Hiv蛋白酶抑制劑在阻斷細胞遷移和/或侵襲、組織浸潤和水腫形成中的用途的製作方法

2023-09-14 03:26:20 2

專利名稱：Hiv蛋白酶抑制劑在阻斷細胞遷移和/或侵襲、組織浸潤和水腫形成中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及人免疫缺陷性病毒(HIV)的蛋白酶抑制劑在抑制正常和/或腫瘤細胞的組織侵襲中的用途，用於治療相關疾病，例如與HIV感染有關或無關的卡波濟氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、腫瘤、血管增殖性、炎性或自身免疫性疾病。
現有技術HIV病毒蛋白酶的抑制劑是具有已知抗病毒活性的化合物，例如Deeks等人所述(Deeks等人，1997)。利用其抑制病毒成熟並阻斷其複製的功能，可用於治療罹患獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)患者的HIV感染(Deek等人，1997)。在本說明書中，HIV病毒蛋白酶的抑制劑下文也表示為HIV-PI。
卡波濟氏肉瘤(KS)是與人皰疹病毒8(HHV8)感染有關的腫瘤，在感染HIV病毒的受試者中(AIDS-KS)特別常見(Ensoli和Stürzl，1998)。在未感染HIV的受試者中也觀察到KS，特別是地中海地區和義大利(典型KS)、非洲(地方性KS)以及經受免疫抑制療法的器官移植個體(醫原性KS)(Ensoli和Stürzl，1998)。感染HHV8的受試者產生KS的必要條件似乎是免疫系統失調(Ensoli和Stürzl，1998)。
很多作者描述了在感染HIV並經包含至少一種HIV-PI的抗病毒藥物聯合治療的患者中(Deeks等人，1997)，KS和淋巴瘤的發生率降低(International Collaboration on HIV and Cancer，2000)或KS消退(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999)。KS是以血管生成、血管細胞以及炎性細胞浸潤為特徵的血管瘤；尤其在同時感染HIV和HHV-8的同性戀和雙性戀男性中常見並具有侵襲性的(Ensoli和Stürzl，1998)。損傷形成由具有血管生成性、增殖性、水腫形成性、趨化性和炎性作用的細胞因子和趨化因子介導。由KS細胞、活化的內皮細胞和浸潤組織的免疫細胞生成這些細胞因子(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。在血管生成性因子之中，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)在KS損傷中高水平表達，對於KS生長和血管生成是最重要的自分泌和旁分泌因子(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。實際上，針對bFGF的抗體或反義寡聚物阻斷裸鼠中接種原代KS細胞所誘發的血管生成和KS樣損傷形成，以及KS細胞的體外生長(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994b；Barillari等人，1999b)。反之亦然，裸鼠接種bFGF可促進KS樣血管增殖性損傷形成(Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)，能模擬細胞外基質蛋白質作用的HIV-1蛋白質Tat可提高其頻率和侵襲性。特別對於作用於KS而言，Tat要求存在bFGF或炎性細胞因子，其依次誘導內皮細胞和KS細胞產生bFGF，並作為Tat受體的整聯蛋白的表達(Ensoli等人，1990；Barillari等人，1992；Barillari等人，1993；Ensoli等人，1994a；Albini等人，1995；Fiorelli等人，1995；Fiorelli等人，1998；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a和1999b)。血管內皮細胞生長因子(VEGF)是存在於KS中的另一種生長、血管生成和血管通透性的誘導物，與bFGF協同作用於KS的血管生成和水腫(Samaniego等人，1998)。KS中存在的、並協同作用於其形成的其它因子有白細胞介素(IL)-1、(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、幹擾素(IFN)γ、粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板源性生長因子(PDGF)、制瘤素-M以及趨化因子(RANTES、MIP-1α、MIP-1β等)(Ensoli和Stürzl，1998)。特別是炎性細胞因子，例如IL-1、IL-6、和IFNγ，可誘導KS細胞和內皮細胞產生bFGF和VEGF，誘導內皮細胞獲得KS細胞的表型、變得具有體內血管生成性，並誘導小鼠的KS損傷(Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Fiorelli等人，1998；Barillari等人，1999a)。除了促進KS生長以外，bFGF，例如VEGF，能夠激活血管生成所需的全部過程。血管生成也是腫瘤生長和轉移以及非瘤性血管增殖性疾病的基礎，常常是慢性炎性疾病的重要組成部分(Carmeliet和Jain，2000)。此外，由活化的內皮細胞、KS細胞和浸潤組織的炎性細胞產生的趨化因子，例如RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、MCP-1等具有間接的血管生成作用，並作為炎性細胞的趨化物，因而誘導組織和損傷中的炎性和免疫細胞(不論受HHV-8感染與否)進一步募集和浸潤(Ensoli和Stürzl)，1998)。在此方面，血管生成、炎性細胞的組織浸潤以及水腫均需要由特定蛋白酶降解血管基底膜和/或細胞外基質，以便血管周隙的細胞定向遷移(內皮或炎性/免疫細胞侵襲和遷移)，或促進從血流中流出液體(Carmeliet和Jain，2000)。此外，血管生成需要在於內皮細胞增殖的第三個步驟。
特別是血管基底膜和間質組織的降解，由基質金屬蛋白酶(MMP)介導。MMP本身為腫瘤和轉移性生長、炎性細胞的組織浸潤以及水腫形成所必需(Stetler-Stevenson，1999)。特別是炎性細胞的組織浸潤，在癌症、炎症和自身免疫疾病中具有重要作用，因為這些細胞產生因子，包括血管生成因子和炎性細胞因子，旁分泌作用於鄰近細胞。在MMP當中，MMP-2對於血管生成必不可少，它由bFGF誘導，在KS的原發損傷及其它腫瘤中高表達(Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999b；Stetler-Stevenson，1999)，而MMP-9是介導組織中單核細胞和淋巴細胞浸潤的最重要的MMP。抑制內皮細胞的遷移、侵襲或增殖、或者MMP-2和MMP-9或其它MMP的活性，能夠阻斷血管生成，構成了當前用於抗血管生成和抗腫瘤治療的理論基礎(Stetler-Stevenson，1999；Koivunen等人，1999；Carmeliet和Jain，2000)。此外，在包括感染、多發性硬化、炎性疾病、免疫疾病和癌症在內的幾種病理條件下，顯示MMP的局部和整體濃度和/或活性顯著改變(Fujimoto等人，1993；Leppert D等人，1998；Leppert等人，2000；)，因此可作為這些疾病診斷、預後和治療的目標。
在感染HIV並經HIV-PI治療的個體中觀察到KS發生率下降及消退(Lebbé等人；Cattelan等人，1999；International Collaborationon HIV and Cancer，2000)，與該藥物能夠抑制HIV複製、從而抑制KS強推動因子HIV-1Tat蛋白質的產生和釋放有關(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999a；Barillari等人，1999b)。此外，通過恢復特異性細胞毒性T淋巴細胞的數目和功能以及天然殺傷活性，利用HIV-PI治療提高了針對據認為是KS病因的HHV-8病毒的保護性免疫反應(Ensoli和Stürzl)，1998)。實際上，HIV-PI治療的患者的HIV(Deeks等人，1997)和HHV-8含量均下降，並重現了針對HHV-8的免疫應答(Blum等人，1997；Rizzieri等人，1997；Lebbé等人，1998；Osman等人，1999；Sirianni等人，1999；Sirianni等人，2000；Wang等人，2000)。
在此方面，現有資料表明，在沒有HIV的情況下，HIV-PI也可調節樹突狀細胞功能和抗原呈遞(André等人，1998，Gruber等人，2001)、降低T細胞活化以及炎性細胞因子生成(Tovo，AIDS 2000，Ledru等人，2000)。另外，已經表明一種HIV-PI，即利託那韋(ritonavir)，對蛋白酶體活性具有極大作用，導致通過主要組織相容性複合體(MHC)I類的抗原表位加工和呈遞改變(André等人，PNAS，1998；專利申請WO99/63998)。這些資料表明，HIV-PI可能具有免疫調節特性(André等人，PNAS，1998；Tovo，AIDS2000；專利申請WO99/63998，專利申請WO0033654)。此外，由於已知蛋白酶體與血管生成有關(Oikawa等人，1998)，這些資料提示，HIV-PI還可能影響血管生成。另外，最近的資料表明，HIV-PI具有對包括細胞活化、存活和增殖在內的幾種細胞過程的調節特性(專利申請WO99/63998，專利申請WO0033654)。這些資料提示，蛋白酶抑制劑(包括HIV-PI)、蛋白酶體抑制劑、微生物和病毒蛋白酶抑制劑、以及半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶抑制劑可能用於調節細胞應答和代謝，通過作用於這些細胞應答而治療各種人類疾病。
相反，我們假定由於HIV-PI作用於細胞侵襲和血管通透性過程有關的酶或分子，即與細胞蛋白酶體無關的分子，例如(而不僅僅)MMP，而可能對這些過程具有直接和特異性的作用。因此，在HIV-PI治療的個體中觀察到KS發生率下降及消退是可能由於HIV-PI抑制內皮和KS細胞侵襲、炎性和/或免疫細胞的組織浸潤以及水腫形成。應當指出，現有研究無法預見HIV-PI的這些作用。實際上，所有研究一致將HIV-PI治療患者的KS發生率下降或消退歸因於抑制HIV感染從而降低蛋白質Tat的表達，歸因於免疫系統重建從而使HHV8在血液或損傷中消失，或歸因於HIV-PI的免疫調節作用(Blum等人，1997；Rizzieri等人，1997；Lebbé等人，1998；De Milito等人，1999；Cattelan等人，1999；Osman等人，1999；Sirianni等人，1999；Sirianni等人，2000；Wang等人，2000；專利申請WO99/63998，專利申請WO0033654)。相反，我們假想的HIV-PI作用以前從未描述或研究過。
發明概述本發明的目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用於通過抑制或調節分子和蛋白水解酶，例如但不限於MMP，阻斷正常、腫瘤炎性或免疫細胞的遷移和/或侵襲、組織浸潤、和/或水腫形成，以治療發病機理與上述過程有關的各種疾病，包括腫瘤、非瘤性血管增殖性疾病、炎性疾病或自身免疫疾病。
本發明另一目的在於通過使用HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)抑制或調節分子和蛋白水解酶，例如但不限於MMP，從而阻斷正常、腫瘤、炎性或免疫細胞遷移和/或侵襲、組織浸潤和/或水腫形成的方法。
本發明另一目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用於產生能夠通過抑制分子和蛋白水解酶，例如但不限於MMP，從而阻斷細胞遷移和/或侵襲以及組織浸潤，以引起抗血管生成作用的藥物，用於治療感染或未感染HIV病毒受試者中的腫瘤和非腫瘤性血管增殖性疾病。
本發明另一目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用於阻斷感染或未感染HIV病毒受試者中的腫瘤細胞侵襲。
本發明另一目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用於產生具有抗水腫形成活性並能夠阻斷炎性和免疫細胞的組織浸潤的藥物，以治療感染或未感染HIV病毒受試者中的炎性和自身免疫疾病。
本發明另一目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用於產生治療感染或未感染HIV病毒受試者中的卡波濟氏肉瘤的藥物。
本發明另一目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用於產生能夠通過抑制分子和蛋白水解酶，例如但不限於MMP，從而阻斷細胞遷移和/或侵襲以及組織浸潤，以引起抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫形成和/或抗炎作用的藥物，用於治療感染HIV病毒受試者中的卡波濟氏肉瘤、腫瘤和非腫瘤性血管增殖性、炎性和自身免疫疾病。
本發明另一目的在於化合物的上述用途，這些化合物為Merck，Sharp和Dohme出售的Crixivan(茚地那韋(indinavir))；Roche出售的Invirase或Fortovase(沙奎那韋(saquinavir))；AbbottLaboratories出售的Norvir(利託那韋)；Roche出售的Viracept(那非那韋(nelfinavir))；Glaxo Wellcome出售的Agenerase(安潑那韋(amprenavir))；Abbott Laboratories出售的Kaletra(洛匹那韋(lopinavir)和利託那韋)。
本發明另一目的在於HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)以及上述化合物的用途，其相互聯合和/或聯合抗炎症、抗血管生成或抗腫瘤藥物，用於上述適應症。
本發明另一目的在於上述HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化學類似物或衍生物的用途，其單獨、或互相聯合、和/或與抗炎症、抗血管生成或抗腫瘤藥物聯用，因抑制分子和蛋白水解酶，例如但不限於MMP，能夠阻斷正常、腫瘤、炎性或免疫細胞細胞侵襲以及組織浸潤，從而具有抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫形成和/或抗炎作用。
本發明的其它目的根據以下發明詳述顯而易見。
附圖簡述

圖1(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋對主要大血管(humbelical靜脈)內皮細胞基本的或bFGF誘導的增殖沒有作用。圖A茚地那韋對基本的或bFGF誘導的細胞增殖的作用；圖B沙奎那韋對基本的或bFGF誘導的細胞增殖的作用。
圖2(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋抑制大血管(臍靜脈)內皮細胞響應bFGF的遷移。圖A.茚地那韋對細胞遷移的作用；圖B沙奎那韋對細胞遷移的作用。
圖3(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋抑制大血管(臍靜脈)內皮細胞響應bFGF的侵襲。圖A茚地那韋對細胞侵襲的作用；圖B沙奎那韋對細胞侵襲的作用。
圖4.茚地那韋和沙奎那韋不影響微血管(皮膚的)內皮細胞響應bFGF的增殖。
圖5.茚地那韋和沙奎那韋抑制微血管(皮膚的)內皮細胞響應bFGF的侵襲。
圖6.茚地那韋和沙奎那韋不影響平滑肌細胞響應bFGF的增殖。
圖7.茚地那韋和沙奎那韋抑制平滑肌細胞響應bFGF的侵襲。
圖8(圖A、B和C).茚地那韋阻斷MMP-2的活化。圖A在茚地那韋存在與否的情況下，經bFGF處理與否的內皮細胞上清中的潛伏的MMP-2(72kD)、活化前MMP-2(64kD)或活化MMP-2(62kD)對應的明膠分解活性；圖B潛伏MMP-2的光密度定量；圖C活化的前和活化MMP-2形式的光密度定量。
圖9(圖A、B和C).沙奎那韋阻斷MMP-2的活化。圖A在沙奎那韋存在與否的情況下，經bFGF處理與否的內皮細胞上清中的潛伏的MMP-2(72kD)、活化前MMP-2(64kD)或活化MMP-2(62kD)對應的明膠分解活性；圖B潛伏MMP-2的光密度定量；圖C活化的前和活化MMP-2形式的光密度定量。
圖10.茚地那韋和沙奎那韋阻斷前MMP-2自身蛋白水解轉化為活性形式。
圖11(圖A和B).沙奎那韋阻斷內皮細胞生成酪蛋白特異性MMP。圖A在沙奎那韋存在與否的情況下，利用bFGF或TPA處理8小時的內皮細胞上清的酪蛋白酶譜(zymography)；圖B在沙奎那韋存在與否的情況下，利用bFGF或TPA處理24小時的內皮細胞上清的酪蛋白酶譜；圖12[(1)(圖a-d)和(2)(圖a-h)].茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠形成bFGF誘導的血管增殖性損傷。A)圖a經鹽溶液處理、只接種基質膠(matrigel)的典型小鼠的注射部位；圖b經鹽水處理、並接種含有bFGF的基質膠的典型小鼠的注射部位；圖c經茚地那韋處理、並接種含有bFGF的基質膠的典型小鼠的注射部位；圖d經沙奎那韋處理、並接種含有bFGF的基質膠的典型小鼠的注射部位。B)圖a和b經鹽水處理、只接種基質膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖a100×放大倍數；圖b100×放大倍數)；圖c和d經鹽水處理、並接種bFGF的基質膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖c100×放大倍數；圖d100×放大倍數)；圖e和f經茚地那韋處理、並接種bFGF的基質膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖e100×放大倍數；圖f100×放大倍數)；圖g和h經沙奎那韋處理、並接種bFGF的基質膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖g100×放大倍數；圖h100×放大倍數)。
圖13(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細胞的侵襲力。圖A茚地那韋對細胞侵襲的作用；圖B沙奎那韋對細胞侵襲的作用。
圖14.茚地那韋和沙奎那韋不影響內皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細胞的增殖。
圖15.茚地那韋和沙奎那韋抑制內皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細胞的侵襲力。
圖16.茚地那韋和沙奎那韋不影響肝癌(SK-Hep-1)細胞的增殖。
圖17.茚地那韋和沙奎那韋抑制肝癌(SK-Hep-1)細胞的侵襲力。
圖18.茚地那韋和沙奎那韋不影響肺癌(A549)細胞的增殖。
圖19.茚地那韋和沙奎那韋抑制肺癌(A549)細胞的侵襲力。
圖20.茚地那韋和沙奎那韋不影響乳癌(MDA-MB-468)細胞的增殖。
圖21.茚地那韋和沙奎那韋抑制乳癌(MDA-MB-468)細胞的侵襲力。
圖22.茚地那韋和沙奎那韋抑制髓單核細胞性白血病(U937)細胞的侵襲力。
圖23(圖a、b、c、d、e和f).茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種KS細胞誘導的KS樣損傷的發展。圖a和b經鹽水溶液處理的典型小鼠的KS細胞注射部位的顯微形狀(圖a100×放大倍數；圖b400×放大倍數)；圖c和d經茚地那韋處理的典型小鼠的KS細胞注射部位的顯微形狀(圖c250×放大倍數；圖d400×放大倍數)；圖e和f經沙奎那韋處理的典型小鼠的KS細胞注射部位的顯微形狀(圖e250×放大倍數；圖f400×放大倍數)。
圖24.茚地那韋和沙奎那韋促進裸鼠接種KS細胞誘導的KS樣損傷的消退。
圖25.茚地那韋和沙奎那韋促進裸鼠接種內皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細胞誘導的腫瘤血管生成性損傷的消退。
圖26.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肝癌(SK-Hep-1)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
圖27.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肺癌(A549)細胞誘導的KS樣損傷的發展。
圖28.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種乳癌(MDA-MB-468)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
圖29.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種髓單核細胞性白血病(U937)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
圖30.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種T細胞白血病(Jurkat)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
圖31.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠接種KS細胞促進的血管通透性和水腫。
圖32(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋阻斷KS細胞生成炎性細胞因子，例如IL-6。圖A茚地那韋對細胞因子生成的作用；圖B沙奎那韋對細胞因子生成的作用。
發明詳述在描述本發明主體之前，提供下列定義細胞侵襲(細胞的侵襲)-細胞通過蛋白水解酶降解細胞外基質或基底膜而在組織或基底膜中移動的過程。
組織浸潤-細胞由於細胞侵襲而從遠處遷移，定位於組織中。
水腫-由於浸潤或原有細胞可釋放通過蛋白酶(包括基質金屬蛋白酶)作用改變毛細血管內皮和基底膜結構通透性的因子的活性，而從血液或淋巴管滲出液體。
細胞外基質-由細胞產生、充滿細胞間隙的物質，以不同數量存在於各種組織中。
基底膜-由細胞產生、位於正常內皮或上皮之下、使其與下層組織分開的蛋白質結構。
基質金屬蛋白酶-可以裂解幾乎任何細胞外基質成分的內肽酶，分為膠原酶、明膠酶、基質溶素(stromelysin)和間質溶素(matrilysin)。
最近的報告描述了經包含至少一種HIV-PI(例如茚地那韋或沙奎那韋)的高活性抗逆轉錄病毒治療(HAART)的HIV1感染病人的KS發生率下降或消退(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999；International Collaboration on HIV and Cancer，2000)。人們已經將這些效果歸因於HIV-PI阻斷HIV病毒複製、阻斷HHV8病毒複製和/或重建針對HHV-8和HIV的免疫應答(Blum等人，1997；Rizzieri等人，1997；Lebbé等人，1998；De Milito等人，1999；Cattelan等人，1999；Osman等人，1999；Sirianni等人，1999；Sirianni等人，2000；Wang等人，2000)。另一方面，我們過去和最近的研究表明，KS細胞、內皮細胞和免疫系統細胞產生的細胞因子、生長和血管生成因子(特別是bFGF)介導KS損傷形成，內皮和KS細胞侵襲、這些細胞以及炎性細胞和免疫細胞的組織浸潤、水腫形成以及MMPs的活化或生成增多是KS損傷發展和生長的關鍵(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1995；Samaniego等人，1997；Ensoli和Stürzl，1998；Fiorelli等人，1998；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a；Barillari等人，1999b；Fiorelli等人，1999)。因此，與學術界的一般觀點相反，我們假設經HIV-PI治療的AIDS-KS患者的KS消退是由於HIV-PI作用於與細胞侵襲、組織浸潤以及水腫過程有關的、不同於細胞蛋白酶體的分子和酶，而對這些過程產生的直接活性。我們利用體外模型表明，使用與治療患者血漿中相同濃度的茚地那韋和沙奎那韋，可阻斷主要大血管或微血管內皮細胞和淋巴或實體腫瘤細胞的遷移和侵襲，而不影響這些細胞的生長。我們進一步表明，這些HIV-PI抑制MMP-2酶活化或降解酪蛋白的MMP的增加生成。金屬蛋白酶類(MMP)對細胞運動性(遷移和侵襲)或血管通透性必不可少，因而對血管生成、水腫以及腫瘤的生長和侵襲是必要的(Carmeliet和Jain，2000)。與這些數據一致，我們證明茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠接種bFGF、bFGF和VEGF聯合或原發的人KS細胞所誘導的KS樣血管增殖性損傷的發展，並阻斷bFGF或VEGF在雞尿囊絨膜(CAM)中誘導的血管生成。我們進一步證明，茚地那韋或沙奎那韋阻斷裸鼠接種人淋巴和實體腫瘤細胞誘導的腫瘤生長。最後，我們表明HIV-PI阻斷裸鼠中KS細胞促進的血管通透性和水腫。此外，它們抑制KS細胞生成細胞因子。這些細胞因子不僅促進KS損傷，而且也具有炎症活性(Ensoli等人，1989；Barillari等人，1992；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Sirianni等人，1998；Samaniego等人，1998；Fiorelli等人，1998；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a)，其中一些還促進多中心Castleman病(MCD)和淋巴瘤(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Ramsay等人，1994；Asou等人，1998)。
這些數據因此表明，HIV-PI對KS和淋巴瘤的作用是由於MMP直接阻斷內皮和腫瘤細胞的遷移和侵襲，對於血管生成和水腫具有抑制作用，因而在經HIV-PI處理的小鼠模型和/或患者中觀察到抑制損傷形成以及腫瘤發生率下降。然而HIV-PI的這些作用並非由於抑制正常或瘤性細胞的增殖。重要的是要強調，這些治療性作用是在缺少HIV和HHV8的情況下獲得的，因此排除了HIV-PI的這些作用可能由HIV-PI對HIV和/或HHV8的作用來介導。
因此，我們的研究表明，可以利用HIV-PI調節相應生物進程，或用於治療與細胞遷移和侵襲、組織浸潤以及MMP活性有關的病理狀況。特別而言，發現HIV蛋白酶抑制劑是阻斷細胞侵襲和組織浸潤的有效藥物，它們可以阻斷與這些過程有關的細胞金屬蛋白酶的活性，開闢了用於調節和治療與上述細胞應答和功能有關的所有生物進程和病理狀況的嶄新領域，包括感染HIV受試者以及未感染HIV受試者的血管生成、非瘤性血管增殖性病變、KS、腫瘤、炎症和自身免疫疾病。
因此，表現HIV病毒蛋白酶抑制劑(此處為簡便起見記為HIV-PI)活性的所有化合物、或與其類似、或其衍生的化合物均屬於本發明範圍之內。在這點上，此處作為這些化合物的例子而提及茚地那韋、沙奎那韋、利託那韋、那非那韋、安潑那韋、洛匹那韋。
在感染HIV和未感染HIV的受試者中均可能如下使用HIV-PI化合物-阻斷內皮細胞遷移，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷腫瘤細胞遷移，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷內皮細胞侵襲，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷腫瘤細胞侵襲，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷炎性細胞遷移，具有治療性抗炎症、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷免疫細胞遷移，具有治療性抗炎症和抗自身免疫作用；-阻斷炎性細胞的組織浸潤，具有治療性抗炎症、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷免疫細胞的組織浸潤，具有治療性抗炎症和抗自身免疫作用；-阻斷與細胞遷移和侵襲有關的MMP包括MMP-2、基質溶素、間質溶素及其它蛋白酶或分子；阻斷活化與細胞遷移和侵襲有關的MMP及其它蛋白酶或分子的酶；阻斷與細胞遷移和侵襲有關的血小板反應蛋白及其它分子；-阻斷與血管生成有關的MMP包括MMP-2、基質溶素、間質溶素及其它蛋白酶或分子(Carmeliet，Nature2000)；-阻斷活化與血管生成有關的MMP及其它蛋白酶的酶；-阻斷與血管生成有關的血小板反應蛋白及其它分子；-阻斷與炎性和免疫細胞遷移以及組織浸潤有關的MMPs包括MMP-2、基質溶素、間質溶素及其它蛋白酶或分子；-阻斷與腫瘤生長和轉移有關的MMP包括MMP-2及其它蛋白酶或分子；-阻斷bFGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS作用；-阻斷VEGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；-阻斷bFGF和VEGF的聯合活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；-阻斷Tat單獨或在bFGF存在下的活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫和抗炎症作用；-阻斷與血管生成有關的血管通透性和水腫；-阻斷與腫瘤有關的血管通透性和水腫；-阻斷與KS有關的血管通透性和水腫；-阻斷與炎症有關的血管通透性和水腫；-阻斷炎性細胞因子的生成，具有治療性抗炎症作用；-阻斷細胞因子的生成，具有治療性抗水腫形成作用；-阻斷細胞因子的生成，具有治療性抗血管生成作用；-阻斷細胞因子的生成，具有治療性抗KS作用；-阻斷細胞因子生成，具有治療性抗腫瘤作用，-用於治療KS，-治療血管生成，
-治療非腫瘤性血管增殖性疾病(眼睛、腎臟、血管系統、皮膚)，例如糖尿病性視網膜病、晶狀體後纖維組織形成、沙眼、血管性青光眼、銀屑病、免疫性和非免疫性炎症、動脈粥樣硬化、瘢痕瘤，-治療軟組織、軟骨、骨和血液的良性和惡性腫瘤，-治療一般的自身免疫疾病，特別是系統性紅斑狼瘡、硬皮病、類風溼性關節炎、銀屑病、甲狀腺炎、潰瘍性直腸結腸炎和克羅恩氏病(Crohn’s disense)、古德帕斯徹氏(Goodpasture’s)症候群、系統性血管炎、Sjgren氏綜合症、原發性膽汁性肝硬變，-治療炎性疾病，特別是與變態反應和病毒性感染、細菌或寄生物(parasitic agent)有關的慢性炎症，包括Castleman氏多中心病。
對於上述用途，通常指明了顯示抑制HIV病毒蛋白酶活性的所有化合物，特別指明的化合物有茚地那韋、沙奎那韋、利託那韋、那非那韋、安潑那韋、洛匹那韋及其類似或衍生物、單用或彼此聯用和/或與其它藥物聯用。
從而可能利用有助於將活性物質加工成藥用製劑的一種或多種藥學可接受的、包含賦形劑和輔料的載體，按常規方法配製用於本發明的藥物組合物。可按已知方法製備這些藥物組合物，例如利用常規的混合、溶解、粒化、糖衣化、粉化、乳化、膠囊化、包夾或凍幹加工。合適的劑型取決於所選給藥途徑。藥物組合物還可能包含適當的固相或膠體相載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的例子包括但不限於碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、澱粉、纖維素衍生物、明膠以及聚合物，例如聚乙二醇。
本說明書提及的已知的HIV-PI的化學類似物、和/或衍生物、和/或鹽，單用、或彼此聯用、和/或與其它藥物、或輔藥、或載體、或賦形劑聯用，均被認為處於本發明範圍之內。
對於上列的各種適應症，本發明HIV-PI可口服、靜脈內、肌內、皮下、皮內、腹膜內、鞘內、胸膜內、子宮內、陰道內、局部直腸內、透過黏膜、損傷內或透皮給予。劑量和給藥方式取決於所治療的疾病類型。特別而言，考慮低於、等於或高於治療HIV感染病人的常用劑量。例如，劑量為對於茚地那韋(大約)600mg/天、1200mg/天、2400mg/天或4800mg/天；對於沙奎那韋(大約)900mg/天、1800mg/天、3600mg/天、7200mg/天。
下文給出的實施例，也涉及包括的圖表，可用來驗證我們的假設。我們使用與所治療患者的KS消退有關的兩種HIV-PI，茚地那韋和沙奎那韋(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999)，其結構類似，但為優化其作用而設計成不同的化學取代基。在bFGF和/或VEGF體內和體外促進的血管生成模型中，研究兩種HIV-PI對KS樣損傷形成、KS細胞體內引起的血管通透性以及體外KS細胞的作用(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a和1994b；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a；Sgadari等人，2000)，對淋巴或實體腫瘤細胞系體內誘導的腫瘤生長以及體外淋巴或實體腫瘤細胞系的作用。
給出以下實施例和圖闡明本發明，而不應認為限制其範圍。
材料和方法/附圖詳述圖1.茚地那韋和沙奎那韋對主要大血管(humbelical靜脈)內皮細胞的基礎增殖或bFGF誘導的增殖沒有作用。圖A茚地那韋對主要大血管(humbelical靜脈)內皮細胞的基礎增殖或bFGF誘導的增殖的作用；圖B沙奎那韋對主要大血管(humbelicBl靜脈)內皮細胞的基礎增殖或bFGF誘導的增殖的作用。
圖形顯示增殖分析結果，表示為在存在或缺少0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或其重懸緩衝液(緩衝液)的情況下，與bFGF的PBS緩衝液(黑條)、或無bFGF(單獨PBS，白條)溫育5天後計數的細胞數目。將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC，Bio-Whittaker，Verviers，Belgium)一式三份接種於預先覆蓋明膠的12孔板中(1.5×104細胞/孔)。次日將細胞在無血清培養基中溫育4小時，培養於添加10％胎牛血清(FBS)以及含bFGF的PBS緩衝液(10ng/ml)或單獨PBS緩衝液的RPMI1640培養基中(Life Technologies，Eragny，France)。3日後更換培養基、bFGF、PBS緩衝液、茚地那韋、沙奎那韋或HIV-PI重懸緩衝液。培養5日後，如前所述利用臺盼藍染色，計數細胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)對於所有的體外研究，將純粉劑的茚地那韋或沙奎那韋(分別為Merck Sharpe Dohme和Roche)重懸於蒸餾水中。LAL檢驗藥物不含有內毒素(Associatedof Cape Code Inc.，Falmouth，MA)。
圖2和3.茚地那韋和沙奎那韋阻斷bFGF誘導的主要大血管(humbelical靜脈)內皮細胞的遷移和侵襲。
圖2顯示遷移分析的結果。圖3顯示侵襲分析的結果。對內皮細胞進行兩種分析。結果表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩衝液(緩衝液)存在下，響應含bFGF的PBS緩衝液(黑條)、或單獨的PBS緩衝液(白條)而遷移(圖2)或侵襲(圖3)的細胞數目/孔。圖A茚地那韋對bFGF誘導的主要大血管(humbelical靜脈)內皮細胞遷移(圖2)或侵襲(圖3)的作用；圖B沙奎那韋對bFGF誘導的主要大血管(humbelical靜脈)內皮細胞遷移(圖2)或侵襲(圖3)的作用。
兩種分析是在Boyden槽(Nucleoprobe，Cabin John，MD)中進行的，該槽利用由12μm微孔聚碳酸酯濾膜隔成兩部分，塗有膠原IV(Collaborative Biomedical Products)用於遷移，或共同塗有膠原IV和基質膠用於侵襲，如前所述(Barillari等人，1999b)。在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋、或其稀釋緩衝液存在下，將HUVEC培養5-6天。收集細胞，重懸於包含0.01％BSA的無血清培養基中，在茚地那韋、沙奎那韋或其稀釋緩衝液存在下，一式兩份置於Boyden槽的上層(2×105細胞/孔)。將bFGF(50ng/ml)放入下層包含0.01％BSA的培養基中，作為趨化物。培養5小時(遷移)或6小時(侵襲)後，機械去除存在於濾膜上表面的未遷移細胞，將濾膜下表面的遷移細胞甲醇固定，甲苯胺藍染色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。隨機選取濾膜5-10個顯微鏡視野(field)的細胞，如前所述計數(Barillari等人，1999b)。
圖4.茚地那韋和沙奎那韋不影響微血管(皮膚的)內皮細胞響應bFGF的增殖。
圖形顯示增殖分析的結果，表示為在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或其重懸緩衝液(緩衝液)存在下，與bFGF溫育5天後的皮膚微血管內皮細胞數目。人皮膚微血管內皮細胞(HDMVEC，Bio-Whittaker)一式三份接種於包被明膠的12孔板(2×104細胞/孔)，在補充有10％FBS的RPMI1640培養基中培養，其中一直存在bFGF(10ng/ml)，以防止在耗盡該因子24-48小時之後發生細胞凋亡。3日後更換培養基、bFGF、茚地那韋、沙奎那韋(10μM)或HIV-PI重懸緩衝液。培養5天後通過臺盼藍染料排除法計數細胞，如上所述。兩次重複實驗的數據可以表示為在茚地那韋、沙奎那韋或HIV-PI重懸緩衝液存在下，響應bFGF而生長的HDMVEC數目。
圖5.茚地那韋和沙奎那韋抑制微血管(皮膚的)內皮細胞響應bFGF的侵襲。
圖形顯示利用H-DMVEC進行的細胞侵襲分析的結果。
數據可以表示為在茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)或HIV-PI重懸緩衝液(緩衝液)存在下，響應含bFGF的PBS緩衝液(■)或單獨的PBS緩衝液(□)而侵襲的細胞的平均百分數和標準差(SD)。將無bFGF時的基礎侵襲定為100％。顯示了如上所述進行的HUVEC Boyden槽分析的三次重複實驗的數據。10mM茚地那韋以及1和10mM沙奎那韋阻斷H-MVDEC具有顯著的統計意義(P＜0.05)。
圖6和7.茚地那韋和沙奎那韋抑制平滑肌細胞響應bFGF的侵襲而非增殖。
圖6顯示利用平滑肌細胞進行的細胞生長分析的結果，圖7顯示利用平滑肌細胞進行的細胞侵襲分析的結果。基本上如圖1和3所述進行分析。數據可以表示為在茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)或HIV-PI重懸緩衝液(緩衝液)存在下，響應含bFGF的PBS緩衝液(■)或單獨的PBS緩衝液(□)而生長或侵襲的細胞的數目或百分比，如圖所示。將無HIV-PI時bFGF誘導的細胞生長、或無bFGF時的基礎細胞侵襲定為100％。顯示兩次重複實驗的數據(平均值)。
圖8和9.茚地那韋和沙奎那韋阻斷潛伏的MMP-2轉化為活性形式。圖8茚地那韋對MMP-2活化的作用。圖A利用含bFGF的PBS溶液(黑條)或單獨的PBS緩衝液(緩衝液，白條)刺激HUVEC，並在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)或其重懸緩衝液存在下培養24小時，對其濃縮上清進行的酶譜分析。箭頭表示由於潛伏形式(72kD)、活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)的MMP-2對應的明膠分解活性而形成的脫色區域。圖B72kD潛伏形式的明膠分解活性對應的脫色區域的光密度定量；圖C細胞釋放的活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)MMP-2的明膠分解活性對應的脫色區域的光密度定量。結果可以表示為脫色條帶的光密度。圖9沙奎那韋對MMP-2活化的作用。圖A利用含bFGF的PBS液(黑條)或單獨的PBS緩衝液(緩衝液，白條)刺激HUVEC，並在0.1、1或10μM沙奎那韋(SAQ)或其重懸緩衝液存在下培養24小時，對其濃縮上清進行的酶譜分析。箭頭表示由於潛伏形式(72kD)、活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)的MMP-2對應的明膠分解活性而形成的脫色區域。圖B72kD潛伏形式的明膠分解活性對應的脫色區域的光密度定量；圖C細胞釋放的活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)MMP-2的明膠分解活性對應的脫色區域的光密度定量。結果可以表示為脫色條帶的光密度。
在存在梯度濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩衝液以及有或沒有bFGF(100ng/ml)的情況下，將HUVEC在添加10％FBS的RPMI1640中培養24小時。然後利用無血清培養基洗滌細胞兩次，並在相同濃度HIV-PI的存在下，於無血清培養基中整夜溫育。然後收集細胞培養上清，利用Centricon-10(Amicon，Bedford，MA)濃縮。以BSA為標準，利用Bradford分析(Bio-Rad，Hercules，CA)測定蛋白質濃度。然後在酶譜緩衝液(5X)(0.4M Tris-HCI，pH6.8，5％SDS，20％甘油和0.03％溴酚藍)中稀釋等量(5μg)蛋白質，上樣包含1mg/ml明膠的9％SDS聚丙烯醯胺凝膠。電泳後將凝膠在2.5％(v/v)TritonX-100中溫育1小時，以除去SDS，其後利用酶緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，5mM CaCl2，0.02％Brij-35)37℃溫育整晚，如前所述(Kleiner等人，1993)。凝膠然後利用考馬斯藍G-250染色，在30％甲醇和10％乙酸中脫色。然後利用與裝有Multi-Analyst軟體(Bio-Rad)的Macintosh Performa電腦相連的光密度計GS-700，定量脫色區域的光密度。
圖10.茚地那韋和沙奎那韋阻斷前MMP-2自身蛋白水解轉化為活性形式。圖形顯示利用佛波酯(12-O-十四烷醯佛波醇-13-乙酯)(TPA)(50nM)或其重懸緩衝液(緩衝液)刺激HUVEC，並在10μM茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)、或其重懸緩衝液(緩衝液)存在下培養8小時，對其上清進行的酶譜分析。箭頭表示由於潛伏形式(原MMP2，72kD)、活化前形式(前MMP2，64kD)和活化形式(活化MMP2，62kD)的MMP-2對應的明膠分解活性而形成的脫色區域。在添加10％FBS的RPMI1640中培養HUVEC24小時。在分析之前，利用無血清培養基洗滌細胞兩次，在10mM茚地那韋、或沙奎那韋、或其重懸緩衝液存在下，於包含0.01％w/v牛血清白蛋白(BSA)的無血清培養基中溫育過夜。細胞然後在包含0.01％w/vBSA、10mM茚地那韋或沙奎那韋和TPA、或其重懸緩衝液的培養基中溫育8小時。然後如上所述，利用凝膠酶譜分析細胞上清等分樣品的MMP-2活性。HT1080是分泌大量MMP-2的腫瘤細胞系，用作對照。如圖所示，利用TPA處理HUVEC可誘導原MMP2轉化為前MMP2和活化的MMP2。然而，在茚地那韋或沙奎那韋存在下，活化的MMP2的明膠分解條帶的相對強度比前MMP2降低，表明茚地那韋和沙奎那韋均阻斷MMP-2的自身蛋白水解活化為活化形式。茚地那韋還在TPA存在下抑制細胞釋放MMP-2的總量。分析的上清量按細胞總數歸一化。
圖11.沙奎那韋阻斷內皮細胞生成降解酪蛋白的MMP。HUVEC如圖10所述生長並處理，只是在無血清過夜培養之後，將細胞在沙奎那韋(SAQ)或重懸緩衝液(緩衝液)存在下，於TPA(50nM)、含不同濃度bFGFPBS緩衝液(0.1或1μg/ml)、單獨的PBS緩衝液(緩衝液)中培養。細胞上清的等分樣品按細胞總數歸一化，然後如上所述，在包含酪蛋白(2mg/ml)而非明膠的凝膠中，利用凝膠酶譜分析MMP活性。圖A利用在TPA或bFGF存在下培養8小時後收集的細胞上清進行的酪蛋白酶譜；圖B利用在TPA或bFGF存在下培養24小時後收集的細胞上清進行的酪蛋白酶譜。酪蛋白由間質溶素(MMP-3、MMP-10、MMP-11)和基質溶素(MMP-7)特異性裂解(Whittaker和Ayscough，2001)。由於細胞上清中存在酪蛋白水解活性，導致脫色區域出現。如圖所示，無沙奎那韋時，bFGF以劑量依賴形式誘導釋放酪蛋白降解活性，TPA處理的細胞最甚。然而，酪蛋白水解條帶的強度下降，表明沙奎那韋(10μM)抑制bFGF或TPA釋放該活性。
圖12.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠形成bFGF誘導的KS樣血管生成性損傷。
(A)圖a雙側注射基質膠中的緩衝液(PBS-0.1％BSA)、並經鹽水溶液處理的小鼠，其注射部位的目視形態(macroscopic appearance)；圖b雙側注射基質膠中的bFGF(1μg)、並經鹽水溶液處理的小鼠，其注射部位的目視形態；圖c雙側注射基質膠中的bFGF(1μg)、並經茚地那韋處理(1.4mg/天)的小鼠，其注射部位的目視形態；圖d雙側注射基質膠中的bFGF(1μg)、並經沙奎那韋處理(1mg/天)的小鼠，其注射部位的目視形態。(B)圖a注射緩衝液、並經鹽水溶液處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(100×放大倍數)；圖b注射緩衝液、並經鹽水溶液處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(400×放大倍數)；圖c注射bFGF、並經鹽水溶液處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(100×放大倍數)；圖d注射bFGF、並經鹽水溶液處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(400×放大倍數)；圖e注射bFGF、並經茚地那韋處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(100×放大倍數)；圖f注射bFGF、並經茚地那韋處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(400×放大倍數)；圖g注射bFGF、並經沙奎那韋處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(100×放大倍數)；圖h注射bFGF、並經沙奎那韋處理的典型小鼠，其HE染色的接種部位的顯微形態(400×放大倍數)。按表1重點所述進行實驗。
圖13.茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細胞的侵襲力。圖A茚地那韋對兩種KS細胞株(KS3、KS8)的侵襲作用；圖B沙奎那韋對兩種KS細胞株(KS8、KS12)的侵襲作用。
圖形顯示對在茚地那韋、或沙奎那韋、或稀釋緩衝液(對照)存在下體外培養5-6天的三種原代KS細胞株(KS3、KS8、KS12)進行的侵襲分析結果。兩種藥物均以劑量依賴方式抑制KS細胞侵襲基質膠(Matrigel)膜的能力。特別而言，與對照的KS細胞觀察到的水平相比較，兩種HIV-PI均抑制侵襲(p＜0.05)。
如圖3所述進行分析。簡言之，將KS細胞在茚地那韋或沙奎那韋(1uM)或稀釋緩衝液(鹽水溶液)存在下培養5-6天。收穫細胞，然後一式兩份(5×105，在包含0.05％BSA的培養基中)接種於Boyden槽上層，始終處於HIV-PI或緩衝液存在下。將bFGF(20ng/ml)置於下層，作為趨化劑。6小時後，將侵襲基質膠膜的細胞染色，如圖3所述要點計數。
圖14和15.茚地那韋和沙奎那韋抑制內皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細胞的侵襲而非增殖。
圖14顯示利用H-UVEC與人肺腺癌細胞雜交的Ea-hy926細胞進行的細胞生長分析結果(Edgell等人，1983)，該細胞保持內皮細胞的大部分標誌，用作血管生成性腫瘤模型(Albini等人，1995，Albini等人，1996，Cai等人，1999)。結果表示為與HIV-PI重懸緩衝液(緩衝液)(□)相比，加入1μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)(■)5天後計數的細胞數目。基本上如圖1所述要點進行分析。在Ea-hy 926細胞中未加入生長因子，因其生成因子，以自分泌方式調解細胞生長(Edgell等人，1983，Albini等人，PNAS 1995，Albini等人，Nat Med1996)。圖15顯示侵襲分析的結果，表示為與HIV-PI重懸緩衝液(緩衝液)(□)相比，在1μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)(■)存在下，響應bFGF的侵襲細胞數目/視野(field)。基本上如圖3的圖例所述進行分析。顯示各一式兩份進行的兩次獨立實驗的平均值和變異區間。沙奎那韋處理對Ea-hy926細胞侵襲的阻斷具有顯著統計意義(P＜0.05)。
圖16.茚地那韋和沙奎那韋不影響肝癌細胞(SK-Hep-1)的增殖。所示為對肝癌細胞進行的典型的細胞生長分析的結果。將人肝癌細胞(SK-Hep-1；來自ATCC)一式三份接種於12孔板中(8×104細胞/孔)。次日將細胞在無血清培養基中飢餓6小時，然後在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或稀釋緩衝液(PBS)存在下，於包含10％胎牛血清(FBS)的培養基中溫育。每2天更換包含茚地那韋、沙奎那韋或緩衝液的培養基。培養4天後，如前所述通過臺盼藍染料染色法計數細胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)。在所有體外試驗中，將不含內毒素的純粉末狀HIV-PI(Merck、Sharp Dohme以及Roche友情贈送)重懸於蒸餾水中。重複分析至少三次。
圖17.茚地那韋和沙奎那韋抑制肝癌(SK-Hep-1)細胞響應bFGF的侵襲力。
所示為兩次不同實驗中侵襲的肝癌細胞SK-Hep-1的平均值，表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩衝液(緩衝液)存在下，響應bFGF(黑條)、或其稀釋緩衝液(白條)而侵襲的細胞的平均數目。在Boyden槽中進行侵襲分析。如前所述，聚碳酸酯濾膜(8μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然後覆蓋基質膠(Collaborative BiomedicalProducts)(Barillari等人，1999b)。在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(0.1μM、1μM、10μM)或稀釋緩衝液(對照)存在下，將SK-Hep-1細胞培養5天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩衝液的0.1％BSA中將2×105細胞一式兩份接種於Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置於下層，作為趨化劑。培養5小時後，機械去除存在於濾膜上表面的非侵襲細胞，將濾膜下表面的侵襲細胞在乙醇中固定，甲苯胺藍染色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學顯微術計數10個濾膜隨機視野(Barillari等人，1999b)。
圖18.茚地那韋和沙奎那韋不影響肺癌(A549)細胞的增殖。
所示為對肺癌細胞進行的典型的細胞生長分析的結果。將人肺癌細胞(A549；來自ATCC)一式三份接種於12孔板中(8×104細胞/孔)。次日將細胞在無血清培養基中飢餓6小時，然後在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或稀釋緩衝液(PBS)存在下，於包含10％胎牛血清(FBS)的培養基中溫育。每2天更換包含茚地那韋、沙奎那韋或緩衝液的培養基。培養4天後，如前所述通過臺盼藍染料染色法計數細胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)在所有體外試驗中，將不含內毒素的純粉末狀HIV-PI(Merck、Sharp Dohme和Roche友情贈送)重懸於蒸餾水中。重複分析至少三次。
圖19.茚地那韋和沙奎那韋抑制肺癌(A549)細胞響應bFGF的侵襲力。
所示為兩次不同實驗中侵襲的肺癌細胞A549的平均值，表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或稀釋緩衝液(緩衝液)存在下，響應bFGF(黑條)、或其稀釋緩衝液(白條)而侵襲的細胞的平均數。在Boyden槽中進行侵襲分析。如前所述，聚碳酸酯濾膜(12μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然後覆蓋基質膠(Collaborative Biomedical Products)(Barillari等人，1999b)。將A549細胞在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(0.1μM、1μM、10μM)或稀釋緩衝液存在下培養5天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩衝液的0.1％BSA中將2×105細胞一式兩份接種於Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置於下層，作為趨化劑。培養5小時後，機械去除存在於濾膜上表面的非侵襲細胞，將濾膜下表面的侵襲細胞在乙醇中固定，甲苯胺藍染色(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學顯微術計數10個濾膜隨機視野(Barillari等人，1999b)。
圖20.茚地那韋和沙奎那韋不影響乳癌細胞(MDA-MB-468)的增殖。
所示為對乳癌細胞進行的典型的細胞生長分析的結果。將人乳癌細胞(MDA-MB-468；ATCC)一式三份接種於12孔板中(8×104細胞/孔)。次日將細胞在無血清培養基中飢餓6小時，然後在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或稀釋緩衝液(緩衝液)存在下，於包含10％胎牛血清(FBS)的培養基中溫育。每2天更換包含茚地那韋、沙奎那韋或緩衝液的培養基。培養4天後，如前所述通過臺盼藍染料染色法計數細胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)在所有體外試驗中，將不含內毒素的純粉末狀HIV-PI(Merck、Sharp Dohme和Roche友情贈送)重懸於蒸餾水中。重複分析至少三次。
圖21.茚地那韋和沙奎那韋抑制乳癌(MDA-MB-468)細胞響應bFGF的侵襲力。
所示為對乳癌細胞MDA-MB-468進行的典型的侵襲分析的結果。數據表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩衝液(緩衝液)存在下，響應bFGF(黑條)、或其稀釋緩衝液(白條)而侵襲的細胞的平均數。在Boyden槽中進行侵襲分析。如前所述，聚碳酸酯濾膜(8μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然後覆蓋基質膠(Collaborative BiomedicalProducts)(Barillari等人，1999b)。在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(0.1μM、1μM、10μM)或稀釋緩衝液存在下，將乳癌細胞(MDA-MB-468)培養5天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩衝液的0.1％BSA中將2×105細胞一式兩份接種於Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置於下層，作為趨化劑。培養5小時後，機械去除存在於濾膜上表面的非侵襲細胞，將濾膜下表面的侵襲細胞在乙醇中固定，甲苯胺藍染色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學顯微術計數10個濾膜隨機視野(Barillari等人，1999b)。重複分析兩次。
圖22.茚地那韋和沙奎那韋抑制髓單核細胞性白血病(U937)細胞響應bFGF的侵襲力。
所示為對髓單核細胞性白血病細胞U937進行的典型的侵襲分析的結果。數據表示為在1或10μM沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩衝液(緩衝液)存在下，響應bFGF(黑條)、或其稀釋緩衝液(白條)而侵襲的細胞的平均數。利用1或10μM茚地那韋處理細胞，也獲得類似結果(數據略)。侵襲分析在Boyden槽中進行。如前所述，聚碳酸酯濾膜(5μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然後覆蓋基質膠(Collaborative Biomedical Products)(Barillari等人，1999b)。將髓單核細胞性白血病細胞U937在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(1μM、10μM)或稀釋緩衝液存在下培養4天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩衝液的0.1％BSA中將8×105細胞一式兩份接種於Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置於下層，作為趨化劑。培養4小時後，機械去除存在於濾膜上表面的非侵襲細胞，將濾膜下表面的侵襲細胞在乙醇中固定，甲苯胺藍染色(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學顯微術計數10個濾膜隨機視野(BariLLari等人，1999b)。重複分析兩次。
圖23.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種KS細胞誘導的KS樣損傷的發展。
裸鼠接種KS細胞(3×106)以誘導血管增殖性KS樣損傷形成、或接種重懸緩衝液(對照)，並在接種細胞前2天開始，按照圖12的要點所述劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。處死時檢查接種部位存在的肉眼可見的血管增殖性損傷，如圖12和表5的要點所述。圖a經鹽水溶液處理的典型小鼠，其HE染色的KS細胞接種部位中心區的顯微形態(100×放大倍數)；圖b經鹽水溶液處理的典型小鼠，其HE染色的KS細胞接種部位中心區的顯微形態(400×放大倍數)；圖c經茚地那韋處理的典型小鼠，其HE染色的KS細胞接種部位中心區的顯微形態(250×放大倍數)；圖d經茚地那韋處理的典型小鼠，其HE染色的KS細胞接種部位中心區的顯微形態(400×放大倍數)；圖e經沙奎那韋處理的典型小鼠，其HE染色的KS細胞接種部位中心區的顯微形態(250×放大倍數)；圖f經沙奎那韋處理的典型小鼠，其HE染色的KS細胞接種部位中心區的顯微形態(400×放大倍數)；實驗按表5的要點所述進行。
圖24.茚地那韋和沙奎那韋促進裸鼠接種KS細胞誘導的KS樣損傷的消退。
茚地那韋和沙奎那韋未經任何藥物預處理，也能促進KS消退。裸鼠(10隻動物/組)接種KS細胞(KS12細胞株，3×106)以誘導血管增殖性KS樣損傷形成、或接種其重懸緩衝液(對照)，從同一天開始，按照表5的圖例的所述劑量，通過胃內管飼法利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。連續處理5天，直至處死。每日利用卡尺測量，計算兩個較大損傷直徑的乘積，評價注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖25.茚地那韋和沙奎那韋促進裸鼠接種內皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細胞誘導的腫瘤血管生成性損傷的消退。
為證明茚地那韋和沙奎那韋不經藥物預處理可促進KS之外的其它腫瘤消退，使用H-UVEC和人肺腺癌細胞雜交的Ea-hy926細胞(Edgell等人，1983)(該細胞保持大部分內皮細胞標誌，被用作血管生成性腫瘤模型(Albini等人，1995，Albini等人，1996，Cai等人，1999)進行體內試驗。小鼠下背皮下接種Ea-hy926細胞(0.2ml 10％FBS的RPMI1640中的3×106細胞/動物)或重懸培養基，如上所述在接種之前與0.2ml耗盡生長因子的基質膠(BD Biosciences，Bedford，MA)混合。從同一天開始，按照圖24的圖例所述劑量，通過胃內管飼法以茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。連續處理5天，直至處死。每天利用卡尺測量，評價注射部位的損傷尺寸。然後將兩個較大的損傷直徑乘積，計算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖26.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肝癌(SK-Hep-1)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷肝癌細胞體內誘導的腫瘤生長。利用肝癌細胞(SK-Hep-1細胞系，得自ATCC，5×106細胞/部位)接種裸鼠(10隻動物/組)，誘導腫瘤，如圖23要點所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動物。在細胞注射24小時之前，為增加腫瘤攝取，亞致死照射(400G)小鼠。連續利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測量，評價注射部位的損傷尺寸。然後將兩個較大的損傷直徑乘積，計算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖27.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肺癌(A549)細胞誘導的KS樣損傷的發展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷肺癌細胞體內誘導的腫瘤生長。利用肺癌細胞(A549細胞系，得自ATCC，5×106細胞/部位)接種X級裸鼠(10隻動物/組)，誘導腫瘤，如圖23要點所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動物。連續利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測量，評價注射部位的損傷尺寸。然後將兩個較大的損傷直徑乘積，計算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖28.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種乳癌(MDA-MB-468)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷乳腺癌細胞體內誘導的腫瘤生長。利用乳癌細胞(MDA-MB-468細胞系，得自ATCC，5×106細胞/部位)接種X級裸鼠(10隻動物/組)，誘導腫瘤，如圖23要點所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動物。連續利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測量，評價注射部位的損傷尺寸。然後將兩個較大的損傷直徑乘積，計算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖29.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種髓單核細胞性白血病(U937)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷髓單核細胞性白血病細胞體內誘導的腫瘤生長。利用髓單核細胞性白血病細胞(U937細胞系，得自ATCC，處於0.2ml培養基中的5×106細胞/部位)接種X級裸鼠(10隻動物/組)，誘導腫瘤，如圖23圖例所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動物。連續利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測量，評價注射部位的損傷尺寸。然後將兩個較大的損傷直徑乘積，計算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖30.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種T細胞白血病(Jurkat)細胞誘導的腫瘤損傷的發展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷T淋巴細胞性白血病細胞體內誘導的腫瘤生長。利用白血病細胞(Jurkat細胞系，得自ATCC，20×106細胞/部位)接種X級裸鼠(10隻動物/組)，誘導腫瘤，如圖23圖例所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動物。連續利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測量，評價注射部位的損傷尺寸。然後將兩個較大的損傷直徑乘積，計算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖31.茚地那韋和沙奎那韋阻斷KS細胞誘導裸鼠中的血管通透性和水腫。
按如前所述相同的劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液(鹽水)處理裸鼠2天。在第3天接種新安替根(pyrilamine)(80μg處於100ul鹽水溶液中，4mg/kg，Sigma)，以避免因接種影響組胺釋放，然後立即靜脈內接種100μl伊文思藍(Evans blue)(5mg/ml的鹽水溶液)，並皮下接種體外培養的KS細胞(3×106/小鼠)，其處於存在茚地那韋、沙奎那韋(1μM)或稀釋緩衝液的0.2ml基質膠中。每隻動物對照地(controlaterally)接種相同體積的稀釋緩衝液和基質膠，作為對照。18小時後處死動物，利用量規在兩個最大垂直直徑水平上測定KS細胞接種部位傾注染色(staining decanted)的數量。還在取得接種部位皮膚後評估傾注染色的數量，利用甲醯胺56℃抽提24小時，然後分光光度計定量(Nakamura等人，1992)。減去對照部位測得的光密度後，計算傾注染色的數量。如圖所示，利用茚地那韋或沙奎那韋處理，其分光光度計定量的傾注染色數量分別減少39.8％(p＜0.05)和44.5％(p＜0.01)，量規測量則分別減少43.5％和47.5％。
圖32.茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細胞體外生成炎性細胞因子。圖A在茚地那韋存在(IND)或不存在(緩衝液)下培養的KS細胞上清中的IL-6數量；圖B在沙奎那韋存在(SAQ)或不存在(緩衝液)下培養的KS細胞上清中的IL-6數量。
將細胞接種於6孔板中，如(Ensoli等人，1990)所述，在濃度為0.1、1和10μM茚地那韋或沙奎那韋或稀釋緩衝液持續存在下培養5天。第5天，將培養基更換為存在所示濃度茚地那韋或沙奎那韋的包含牛血白蛋白(0.05％重量/體積)的無血清培養基。培養24後，ELISA(RD Systems，Minneapolis，MN，USA)檢測培養上清，測定培養基中IL-6的數量。IL-6的數量表示為pg/ml上清。利用商品化ELISA試劑盒，對bFGF、VEGF、L-1α和IL-1β進行同樣檢測。茚地那韋和沙奎那韋均降低bFGF、VEGF、IL-1α、IL-1β和IL-6的生成。
實施例1為檢驗為KS發展所需的哪些過程受茚地那韋或沙奎那韋抑制，將來自臍靜脈的原代人大血管內皮細胞在有或沒有梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋的存在下培養，分析其響應bFGF的增殖、遷移和侵襲。HIV-PI的使用濃度與所治療患者的血漿濃度相同(Deeks等人，1997)。
如圖1所示，在任何使用濃度下，HIV-PI對基礎的或bFGF誘導的大血管內皮細胞增殖均無影響。同樣，未觀察到茚地那韋或沙奎那韋對大血管內皮細胞存活的影響。相反，任何使用濃度下，兩種HIV-PI均抑制bFGF所促進的大血管內皮細胞的遷移(圖2)，並完全阻斷其侵襲(圖3)。利用原代人皮膚微血管內皮細胞(圖4和5)或原代人平滑肌細胞(圖6和7)獲得相同結果。
實施例2內皮細胞的遷移和侵襲由活化的MMP的蛋白質水解活性介導，其降解基底血管膜，以致內皮細胞遷移和侵襲，這正為新血管形成所需(Stetler-Stevenson，1999)。內皮細胞以酶原、原酶釋放MMP。為檢驗茚地那韋或沙奎那韋是否對內皮細胞的MMP活性具有任何影響，利用明膠和酪蛋白酶譜進行實驗，測定明膠分解活性(Kleiner等人，1993)。特別而言，MMP-2對於血管生成、腫瘤生長和侵襲具有關鍵作用。MMP-2酶原(潛伏的MMP-2，72kD)通過涉及其它蛋白酶的複雜機制在細胞表面蛋白水解活化為64/62kD形式(Stetler-Stevenson，1999)。茚地那韋或沙奎那韋(分別為圖8和9)對潛伏的MMP-2影響極小或沒有影響，而兩種HIV-PI均以劑量依賴方式阻斷MMP-2的活化(圖8和9)。將細胞與所治療患者血漿濃度相同的HIV-PI培養24小時後，觀察到這些作用(Deeks等人，1997)。與HIV-PI培養5天後，也觀察到類似作用。為分析與HIV-PI抑制MMP-2活化相關的步驟，利用佛波酯活化內皮細胞，已知佛波酯非常有效地促進MMP-2轉化為其活化形式。如圖10所示，這些實驗表明，兩種HIV-PI均通過抑制前MMP2自身蛋白水解轉化為活化形式(62kD)而起作用(Stetler Stevenson，1999)。然而，尚須確定茚地那韋或沙奎那韋抑制潛伏的MMP-2轉化為活化形式的確切機制。實際上，並未發現HIV蛋白酶與MMP-2或其它MMP的活性部位序列之間的同源性。然而，已知能夠活化或抑制MMP和/或血管生成的血小板反應蛋白，據發現與HIV蛋白酶催化部位(Carr等人，1998)存在胺基酸序列同源性(Bein和Simons，2000；Taraboletti等人，2000)。提示HIV-PI可能通過與血小板反應蛋白相互作用而影響MMP活化或細胞侵襲。
為研究茚地那韋和沙奎那韋對其它MMP的作用，在有或沒有HIV-PI存在下利用bFGF或TPA處理內皮細胞，進行酪蛋白酶譜分析。這些實驗表明，沙奎那韋能夠抑制bFGF或TPA誘導的酪蛋白特異性MMP的合成(圖11)。
由於MMP是細胞遷移和侵襲的關鍵，這些結果表明，茚地那韋和沙奎那韋通過抑制MMP而抑制細胞遷移和侵襲。儘管茚地那韋或沙奎那韋可能針對有關細胞侵襲的其它蛋白酶或分子，但MMP-2和酪蛋白特異性MMP代表了該作用的主要典型實例。
實施例3已經證明MMP-2由bFGF及其它血管生成因子誘導(Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999b；Stetler-Stevenson，1999)，在KS損傷中表達bFGF和MMP-2(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998)。此外，已知抑制bFGF或MMP活性，特別是MMP-2，通常阻斷血管生成、KS損傷形成以及腫瘤生長(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Stetler-Stevenson，1999；Koivunen等人，1999；Carmeliet和Jain，2000)。另一方面，細胞侵襲為正常組織和腫瘤的血管生成所必需。這些數據表明，茚地那韋和沙奎那韋對細胞侵襲和MMP的抑制應該能夠阻斷血管生成。因此，利用裸鼠和尿囊絨膜(CAM)分析，研究茚地那韋和沙奎那韋對bFGF和/或VEGF誘導的血管生成的作用。
通過胃內管飼法，每日一次利用茚地那韋(1.4mg/天)、沙奎那韋(1mg/天)或鹽水溶液(陰性對照)處理裸鼠，進行2天(Kleiner等人，1993)。然後給小鼠接種處於基質膠中的bFGF(1μg)或其稀釋緩衝液(Kleiner等人，1993；Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。每日利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理，再進行5天。然後處死小鼠，目視及顯微鏡檢查接種面積是否存在KS樣血管增殖性損傷(Kleiner等人，1993；Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。與先前結果一致(Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)，接種1μg bFGF促進71％未處理小鼠發展血管增殖性損傷(表1和圖12(1))。相反，利用茚地那韋或沙奎那韋處理使形成損傷小鼠的百分比分別下降至28％-25％(p＜0.05)(表1和圖12(1))圖12(1)顯示了這些結果的一個實例。利用茚地那韋或沙奎那韋處理完全阻斷損傷形成或極大減小了損傷尺寸。顯微鏡檢查茚地那韋或沙奎那韋處理小鼠的接種部位，顯示其血管生成和細胞浸潤相比接種bFGF、未經HIV-PI處理的小鼠顯著減少(圖12(2))。就總的消退而言，其組織的組織學形態與只注射緩衝液的小鼠(陰性對照)類似或相同(圖12(2))。利用抗FVIII或抗CD31抗體染色、並經計算機輔助分析定量，證實了這一點(表1)。實際上，HIV-PI處理小鼠的內皮細胞標誌陽性的損傷面積比未處理對照減少了多達70％(P＜0.001)(表1)。由於VEGF與bFGF協同誘導血管生成和KS樣損傷形成，還給小鼠(6隻動物/組)聯合接種亞最適量的bFGF(0.1μg)和VEGF(1μg)，如前所述觀察其協同效應(Samaniego等人，1998)，並如上所示經HIV-PI處理。聯合加入兩種因子誘導83％未處理小鼠的損傷發展，而茚地那韋或沙奎那韋使處理小鼠的損傷形成分別降低到33％和17％(P＜0.05，沙奎那韋)(表2)。因此，兩種HIV-PI均抑制裸鼠中聯用bFGF和VEGF的協同效應所誘導的血管生成和KS樣損傷發展。這些結果表明，HIV-PI具有直接的抗血管生成作用。
使用建立的體內CAM分析，測定血管生成(Ribatti等人，1996)，以證實HIV-PI具有直接的抗血管生成作用。如表3所示，茚地那韋或沙奎那韋分別阻斷bFGF誘導的血管生成達到未處理的bFGF對照的42％和19％，達到未處理的VEGF對照的36％和11％(P＜0.05)。值得注意的是，兩種HIV-PI阻斷bFGF誘導的血管生成可與紫杉酚相當，紫杉酚是兼有抗腫瘤和抗血管生成活性的細胞毒類藥物，用於治療KS和實體腫瘤(Sgadari等人，2000)(表3)。這些數據證實，HIV-PI抑制微血管和大血管內皮細胞遷移和侵襲、平滑肌細胞侵襲以及MMP活性，導致阻斷體內血管生成。
實施例4KS細胞是內皮細胞起源的具有活化表型的轉分化細胞，表達bFGF和VEGF以及MMP(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994a；Ensoli和Sturzl綜述，1998)。因此這些數據表明，HIV-PI可能對KS細胞具有對內皮細胞和平滑肌細胞的類似作用，能夠抑制KS細胞侵襲。因而在濃度為0.01μM-1μM茚地那韋或沙奎那韋存在下培養KS細胞5-7天，進行粘附、增殖、遷移和侵襲實驗。如表4所示，茚地那韋或沙奎那韋不抑制KS細胞粘附纖連蛋白底物的能力。同樣，利用茚地那韋或沙奎那韋處理KS細胞7天，對細胞增殖沒有影響，細胞增殖是通過臺盼藍染料排除法計數活細胞進行測定(表4)。
為確定HIV-PI是否影響KS細胞響應血管生成因子而遷移和侵襲基底膜的能力，將利用茚地那韋或沙奎那韋(0.01μM-1μM)處理5天的KS細胞置於始終存在HIV-PI的Boyden槽上層，而將bFGF置於下層，作為趨化劑。如表4所示，茚地那韋和沙奎那韋對KS細胞的遷移均無任何影響。相反，兩種藥物均以劑量依賴方式抑制KS細胞侵襲基質膠底物的能力。特別是兩種HIV-PI均抑制KS細胞侵襲30-40％(p＜0.05)(表4和圖13)。
這些數據表明，HIV-PI響應趨化性刺激而作用於細胞侵襲的機理，包括例如抑制MMP，很可能對許多細胞類型有效，包括腫瘤細胞。
實施例5為驗證HIV-PI是否能夠特異性抑制腫瘤細胞侵襲，對來自各種腫瘤的腫瘤細胞系進行細胞增殖和侵襲實驗。特別研究下列細胞系來自H-UVEC和人肺癌細胞的雜交細胞Ea-hy926(Edgell等人，PNAS1983)、肝癌細胞(SK-Hep-1)、肺癌細胞(A549)、乳腺癌細胞(MDA-MB-468)以及髓單核細胞性白血病細胞(U937)。茚地那韋或沙奎那韋對這些細胞系的增殖沒有明顯作用(圖14，16，18，20)。相比之下，與所治療患者血清濃度相同的兩種HIV-PI均顯著抑制腫瘤細胞侵襲(圖15、17、19、21、22)。因此這些數據表明，HIV-PI抑制正常和腫瘤細胞侵襲的能力遵從所有細胞共有的機制，例如阻斷與細胞遷移和侵襲有關的分子和酶，特別是MMP。
實施例6這些結果表明，儘管對腫瘤細胞增殖沒有作用，HIV-PI可能通過選擇性阻斷腫瘤發展、腫瘤浸潤和轉移所需的腫瘤細胞侵襲和腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長(Carmeliet等人，2000)。為此進行體內試驗，以確定HIV-PI是否有效抑制異種移植腫瘤模型、包括體外試驗所用腫瘤細胞系的生長。
首先，在廣泛用於抗KS治療有效性臨床前研究的體內模型裸鼠中，研究茚地那韋或沙奎那韋對接種原代人KS細胞而促進的KS樣損傷形成的作用(Ensoli等人，1994b；Koivunen等人，1999；Sgadari等人，2000)。這些是響應KS細胞釋放的細胞因子(例如bFGF和VEGF、IL-1、IL-6等)而形成的暫時性、鼠源的血管增殖性損傷(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1995；Samaniego等人，1997；Sgadari等人，2000)。實際上，KS至少在初始階段是一種反應性血管增殖性疾病，而非真正的腫瘤(Ensoli和Sturzl，1998)。利用上述實驗使用的茚地那韋或沙奎那韋的相同方法和劑量處理動物。如表5所示，接種KS細胞誘導100％的動物形成KS樣損傷。茚地那韋或沙奎那韋處理可使形成損傷小鼠的百分比分別減少到43％和25％。肉眼可見未處理小鼠的損傷為鮮紅色、多血管，經HIV-PI處理的動物則較小、蒼白並處於消退期。類似地，未處理小鼠中損傷的新血管生成增多、梭形細胞浸潤、水腫以及紅細胞外滲(圖23)。相比之下，HIV-PI處理小鼠的細胞注射部位大片壞死，包含高達總損傷面積的85％，新血管生成和梭形細胞浸潤均顯著減少，主要局限於壞死/消退區域的外圍(圖23)。
還在接種KS細胞時利用HIV-PI處理小鼠，進行實驗，以確定HIV-PI在沒有任何藥物預處理時是否也促進KS消退。如圖24所示，KS損傷通常隨時間緩慢消退，經HIV-PI處理的小鼠的損傷消退更快，在處死時，其外表損傷面積與陰性對照類似或相同(P＜0.001)。
HIV的Tat蛋白質可提高感染HIV-1受試者的KS發生率和侵襲性(Ensoli等人，1994a)。這是由於Tat誘導內皮細胞和KS的粘附、遷移、侵襲和增殖。Tat實際上協同增強bFGF對血管生成和KS的作用(Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999a和1999b)。但是Tat對KS發揮作用需要bFGF或炎症性細胞因子，因為它們可提高Tat受體在細胞和組織上的表達(Barillari等人，1992；Barillari等人，1993；Albini等人，1995；Fiorelli等人，1995；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a；Barillari等人，1999b)。
因此，給裸鼠接種bFGF和Tat，並利用茚地那韋、沙奎那韋或其重懸緩衝液處理，以檢驗HIV-PI是否抑制Tat和bFGF對血管生成和KS的聯合作用。如表6所示，茚地那韋和沙奎那韋均降低形成KS損傷的裸鼠的百分比(分別為50％和20％)。
這些結果表明，儘管HIV-PI對KS細胞增殖沒有作用，但由於其作用於細胞侵襲、MMP活性和血管生成，而能夠抑制反應性、增生性腫瘤模型如KS(Ensoli和Sturzl，1998)的形成並誘導其消退。
實施例7給裸鼠接種Ea-hy926細胞系，以確定HIV-PI是否可以抑制惡性血管生成性腫瘤的生長。該細胞系來自於H-UVEC和人肺腺癌細胞的雜交細胞(Edgell等人，PNAS1983)，保留大部分內皮細胞標誌，可用作血管生成性腫瘤模型(Albini等人，Nat Med1996；Albini等人，PNAS1995；Cai等人，Lab Invest1999)。在接種腫瘤細胞前2天，開始給予裸鼠HIV-PI。如表7所示，83％未處理的小鼠出現腫瘤，但茚地那韋或沙奎那韋處理的小鼠分別只有33％和25％(P＜0.05)。類似地，兩種HIV-PI處理的小鼠的外表腫瘤面積減少到陰性對照的大小(P＜0.05)(表7)。經組織學以及抗FVIII-RA或抗CD31抗體染色測定，所處理動物的殘餘腫瘤的生長和血管生成均較對照大大下降(P＜0.001)(表7)。不經藥物預處理也觀察到腫瘤生長抑制(圖25)。實際上，這些動物在處死時的外部腫瘤大小比未處理對照減少了50％以上(圖25)。因此，儘管HIV-PI不影響Ea-hy926細胞增殖，但通過直接阻斷腫瘤細胞侵襲和血管生成而抑制血管增殖性腫瘤模型的體內生長。
實施例8為測定HIV-PI是否可以抑制惡性實體腫瘤和淋巴腫瘤的生長，給裸鼠接種肝癌細胞(SK-Hep-1)、肺癌細胞(A549)、乳腺癌細胞(MDA-MB-468)髓單核細胞性白血病細胞(U937)以及T淋巴性白血病細胞(Jurkat)。雖然缺少HIV-PI對這些細胞系增殖的作用，但茚地那韋或沙奎那韋均顯著抑制所有這些異種移植腫瘤的生長(圖26-30)。因此，這些數據表明，由於HIV-PI抑制MMP活性而阻斷腫瘤和內皮細胞侵襲，從而導致這些藥物對腫瘤生長的作用。
實施例9既然MMP與血管生成、KS、腫瘤和炎症性疾病的重要臨床特徵血管通透性和水腫形成有關(Carmeliet等人，2000)，在接種KS細胞的裸鼠中進行血管通透性的實驗。這些細胞生成具有水腫形成作用的細胞因子，包括VEGF、bFGF(聯合VEGF)、IL-1、IL-6等，因而誘發水腫。按照實施例6所述劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理裸鼠2天，靜脈內接種伊文思藍(Evanis blue)，然後在茚地那韋或沙奎那韋(1μM)或稀釋緩衝液存在下注射體外培養的KS細胞。12小時後處死動物，利用卡尺測量KS細胞接種部位的染色面積，並利用甲醯胺提取滲出的染料，通過分光光度術測定(Nakamura，Science1992)。如圖31所示，利用茚地那韋或沙奎那韋處理使滲出染料數量分別減少39.8％(p＜0.05)和44.5％(p＜0.01)，染色面積則分別減少43.5％和47.5％(圖31)。
實施例10KS細胞通過自分泌和旁分泌作用分泌具有炎性、水腫形成、血管生成和增殖活性的細胞因子(Ensoli和Stürzl，1998)。這些因子介導KS細胞在裸鼠中誘導KS樣損傷形成(血管生成、細胞增殖和侵襲、炎性浸潤、水腫)、血管通透性和水腫所需的全部過程。在有或沒有梯度濃度茚地那韋或沙奎那韋存在下培養KS細胞，以測定茚地那韋和沙奎那韋對細胞因子生成的作用。將KS細胞在無血清以及兩種HIV-PI的持續存在下培養24小時後，利用免疫酶試驗定量其上清中的bFGF、VEGF、IL-1和IL-6(ELISA)。茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細胞生成IL-1α、IL-1β和IL-6。圖32顯示抑制IL-6便是該作用的實例，IL-6是由KS細胞和內皮細胞、血液和組織中的淋巴細胞和單核細胞生成的典型的炎症性細胞因子，還具有血管生成作用(Mateo等人，1994；Cohen等人，1996)。此外，IL-6在多中心性Cstleman’s疾病以及淋巴瘤生長中具有重要作用(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Asou等人，1998；Ramsay等人，1994)，淋巴瘤是患者經HIV-PI治療而發病率下降的另一類腫瘤(International Collaboration onHIV and Cancer 2000)。
討論這些結果表明，HIV-PI對細胞遷移和/或侵襲具有特異性抑制作用，對細胞增殖則不然。這些作用似乎應歸於許多不同起源的原發和腫瘤細胞類型所通用的機制，以及針對與細胞蛋白酶體無關的影響細胞遷移和侵襲的關鍵分子。例如，我們的研究表明，HIV-PI的作用與抑制MMP活化或生成有關，並可能針對與MMP代謝有關的其它分子，例如血小板反應蛋白。由於這些活性，HIV-PI能夠阻斷需要細胞遷移、侵襲、和/或MMP活性的若干細胞過程，包括血管生成、血管通透性、水腫形成以及反應性、增生性腫瘤(例如KS)、或惡性實體瘤或淋巴瘤的生長。由於炎症細胞和免疫細胞的遷移也需要細胞侵襲和MMP活性，我們的數據表明，HIV-PI可以抑制炎症反應或免疫應答期間的組織細胞浸潤。此外，HIV-PI抑制介導KS形成和其它腫瘤生長以及與其有關的炎性浸潤的細胞因子及其它因子的生成。HIV-PI可減少細胞因子例如IL-6、IL-1、可能與炎症有關的其它細胞因子以及也存在於人或小鼠KS損傷中的細胞因子的生成，因而還具有抗炎症作用。所述炎症性細胞因子能夠誘導生成血管生成因子(bFGF、VEGF)，也具有體內血管生成作用(Barillari等人，1992；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Fiorelli等人，1998；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a)。特別而言，IL-6在多中心性Cstleman’s疾病以及淋巴瘤生長中具有重要作用(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Ramsay等人，1994；Asou等人，1998)。
HIV-PI與屬於天冬氨醯蛋白酶家族的HIV蛋白酶的活性部位結合。最近證明，這些藥物可以抑制真菌天冬氨醯蛋白酶(Cassone等人，1999)。然而，已知與細胞遷移和侵襲有關的蛋白酶均非天冬氨醯蛋白酶，在HIV蛋白酶和涉及這些過程的蛋白酶(血小板反應蛋白除外)的活性部位之間未發現序列同源性。因此，我們所證明的對細胞遷移、侵襲和MMP的作用完全不可預見，不能預期。
實際上，儘管某些研究提示HIV-PI對細胞代謝、蛋白酶體和免疫起作用(Deeks等人，1997；André等人，1998；Weichold等人，1999；Ledru等人，2000；Tovo，2000，專利申請WO99/63998，專利申請WO0033654)，我們證明HIV-PI發揮直接的抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫和抗炎症活性，而與已知的天冬氨醯蛋白酶、細胞蛋白酶體、或HIV-PI對HIV或HHV-8複製的作用無關。實際上，用於此研究的細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成、KS和腫瘤的體外和體內模型沒有傳染物。
利用茚地那韋和沙奎那韋得到相同結果，它們與另一HIV-PI共有類似的結構，但每種藥物具有特定的化學取代基。因此，這些數據表明，我們利用茚地那韋和沙奎那韋發現的HIV-PI活性是所有HIV-PI的共有特性，這與在處理的個體中觀察到的不同HIV-PI共同作用一致(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999；InternationalCollaboration on HIV and Cancer，2000)。
在與治療患者血漿相同的藥物濃度下觀察到HIV-PI的上述作用，這些個體很耐受該藥物濃度。同樣，體外或小鼠中未觀察到茚地那韋或沙奎那韋的毒性作用。雖然先前數據表明HIV-PI抑制細胞蛋白酶體，而蛋白酶體的抑制可誘導增殖中的內皮細胞程序性死亡(Andre等人，1988，Hannes等人，2000)，但在我們的研究中，茚地那韋和沙奎那韋對內皮細胞、平滑肌細胞或腫瘤細胞的細胞存活或生長沒有任何影響。相反，它們選擇性抑制細胞遷移和侵襲，提示HIV-PI並不損害預先存在的血管或組織。由於細胞運動性和血管生成不僅對於KS形成、而且對於腫瘤生長和轉移至關重要(Carmeliet和Jain，2000；Stetler-Stevenson，1999)，至此為止描述的結果表明，HIV-PI是有希望的抗血管生成和抗腫瘤藥物。此外，相同結果表明，HIV-PI阻斷炎症性細胞因子和血管通透因子誘導的血管通透性和炎症、以及在多中心Castleman病以及淋巴瘤生長中具有關鍵作用的細胞因子的生成(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Ramsay等人，1994；Asou等人，1998)。因此可以開發HIV-PI及其類似或衍生的藥物，以阻斷血管生成、實體腫瘤和血液腫瘤的生長、侵襲和轉移、水腫和炎症作用，從而成功用於治療KS、腫瘤、血管增殖性疾病以及HIV陰性受試者及HIV感染受試者的炎症性和自身免疫性疾病。
表1.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠形成bFGF誘導的KS樣損傷。
處理注射具有肉眼可見組織染色(面積％±SD)的血管損傷的小鼠數目/接種FVIII-RA CD31小鼠的數目(％)鹽水緩衝液 0/22(0) 0.20±0.20.06±0.1鹽水bFGF 20/28(71) 4.32±2.03.45±1.7茚地那韋bFGF 8/28(28)1.32±1.21.00±0.6沙奎那韋bFGF 7/28(25)1.13±0.60.83±0.3給裸鼠接種bFGF(1μg)以誘導形成KS樣血管增殖性損傷、或接種其重懸緩衝液(對照)，並用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。處死時檢查接種部位是否存在肉眼可見的血管增殖性損傷，並在蘇木精和伊紅(HE)染色之後進行顯微鏡分析，或冷凍用於內皮細胞標誌FVIII-RA和CD31的組織化學分析。此處列出了相對於接種小鼠數目(No.)的形成損傷的小鼠數目(No.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。處理動物中KS樣損傷數目降低在統計上有顯著意義(對比率進行標準檢驗，p＜0.05)。通過測定FVIII-RA或CD31染色的組織面積，定量血管生成。所示為FVIII-RA或CD31染色的損傷面積的百分比[平均±標準差(SD)]，如下所述定量。在HIV-PI處理的動物的殘留損傷中，FVIII或CD31表達下降，在統計上有顯著意義(P＜0.001)。
為進行這些體內實驗，將用於HIV感染病人的相同劑型(formulas)的茚地那韋(Merck Sharpe Dhome Ltd.，Haarlem，NL)或沙奎那韋(Roche，Hertfordshire，GB)溶於鹽水溶液，通過胃內管飼法給予裸鼠(Balb/c nu/nu雌性，Charles River，Calco，Italy，5-6周齡)。為檢測其毒性，分別按35、70、或17.5mg/Kg/天或18、36或9mg/Kg/天的劑量，每日一次給予0.4ml體積的茚地那韋和沙奎那韋，總共8天。這些劑量分別相當於感染HIV患者每日使用的HIV-PI的完整劑量、加倍或減半劑量(Deeks等人，1997)。其中任何劑量均未觀察到器官或全身毒性。從接種bFGF前2天開始，利用70mg/Kg/天的茚地那韋(相當於1.4mg/天)或36mg/Kg/天的沙奎那韋(相當於1mg/天)處理小鼠，每日一次，總共7天。對照動物利用相同體積的鹽水溶液進行處理。第三天，如前所述，在接種之前將稀釋於0.2ml磷酸鹽緩衝液(PBS)-0.1％牛血白蛋白(BSA)的1μg重組bFGF(Roche，Mannheim，Germany)或其重懸緩衝液與0.2ml基質膠(CollaborativeBiomedical Products，Bedford，MA)混合，在小鼠下背四分之一處皮下輸注(Ensoli等人，1994a)。4天後處死小鼠，檢查接種部位是否存在肉眼可見的KS樣血管增殖性損傷，組織切片經HE染色後進行組織學檢查。對於免疫組織化學分析，冷凍的組織切片經冷丙酮固定，用兔抗人FVIII-RA多克隆抗體(Ab)(Dako，Glostrup，Denmark；1∶2000稀釋度)或抗小鼠CD31的大鼠單克隆Ab(BD Biosciences；1∶1000稀釋度)染色。利用彩色CCD相機(Zeiss)拍攝數字圖像(200×放大倍數)，並獲得相應於完整組織切片的4-9個顯微鏡視野(每個視野大約0.15mm2)進行分析。染色由KS300(Zeiss)圖像分析軟體定量，表示為陽性面積佔組織總面積的百分比。
表2.茚地那韋或沙奎那韋抑制bFGF和VEGF聯合誘導的血管增殖性KS樣損傷的形成。
血管生成因子 處理形成損傷的小鼠數目/小鼠數目bFGF0.1μg 鹽水2/4(50％)VEGF1μg 鹽水0/6(0％)bFGF0.1μg+VEGF1μg鹽水5/6(83％)茚地那韋 2/6(33％)沙奎那韋 1/6(17％)給裸鼠接種處於基質膠中的緩衝液、bFGF、VEGF(RD systems，Minneapolis，MN)、或bFGF和VEGF聯用，並用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理，細節如表1要點所述。處死時檢查注射部位是否存在肉眼可見的血管增殖性損傷，組織經HE染色，進行顯微鏡分析。此處列出了相對於接種小鼠數目(No.)的形成損傷的小鼠數目(No.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。經過茚地那韋或沙奎那韋處理，形成血管生成性KS樣損傷的小鼠數目減少(對比率進行標準檢定，P＜0.05)。
表3.在尿囊絨膜分析(CAM)中，茚地那韋和沙奎那韋對bFGF或VEGF誘導的血管生成的作用。
血管生成因子處理(卵數) 平均血管(數目/mm2±SD)緩衝液 鹽水(23)4.39±1.12bFGF鹽水(11)13.50±3.03茚地那韋(11)8.22±2.54沙奎那韋(13)6.08±1.84VEGF鹽水(8) 13.51±2.42茚地那韋(9) 7.70±2.52沙奎那韋(7) 5.39±0.67bFGF紫杉酚(4) 7.71±1.63利用滅菌的1mm3明膠海綿(Gelfoam；Upjohn Co，Kalamazoo，MI)吸附處於5μl PBS中的bFGF或VEGF(分別為1μg或100ng)以及緩衝液、HIV-PI(10μM)或紫杉酚(250nM)(Bristol-Myers Squibb Co.，Princeton，NJ)，按所述進行CAM分析(Ribatti等人，Int.J.Dev.Biol.，1996)。每日在Olympus SZX9立體顯微鏡下檢查CAM，直至第12天。使用冷的數字CCD Hamamatsu ORCA相機(Hamamatsu PhotonicsItalia，Arese，Italy)，在距海綿邊緣2mm處攝像(1024×1024像素)。利用ImageProPlus4.0圖像軟體(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)，每枚卵3個隨機選區(1mm3)，定量血管數目。
結果可以表示為每個實驗條件下標明的CAM數目的血管平均數/mm2±SD。所用茚地那韋、沙奎那韋或紫杉酚的劑量與所治療患者血漿中的藥物濃度類似(Sonnichsen，D.S. Relling，M.V.，Clin.Pharmacokinet.1994，Deeks，S.G等人，JAMA1997)。單獨給予茚地那韋、沙奎那韋或紫杉酚沒有毒性，不影響基礎的CAM血管形成(數據略)。茚地那韋或沙奎那韋抑制血管形成在統計上有顯著意義(ANOVA和Student-Newman-Keuls檢驗；P＜0.05)。
表4.茚地那韋和沙奎那韋對體外KS細胞的作用。
茚地那韋(μM)*沙奎那韋(μM)*KS細胞0.010.1 1 0.01 0.1 1粘附 ND ND 1.05ND ND 1增殖 1 1.081.111 1.151.25遷移 ND ND 1.03ND ND 1.21侵襲 0.980.74** 0.71** 1 0.79** 0.62***與對照相比，表達增加的倍數(1倍)**p＜0.05ND，未測定KS細胞在濃度為0.01μM-1μM的茚地那韋或沙奎那韋存在下培養5-7天，進行粘附、增殖、遷移和侵襲分析。茚地那韋或沙奎那韋不抑制KS細胞粘附纖連蛋白底物的能力。同樣，利用茚地那韋或沙奎那韋處理KS細胞7天，對通過臺盼藍染料排除法測定的細胞增殖沒有影響。
茚地那韋和沙奎那韋對KS細胞的遷移均無任何影響。相反，兩種藥物均以劑量依賴方式抑制KS細胞侵襲基質膠膜的能力(p＜0.05)。
基本上如圖2和3要點所述進行遷移和侵襲分析。將在茚地那韋或沙奎那韋(0.01μM-1μM)或稀釋緩衝液存在下培養5天的KS細胞置於Boyden槽上層，其中始終存在HIV-PI，而將bFGF置於下層，作為趨化劑。
表5.茚地那韋或沙奎那韋對裸鼠接種KS細胞誘導的血管增殖性KS樣損傷的作用。
處理 注射具有肉眼可見的損傷的小鼠數目/接種小鼠的數目(％)鹽水 培養基 0/8(0)鹽水 KS細胞 14/14(100)茚地那韋 KS細胞 7/16(43)沙奎那韋 KS細胞 4/16(25)給裸鼠接種KS細胞(3×106)以誘導KS樣血管增殖性損傷形成、或接種重懸緩衝液(對照)，並在接種細胞前2天開始，按照表1要點所述劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理，直至5天後處死。處死時檢查接種部位存在的肉眼可見的血管增殖性KS樣損傷，如表1要點所述。此處列出了相對於接種小鼠數目(No.)的形成損傷的小鼠數目(No.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。HIV-PI處理動物中的血管生成性KS樣損傷減少在統計上有顯著意義(對比率進行標準檢驗，p＜0.001)。接種部位的組織學形態如圖23所示。
表6.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠聯合接種bFGF和HIV-1Tat所促進的血管增殖性KS樣損傷的形成注射 處理肉眼可見的血管損傷的數目/注射小鼠的數目(％)緩衝液鹽水溶液0/18(0％)BFGF+Tat 鹽水溶液7/10(70％)BFGF+Tat 茚地那韋5/10(50％)BFGF+Tat 沙奎那韋2/10(20％)給裸鼠接種bFGF(1μg)和Tat(10μg)以誘導形成KS樣血管增殖性損傷、或接種其重懸緩衝液(對照)，並用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。處死時檢查接種部位存在的肉眼可見的血管增殖性損傷。此處列出了相對於接種小鼠數目(N.)的形成損傷的小鼠數目(N.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。
按照表1所述方法和劑量，從接種bFGF和Tat前2天開始，利用茚地那韋和沙奎那韋處理小鼠，總共7天。對照動物利用相同體積的鹽水溶液進行處理。第三天，在輸注之前將稀釋於0.2ml PBS-0.1％BSA的1μg重組bFGF和10μg HIV-1Tat、或其重懸緩衝液與0.2ml基質膠混合，在小鼠下背四分之一處皮下接種，如前所述(Ensoli等人，Nature1994)。4天後處死小鼠，檢查接種區域是否存在肉眼可見的KS樣血管增殖性損傷，組織切片經蘇木精/伊紅染色後進行顯微鏡下檢查。
表7.茚地那韋或沙奎那韋抑制裸鼠接種EA-hy 926細胞誘導的血管生成性腫瘤形成。
處理注射具有肉眼可見的損 外部損傷大小組織染色(面積％±SD)傷的小鼠數目/接種(cm2±SD)小鼠的數目(％)FVIII-RACD31鹽水培養基0/8(0)0.58±0.15 0 0鹽水細胞 10/12(83.3) 0.71±0.2 2.91±1 2.30±1.7茚地那韋細胞 4/12(33.3)0.63±0.17 1.01±1.5 0.70±0.6沙奎那韋細胞 3/12(25) 0.55±0.14 0.71±0.8 0.08±0.1如上所述(參見表1要點)，從接種細胞前2天開始，通過胃內管飼法利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理裸鼠，然後皮下注射EA-hy926細胞(3×106細胞/部位)(參見圖25要點)。注射細胞5-6天後處死小鼠，利用卡尺測量注射部位的損傷，HE染色後進行顯微鏡分析或免疫組織化學分析。HIV-PI處理動物中的血管生成性腫瘤損傷的減少在統計上有顯著意義(對比率進行標準檢驗，p＜0.05)。對FVIII-RA或CD31標誌進行免疫組織化學染色以後，評價腫瘤相關的血管生成，如表1說明所述。所示為利用KS300圖像分析軟體(Zeiss)定量的外部損傷大小(cm2±SD)以及染色的腫瘤組織的百分比(±SD)(參見方法)。在茚地那韋或沙奎那韋處理的小鼠中，仍存在於注射部位出現的殘留損傷面積較小(P＜0.05)，並顯示FVIII或CD31的低表達(P＜0.001)。
參考文獻Albini A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4838(1995).
Albini A.et al.，Nat.Med.2，1371(1996)AndréP.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，13120(1998).
Asou H.et al.，Blood 91，2475(1998).
Barillari G.et al.，J.Immunol.，149，3727(1992).
Barillari G.et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 90，7941(1993).
Barillari G.et al.，J.Immunol.，162，1165(1999a).
Barillari G.et al.，Blood 94，663(1999b).
Bein K and Simons M.，J.Biol.Chem.275，32167(2000)Blum L.et al.，AIDS 11，1653(1997).
Cai T.et al.，Lab Invest 79，1151(1999)Carmeliet P.，R.K.Jain，Nature 14，249(2000).
Carr A.et al.，Lancet 351，1881(1998).
Cassone A.et al.，J.Infect.Dis.180，448(1999).
Cattelan A.M.et al.，Eur.J.Cancer 35，1809(1999).
Cohen T.et al.，J.Biol.Chem.271，736(1996).
De Milito A.et al.，J.Med.Virol.57，140(1999).
Deeks S.G.et al.，JAMA 2，145(1997).
Edgell，C.J.，et al.，PNAS 80，37341983Ensoli B.et al.，Science 243，223(1989).
Ensoli B.et al.，Nature 345，84(1990).
Ensoli B.et al.，Nature 371，674(1994a).
Ensoli B.et al.，J.Clin.Invest.94，1736(1994b).
EnsoliB.，M.Stürzl，Cytokine Growth Factor Rev.9，63(1998).
Fiorelli V.et al.，J.Clin.Invest.95，1723(1995).
Fioreli V.et al.，Blood 91，956(1998).
Fiorelli V.et al.，J.Immunol.162，1165(1999).
International Collaboration on HIV and cancer，J.Natl.Cancer Inst.92，1823(2000).
Fujimoto N，et al.，Clin Chim Acta 221，91(1993)Gruber A et al.，J.Biol.Chem.276，47840(2001).
Hannes CA et al，FASEB J.14，85(2000)Kleiner D.E.，W.G.Stetler-Stevenson，Anal，Biochem.218，325(1993).
Koivunen E.et al.，Nat.Biotechnol.17，768 1999).
Lebbé C.et al.，AIDS 12，45(1998).
Ledru E.et al.，Blood 95，3191(2000).
Leppert D et al.，Brain 121，2327(1998).
Leppert D et al.，Clin Infect Dis 31，80(2000).
Masood R.Z.Y.et al.，Blood 85，3423(1995).
Mateo R.B.et al.，Am.J.Physiol.266，R1840(1994).
Meade-Tollin L.C.et al.，Acta Histochem.101，305(1999).
Nakamura S.et al.，Science 255，1437(1992).
Oikawa T et al.，Biochem Biophys Res Comm，246，243(1998)Osman M.et al.，J.Virol.73，6136(1999).
Peterson B.A.，G.F rizzera，Semin.Oncol.20，636(1993).
Ramsay A.J.et al.，Science 264.561(1994).
Ribatti D.，et al.Int.J.Dev.Biol.40，1189(1996).
Rizzieri D.A.et al.，Lancet 349，75(1997).
Samaniego F.et al.，J.Immunol.154，3582(1995).
Samaniego F.et al.，J.Immunol.158，1887(1997).
Samaniego F.et al.，.Am.J.Pathol.152，1433(1998)Sgadari C.et al.，J.Immunol.165，509(2000).
Siriani M.C.et al.，J.Pathol.152，1433(1998)Siriani M.C.et al.，2ndinternational workshop on KSHV/HHV8 and related agents.
St.Catherine’s College，Oxford，UK.10-13 September(1999).
Siriani M.C.et al.，3rdinternational workshop on Kaposi’s sarcoma-associatedherpesvirus and related agents，Amherst，MA，USA.June 6-10(2000).
Stetler-Stevenson W.G.，J.Clin.Invest.103，1237(1999).
Taraboletti G.et al.，FASEB J.14，1674(2000).
Tosato G.et al.，J.Clin.Invest.91，2806(1998).
Tovo P.A.，AIDS 14，743(2000).
Wang Q.J.et al.，J.Infect.Dis.182，928(2000).
Weichold F.F.et al.，J.Hum.Virol.2，261(1999).
權利要求
1.選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的至少一種化合物的用途，用於製備阻斷所需患者中選自正常、腫瘤、炎性或免疫細胞的遷移/侵襲的藥物。
2.權利要求1的用途，其中細胞遷移/侵襲導致組織浸潤和/或水腫形成。
3.權利要求1-2的用途，其中阻斷活性選自阻斷內皮細胞遷移，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷腫瘤細胞遷移，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；阻斷內皮細胞侵襲，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷腫瘤細胞侵襲，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；阻斷炎性細胞遷移，具有治療性抗炎症、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷免疫細胞遷移，具有治療性抗炎症和抗自身免疫作用；阻斷炎性細胞的組織浸潤，具有治療性抗炎症、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷免疫細胞的組織浸潤，具有治療性抗炎症和抗自身免疫作用；阻斷與細胞遷移和侵襲有關的MMP包括MMP-2、基質溶素、間質溶素及其它蛋白酶或分子；阻斷活化與細胞遷移和侵襲有關的MMP及其它蛋白酶或分子的酶；阻斷與細胞遷移和侵襲有關的血小板反應蛋白及其它分子；阻斷與血管生成有關的MMP包括MMP-2、基質溶素、間質溶素及其它蛋白酶；阻斷活化與血管生成有關的MMP及其它蛋白酶的酶；阻斷與血管生成有關的血小板反應蛋白及其它分子；阻斷與炎性細胞和免疫細胞遷移以及組織浸潤有關的MMP包括MMP-2、基質溶素、間質溶素及其它蛋白酶或分子；阻斷與腫瘤生長和轉移有關的MMP包括MMP-2及其它蛋白酶或分子；阻斷bFGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS作用；阻斷VEGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；阻斷bFGF和VEGF的聯合活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；阻斷Tat單獨或在bFGF存在下的活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫和抗炎症作用；阻斷與血管生成有關的血管通透性和水腫；阻斷與腫瘤有關的血管通透性和水腫；阻斷與KS有關的血管通透性和水腫；阻斷與炎症有關的血管通透性和水腫；阻斷炎性細胞因子生成，具有治療性抗炎症作用；阻斷細胞因子生成，具有治療性抗水腫作用；阻斷細胞因子生成，具有治療性抗血管生成作用； 阻斷細胞因子生成，具有治療性抗KS作用；阻斷細胞因子生成，具有治療性抗腫瘤作用。
4.權利要求1-2的用途，其中通過抑制或調節分子和蛋白水解酶而獲得阻斷。
5.權利要求4的用途，其中蛋白水解酶是MMP。
6.權利要求1-5的用途，其中HIV-PI能夠通過抑制分子和蛋白水解酶阻斷細胞侵襲和組織浸潤，引起抗血管生成活性，用於治療腫瘤和非腫瘤性血管增殖性疾病。
7.權利要求1-5的用途，其中HIV-PI能夠阻斷腫瘤細胞侵襲。
8.權利要求1-5的用途，其中HIV-PI能夠阻斷炎性和免疫細胞的組織浸潤，用於治療炎性和自身免疫疾病。
9.權利要求8的用途，其中HIV-PI具有抗水腫形成活性。
10.權利要求1-9的用途，其中該藥物具有抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫形成和/或抗炎症活性，用於治療KS、腫瘤和非腫瘤性血管增殖性、炎性和自身免疫疾病。
11.權利要求1-10的用途，其中該HIV-PI選自下列化合物，即茚地那韋、沙奎那韋、利託那韋、那非那韋、安潑那韋、洛匹那韋和利託那韋、其相應衍生物和化學類似物及其混合物。
12.權利要求11的用途，其中該HIV-PI與抗炎症、抗血管生成或抗腫瘤藥物聯用。
13.權利要求1-12的用途，用於感染或未感染HIV受試者中。
14.權利要求1-13的用途，按照選自口服、靜脈內、肌內、皮下、皮內、腹膜內、鞘內、胸膜內、子宮內、透過黏膜、直腸、陰道、損傷內或透皮給藥方式給藥。
15.權利要求1-14的用途，其中選擇以下劑量對於茚地那韋600mg/天、1200mg/天、2400mg/天和4800mg/天；對於沙奎那韋900mg/天、1800mg/天、3600mg/天、7200mg/天。
16.調節涉及細胞遷移和侵襲、組織浸潤以及與這些細胞途徑有關的分子包括MMP和血小板反應蛋白的活性的生物過程的方法，所述方法包含給予有效量的至少一種選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化合物。
17.治療涉及細胞遷移和侵襲、組織浸潤以及與這些細胞途徑有關的分子包括MMP和血小板反應蛋白的活性的病理狀況的方法，所述方法包含給予治療有效量的至少一種選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化合物。
18.阻斷所需受試者中正常、腫瘤、炎性或免疫細胞侵襲、組織浸潤和/或水腫形成的方法，所述方法包含給予治療有效量的至少一種選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化合物。
19.權利要求18的方法，其中通過抑制或調節分子和蛋白水解酶而獲得阻斷。
20.權利要求19的方法，其中該蛋白水解酶是MMP。
21.權利要求19的方法，其中該分子是血小板反應蛋白。
22.權利要求18的方法，其中該HIV-PI能夠通過抑制分子和蛋白水解酶阻斷細胞侵襲和組織浸潤，引起抗血管生成作用，用於治療腫瘤和非腫瘤性血管增殖性疾病。
23.權利要求18的方法，其中該HIV-PI能夠阻斷腫瘤細胞侵襲。
24.權利要求18的方法，其中HIV-PI能夠阻斷炎性和免疫細胞的組織浸潤，用於治療炎性和自身免疫疾病。
25.權利要求23的方法，其中該HIV-PI具有抗水腫形成活性。
26.權利要求18的方法，其中該病理狀況選自血管生成、非腫瘤性血管增殖性病變、KS、腫瘤、炎性和自身免疫疾病。
27.權利要求17的方法，其中該病理狀況選自卡波濟氏肉瘤、血管生成；眼睛、腎臟、血管系統、皮膚的非腫瘤性血管增殖性疾病，例如糖尿病性視網膜病、晶狀體後纖維組織形成、沙眼、血管性青光眼、銀屑病、免疫性和非免疫性炎症、動脈粥樣硬化、瘢痕瘤；軟組織、軟骨、骨和血液的良性和惡性腫瘤；一般自身免疫疾病，特別是系統性紅斑狼瘡、硬皮病、類風溼性關節炎、銀屑病、甲狀腺炎、潰瘍性直腸結腸炎和克羅恩氏病、古德帕斯徹氏症候群、系統性血管炎、Sjgren氏綜合症、原發性膽汁性肝硬變；炎性疾病，特別是與變態反應和病毒感染性、細菌或寄生物有關的慢性炎症，包括Castleman氏多中心病。
全文摘要
本發明涉及通過抑制或調節分子和蛋白水解酶，例如但不限於MMP，阻斷正常、腫瘤炎性或免疫細胞的侵襲、組織浸潤、和/或水腫形成的方法，用於治療發病機理與上述過程有關的各種疾病，包括腫瘤、非瘤性血管增殖性疾病、炎性疾病或自身免疫疾病，該方法是基於使用HIV病毒的蛋白酶抑制劑(HIV－PI)。
文檔編號A61K31/426GK1700916SQ02812126
公開日2005年11月23日 申請日期2002年4月18日 優先權日2001年4月18日
發明者B·恩索裡 申請人:高等健康研究院