蛋白質三聚體化模序及其應用的製作方法

2023-09-14 15:31:45

專利名稱：蛋白質三聚體化模序及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質三聚體化模序，本發明還涉及該蛋白質三聚體化模序在制
備或表達三聚體蛋白質中的應用，屬於三聚體蛋白質基因工程領域。
背景技術：
巻曲螺旋是一類由兩股或兩股以上右手a螺旋相互纏繞而形成的平行或反平行 的左手超螺旋結構的總稱。巻曲螺旋的特徵是，螺旋每圈需要3.5個胺基酸殘基，每兩圈 形成一個循環，因此形成多個七肽單元的重複序列或稱作七重複序列(abcdefg)n。最常見 的天然巻曲螺旋一般由2-5個七重複序列組成(Vinson C， Myakishev M， Acharya A， et al.Classification of Human B_ZIPProteins Based on Dimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002. 22(18) :6321-6335)。 七重複序列各個位置的胺基酸在形成和維持巻曲螺旋結構中發揮不同的作 用。其中a位和d位通常由疏水性胺基酸佔據，通常為亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)或 異亮氨酸(Ile)。 a、 d位胺基酸構成巻曲螺旋的疏水核心，在維持巻曲螺旋方面起關 鍵作用，同時這些疏水性胺基酸側鏈的幾何結構對於形成二聚體、三聚體、四聚體或 其他寡聚體起決定性作用(Harbury PB， Zhang T， Kim PS， et al. A switch between two_， three—， and four—stranded coiled coils inGCN4 leucine zipper mutants. Science.1993.262(5138) : 1401-1407. Harbury PB， Kim PS， Alber T. Crystal structure of an isoleucine-zipper trimer. Nature. 1994. 371(6492) :80-83. Suzuki K，Hiroaki H， Kohda D， et al. An isoleucine zipperpeptide forms a native—like triple stranded coiled coil in solution. Protein Eng. 1998. 11 (11) :1051—1055.)。第二個七重複序列 的a位通常由極性胺基酸佔據，常見的是天冬醯胺(Asn)、賴氨酸(Lys)或穀氨醯胺(Gin)。 除了 a、 d位以外，其他位置的胺基酸通常是極性胺基酸。其中，e、 g位通常為帶電氨基 酸，相鄰e、 g位形成螺旋間鹽橋(inter-helical salt bridge)，螺旋間鹽橋對於巻曲螺 旋的多聚化至關重要，常見胺基酸是穀氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)，常見的 e_g組合為Glu-Arg、 Glu-Lys、 Arg-Glu、 Lys-Glu (Vinson C， Myakishev M， Acharya A， et al. Classification of Human B_ZIP Proteins Based on Dimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002.22 (18) :6321-6335. Krylov D， Mikhailenko I， Vinson C. A thermodynamic scale for leucinezipper stability and dimerization specificity : e and g interhelical interactions. EMB0 J. 1994. 13 (12) :2849—2861.)。
在異亮氨酸拉鏈(isoleucine zipper, IZ) IZm的設計中，e-b-f位以Lys-Glu-Lys 的組合形成螺旋內鹽橋，這種鹽橋能夠提高巻曲螺旋的穩定性。隨後對異亮氨酸拉鏈 GCN4-pl的晶體結構研究發現，其C末端的g、 c位的Glu、 Arg形成的鹽橋提高了模序的熱 穩定性，而c-f-c位鹽橋的形成也能夠提高巻曲螺旋的穩定性，因此，引入螺旋內鹽橋是蛋 白質寡聚化模序設計中的重要策略。 利用天然巻曲螺旋的寡聚化特性，將其與目的蛋白融合表達，已經用於很多研究中。最常見的應用方向是以天然巻曲螺旋結構替換或部分替代目的蛋白原有的寡聚化區 域，從而改變蛋白質的聚合形式、親和性或穩定性。另外，特殊巻曲螺旋與目的蛋白融合後， 可以模擬目的蛋白的天然構象，使蛋白質處於活性狀態，有利於蛋白質結構和功能的研究。 尤其對於那些體外重組表達後很難維持天然構象的蛋白，巻曲螺旋融合表達是解決方案之 目前應用最多的模式化三股巻曲螺旋結構是GCN4亮氨酸拉鏈(leucinezipper， LZ)和異亮氨酸拉鏈(isoleucine zi卯er，IZ) 。GCN4是酵母細胞轉錄激活蛋白，其C末端序 列GCN4-pl(MetLysGlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHisLeuGluAsnGluValA laArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg) (GenBank NP_010907)為a螺旋結構，通常以二聚體巻 曲螺旋形式存在。由於七重複序列的a位均為亮氨酸，也稱為亮氨酸拉鏈(LZ) (Landschulz 冊，Johnson PF，McKnight SL The leucinezipper :a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science. 1988 Jun 24 ;240(4860) :1759—1764.)。 IZ是LZ的一個衍生物，將LZ的a位亮氨酸殘基替換為異亮氨酸殘基，並在d位引入疏水 性胺基酸。這些修飾使得GCN4 LZ二聚體轉變為具有三聚化傾向的GCN4 IZ(MetLysGlnl 1 eGluAsoLysIleGluGluIleLeuSerLys TleTvrHisIleGluAsnGluIleAlaArglleLvsLvsLeu IleGlyGluVal)(Harbury PB， Zhang T， Kim PS， Alber T. A switchbetween two_， three-， and four—stranded coiled coils in GCN4 leucine zippermutants. Science. 1993 Nov 26 ;262(5138) :1401-1407)。這種修飾不僅改變了巻曲螺旋的聚合狀態，而且增加了巻曲 螺旋結構的穩定性，為設計蛋白質三聚化模序提供了理論指導。 2001年，國際智慧財產權組織(World Intellectual PropertyOrganization，WIP0) 公開了一種利用GCN4 IZ穩定HIV-1三聚化包膜糖蛋白(envelope glycoprotein, Env) 的方法(WO/2001/019958)，其構建方法是刪除Env的跨膜區、胞內區和胞外區C末端七重 復序列(CHR)，保留胞外區N末端七重複序列(NHR)，並在其羧基末端引入GCN4 IZ序列， 作為Env蛋白的三聚化模序，融合後擴展了 Env NHR序列，從而穩定三聚化Env蛋白的結 構。2002年，WIPO公開了一組以IZN17為代表的三聚化多肽(WO/2002/024735)，其構建 方法是向HIV-l Env NHR的氨基末端引入GCN4-pIQI序列(ArgMetLysGlnGluAspLysGluGl uIleLeuSerLysGlnTyrHisGluAsnGluIleAlaArgAsp)或其衍生物，擴展NHR序列，穩定三聚 化多肽。其中GCN4-pIQI及其衍生物的序列源自GCN4 IZ，但進行了點突變或刪除等修飾。 2005年，WIP0公開了另一種穩定三聚化多肽的方法(WO/2005/118886)，其核心思想是在 (WO/2002/024735)所描述的多肽IZN17的基礎上，向其C末端引入分子間二硫鍵，通過共價 鍵作用維持三聚化多肽的穩定性。 上述三項專利申請均利用了GCN4 IZ的三聚化傾向從而穩定三聚體蛋白或多肽， 但該模序具有一定的限制性。首先，GCN4蛋白天然以二聚體形式存在，經過a、d位修飾後 雖然具有三聚化傾向，但其形成二聚體或其他寡聚體的趨勢仍然保留，因此降低了產物中 三聚體的比例及產品的純度。更重要的是，在穩定三聚體蛋白或多肽的研究中，三聚體的形 成及其穩定性的維持必須依賴於Env gp41自身三聚化序列N36和C34的聚合作用，在此過 程中，GCN4主要是通過延長NHR序列起到促進聚合和穩定蛋白的作用，並非三聚化過程始 動因素。因此，GCN4模序只能應用於含有自身三聚化模序的蛋白或多肽的研究，當試圖研 究不攜帶自身三聚化模序的目的蛋白時，該序列不是完全令人滿意的。
2007年，WIP0公開了一種製備三聚體蛋白的方法(WO/2007/030803)，其構建策略 是以一個或多個病毒的部分跨膜蛋白作為三聚化模序，並將其引入外源性目的蛋白的羧基 末端，利用模序的三聚化傾向引導外源蛋白形成三聚體。此專利中所涉及的三聚化模序均 來自病毒跨膜蛋白，具有較強的三聚化能力，但是同樣具有局限性。上述的三聚化模序均屬 於病毒抗原，某些病毒如流感病毒包膜血凝素((hemagglutinin, HA)抗原，在人群中具有 較高的抗體滴度，因此利用這種三聚化模序製備的三聚體融合蛋白不能直接作為免疫原使 用，只能用於蛋白質結構和功能的研究。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有三聚體蛋白製備技術中所存在的三聚化
模序聚合能力弱、三聚體產物比例低、應用範圍窄等缺點，提供了一種高聚合力、可廣泛應 用的蛋白質三聚化模序，採用該蛋白質三聚化模序所製備的蛋白質產物中三聚體比例大， 純度高。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的 —種蛋白質三聚體化模序(MTQ)，其胺基酸序列為SEQ ID NO :2所示；編碼SEQ ID N0:2所示胺基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID N0:1)、含有該核苷酸
序列的原核或真核表達載體以及含有原核或真核表達載體的宿主細胞也當然屬於本發明
的保護範疇之列。 本發明蛋白質三聚化模序MTQ根據天然三聚體巻曲螺旋的序列特徵而設計，序列 更加優化。本發明在設計蛋白質三聚化模序的過程中，充分考慮了各個胺基酸形成寡聚體 的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的胺基酸，提高了產品三聚化成分 純度。 本發明三聚化模序MTQ的胺基酸序列的核心是四個七重複序列GluIleAlaLysIl eLysGluGluGlnAlaLysIleLysGluLysIleAlaGluIleGluLysArglleAlaGluIleGluLys ;上述七 重複序列的七個胺基酸殘基依次用g-a-b-c-d-e-f表示，本發明中，將異亮氨酸(lie)引 入中a、 d位，形成巻曲螺旋的疏水核心，該穩定的核心對於三聚體的形成有利；將穀氨醯 胺(Gin)引入第二個七重複序列的a位，利於巻曲螺旋的聚合數目和聚合方向，形成平行 巻曲螺旋結構，對三聚體的形成有利；g-c-f位Glu-Lys-Glu組合的目的是為了形成螺旋 內鹽橋，提高三聚化模序的穩定性。第4個七重複序列的g位精氨酸(Arg)在三聚體形成 中具有重要意義，因此選擇Arg佔據該位置，提高模序的三聚化能力。N末端g位之前的 Ile-Lys-Glu，以及C末端f位之後Arg-Ile-Ala為"保護性胺基酸"，其作用是使內部氨基 酸形成七重複序列的巻曲螺旋結構。模序N末端Ile-Lys-Glu上遊的Gly-Gly-Ser-Gly-Gly 序列是模序與目的蛋白之間的連接序列(linker)，它的作用一方面保持三聚化模序與目的 蛋白的結構相對獨立，另一方面也可以作為N末端的"保護性胺基酸"，增加巻曲螺旋中螺 旋的成分，使螺旋結構更加穩定。 本發明所要解決的另一個技術問題是將上述蛋白質三聚體化模序應用於製備蛋 白質三聚體； 本發明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的
本發明蛋白質三聚體化模序在製備蛋白質三聚體中的應用，包括
(1)將本發明蛋白質三聚體化模序基因序列與目的蛋白基因相連接，得到融合基 因；二者的連接次序是該蛋白質三聚體化模序基因所編碼的蛋白質的氨基末端與目的基 因所編碼的蛋白的羧基末端相連接； (2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表達載體，構建得到融合蛋 白原核或真核表達載體； (3)將所構建的原核或真核表達載體在體內或體外表達融合蛋白，即得；
本發明蛋白質三聚化模序(MTQ)可廣泛用於天然構象為三聚體的蛋白質的結構 和功能研究。可用於體外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質，進而用於篩選和三聚體形 式目的蛋白相互作用的配體分子。 本發明蛋白質三聚化模序(MTQ)可用於構建和表達天然以三聚體形式存在的病 毒表面抗原，產物可作為DNA免疫原，用於體內表達，構建候選基因疫苗；表達產物可作為 蛋白免疫原，構建候選亞單位疫苗，有潛在的遠期社會和經濟效益。本發明所涉及的蛋白質 三聚化模序MTQ可用於天然以三聚體形式存在的病毒表面蛋白的表達，表達產物可用於診 斷試劑的開發並應用於病毒性疾病的診斷，將產生較大的經濟效益。


圖l是三聚化模序MTQ引入目的蛋白羧基末端的模式圖。將三聚化模序MTQ引入
目的蛋白的羧基末端而獲得的融合蛋白。 圖2是將融合蛋白基因引入表達載體的模式圖。 圖3是三聚化融合蛋白在293T細胞中瞬時表達及鑑定的結果圖。用融合蛋白 (HA1-MTQ)表達載體瞬時轉染293T細胞後收穫培養上清液。第一泳道是用變性SDS-PAGE 檢測到的變性後的目的蛋白；第二泳道是用非還原PAGE檢測到的目的蛋白天然三聚化形 式；第三泳道是陰性對照。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施例1 本實施例中的蛋白質三聚化模序MTQ胺基酸序列為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys_Glu_Glu_Ile_Ala_Lys_Ile_Lys_Glu_Glu_Gln_Ala_Lys_Ile_Lys_Glu_Lys_Ile_Ala_G lu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO :2)。 —、流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin, HA)HA1亞基與MTQ的融合重組體 HA 1-MTQ的構建 1.獲取HA1基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (購自美國ATCC)總RNA， 以獲得的總RNA為模板，進行RT反應產生cDNA ;再以cDNA為模板，利用引物HAIUP(TAC AGGATCCGCCATGAAGACTATCATTGCT)和HA1D0WN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR擴增HA1基因，反應條件為98°C 15s，60°C 10s，72°C 2min，共30個循環，DNA聚合酶為 PrimeStarHS DNA Polymerase (購自日本TaKaRa)。 2. HA1-MTQ融合重組體的構建將編碼MTQ蛋白的基因(GGGGGTTCTGGCGGAATCAAG
AATCGAAAAGAGAATTGCTGGTGGATGTTGC) (SEQ ID NO :1)合成於載體pcDNA3. 1 (+)(購自美國 Invitrogen)的多克隆位點EcoR I、Xho I之間獲得載體pcMTQ，再將純化後的HA1基因克隆 至含有MTQ基因的pcMTQ載體上，其中，HA1基因C末端與MTQ基因N末端相連，並位於同一 讀碼框內，獲得HA1-MTQ融合蛋白表達載體；將純化後的HAl基因克隆至載體pcDNA3. 1(+) (購自美國Invotrogen)上獲得不含MTQ基因的單純HA1表達載體。
二融合蛋白的表達 1.真核細胞轉染實驗將人胚腎293T細胞(購自美國ATCC)以5X 105個/孔的 密度鋪於6孔板內，置於37°C、5% C02的細胞培養箱中培養。至細胞生長面積為孔板底面 積的85% -90%時，將4 g HA1-MTQ融合蛋白表達載體轉染至293T細胞內，所用的轉染試 劑為Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen)，轉染操作參考試劑說明書。
2.表達產物的收穫轉染後72h，將293T細胞培養上清轉移至2. Oml離心管內， 3000 X g離心5min，棄去細胞碎片，將離心上清分裝於0. 5ml離心管中，於-4(TC保存。
三、利用特異性抗體通過western blotting方法檢測產物中的HA1重組蛋白
1.聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳向125iU收穫的細胞上清中加入25iU 6X loading buffer (0.35M Tris-HCl p朋.8， 30 %甘油，10 % SDS， 0. 012 %溴酚藍，6 % P-巰基乙醇)或6Xnon-reduced loading buffer (0. 35MTris_HCl pH6. 8， 30%甘油，10% SDS，O. 012%溴酚藍)，充分混勻，IO(TC煮沸2min，4。C 8000Xg，離心10min，蛋白樣品加載 至8% SDS-PAGE凝膠中，160V電泳lh。 2. Western blotting :電泳結束後，將蛋白質轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉於 37t:封閉2h。封閉後的PVDF膜與兔抗HA單克隆抗體(1 : 1000，購自美國CST)於4t:過 夜孵育，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG於37t:孵育lh。加入過氧化物酶 底物，顯示蛋白條帶。 試驗結果見圖3.從試驗結果可見，本發明所表達的融合蛋白產物三聚體比例大， 純度高。 序列表 〈110〉哈爾濱醫科大學 〈120〉蛋白質三聚體化模序及其應用 〈130>KLPI08098 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>129
〈212>DNA 〈213>artifical sequences
〈220〉
〈221>CDS (1). (129) 〈223〉 〈400〉 1 gggggttctg gcgg朋tc朋ggemgagatt gcca肪atte 3ggagg肌ca 50 3gct朋朋te 3肌g3g朋g3 tegctga朋t cg3g朋朋ga attgcag朋3 100 tcgaaaagag aattgctggt ggatgttgc 129 〈210>2 〈211>43 PRT 〈213>artifical sequences 〈400>2 Gly Gly Ser Gly Gly lie Lys Glu Glu lie Ala Lys lie Lys Glu Glu 15 10 15 Gin Ala Lys lie Lys Glu Lys lie Ala Glu lie Glu Lys Arg lie Ala
20 25 30 Glu lie Glu Lys Arg lie Ala Gly Gly Cys Cys
35 40
8
權利要求
一種蛋白質三聚體化模序，其特徵在於其胺基酸序列為SEQ IDNO2所示。
2. 編碼權利要求1所述蛋白質三聚體化模序的核苷酸序列。
3. 按照權利要求2所述的核苷酸序列，其特徵在於其鹼基序列為SEQID No :1所示。
4. 含有權利要求2或3所述核苷酸序列的表達載體。
5. 含有權利要求3所述表達載體的宿主細胞。
6. 權利要求1所述的蛋白質三聚體化模序在製備或表達蛋白質三聚體中的應用。
7. 權利要求2或3所述的核苷酸序列在製備或表達蛋白質三聚體中的應用。
8. 按照權利要求7所述的的應用，包括(1) 將權利要求2或3所述的核苷酸序列與目的基因相連，得到融合基因；二者的連接 次序為權利要求2或3所述核苷酸序列編碼的蛋白質的氨基末端與目的基因所編碼的蛋 白的羧基末端相連接；(2) 將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核表達載體或真核表達載體，構建得到融 合蛋白原核表達載體或真核表達載體；(3) 將所構建的原核或真核表達載體在體內或體外表達融合蛋白，即得。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質三聚體化模序及其應用。該三聚體化模序的胺基酸序列為SEQ ID No2所示。本發明蛋白質三聚化模序根據天然三聚體捲曲螺旋的序列特徵而設計，序列更加優化。在設計蛋白質三聚化模序的過程中，充分考慮了各個胺基酸形成寡聚體的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的胺基酸，提高了產品三聚化成分純度。本發明蛋白質三聚化模序可廣泛用於天然構象為三聚體的蛋白質的結構和功能研究，可用於體外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質，進而用於篩選和三聚體形式目的蛋白相互作用的配體分子。本發明蛋白質三聚化模序可用於構建和表達天然以三聚體形式存在的病毒表面抗原，構建候選基因疫苗或亞單位疫苗。
文檔編號C12N5/10GK101724027SQ20091022385
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月24日 優先權日2009年11月24日
發明者凌虹, 周海舟, 李妍, 王甲業, 鍾國才 申請人:哈爾濱醫科大學