祖細胞的選擇和增殖的製作方法

2023-09-19 16:51:50

專利名稱：祖細胞的選擇和增殖的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及祖細胞選擇、增殖和使用方法。更具體地說，本發明涉及用於體外產生祖細胞群的方法和組合物。
背景技術：
成體幹細胞和胚胎幹細胞由於其在細胞治療中的潛在作用受到科學界的強烈關注。一種有前景的幹細胞源是成熟器官中天然存在的幹細胞和祖細胞。然而，由於選擇性培養相關的困難，限制了實質祖細胞的使用。例如，在建立來自成人胰或成人胰島組織的祖細胞培養物中遇到的主要問題是汙染性非實質細胞類型的過度生長和分化一定型細胞的繼續存在。
培養胰島祖細胞作為胰島素依賴型糖尿病的潛在治療手段是特別感興趣的。已嘗試在含血清培養基中培養來源於分離的胰組織的胰島細胞。然而，大多數連續增殖的胰島細胞群僅顯示適度的增殖能力且保留分化特性。胚胎來源的祖細胞，在牛腦提取物的幫助下增殖，不僅產生胰島細胞，而且產生腺泡細胞和導管細胞的細胞群，與胰島前體相比，它可能代表早期胚胎胰祖細胞。而且，本方法使用天然高祖細胞數量的胚胎來源的細胞，而在成熟組織中鑑定和控制祖細胞更難。描述了能夠體內產生胰島素的胰島細胞群。
雖然本方法使胰島前體細胞一定程度的增殖，但該細胞需要伴隨的不同組織類型的間質或「撫育」細胞如導管細胞的共增殖，而導管細胞代表是培養基中的大多數細胞。
已使用(例如)細胞標記物的可選擇的機械分離方法，以選擇幹細胞或祖細胞群。然而，這種人為細胞選擇僅得到暫時富含的幹細胞和祖細胞群。
在為尋求得到含再生組分的增殖上皮細胞群，沒有研究可區分祖細胞及其天然後代，過渡放大細胞。因此，先前的方法不利於維持祖細胞庫通過過渡放大過度生長。過渡放大細胞具有能夠連續傳代的生長能力，但它們天然抑制幹細胞活化和祖細胞繼續增殖(Hardin-Young等，Current Neurovascular Research1，(2004)；Parenteau，Encyclopedia of Animal and Plant Cell Technology，365-78(1999))。控制過渡放大細胞的產生和生長或控制汙染細胞類型的生存的同時不能維持祖細胞活化和生長，阻止了基本上純的成人祖細胞群的發育和維持。這一困難導致在實踐人上皮細胞培養物中經歷的變異。
因此，需要一種產生大多數細胞是體外能夠延長擴展、體內具有高保真度器官再生的實質祖細胞的細胞培養物的方法。此外，需要一種產生這種來自成熟(成人或新生兒)組織，尤其是實質性組織的方法。
發明概述本發明提供選擇和擴展來自新生兒或成人實質性組織的祖細胞群的方法。本發明培養的祖細胞群是一種容易獲得的細胞來源，體內移植時，它可用於增加、修復、恢復或代替患病、損傷、缺失或損害的組織或器官。
本發明方法提供促進真祖細胞的選擇的培養條件。根據本發明，選擇損害更分化(more differentiated cell)細胞的細胞培養條件，因而解除更分化細胞通常對祖細胞生長的抑制作用。結果使得構成大多數細胞培養物的自支持、未分化祖細胞的集落形成。本發明考慮在細胞培養中可誘導應激反應的任何無血清的培養條件，以抑制更分化細胞的增殖而使祖細胞生長。理想地，選擇條件以使一旦產生祖細胞群即可誘導組織特異性分化，體外或體內。
雖然考慮了促進祖細胞生長的任何一組培養條件，優選的增殖祖細胞的方法包括在正在分化和/或分化的細胞中誘導凋亡或壞死的無血清培養基。可將細胞先培養在含有低水平或不含鈣和/或生長因子的嚴格的原代培養基中，以使培養朝祖細胞活化和生長偏移。祖細胞開始生長後，祖細胞擴展成為大多數細胞群，細胞在比原代培養基較不嚴格的第二代最小生長培養基中增殖。最後，在特定生長因子的存在下，通過在第三代培養基中加入分化因子，可促進所得祖細胞培養物的分化。
或者，分化前收集祖細胞供使用。考慮抑制分化細胞生長的任何培養基成分，作為產生本發明祖細胞群的方法。降低生長因子的濃度和/或效力是達到此目的的一種方法。抑制細胞粘附是另一種方法。然而，本領域已知其它方法，例如降低某些通常促進分化細胞生長的離子的濃度、抑制細胞粘附、改變培養pH等。當然，可採用任何這種獨立技術的組合。
在優選的實施例中，本發明方法包括在無血清培養基中提供含有祖細胞和至少一種正在分化細胞及分化細胞的原代細胞培養物；在原代細胞培養物中誘導應激反應，使祖細胞複製並抑制至少一種正在分化細胞和分化細胞的增殖；鑑定複製所得祖細胞群，它構成原代細胞培養物的大多數細胞。方法可包括從原代細胞培養物中分離祖細胞並培養分離的祖細胞的步驟，以提供次生細胞培養至不少於5個連續代。可在含有穀胱甘肽，例如0.01-10mM穀胱甘肽的合成培養基中維持次生細胞培養。方法還可包括刺激祖細胞群分化的步驟。
在優選的實施例中，當次生細胞培養約為60％-75％融合時，可進行連續傳代。可在基質組分如膠原的存在下，維持原代細胞培養物或次生細胞培養。
優選的應激反應包括在細胞培養物中誘導凋亡和/或壞死。並且，優選的原代培養基基本上不含生長因子或器官提取物，沒有或低水平的鈣。可使用任何細胞類型產生原代培養物，但優選上皮細胞，例如胰細胞、肝細胞和表皮細胞。一種優選的方法產生包含至少約60數量％、70數量％或80數量％祖細胞的細胞群。培養細胞一段時間，足以產生祖細胞群。
通過改變培養條件，例如增加分化因子，在培養中完成分化細胞的刺激，以朝形成分化細胞偏移。
本發明提供從非胎(non-fetal)組織體外增殖的基本上純的哺乳動物祖細胞群。
本發明其它方法包括通過根據方法體外培養胰島祖細胞；並將祖細胞移植入哺乳動物，防止或治療糖尿病。
由下面的描述和附圖可更全面地理解本發明的上述和其它特徵和優點以及發明本身。
附圖簡要說明

圖1說明涉及實質產生和使用祖細胞庫的新生方法。
附圖不一定按比例，而是通常重點在於說明本發明的原理。結合附圖參考說明，將更好地理解本發明的優點。
發明詳述本發明(部分)提供得到能夠體外自持和延長擴展和體內器官再生的實質祖細胞群及所得組合物的方法。該方法包括在不能支持更分化細胞的維持，仍允許下面的祖細胞群生長和擴展的培養基中培養原代細胞。結果是祖細胞構成大多數，優選較高百分比，例如60、70或80數量％的細胞群的培養物。在一個實施例中，細胞培養物是基本上純或同種祖細胞群。一旦建立，可在確定的條件下將祖細胞群增殖用於多次傳代，需要時，可擴展用於臨床治療。本發明方法的優點之一是它們提供可用於細胞療法的容易獲得的祖細胞來源。
本發明祖細胞來源於含能再生的實質細胞的任何器官或組織，包括但不限於，來源於胰、肝、腸、心、腎、角膜、皮膚、視網膜、內耳、骨骼肌、腦或腺的細胞群。在優選的實施例中，祖細胞群產生特定實質譜系的細胞，例如胰島內分泌細胞譜系、肝細胞譜系或表皮細胞譜系。
參考圖1，為了達到新生，即從頭產生功能組織，本發明方法著眼於體外祖細胞群的增殖和活化。在一個實施例中，來源於器官如胰的原代細胞培養物含有多種細胞類型。殘留的幹細胞10是慢周期細胞，產生祖細胞20。祖細胞20是分化程度最低的細胞，構成負責器官再生的增殖細胞區室。基於發育研究、基因表達和轉錄因子的表觀調節，慢周期幹細胞10區別於祖細胞區室和過渡放大細胞30。一旦激活祖細胞20，產生過渡放大細胞30，過渡放大細胞依次產生實質細胞40。過渡放大細胞30是譜系定型的分化細胞並顯示有限的複製。實質細胞40是分化程度最高的功能細胞。
根據本發明的一方面，可在身體外面，例如體外培養基本純或同種祖細胞群，而不依賴於來自非實質如間質組織、結締組織或支持組織的細胞。換句話說，本發明祖細胞能夠實現由其自身組織型細胞的自持增殖。根據本發明的另一方面，通過控制細胞培養條件，以消除或至少抑制更分化細胞，包括正在分化細胞和分化細胞，可選擇上述祖細胞群。該方法的優點在於，更多地是由其行為和這種行為的結果而不是在任何給定時間或位置可能表達的任何標記物來鑑定祖細胞。另一個優點是已知調節細胞周期的機制，包括細胞凋亡和壞死可用來達到本發明的目的。
在優選的實施例中，通過在原代培養基中培養上皮細胞的原代培養物，體外產生基本上純的上皮祖細胞群，所述原代培養基可在細胞中誘導耗盡成熟、分化實質細胞和/或正在分化的過渡放大細胞的應激反應。此反應改變培養基中細胞信號的動力學，以使祖細胞複製和增殖。應激反應殺死更分化細胞，使所得細胞群基本上不含分化或正在分化的細胞，以及來自其它組織型，如間質細胞、成纖維細胞的汙染細胞。雖然尚不確定，但抑制更分化細胞可扼制細胞間抑制祖細胞複製的信號和/或可能提供活化祖細胞增殖的信號。結果，祖細胞增殖而沒有任何類型的來自其它組織型的「飼養」細胞或「撫育」細胞。
除肉眼觀察外還有各種其它監測應激反應的方法。例如，可測定熱激蛋白質或急性期反應物基因的表達作為應激反應的指示器。
一種鑑定祖細胞預融合集落的方法是測定原代培養細胞是否經歷主動的有絲分裂。其它方法包括顯微鏡下觀察細胞；或將5-溴-脫氧尿苷(BrdU)，一種胸腺嘧啶核苷類似物，加入到細胞培養物中並使用單克隆抗-BrdU抗體檢測BrdU摻入細胞。
原代培養中鑑定祖細胞的預融合集落後，可分離該祖細胞集落並用於建立包含基本同種祖細胞的次生細胞培養物。次生細胞培養物可使用與原代培養相同類型的培養基，或使用較不嚴格的培養基。次生細胞培養物通過多次傳代維持祖細胞，祖細胞保留分化或經歷新生的能力。在一個實施例中，祖細胞經歷不少於5次傳代。
本發明還包括活化祖細胞成為正在分化的細胞如過渡放大細胞，和/或分化細胞如實質細胞的步驟。祖細胞和/或其正在分化的和/或分化的後代可用於治療應用，如通過移植。
通篇說明書中，若所述組合物具有、包括或包含特定組分，或所述方法具有、包括或包含特定方法步驟，則考慮本發明組合物也基本包含，或由所述成分組成，並且本發明方法也基本包括，或由所述方法步驟組成。
應理解，只要本發明可操作，步驟的順序或進行某些操作的順序不重要。而且，可同時進行兩個或多個步驟或操作。
原代細胞培養物設計原代細胞培養物，在正在分化的細胞和分化細胞中，包括其它組織型的汙染細胞中誘導應激反應，但允許祖細胞增殖。認為，一旦耗盡正在分化的細胞和分化細胞群，祖細胞活化，進入細胞周期並開始高速分裂。可通過多種方法，例如誘導這種細胞的凋亡和/或壞死，開始祖細胞選擇過程的應激反應。在一個實施例中，原代培養基是確定化學成分的。「確定化學成分的」表示培養基基本上不含有或大體上不含有血清或器官提取物。在某些實施例中，培養基含有低水平或大體上不含生長因子。如果存在生長因子，優選小於約10ng/ml，更優選小於約5ng/ml，例如約1ng/ml。在一個實施例中，培養基含有cAMP的升高劑，如霍亂毒素和毛喉素，優選濃度為9ng/ml，以支持祖細胞的活化和增生。
可設計原代培養基，以抑制細胞-細胞粘附。例如，培養基可含有氧化氮，已知氧化氮可抑制細胞粘附並破壞細胞基質相互作用。另一方面或此外，可加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1-β(ILl-β)和幹擾素-γ(IFN-γ)，以刺激氧化氮誘導的凋亡。也可在稀釋的水膠體、葡聚糖等中培養細胞，以破壞細胞粘附並不利於更分化細胞的存活。
在一些實施例中，培養基含有低水平鈣或不含鈣。如果培養基中存在鈣，鈣的濃度優選小於約1mM，例如約0.001-0.9mM。在一個實施例中，鈣濃度約為0.01-0.5mM，在另一個實施例中，約為0.08mM。雖然不希望受被理論約束，認為低鈣環境限制細胞與細胞接觸，細胞-細胞接觸對更分化細胞的相互作用和維持是必需的。低鈣環境聯合確定化學成分的培養基以及最小濃度的生長因子，使得分化細胞分裂地更慢，最終導致這種細胞凋亡，培養物內產生祖細胞群。
本領域已知許多凋亡或壞死相關途徑。可設計原代培養基，以啟動或增強這種途徑。下調所述應激的途徑可去活化，例如，可阻斷抑制凋亡的蛋白激酶。許多這種途徑是協同的，且可聯合使用，這種信號途徑的例子包括，胱冬酶途徑、Bcl-2途徑和白介素-10途徑。
胱冬酶途徑涉及轉錄因子的核因子κB(NF-κB)，一旦易位至核，該因子可活化各種基因的轉錄，包括影響細胞死亡發生的基因。可將調節NF-κB的配體、抗原、抗體、生長因子、細胞因子、淋巴因子、趨化因子、輔因子、激素和其它因子，例如腫瘤壞死因子(TNF)，加入到培養基中，通過胱冬酶、Bcl-2和其它途徑殺死正在分化和/或分化細胞。這種因子包括TNF-α、TNF-樣細胞凋亡弱誘導劑(TWEAK)、TNF相關誘導細胞凋亡的配體(TRAIL)、白介素(IL)(例如IL 10)、Fas配體、凋亡誘導蛋白配體(例如APO-3L和2L)、轉化生長因子β(TGF-β)、內毒素(例如脂多糖)、正常T細胞表達和分泌的活化調節因子(regulated-upon-activation normal T-cell expressed and secreted)(RANTES)、幹擾素(如IFN-γ)、噁玳酸(oxadaic acid)(色氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑)等。
可被破壞而不利於更分化細胞存活的抑制凋亡信號途徑的例子包括AKT-介導的信號途徑及通過其它所謂「存活激酶」如IKK、erk、Raf-1的活化途徑。幹擾AKT信號途徑的可能方法包括使用siRNA、生長因子如自分泌和旁分泌產生的生長因子，和/或阻斷受體酪氨酸激酶AKT的抗體。或者，使用嚴格的確定成分培養基排除可誘導該途徑的生長因子，得到相似的結果。破壞抑制凋亡信號的另一個例子包括熱激蛋白質70的失活。
其它環境因子如熱、輻射、溼度和pH也在細胞培養中導致所需應激反應。例如，在更分化細胞中紫外輻射可誘導細胞死亡。
次生細胞培養次生細胞培養通常包括利用祖細胞在應激條件下旺盛生長的能力，從原代細胞培養物中選擇祖細胞。次生細胞培養維持祖細胞，使其保留分化或新生而不實際分化的潛力。通過連續傳代，祖細胞群耐受長期增殖的能力產生本發明的另一個優點，即積聚足夠量的祖細胞用於新生或其它應用的能力。
次生細胞培養可使用與原代培養相同類型的培養基，正如該培養基可繼續抑制祖細胞的分化。或者，第二代培養基可較不嚴格。因為開始培養中基本上不含更分化細胞，所以可將一些限量的生長因子加入到鹼性培養基中。在第二代培養基中可略微或間歇使用一些非必需生長因子。這種生長因子的例子包括表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGF-α)、角質形成細胞生長因子(KGF)和鹼性成纖維細胞生長因子。
進一步調節可進一步調節由原代或第二代培養收集的細胞。在某些實施例中，誘導祖細胞進行性分化入各階段，參考圖1如上所述。可製備具有分化因子如較高水平的鈣、血清和/或TGF-β的第三代培養基。培養基還可包含地塞米松和環腺苷酸單磷酸鹽(cAMP)升高劑，且已知可促進和維持分化細胞生長的其它因子。加入有助於形成細胞複合物的細胞外基質、水凝膠或水膠體底物或聚合物也可促進細胞分化。這種細胞可應用於許多療法。
實施例提供下面的實施例以闡述本發明的原理，而不應解釋為以任何方式限制權利要求的範圍。本領域技術人員將明白，不背離本發明的精神和範圍內可進行多種改進。
實施例1培養條件通過酶解感興趣組織或模擬形成1-2mm2的組織移植物，建立來源於人組織的祖細胞。如果使用酶消化，優選酶例如膠原酶、透明質酸酶、分散酶、鏈黴蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和糜蛋白酶。本領域已知許多製備原代細胞培養物的方法。
通過將異種細胞群平鋪並鋪展在組織培養底物(如塗布有I型膠原的板)上，開始培養。通常，大多數細胞顯示大、鋪展的上皮樣細胞到成纖維細胞外觀。然後在含有少或無鈣且非常少或無生長因子的確定化學成分培養基中培養細胞。確定化學成分的條件是指培養基基本上不含有血清或器官提取物。如果培養基中存在鈣，鈣的濃度優選小於約1mM，例如約為0.001-0.9mM。在另一個實施例中，鈣濃度約為0.08mM。如果存在生長因子，其濃度小於約10ng/ml，優選小於約5ng/ml，例如約為1ng/ml。
第一個10天內鑑定單一實質祖細胞和實質祖細胞集落。通常，肉眼觀察集落區別於其它細胞。與大多數細胞不同，實質祖細胞的形狀仍為小的圓形或多角形。祖細胞通常小於約15微米並具有緻密外觀。這種細胞頑固，並且使用相差顯微鏡可容易地識別。而且，可由其活性有絲分裂鑑別實質祖細胞。通常，實質祖細胞的集落數量增加，約14天內在原代培養中成為主要細胞群。當鬆散形成的集落和小分裂細胞佔據約50-70％的細胞培養物表面時，由胰蛋白酶消化收集細胞。在一個實施例中，祖細胞佔據約80％的細胞培養物表面。
第二代培養中所得祖細胞群的特徵在於，具有小尺寸，傳代後集落形成率約為40％或更高，約36小時或更少時間快速細胞分裂。傳代祖細胞至少約5代並可延長到約13代或更多，取決於傳代期間所用的分裂比例。細胞通常達到約10個群體倍增或更多。細胞保持組織特異性祖細胞的特徵，例如譜系特異性基因和祖細胞相關發育基因的表達。
改變環境如第三代培養基的培養條件後，所述環境含有促進和/或支持正在分化的細胞發育和生長的因子，祖細胞具有顯示器官型分化的能力。這種因子的例子包括皮質醇、TGF-β、肝細胞生長因子或其它已鑑定為在調節胚胎器官發生中有效的因子。可引入第三代培養的其它環境條件的例子包括，加入細胞外基質以促進簇形成或三維培養，加入濃度大於約1.0mM的鈣，或可產生細胞-細胞粘附和發展組織結構的任何方法。根據組織類型，可一起使用或按順序使用任何這種因子和條件，以促進器官發生。
胰島祖細胞群的選擇如下所述。然而，該實施例不是為了限制，祖細胞可來源於含有能再生實質細胞的任何組織或器官，例如肝、腸、心、角膜、皮膚、視網膜、內耳、骨骼肌、腦或腺體。
實施例2胰島細胞內分泌祖細胞來源於整體新生胰腺或分離的成人胰島。然後在嚴格條件下培養細胞，對細胞培養物施加應激條件以選擇內分泌祖細胞群的生長。一旦建立，該細胞群增殖未分化的多次傳代，因而擴展了胰島素依賴性糖尿病的臨床治療。
本發明誘導應激的培養基允許建立原代培養物，並且由這種可連續傳代的原代培養物可促進細胞亞群的鑑定，因而提供了具有治療價值的擴展細胞數目。優選地，誘導應激的培養基由不含血清或生長因子的確定化學成分的培養基構成。使用該培養基和培養方法的胰腺或胰島組織的細胞生長主要顯示上皮樣形態且表達上皮細胞的細胞角蛋白標記特徵。
隨著細胞在培養基中擴展，其特徵是與胰祖細胞，如PDX1相關標記的表達。在胰發育的早期需要同源結構域蛋白PDX1(Nature Genetics 15106-110(1997)；Development 1221409-1416(1996))。隨著分化的內分泌細胞的出現，這種細胞從上皮細胞分離並轉移入相鄰的間充質並在那裡聚簇。後面需要PDX1，通過正調節胰島素和胰島澱粉樣多肽表達並抑制胰高血糖素表達以維持產生激素的β細胞表型(Genes Dev 121763-1768(1998))。也需要PDX-1調節β細胞中的GLUT2表達，提示在維持正常β細胞穩態中起著重要作用。
哺乳動物神經發生蛋白基因家族的成員之一，神經發生蛋白-3已鑑定為前分泌基因(見Proc Natl Acad Sci USA 971607-11(2000)Curr Opin Genet Dev 9295-300(1999))，並認為是發育過程中胰島祖細胞的標記(Development 1292447-57(2002))。特徵為胰島來源細胞群的祖細胞表達神經發生蛋白-3。
使用化學或物理方法，例如通過在培養基中補充促進產生胰島素的細胞分化的試劑，或在細胞外基質的存在下通過誘導形態變化如細胞簇β形成，可誘導內分泌祖細胞分化。誘導細胞分化也可是移植入允許環境的結果。例如，在腎囊下、皮下或小腸的黏膜下空隙中植入後，可見體內分化。
實施例3培養基用於原代培養的嚴格、誘導應激的培養基不含或基本上不含血清或器官提取物。
本發明原代培養基備有營養基，營養基還可補充或沒有其它組分。營養基可包括無機鹽、葡萄糖、胺基酸和維生素和其它基礎培養基成分。例子包括Dulbecco’s改良的Eagle培養基(DMEM)；極限必需培養基(MEM)；M199；RPMI1640；Iscove′s改良Dulbecco’s培養基(EDMEM)；Ham′s F12，Ham′s F-10，NCTC109和NCTC 135。本發明優選的基礎培養基包含3比1比例的沒有葡萄糖、丙酮酸鎂或丙酮酸鈉，含4.0mM L-穀氨醯胺的不含鈣或低鈣DMEM的營養基，和含5mM葡萄糖的Ham′s F-12。基礎培養基中最終葡萄糖濃度優選調節至約5mM。基礎培養基中補充有一種或多種動物細胞培養領域技術人員已知的以下成分胰島素或胰島素樣生長因子；轉鐵蛋白或亞鐵離子；三碘甲腺原氨酸或甲狀腺素；乙醇胺和/或正磷醯基乙醇胺，氯化鍶，丙酮酸鈉，硒，非必需胺基酸，蛋白酶抑制劑(例如，抑肽酶或大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI))和葡萄糖。
在一個實施例中，培養基中不加入生長因子。在另一個實施例中，基礎培養基還補充有諸如非必需胺基酸、生長因子和激素的成分。例如，加入TGF-β作為凋亡基因以促進分化肝細胞的凋亡，或加入TNFα作為分化胰島、肝和上皮細胞的凋亡基因。可用於本發明的確定成分培養基參見Parenteau的美國專利5,712,163，該專利納入本文作參考。可使用滴定實驗測定補充物的合適濃度，如本領域技術人員所知的那樣。優選濃度的例子如下所述在第二代培養基中胰島素的優選濃度為5.0μg/ml。前胰島素，胰島素樣生長因子如IGF-I或II可取代胰島素。本文所用胰島素樣生長因子指結構類似於胰島素並刺激胰島素樣生長因子受體的組合物。
優選地，在第二代培養基中通過轉鐵蛋白提供濃度約為0.05-50u g/ml，優選濃度約為5μg/ml的亞鐵離子。
加入三碘甲腺原氨酸以維持細胞代謝速率。優選存在的濃度約為2-200pM，更優選約為20pM。
實施本發明可使用乙醇胺和正磷醯基乙醇胺中的一種或兩種。兩者都是在肌醇途徑和脂肪酸代謝中作為前體起作用的磷脂。在不含血清的培養基中補充血清中通常存在的脂質是必需的。培養基中提供一種或兩種乙醇胺和正磷醯基乙醇胺，優選濃度約為10-6M-10-2M，更優選約為10-4M。
使用的硒濃度約為10-9M-10-7M，優選約5×10-8M。使用的胺基酸L-穀氨醯胺或其取代物濃度約為1mM-10mM，優選約為6mM。
製備祖細胞連續傳代的第二代培養基時，培養基中可加入其它成分，取決於，例如，所培養的特定細胞，包括但不限於，表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TNF-α)、角質化形成細胞生長因子(KGF)和鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。在第二代培養基中作為任選成分的EGF，使用的濃度低至1ng/ml。
第二代培養基的優選實施例包括3∶1 DMEM(無葡萄糖，無鈣，有4mM L-穀氨醯胺)和Ham′s F-12的基礎培養基，補充有以下成分使每種成分的最終濃度為6mM L-穀氨醯胺(或等價物)，1ng/ml EGF，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷醯基乙醇胺，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，1mM氯化鍶，100mM丙酮酸鈉，10mM非必需胺基酸和5mM葡萄糖。
雖然根據本發明增殖的細胞群包含一個階段的祖細胞庫，但可誘導進一步的定型分化和器官發育。需要時，第三代培養基使得祖細胞產生大多數過渡放大細胞並促進器官發育。用於產生過渡放大細胞的培養基的優選實施例包含1∶1 DMEM(無葡萄糖，無鈣，含4mM L-穀氨醯胺)和Ham′s F-12的基礎培養基，補充有以下成分使每種成分的最終濃度為6mM L-穀氨醯胺(或等價物)，10ng/ml EGF或HGF或兩者(取決於細胞類型)，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷醯基乙醇胺，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，100mM丙酮酸鈉，2x10-9孕酮，1.1uM皮質醇，0.08mM氯化鈣和9ng/mL毛喉素。
可將祖細胞以此培養基中約1,000-5,000個細胞/平方釐米的中等密度平板接種在塗布有膠原的塑料表面上，並至少培養一代。可使用細胞群或可啟動進一步分化。需要進一步分化時，可將細胞轉移至不含毛喉素的第三代培養基且增加鈣濃度(例如)至1.88mM的條件下。也可包括其它培養環境的改變，例如，加入細胞外基質成分。一些環境條件的改變取決於組織類型，例如，可在氣液界面培養表皮細胞，可在促進簇形成的基質條件中培養胰島細胞，可在促進束形成的三維底物中培養肝細胞。
製備本發明使用的培養基的典型方法如下所述。然而，可使用其它常規方法製備本發明成分，在某些成分中用類似物或功能等價物取代或不取代。並且，可根據諸如年齡、大小和健康的因素，優化來自不同種的細胞和來自不同生物體的細胞系的補充物濃度。可用成分的不同濃度進行滴定實驗，以得到該成分的最佳濃度。
在無菌條件下，從基礎培養基和通過常規方法，如過濾滅菌產生或得到的成分開始，製備原代、第二代和第三代培養基。整個實施例中使用合適的無菌步驟。混合DMEM和F-12，然後加入各個成分完成培養基。所有成分的儲備液可儲存在-20℃，除了營養物源可儲存在4℃。
可使用適合於動物細胞或組織培養的容器，如培養皿、培養瓶或滾瓶培養內分泌祖細胞。可使用材料如玻璃，不鏽鋼，聚合物，矽底物，包括融合矽和聚矽，以及其它生物相容材料作為細胞生長表面。本發明細胞可在固體表面或多孔表面如多孔膜上生長，以使培養基與培養細胞雙向接觸。此外，細胞生長表面材料可是化學處理或修飾的、靜電荷的、或塗覆有生物試劑如肽或基質成分。實施本發明的優選生長表面是塗覆有I型膠原的常規組織培養表面。
培養優選維持在約34℃-38℃，更優選37℃，氣體約5-10％ CO2，相對溼度約為80-90％。使用培養箱以維持培養細胞的控制的溫度、溼度和氣體混合物環境條件。
可收集居留祖細胞活化祖細胞的第一步中使用的培養基，並用於促進仍居留在擴展的培養中的祖細胞的活化。類似地，可使用增殖後面傳代細胞的條件培養基，支持低密度接種的祖細胞的增殖。條件培養基可含有10-50％的營養培養基。或者，可通過除去普通肝素結合生長因子，濃縮並脫鹽收集的培養基，產生更特殊的條件補充物。可以相當於原來起始物質的濃度使用濃縮的補充物。更詳細的實施例如在以下實施例7中提供。
實施例4移植本發明提供移植入哺乳動物的方法。可將上述所需祖細胞移植入或引入哺乳動物或患者中。在一個實施例中，移植涉及通過將細胞懸浮液注射入哺乳動物或患者，將細胞群外科移植入哺乳動物或患者的組織或器官，或灌注具有細胞懸液的組織或器官，將祖細胞轉移入哺乳動物或患者。轉移祖細胞或移植的途徑將由細胞居留在特定組織或器官的需要及細胞找到並由所需靶組織或器官保留的能力來確定。若要使移植細胞居留在特定部位，可用外科方法植入組織或器官(如十二指腸)中，或如果細胞具有遷移至所需靶器官的能力則注射入血流或相關器官，正如當注射入門脈循環或脾時肝細胞可定位於肝那樣。
本發明特別考慮將同基因、同種異體基因或異種基因祖細胞或它們的混合物移植入患者。
實施例5使用胰祖細胞治療胰島素依賴性糖尿病祖細胞可用於代替1型糖尿病患者所失去的β細胞或在2型胰島素依賴性糖尿病患者中增加β細胞的總量。優選屍體組織作為用來產生祖細胞的供體組織。從組織分離胰島和選擇祖細胞如下所述。培養物擴展後或一段時間由生長因子、激素和鈣誘導的分化後，可直接將祖細胞移植入患者。在一個實施例中，祖細胞是免疫耐受的，以使在同種異體移植物中，它們不誘發體液或免疫細胞反應。在本發明該實施例的一方面，這些細胞一般不表達MHC類II型抗原，且不誘發促進T細胞活化的共刺激反應。
在本發明的另一個實施例中，移植物的受體可顯示通過注射自身抗原如GAD65的封閉抗體，通過注射一種或多種本文所述免疫抑制藥物，或通過本領域已知的防止或改善同種異體免疫和/或自身免疫排斥的任何方法，可對抗移植細胞的免疫反應。
實施例6藥物開發成人器官祖細胞，尤其是濃縮或基本上純的細胞群的獨特性質，使得這些細胞成為鑑定(例如)器官調節和自分泌生長調節非常適合和理想的工具。尤其涉及致癌作用和研究如何體內刺激再生。可使用人細胞尤其有益。在明確化學成分的條件下使用系統的能力也利於研究和分析。
在一些實施例中，在上述方法的各階段從成熟器官的原代活化，第二代生長和連續傳代，以及促進分化的第三代條件，使用基因晶片分析、多聚酶鏈反應、和/或蛋白組學分析，鑑定根據本發明培養的細胞群。使用相同的細胞株，通過比較活化的基因和產生的蛋白，及其在各階段的表達水平，可觀察到直接涉及細胞群調節中改變的差異。然後，在不同條件下，從類似或不同器官來源的多種人細胞株中比較這些反應，得到在成人器官中控制人細胞群的一般細胞途徑。這些途徑成為生物藥物或藥物治療的候選靶點。一旦確立了靶點，可在系統中試驗混合物以證實其在調節人細胞或器官型組織中的作用。
實施例7建立和使用來自分離的人朗格漢胰島的祖細胞使用Ricordi首先提出的半自動方法(Diabetes 37413-420，1988)分離人胰島。通過導管內輸注釋放酶(Liberase)HI(Roche Molecular Biosciences，Indianapolis IN)或Serva膠原酶(Crescent Chemical，Brooklyn NY)，膨脹所得器官。連續消化約12-30分鐘後，將組織收集於約8升的Hanks溶液中並洗滌。在Cobe 2991細胞分離器中，使用EuroFicoll連續梯度，從其它組織分離游離胰島(Cell Tiss Res.31051-58，2002)。
將約200個胰島接種於含有4ml原代培養基(包含3∶1 DMEM(不含葡萄糖，不含鈣，含4mM L-穀氨醯胺)和Ham′s F12的基礎培養基，補充有以下成分使每一成分的最終濃度為6mM L-穀氨醯胺(或等價物)，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷醯基乙醇胺，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，1mM氯化鍶，1mM丙酮酸鈉，100μM非必需胺基酸25μg/ml抑肽酶，9ng/ml毛喉素和5mM葡萄糖)的60mm塗覆膠原的培養皿中。
培養物孵育14天，期間細胞從分離的胰島鋪展開來。70％融合時，胰酶消化收集出現的祖細胞小細胞群。
胰島來源祖細胞的連續傳代以4000個細胞/平方釐米在I型膠原塗覆的培養皿上，在第二代培養基(包含3∶1 DMEM(不含葡萄糖，不含鈣，含4mM L-穀氨醯胺)∶F12的基礎培養基，補充有以下成分使每種成分的最終濃度為6mM L-穀氨醯胺(或等價物)，1ng/ml EGF，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷醯基乙醇胺，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，1mM氯化鍶，100mM丙酮酸鈉，10mM非必需胺基酸和5mM葡萄糖)中，連續傳代增殖的祖細胞。當建立細胞且達到至少30％融合時，加入表皮生長因子。80％融合或較小時傳代細胞。
肝素分級條件培養基用於選擇性刺激祖細胞從活化的增殖祖細胞培養物收集條件培養基，並置於製備型肝素瓊脂糖上以除去肝素結合生長因子。通過過濾濃縮保留組分並用G-100瓊脂糖柱脫鹽。無菌過濾濃縮組分，等分並儲存在-70℃備用。用新鮮補充的基礎培養基將濃縮組分重新構建至其原先體積，用於支持後傳代或低密度祖細胞的增殖。
活化祖細胞的條件培養基如上所述由胰島建立培養基。在分化細胞凋亡的中間階段和祖細胞集落形成開始時，從培養物中收集條件培養基。通過過濾濃縮條件培養基，並用G-100瓊脂糖柱脫鹽。用新鮮補充的基礎培養基將濃縮組分重新構建至其原先體積，用於支持使用細胞分選或其它方法如產生慢周期胰小細胞培養物的培養物方法而獲得新的祖細胞的活化。
胰島祖細胞的體內分化連續培養胰島祖細胞至第6代。將胰酶消化的細胞懸浮在基礎培養基中並用腹腔鏡通過大針將細胞傳遞入十二指腸的黏膜下間隙。祖細胞聚簇並分化入產生胰島素的胰島組織。
部分分化的胰島祖細胞組織的體內傳遞連續培養胰島祖細胞至第6代並用胰蛋白酶消化。在上述補充的基礎培養基存在下，加入1.8mM氯化鈣，10ng/mL毛喉素，4μg/ml皮質醇和I型膠原的塗覆層，將細胞接種於組織培養塑料板上。形成囊狀結構。收集囊，原樣遞送或通過除去毛喉素並用膠原酶處理除去膠原塗覆層，進行進一步分化處理。或者，在上述補充的基礎培養基存在下，加入1.8mM氯化鈣，4μg/ml皮質醇，將細胞懸液接種於零重力培養系統中以促進懸浮細胞聚簇的形成。使用套針將囊或部分分化的聚簇腹腔鏡注射入十二指腸的黏膜下間隙或可選地注射入肝門靜脈。
不背離本發明的精神或其必要特徵，本發明可進行其它具體形式的實施例。因此，在所有方面認為上述實施例是示例性的而不是對本文所述發明的限制。因此，由所附權利要求書而非上述說明書限定本發明的範圍，本文包括在權利要求書的意義或等價範圍內的所有改變。
上述每種專利文獻和科學出版物納入本文作為參考。
權利要求
1.一種體外增殖祖細胞的方法，所述方法包括以下步驟提供包含祖細胞及正在分化的細胞和分化細胞中至少一種的在無血清培養基中的原代細胞培養物；在原代細胞培養物中誘導應激反應，其中所述應激反應允許祖細胞複製並抑制所述正在分化的細胞和分化細胞中至少一種的增殖；和鑑定複製所得祖細胞群，其中所述祖細胞群構成原代細胞培養物中的大多數細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述應激反應包括凋亡。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述應激反應包括壞死。
4.如權利要求1所述的方法，包括從原代細胞培養物中分離祖細胞的步驟。
5.如權利要求4所述的方法，包括培養祖細胞以提供次生細胞培養物的步驟。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述培養步驟包括祖細胞群的不少於5次的傳代。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述原代細胞培養物包含選自以下的細胞上皮細胞、胰細胞和肝細胞。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述正在分化的細胞和分化細胞中至少一種是導管上皮細胞、撫育細胞、基質細胞或成纖維細胞。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基基本上不含器官提取物。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含約0mM-0.9mM鈣離子。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含濃度約為0.08mM的鈣離子。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基基本上不含生長因子。
13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，設計所述培養基以抑制細胞粘附。
14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含配體、抗原、抗體、生長因子、細胞因子、淋巴因子、趨化因子、輔因子和激素中的至少一種。
15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述誘導應激反應的步驟包括調節胱冬酶途徑、Bcl-2途徑、白介素-10途徑及AKT-介導途徑中的至少一種。
16.如權利要求1所述的方法，所述培養基包含腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-樣細胞凋亡的弱誘導劑(TWEAK)、TNF相關誘導細胞凋亡的配體(TRAIL)、白介素(IL)、Fas配體、凋亡誘導蛋白配體、轉化生長因子、內毒素、正常T細胞表達和分泌的活化調節因子(RANTES)、幹擾素和噁玳酸中的至少一種。
17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含至少一種選自以下的分子氧化氮、TNF-α、IL-10、IL 1-β、APO-3L、APO-2L、TGF-β、IFN-γ和脂多糖。
18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含環腺苷酸(cAMP)升高劑。
19.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述祖細胞群由數量至少約為80％的祖細胞構成。
20.如權利要求1所述的方法，還包括刺激祖細胞群分化的步驟。
21.一種在哺乳動物中預防或治療疾病或病症的方法，所述方法包括以下步驟將按照權利要求4所述的方法分離的祖細胞移植入哺乳動物。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述疾病是糖尿病。
23.一種維持在確定成分培養基中的包含祖細胞的體外祖細胞群，其中，所述確定成分培養基在細胞培養中誘導應激反應，並且，所述祖細胞群在數量上構成培養基中所有細胞的大多數。
24.如權利要求23所述的體外祖細胞群，其特徵在於，所述確定成分培養基不含血清和生長因子，含有濃度不大於約0.09mM的鈣離子，其中，所述祖細胞群構成不少於培養基中所有細胞的80％，且所述祖細胞能夠分化和新生。
25.一種從非胎組織體外增殖的基本上純的哺乳動物祖細胞群。
全文摘要
本發明涉及祖細胞群及獲得和培養祖細胞的方法。本發明方法和組合物可用於包括再生醫學(組織再生)、移植和癌症研究的領域。
文檔編號C12N5/00GK1820069SQ200480019509
公開日2006年8月16日 申請日期2004年6月3日 優先權日2003年6月3日
發明者N·L·帕倫特諾 申請人:器官恢復體系股份有限公司