在酵母菌中產生衣康酸的方法

2023-09-19 16:34:15

專利名稱：在酵母菌中產生衣康酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種產生衣康酸(itaconic acid)的方法，且特別涉及一種以甘油為 基質在酵母菌中產生衣康酸(itaconic acid)的方法。
背景技術：
在化學工業中高度需要的衣康酸(itaconic acid, ΙΑ)為前體化合物一般使用於 多種產品的製造，例如丙烯酸系纖維(acrylic fiber)、橡膠、人工鑽石與鏡片。特定絲狀 真菌(filamentous fungi)(例如黑穗菌(Ustilago)、膏藥病菌(Helicobasidium)與曲 菌(Aspergillus))將單糖轉換為此化合物。已發現順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)在衣康酸的生物合成中扮演關鍵角色。

發明內容
本發明意外地發現，當將經基因修飾表達順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)細胞培養在含甘油的培養基 中時，其高度產生衣康酸(itaconicacid)。因此，本發明以使用甘油作為基質在酵母細胞中產生衣康酸的方法為特徵。 此方法包括(i)提供經基因修飾的酵母菌宿主細胞，其包含第一表達框(expression cassette)，第一表達框包括第一酵母菌啟動子(promoter)，第一酵母菌啟動子可操作地被 連結至編碼順烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列，(ii)在允許甘油轉換為衣康酸的適合條件下， 培養酵母菌宿主細胞於含有甘油濃度為5至700g/L(例如，5至250g/L)的培養基中，以及 (iii)收集此培養基以分離衣康酸。在此方法中，甘油可為合成衣康酸的唯一基質。酵母菌 宿主細胞(例如，解脂耶氏酵母)可還包含第二表達框，與視需要包含第三表達框，其各包 括酵母菌啟動子，被操作地連結至編碼檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)或烏頭酸酶 (aconitase，Aco)的核苷酸序列。上述的任何酵母菌啟動子可為hp4d、pTEF、pRPS7或pG3P。 三個表達框的每一個可包括引導序列(Ieadersequence)於編碼順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸 合成酶或烏頭酸酶的核甘酸序列的上遊且讀碼框定向(in-frame with)至編碼順烏頭酸脫 羧酶、檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的核甘酸序列。在一個例子中，引導序列編碼MSAILSTTSKS FLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS的胺基酸序列。在另一例子中，其編碼MKLATAFTILTAVLA。本發明也包括核酸序列，其包括第一、第二，與視需要而定第三表達框，各表達框 包含酵母菌啟動子，其與編碼衣康酸合成相關的酶的核苷酸序列操作性連結。在一個例子 中，核酸包含兩個表達框，編碼順烏頭酸脫羧酶的第一表達框與編碼檸檬酸合成酶或烏頭 酸酶的第二表達框。在另一實施例中，核酸包含編碼編碼順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與 烏頭酸酶的三個表達框。為了讓本發明的上述和其它目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施 例，並配合所附圖示，作詳細說明如下。


圖1為圖式，其顯示在表達順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的經基因 修飾的解脂耶氏酵母細胞中甘油至衣康酸的轉變。圖2A為圖式，其顯示表達順烏頭酸脫羧酶(框a)、順烏頭酸脫羧酶與檸檬酸合成 酶(框b)、順烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶(框c)，及順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸 酶(框d)的DNA框。圖2B為表達載體pYLE的圖譜。Sal I與Cla I為克隆上述讀碼框的限制位點。圖3為曲線圖，其顯示在不同時間點，在含甘油與葡萄糖的培養的培養基中的衣 康酸濃度。在上述圖中101表示甘油；103表示經基因工程的酵母細胞；105表示發酵作用；107表示衣康酸
具體實施例方式此處所述為使用甘油(可為生質柴油副產品)101作為基質在經基因工程的酵母 細胞103中(經發酵作用105)產生衣康酸(itaconicacid) 107 (生物材料的構成要素)的 方法。參見圖1。設計經基因修飾的酵母菌(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵 母(Saccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)與 Pseudozyma antarctica)以高禾呈 度表達順烏頭酸脫羧酶，與視需要而定以高程度表達檸檬酸合成酶及/或烏頭酸酶。此處使用的術語「順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase) 」或 「CAD」意指自然發生的順烏頭酸脫羧酶(例如，敘述在Dwiarti et al. , J. Bioscience and Bioengineering,94(l) :29_33，2002 and W02009/014437 中的土曲菌(Aspergillus terreus)順烏頭酸脫羧酶)與其功能等同物(functional equivalent)。以下提供為示範 的土曲菌(Aspergillusterreus)順烏頭酸脫羧酶的核甘酸序列(序列標識號1)與氨基 酸序列(序列標識號2)土曲菌(Aspergillus terreus)順烏頭酸脫羧酶atgaccaagcagtctgctgattccaacgcgaagtctggtgtgacctctgagatctgtcacMTKQ SADSNAKSGVT SEICHtgggcgtctaatctcgccactgatgatatcccgagcgacgttctggagcgtgcaaaatacWASN LATDDIPSDVL ERAKYctgatcctggatggtatcgcgtgcgcgtgggtaggtgctcgtgtcccatggtctgaaaaaLILD GIACAffVGARV PffSEKtacgttcaagcgaccatgtctttcgaacctccgggtgcgtgtcgtgtcatcggttacggcYVQA TMSFEPPGACR VIGYGcagaaactgggtccggtagcggctgccatgacgaactctgcatttattcaggcgaccgaa
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ctgaattgtccggttaaatccccactggtttaaLNCPVKSP LV-此處使用的術語「檸檬酸合成酶」與「烏頭酸酶」分別將意指將草醯乙酸 (oxaloacetate)轉換為檸檬酸(citrate)，與將檸檬酸或異檸檬酸(isocitrate)轉換為烏 頭酸的酶，其包括兩者自然發生的酶與其功能等同物(functional equivalent)。以下提供 為大腸桿菌(Escherichia coli)檸檬酸合成酶(citrate synthase)的核甘酸序列(序列 標識號3)與胺基酸序列(序列標識號4)、烏頭酸酶A(aC0nitase Α)的核甘酸序列(序 列標識號5)與胺基酸序列(序列標識號6)以及烏頭酸酶B(aC0nitase B)的核甘酸序列 (序列標識號7)與胺基酸序列(序列標識號8)大腸桿菌(Escherichia coli)檸檬酸合成酶atggctgatacaaaagcaaaactcaccctcaacggggatacagctgttgaactggatgtgMADTKAKL TLNGDTAV ELDVctgaaaggcacgctgggtcaagatgttattgatatccgtactctcggttcaaaaggtgtgLKGTLGQD V I D I R T L G SKGVttcacctttgacccaggcttcacttcaaccgcatcctgcgaatctaaaattacttttattFTFDPGFT STASCESK ITFIgatggtgatgaaggtattttgctgcaccgcggtttcccgatcgatcagctggcgaccgatD G D E G I L L H R G F P I D Q LATDtctaactacctggaagtttgttacatcctgctgaatggtgaaaaaccgactcaggaacagSNYLEVC Y I L L N G E K PTQEQtatgacgaatttaaaactacggtgacccgtcataccatgatccacgagcagattacccgtYDEFKTT V T R H T M I H EQITRctgttccatgctttccgtcgcgactcgcatccaatggcagtcatgtgtggtattaccggcLFHAFRR DSHPMAVM CGITGgcgctggcggcgttctatcacgactcgctggatgttaacaatcctcgtcaccgtgaaattALAAFYH DSLDVNNP RHREIgccgcgttccgcctgctgtcgaaaatgccgaccatggccgcgatgtgttacaagtattccAAFRLLS KMPTMAAM CYKYSattggtcagccatttgtttacccgcgcaacgatctctcctacgccggtaacttcctgaatIGQPFVY PRNDLSYA GNFLNatgatgttctccacgccgtgcgaaccgtatgaagttaatccgattctggaacgtgctatgMMFSTPC E P Y E V N P I LERAMgaccgtattctgatcctgcacgctgaccatgaacagaacgcctctacctccaccgtgcgtDRILILH ADHEQNAS TSTVRaccgctggctcttcgggtgcgaacccgtttgcctgtatcgcagcaggtattgcttcactgTAGSSGA N P F A C I A A GIASLtggggacctgcgcacggcggtgctaacgaagcggcgctgaaaatgctggaagaaatcagcWGPAHGG ANEAALKM LEEIStccgttaaacacattccggaatttgttcgtcgtgcgaaagacaaaaatgattctttccgc
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其它檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的例子列在下方表1中表1、示範的檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的GenBank登錄號(GenBankAccession Numner)
權利要求
一種在酵母菌中產生衣康酸的方法，包括提供經基因修飾的酵母菌宿主細胞，該宿主細胞包含第一表達框，其包括第一酵母菌啟動子，該第一酵母菌啟動子可操作地被連結至編碼順烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列；在含有甘油濃度為5 700g/L的培養基中培養該酵母菌宿主細胞；以及收集該培養基以分離衣康酸。
2.根據權利要求1所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該經基因修飾的酵母菌 宿主細胞還包含第二表達框，其包括第二酵母菌啟動子，該第二酵母菌啟動子可操作地被 連結至編碼檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中在該第二表達框中的該 核苷酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該經基因修飾的酵母菌宿主細胞還包含第三表達框，該 第三表達框由第三啟動子所組成，該第三啟動子可操作地被連結至編碼烏頭酸酶的核苷酸 序列。
4.根據權利要求1所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該甘油為產生衣康酸的唯一基質。
5.根據權利要求4所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該培養基含有甘油濃度 為 5-250g/L。
6.根據權利要求1所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子選 自由hp4d、pTEF、pRPS7與pG3P所組成的群組。
7.根據權利要求2所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為 pTEF，且該第二啟動子為pRPS7。
8.根據權利要求3所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為 pTEF、該第二酵母菌啟動子為pRPS7，且該第三酵母菌啟動子為pG3P。
9.根據權利要求1所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一表達框在編碼順 烏頭酸脫羧酶的該核苷酸序列的上遊還包括引導序列。
10.根據權利要求9所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該引導序列編碼MSAIL STTSKSFLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS 或 MKLATAFTILTAVLA 的胺基酸序列。
11.根據權利要求1所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該酵母菌宿主細胞為 解脂耶氏酵母細胞。
12.根據權利要求11所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該酵母菌啟動子選自 由hp4d、pTEF、pRPS7與pG3P所組成的群組。
13.根據權利要求11所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該解脂耶氏酵母細胞 還包含第二表達框，其包括第二酵母菌啟動子，該第二酵母菌啟動子可操作地被連結至編 碼檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的核苷酸序列。
14.根據權利要求13所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子 為pTEF，且該第二啟動子為pRPS7。
15.根據權利要求11所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中在該第二表達框中的 該核苷酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該解脂耶氏酵母細胞還包含第三表達框，該第三表達 框由第三酵母菌啟動子與編碼烏頭酸酶的核苷酸序列所組成。
16.根據權利要求15所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為pTEF、該第二酵母菌啟動子為pRPS7，且該第三酵母菌啟動子為pG3P。
17.根據權利要求11所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該甘油為產生衣康酸 的唯一基質。
18.根據權利要求17所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該培養基含有甘油濃 度為 5-250g/L。
19.根據權利要求11所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一表達框在編碼 順烏頭酸脫羧酶的該核苷酸序列的上遊還包括引導序列。
20.根據權利要求19所述的在酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該引導序列編碼MSAI LSTTSKSFLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS 或 MKLATAFTILTAVLA 的胺基酸序列。
全文摘要
本發明涉及在酵母菌中產生衣康酸的方法，其使用甘油作為基質在酵母細胞中產生衣康酸(itaconic acid)。酵母細胞高度表達順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase)且是需要高度表達檸檬酸合成酶(citrate synthase)及/或烏頭酸酶(aconitase)。
文檔編號C12P7/44GK101993899SQ201010263379
公開日2011年3月30日 申請日期2010年8月25日 優先權日2009年8月25日
發明者王嘉宏, 蔡書憲, 鄧克立 申請人:財團法人工業技術研究院