB-CMV-BL的G2半合子雞(例如，同一隻G1雄性的後代)雜交，繁育了兩組雞第一組是來源於G1 4133雄性的母雞和公雞，第二組來源於G1 5657母雞。用Taqman試驗的標準曲線定量測定G3後代中的neor轉基因。用已知量的經Southern分析確定為轉基因半合子的G1轉基因4133雄雞的基因組DNA來構建此標準曲線。此標準曲線轉基因總拷貝的範圍是103-1.6×104或每個二倍體基因組0.2-3.1轉基因拷貝。因為在指數期反應組分是無限制的，所以擴增效率很高並對給定的拷貝數給出了可重複的值。在拷貝數相差2倍的每個標準曲線之間有可重複的一個循環的差異。
為確定G3後代中轉基因等位基因的數目，擴增DNA並與標準品比較。非轉基因雞的DNA不擴增。根據轉基因等位基因純合子雞繪製的圖，擴增起始比等位基因半合子雞早一個循環。此序列檢測程序能依據標準曲線和循環閾值(Ct)來計算出未知DNA樣品中等位基因的數目，在循環閾值處樣品的擴增圖顯示顯著增高。數據示於下面表3。
為驗證Taqman拷貝數分析，用PstI消化的DNA和與neor基因互補的探針檢測0.9kb片段通過Southern印跡分析所選雞的DNA。選擇檢測小片段是因為將較小DNA從凝膠轉移到膜更易量化。該0.9kb條帶的信號強度與Taqman試驗檢測到的G3轉基因雞的拷貝數良好對應。用Southern印跡分析的其它18隻G3轉基因雞的拷貝數與Taqman測定的一致。共分析了4133譜系33隻後代，其中9隻(27.3％)是非轉基因的，16隻(48.5％)是半合子，8隻(24.2％)是純合子。5657譜系共分析了10隻後代，其中5隻(50.0％)是非轉基因的，1隻(10.0％)是半合子，4(40.0％)只是純合子。4133譜系G3後代所觀察到的非轉基因、半合子和純合子的比率統計上與預期的用x2測驗(P≤0.05)測定的1∶2∶1比率沒有差異。5657譜系的後代不具有預期的分離，但這可能是由於所檢測後代的數目少而致(Harvey等，「用複製缺陷型逆轉錄病毒載體和高通量篩選程序進行轉基因雞的連續生產」(「Consistent production of transgenic chickens using replicationdeficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures」)(2002年2月)Poultry science 81202-212)。
實施例10pNLB-MDOT-EPO載體的載體構建依照本說明書實施例1(載體構建)所述，將BL編碼序列替換為EPO編碼序列(圖8B)，創建了pNLB-MDOT-EPO載體。用MDOT代替CMV啟動子(圖13)。MDOT是含有卵類粘蛋白(MD)和卵轉鐵蛋白(OT)啟動子元件的合成啟動子。(pNLB-MDOT-EPO載體，又名pAVIJCR-A145.27.2.2)。用Wisconsin Package，9.1版(Genetics Computer Group，Inc.，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序以從雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白編譯的密碼子使用率表，創建基於母雞卵巢優化密碼子使用率的人EPO DNA序列。合成該DNA序列並用Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，以規定的形式將此序列克隆入pCR II-TOPO(Invitrogen)3』突端的T中。然後用HindIII和FseI將EPO編碼序列從pEpoMM切下，用0.8％瓊脂糖-TAE凝膠純化，連接於HindIII和FseI消化的鹼性磷酸酶處理的pCMV-IFNMM。產生的質粒是含有受巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子和SV40 polyA位點控制的EPO編碼序列的pAVIJCR-A137.43.2.2。用NcoI和FseI酶切質粒pAVIJCR-A137.43.2.2，將正確的片段與用NcoI和FseI酶切的pMDOTIFN片段連接，得到含有受MDOT啟動子驅動的EPO的pAVIJCR-A137.87.2.1。為將MDOT啟動子控制的EPO編碼序列克隆入NLB逆轉錄病毒質粒，用KpnI和FseI酶切質粒pALVMDOTIFN和pAVIJCR-A137.87.2.1。在0.8％瓊脂糖-TAE凝膠上純化正確的DNA片段，然後將這些片段連接並轉化入DH5α細胞。產生的質粒為pNLB-MDOT-EPO(又名pAVIJCR-A145.27.2.2)。
實施例11表達EPO的轉基因雞和完全轉基因G1雞的產生如NLB-CMV-BL(見實施例2)那樣製備NLB-MDOT-EPO轉導顆粒。根據Speksnijder工藝(美國專利號5,897,998)將300隻白來杭雞蛋開窗，然後每隻蛋注射～7×104轉導顆粒。注射後孵化蛋21天，用EPO ELISA測定孵化後一周採集的仔雞血清樣品中的人EPO水平。
為篩選精子中含有EPO轉基因的G0公雞，用「Chelex-100抽提」(Walsh等，1991)提取公雞精子樣品的DNA。然後將DNA樣品用「neo for-1」(5』-TGGATT
表3測定G2轉基因雞繁育的G3後代中轉基因拷貝數
1Std.No平均數；NTC無模板對照。
2Ct循環閾值；樣品螢光出現高於背景的顯著增加的循環。
3平均數除以5100然後取捨到最近的第一個十進位位所確定的每二倍體基因組的拷貝。
4NA不適用。
GCACGCAGGTTCT-3』)和「neo rev-1」(5』-GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3』)引物以及FAM標記的NEO-探針1(5』-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3』)在7700序列測定儀(Perkin Elmer)上進行TaqmanTM分析以檢測轉基因。將精子樣品中轉基因水平最高的8隻G0公雞通過人工授精與非轉基因SPAFAS(白來杭雞)母雞交配。用上述的TaqmanTM分析篩檢血DNA樣品中轉基因的存在。
在1,054隻後代中，發現16隻仔雞是轉基因的(G1禽)。用EPO ELISA檢測雞血清中人EPO的存在，EPO為～70納克/毫升(ng/ml)。用EPO ELISA檢測G1母雞蛋的卵清中人EPO的存在，發現含有人EPO約～70ng/ml。當以細胞培養試驗在人EPO響應細胞系(HCD57鼠紅細胞樣細胞)上檢測時發現蛋中存在的EPO(即，衍生自人EPO優化的編碼序列)是生物活性的。
實施例12pNLB-CMV-IFN的載體構建依照實施例1所述，以IFN編碼序列替代實施例1中的BL編碼序列創建了pNLB-CMV-IFN載體(圖8A)。
創建了優化的編碼序列，其中，用卵清蛋白質卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白中各特定胺基酸使用率最高的密碼子設計了優選人幹擾素-α2b(IFN-α2b)多聚核苷酸序列，將其插入本發明的載體。更具體地，優化的人幹擾素-α2b的DNA序列是根據母雞輸卵管優選使用密碼子並通過Wisconsin Package9.1版(Genetics Computer Group Inc.)，Madison，WI)的BACKTRANSLATE程序利用雞(Gallus gallus)卵白蛋白、溶菌酶、卵類粘蛋白和卵轉鐵蛋白蛋白質編譯的密碼子使用率表創建的。例如，在這四種卵清蛋白質中，丙氨酸四種密碼子的使用百分率為GCU 34％，GCC 31％，GCA 26％，GCG 8％。因此，將GCU作為優化的人IFN-α2b編碼序列大多數丙氨酸的密碼子。用含有編碼優化人IFN-α2b基因的載體，創建在組織和卵中表達轉基因禽IFN-α2b(TPD IFN-α2b)的轉基因禽類。
通過PCR以pfu多聚酶(Stratagene，La Jolla，CA)用20個循環94℃1min；50℃ 30sec；和72℃ 1min 10sec擴增下表4中列出的模板和引物寡核苷酸。以「擠壓和浸透」方法(Maniatis等，1982)從12％的聚丙烯醯胺-TBE凝膠純化PCR產物，然後組合該PCR產物在只用IFN-1和IFN-8作引物的擴增反應中作為模板(見表4)。將產生的PCR產物用HindIII和XbaI酶切，從2％瓊脂糖-TAE凝膠純化，然後連入用HindIII和XbaI酶切鹼性磷酸酶處理的pBluescriptKS(Stratagene)，產生質粒pBluKSP-IFNMagMax。在ABI PRISM377 DNA測序儀(Perkin-Elmer，Foster City，CA)上用通用T7或T3引物，通過循環測序測定兩條鏈的序列。用轉換基因定點突變試劑盒(Transformer Site-DirectedMutagenesis Kit)(Clotech，Palo Alto，CA)的定點突變修正衍生自原始寡聚核苷酸模板的pBluKSP-IFN中的突變。然後將IFN編碼序列用HindIII和XbaI從修正的pBluKSP-IFN切下，從0.8％瓊脂糖-TAE凝膠純化並連入HindIII和XbaI酶切鹼性磷酸酶處理的pCMV-BetaLa-3B-dH。產生的質粒是含有受巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子和SV40 polyA位點控制的IFN編碼序列的pCMV-IFN。為將CMV啟動子/增強子控制的IFN編碼序列克隆入NLB逆轉錄病毒載體，先用ClaI和XbaI酶切pCMV-IFN，然後兩末端用DNA多聚酶的Klenow片段(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)填平。將pNLB-銜接子用NdeI和KpnI酶切，用T4 DNA多聚酶(New England BioLabs)使兩末端為鈍性。將正確的DNA片段在0.8％瓊脂糖-TAE凝膠上純化，然後連接並轉化入DH5α細胞。產生的質粒是pNLB-銜接子-CMV-IFN。然後將該質粒用MluI酶切BlpI部分酶切，正確的片段用凝膠純化。將pNLB-CMV-EGFP用MluI和BlpI酶切，然後用鹼性磷酸酶處理和凝膠純化。將pNLB-銜接子-CMV-IFN的MluI/BlpI部分片段與衍生自pNLB-CMV-EGFP MluI/BlpI酶切的大片段連接，產生pNLB-CMV-IFN。
表4用於IFN基因合成的寡聚核苷酸
實施例13表達IFN的轉基因雞和完全轉基因G1雞的產生依照實施例2的程序製備pNLB-CMV-IFN轉導顆粒。根據Speksnijder工藝(美國專利號5,897,998)將300隻白來杭雞(株系0)蛋開窗，然後每隻蛋注射～7×104轉導顆粒。注射後孵化蛋21天，通過IFN ELISA試驗測定孵化後一周採集的仔雞血清樣品中的人IFN水平。
為篩選精子中含有IFN轉基因的G0公雞，用「Chelex-100抽提」(Walsh等，1991)提取公雞精子樣品的DNA。然後將DNA樣品用「neo for-1」(5』-TGGATTGCACGCAGGTTCT-3』)和「neo rev-1」(5』-GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3』)引物以及FAM標記的NEO-探針1(5』-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3』)在7700序列測定儀(Perkin Elmer)上進行TaqmanTM分析以檢測轉基因。將精子樣品中轉基因水平最高的3隻G0公雞通過人工授精與非轉基因SPAFAS(白來杭雞)母雞交配。
如上所述用TaqmanTM分析篩檢血DNA樣品轉基因的存在。在1,597隻後代中，發現1隻公雞是轉基因的(又名「Alphie」)。用hIFN ELISA檢測Alphie血清中hIFN的存在，hIFN為200ng/ml。
用Alphie的精子對非轉基因SPAFAS(白來杭雞)母雞人工授精。用TaqmanTM分析檢測到202隻中有106隻(～52％)後代含有轉基因。這些繁育結果遵循孟德爾遺傳模式，表明Alphie是轉基因的。
實施例14轉基因家禽產生的幹擾素-α2b(TPD IFNα-2b)的碳水化合物分析實驗證據揭示了家禽產生的幹擾素-α2b(即TPD IFNα-2b)中有一種新糖基化模式。發現TPD IFNα-2b含有正常情況下人外周血白細胞產生的幹擾素-α2b(PBL IFNα-2b)或天然人幹擾素-α2b(天然hIFN)中不存在的兩種新糖形(條帶4和5是α-Gal延伸的二糖；見圖9)。還發現TPD IFNα-2b含有與人PBL IFNα-2b相似但在雞中比在人中更有效產生的O-連接碳水化合物結構。
對人IFN-α2b編碼序列(實施例12，見上)進行優化，產生重組IFN-α2b編碼序列。然後在雞中生產TPD IFN-α2b(實施例13，見上)。碳氫化合物分析包括單糖分析和FACE分析揭示了該蛋白質的糖組成或新糖基化模式。這樣，TPD IFN-α2b顯示含有以下單糖殘基N-乙醯基-氨基半乳糖(NAcGal)、半乳糖(Gal)、N-乙醯基-葡糖胺(NAcGlu)和唾液酸(SA)。在TPD IFN-α2b中沒發現N-連接的糖基化，而是在Thr-106位O-糖基化。這種類型的糖基化與人IFN-α2的相似，其中，106位的Thr殘基是IFN-α2獨有的。此外，沒有發現TPD IFN-α2b含有甘露糖殘基。FACE分析顯示了代表各種糖殘基的6條帶(圖9)，其中條帶1、2、3分別是未唾酸化、單唾酸化和雙唾酸化的(圖10)。唾液酸(SA)連接是α2-3-半乳糖(Gal)和α2-6-N-乙醯基-氨基半乳糖(NAcGal)。條帶6代表未唾酸化的四糖。條帶4和5是在人PBL IFN-α2b中未發現的α-半乳糖(α-Gal)延伸的雙糖。圖10顯示TPD IFN-α2b(卵清hIFN)和人PBL IFN-α2b(天然hIFN)的比較。TPD IFN-α2b中條帶3和4，條帶4和帶5之間有次帶(見下)。
發現該蛋白質在Thr-106位以特定殘基O-糖基化，例如(i)Gal-NAcGal-(ii)SA-Gal-NAcGal-(iii)SA-Gal-NAcGal-|SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal-(vi)Gal-Gal-NAcGal-|SA其中，Gal＝半乳糖NAcGal＝N-乙醯基-氨基半乳糖NAcGlu＝N-乙醯基-葡糖胺SA＝唾液酸百分比如下(i)Gal-NAcGal- 約20％(ii)SA-Gal-NAcGal- 約29％(iii)SA-Gal-NAcGal-約9％
SA(iv)Gal-NAcGlu-NAcGal-約6％|Gal(v)Gal-Gal-NAcGal-約7％(vi)Gal-Gal-NAcGal- 約12％|SA條帶3和4，條帶4和5之間存在約佔TPD IFN-α2b 17％的次帶。
實施例15家禽細胞中用EMCV IRES由質粒轉染和逆轉錄病毒轉導的Mabs的表達通過在輕鏈(LC)和重鏈(HC)編碼序列間放置腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES(又見Jang等，(1988)「腦心肌炎病毒RNA 5』非翻譯區的一個區段在體外翻譯過程中指導核糖體的內部進入」J.Virol.622636-2643)從單個載體pCMV-LC-emcvIRES-HC表達人單克隆抗體的輕鏈和重鏈。用CMV啟動子驅動轉錄。
為測定兩個獨立載體的單克隆抗體的表達，將與CMV啟動子相連的LC或HC共轉染入LMH/2α細胞，該細胞是雌激素響應性雞肝細胞系(又見Binder等(1990)「內源和轉染的載脂蛋白II和卵黃原蛋白II基因在雌激素響應性雞肝細胞系中的表達」Mol.Endocrinol.4201-208)。pCMV-LC和pCMV-HC的共轉染產生了經MABELISA測定為392ng/ml的單抗，而pCMV-LC-emcvIRES-HC轉染產生了185ng/ml的單抗。
將CMV-LC-emcv-HC盒插入基於莫羅尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)的逆轉錄病毒載體，產生pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG。用LMH/2α的親代系LMH細胞(又見Kawaguchi等(1987)「一種雞肝癌細胞系LMH的建立和鑑定」，CancerRes.474460-4464)作為靶細胞，因為它們不具有新黴素抗性。以pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG逆轉錄病毒載體轉導LMH細胞，以新黴素篩選並傳代幾周。獨立地以親代MLV載體LXRN轉導LMH細胞並用新黴素篩選。LXRN細胞的培養基為單抗陰性，而L-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG-轉導細胞的培養基含有22ng/ml單抗。
以上說明書引用的所有文獻(例如，美國專利，美國專利申請，出版物)都以參考文獻的形式引入本文。對本發明的各種改進和變動對本領域一般技術人員是顯而易見的，不超出本發明的範圍和構思。雖然已結合具體的優選實施方案對本發明作了描述，但應了解，如權利要求所述，本發明不過分限於這些具體實施方案。實際上，對本領域一般技術人員顯而易見的用於實施本發明的方式的各種改進都落在以下權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種包含編碼序列和操作及位置上相關的啟動子以在禽輸卵管中表達所述編碼序列的載體，其特徵在於，所述編碼序列選自重組轉基因禽產生的幹擾素-α2b和促紅細胞生成素的編碼序列。
2.如權利要求1所述的載體，其特徵在於，所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)啟動子、MDOT啟動子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠白血病病毒(MLV)啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子、卵轉鐵蛋白啟動子及其區段，其中所述啟動子能充分實現所述編碼序列在禽輸卵管中的表達。
3.如權利要求1所述的載體，其特徵在於，該載體是逆轉錄病毒載體並且其中所述編碼序列和所述啟動子均位於逆轉錄病毒載體的5』和3』UTRs之間。
4.如權利要求3所述的載體，其特徵在於，所述逆轉錄病毒載體來源於禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。
5.如權利要求1所述的載體，其特徵在於，該載體還包括可操作性連接於所述編碼序列的信號肽編碼序列，從而在細胞中翻譯時信號肽將指導該載體表達的轉基因禽產生的幹擾素-α2b或促紅細胞生成素分泌入硬殼蛋的卵清中。
6.如權利要求1所述的載體還包括標記基因，其特徵在於，所述標記基因可操作性連接於選自以下的啟動子巨細胞病毒(CMV)啟動子、MDOT啟動子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠白血病病毒(MLV)啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子、卵轉鐵蛋白啟動子及其區段。
7.一種在其種系組織的遺傳物質中含有轉基因的轉基因禽，其特徵在於，所述轉基因包含外源基因及操作和位置上相關的啟動子以表達轉基因禽產生的幹擾素-α2b或促紅細胞生成素，其中所述外源基因在所述轉基因禽的輸卵管中表達。
8.如權利要求7所述的轉基因禽，其特徵在於，所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)啟動子、MDOT啟動子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠白血病病毒(MLV)啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子、卵轉鐵蛋白啟動子及其區段。
9.如權利要求7所述的轉基因禽，其特徵在於，該轉基因禽選自雞和火雞。
10.一種含有對於某禽類為外源性蛋白質的禽蛋，其特徵在於，所述蛋白質選自轉基因禽產生的幹擾素-α2b和促紅細胞生成素。
11.一種將外源編碼序列穩定導入禽類基因組的方法，包括將權利要求1所述的載體導入禽類胚胎胚盤細胞中，其中該載體隨機插入禽類基因組。
12.一種在禽類輸卵管中產生轉基因禽幹擾素-α2b或促紅細胞生成素蛋白質的方法，該方法包括提供包含編碼序列及可操作性連接於所述編碼序列的啟動子的載體，其中所述啟動子可影響該編碼序列在禽類輸卵管中的表達；通過將所述載體導入禽類胚胎胚盤細胞中創建轉基因細胞或組織，其中該載體序列隨機插入禽類基因組；和由所述轉基因細胞或組織產生成熟的轉基因禽，其中該轉基因禽能在其輸卵管和血液中表達轉基因禽幹擾素-α2b或促紅細胞生成素蛋白質。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)啟動子、MDOT啟動子、羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠白血病病毒(MLV)啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子、卵轉鐵蛋白啟動子及其區段。
14.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，通過逆轉錄病毒介導將所述載體導入胚盤細胞。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，將所述載體導入胚胎胚盤細胞的步驟包括將輔助細胞給予胚胎胚盤細胞，其中所述輔助細胞產生逆轉錄病毒。
16.一種產生含有轉基因禽幹擾素-α2b或促紅細胞生成素蛋白質的禽蛋的方法，該方法包括提供包含編碼序列及可操作性連接於所述編碼序列的啟動子的載體，其中所述啟動子可影響該編碼序列在禽類輸卵管中的表達；通過將所述載體導入禽類胚胎胚盤細胞中創建轉基因細胞或組織，其中該載體序列隨機插入禽類基因組；和從所述轉基因細胞或組織產生成熟的轉基因禽，其中該轉基因禽能在其輸卵管中表達編碼序列，並且將產生的蛋白質分泌入輸卵管腔中，使轉基因禽幹擾素-α2b或促紅細胞生成素蛋白質沉積於硬殼蛋的卵清中。
17.一種包含優化的人幹擾素-α2b多聚核苷酸序列(SEQ ID NO1)的分離的多聚核苷酸。
18.一種包含轉基因禽產生的幹擾素-α2b多肽序列的分離的蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質以Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-|SAGal-NAcGlu-NAcGal-、Gal-Gal-NAcGal-和Gal-Gal-NAcGal-| |GalSA在Thr-106位O-糖基化。
19.如權利要求18所述的分離的蛋白質，其特徵在於，Gal-NAcGal-佔20％，SA-Gal-NAcGal-佔29％，SA-Gal-NAcGal-佔9％，|SAGal-NAcGlu-NAcGal-佔6％，Gal-Gal-NAcGal-佔7％，和Gal-Gal-NAcGal-佔| |GalSA12％。
20.一種包含轉基因禽幹擾素-α2b多肽序列的藥物組合物，某特徵在於，所述蛋白質以Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-、SA-Gal-NAcGal-|SAGal-NAcGlu-NAcGal-、Gal-Gal-NAcGal-和Gal-Gal-NAcGal-| |GalSA在Thr-106位O-糖基化。
21.如權利要求20所述的分離的藥物組合物，其特徵在於，Gal-NAcGal-佔20％，SA-Gal-NAcGal-佔29％，SA-Gal-NAcGal-佔9％，Gal-NAcGlu-NAcGal-佔6％，| |SAGalGal-Gal-NAcGal-佔7％和Gal-Gal-NAcGal-佔12％。|SA
22.一種包含優化的人促紅細胞生成素多聚核苷酸編碼序列(SEQ ID NO3)的分離的多聚核苷酸。
23.一種MDOT啟動子，含有卵類粘蛋白(MD)和卵轉鐵蛋白(OT)啟動子元件。
24.一種載體，包含第一和第二編碼序列以及和所述第一和第二編碼序列操作和位置上相關的啟動子以在禽類輸卵管表達所述第一和第二編碼序列；和位於第一和第二編碼序列之間的內部核糖體進入位點元件；其中所述第一編碼序列編碼蛋白質X，所述第二編碼序列編碼蛋白質Y，其中所述蛋白質X和蛋白質Y沉積於硬殼蛋的卵清。
25.如權力要求24所述的載體，其特徵在於，所述蛋白質X是單克隆抗體的輕鏈(LC)，蛋白質Y是單克隆抗體的重鏈(HC)。
26.如權力要求24所述的載體，它還包含至少一個附加的編碼序列和至少一個附加的內部核糖體進入位點元件，其特徵在於，所述內部核糖體進入位點元件位於兩個編碼序列之間，從而通過內部核糖體進入位點元件將該載體的一個編碼序列與另一編碼序列相隔開。
27.如權力要求24所述的載體，其特徵在於，所述第二編碼序列編碼的蛋白質可以為第一編碼序列編碼的蛋白質提供翻譯後修飾。
28.一種產生含有某種蛋白質的禽蛋的方法，該方法包括提供如權力要求24所述的載體；通過將所述載體導入禽類胚胎胚盤細胞中創建轉基因細胞或組織，其中該載體序列隨機插入禽類基因組；和從所述轉基因細胞或組織產生成熟的轉基因禽，其中該轉基因禽能在其輸卵管中表達編碼序列，並且將產生的蛋白質分泌入輸卵管腔中，使該蛋白質沉積於硬殼蛋的卵清中。
29.如權力要求28所述的方法，其特徵在於，所述蛋白質是單克隆抗體。
30.一種產生含有某種蛋白質的禽蛋的方法，該方法包括提供如權力要求26所述的載體；通過將所述載體導入禽類胚胎胚盤細胞中創建轉基因細胞或組織，其中該載體序列隨機插入禽類基因組；和從所述轉基因細胞或組織產生轉基因禽，其中該轉基因禽能在其輸卵管中表達編碼序列，並且將產生的蛋白質分泌入輸卵管腔，以使蛋白質沉積於硬殼蛋的卵清中。
31.如權力要求30所述的方法，其特徵在於，所述蛋白質是單克隆抗體。
全文摘要
本發明提供將外源核酸序列穩定導入禽類基因組中以表達外源序列來改變禽類表型或產生所需蛋白質的載體和方法。具體說，產生能在輸卵管中表達外源序列並使外源蛋白質沉積到禽蛋中的轉基因禽。本發明包括含有外源蛋白質的禽蛋。本發明還提供在轉基因禽輸卵管中有效表達並沉積於禽蛋中的新形式幹擾素和促紅細胞生成素。
文檔編號C12N15/00GK1980571SQ200480005912
公開日2007年6月13日 申請日期2004年1月23日 優先權日2003年1月24日
發明者R·D·伊瓦瑞, A·J·哈維, J·A·莫裡斯, G·劉, J·C·拉普 申請人:阿維季尼克斯股份有限公司, 喬治亞大學研究基金會股份有限公司