用於基因療法的延長的腺相關病毒載體的順行性心外膜冠狀動脈輸注的製作方法

2023-09-14 03:17:40

專利名稱：：用於基因療法的延長的腺相關病毒載體的順行性心外膜冠狀動脈輸注的製作方法
技術領域：
：本發明涉及治疔心血管疾病、具體來說將多聚核苷酸遞送到心臟組織的基因療法。
背景技術：
：心臟病是一種具有極高發病率(尤其在西方,家)的嚴重公共健康問題。心臟病狀包括冠狀動脈疾病、缺血性心臟病、心力衰竭、心臟瓣膜病、心律失常和心肌炎症(心肌炎)等。冠狀動脈疾病和心力衰竭可能最為嚴重和普遍，這兩種為在西方國家引起死亡的主導原因。急性心肌梗塞和充血性心力衰竭以及其後遺症對患者生活質量和衛生保健成本的影響驅動人們研究新穎療法。充血性心力衰竭(CHF)是心臟喪失其有效泵送血液的能力的嚴重病狀。從美國國家心臟、肺和血液研究所(NationalHeart,LungandBloodInstitute)獲得的數據表明，僅在美國就冇約丄:百萬人患有心力衰竭，並且每年還診斷出550,000例新病例。CHF每年會引起或導致約300,000人死亡。所述疾病在65歲或65歲以上的人、婦女和非洲裔美國人屮最為常見。心力衰竭的最常見症狀為呼吸淺促、感覺疲累和踝關節、腳、腿且有時腹部腫脹。尚無關於充血性心力衰竭的治癒病例，並且所屬領域中迫切需要有效療法。已開始引起較多關注的治療諸如CHF等心臟病的一種方法為基因療法，其中通常在病毒載體中將多聚核苷酸遞送到心臟組織。已嘗試多種將病毒載體遞送到心臟中的方式，包括直接注射到心肌中(劉(Liu)等人，美國實驗生物學聯合會會志(FASEBJ.)2006;20(2):207-16;李(Li)等人，毒理學與應用藥理學(Toxicol.Appl.Pharmacol.)2006年1月25日(電子出版物)；朱(Zhu)等人，循環雜誌(Circulation.)2005;112(17):2650-9)、冠脈內遞送(尼凱寧(Nyka腿)等人，循環研究(Circ.Res.)2006;98(11):1373-80;卡斯帕(Kaspar)等人，基因藥物雜誌(J.GeneMed.)2005;7(3):316-24)、利用冠狀靜脈阻斷的基於導管的順行件冠脈內遞送(早瀨(Hayase)等人，美國生理學雜誌:心臟和循環生理學(Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.)2005;288(6):H2995-3000)、主動脈和肺動脈夾起後腺相關病毒載體的主動脈近端注射(卡斯帕等人，基因藥物雜誌，2005;7(3):316-24)。萊頓(Leiden)和斯文森(Svensson)提及在活體內將rAAV載體輸注到冠狀動脈或通常冠狀竇中，但只詳細描述在4°CK離體利用報告基因灌注小鼠心臟，其中所述心臟已停止跳動(WO00/38518)，這是一種不適於治療諸如人類等大型動物的方法。因此，出於以卜原因這些方法都不適用於臨床環境舉例來說，這些方法因需要手術幹預或中斷氧合血到心肌的流動而過於危險；實踐所述方法所需的病毒載體的量；經轉染組織的低白分含量；轉導僅局限於注射/投藥部位；或所述方法對大型動物或人類的疾病的治療不切實際或未經證實。仍需要將病毒載體中的轉基因遞送到心臟組織中以治療尤其人類的疾病的簡單、最小侵襲性但仍有效的方式。
發明內容本發明涉及治療心血管疾病、具體來說通過將治療劑直接心外膜輸注到冠狀循環中來將治療劑遞送到'l>髒組織中的療法。本發明的優選實施例為適於轉染心臟細胞的治療性多聚核苷酸組合物的用途，其用於製備供治療或預防心臟病的藥劑，所述治療或預防是在不將冠狀循環從全身循環中分離的情況卜'，通過將所述多聚核苷酸經至少三分鐘的時間輸注到冠狀循環的血管中來實現。另一實施例為一種通過轉染大型動物的心臟細胞來治療或預防心血管疾病的方法，所述方法包含鑑別需要治療或預防心血管疾病的哺乳動物；在活體內將治療性多聚核苷酸輸注到冠狀循環的血管中，其中所述治療性多聚核苷酸是經至少約二分鐘的時間輸注到血管中，其中所述冠狀循環並未從哺乳動物的全身循環中分離或實質上分離；且其中所述治療性多聚核苷酸轉染哺乳動物的心臟細胞，從而引起對於心血管疾病的治療或預防。在一些實施例中，經至少約五分鐘的時間將多聚核苷酸輸注到血管中；在一些實施例屮，經至少約十分鐘的時間將多聚核苷酸輸注到血管中；在一些實施例中，經至少約I五分鐘的時間將其輸注到血管屮。在'些實施例中，向血管屮輸注是以小於或等十約6.0mL/min的速率進行；在-些實施例屮.其是以小於或等於約2.5mL/min的速率進行；在'些實施例屮，其是以小於或等於約2.0mL/min的速率進行；在一些實施例中，其是以小於或等於約1.2mL/min的速率進行；在一些實施例中，其是以小於或等於約1.0mL/min的速率進行；在一些實施例中，其是以小於或等於約0.6mL/min的速率進行。7在一些實施例中，血管為左冠狀動脈。在一些實施例中，不是通過非天然方式限制冠狀循環的流出。在-些實施例中，側心室前端、側心室下端、隔膜和右心室的心臟細胞的轉染可使用PCR進行檢測。在一些實施例中，多聚核苷酸能夠表達能調節心臟細胞的細胞活性的蛋白質。在一些實施例中，細胞活性為心肌細胞的鈣循環路徑。在一些實施例中，所述蛋白質為肌質網/內質網二磷酸腺苷酶(SERCA)，且在一些實施例中，SERCA為SERCA2a。在優選實施例中，多聚核苷酸是存在於選自由以下組成的群組的病毒載體中腺相關病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、單純皰疹病毒、牛乳頭瘤病毒、慢病毒載體、牛痘病毒和多瘤病毒。在更優選實施例中，病毒載體為AAV病毒，且在更優選實施例中，病毒載體為AAV2/1載體。在一些實施例中，多聚核苷酸可操作性連接到基於CMV的啟動"f且包裝於病毐載體中。在優選實施例中，多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列。在一些實施例中，心臟細胞的轉染使得側心室節段縮短增加。在一些實施例中，哺乳動物為人類且疾病為充血性心力衰竭。在些實施例屮，將多聚核苷酸包裝十病毒載體的脫氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)屮。在'.些實施例l，所輸注的DRP總數小+或等於選自由以下組成的群組的量1x1014、1x10'3、3x1012、1x10'2、1x1011、1x1010、1x109和1x108。在-些實施例中，所輸注的DRP總數小於或等於1x1013。在一個實施例中，所輸注的DRP總數小於或等於1x10'2，病毒載體為AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，血管為左或右冠狀動脈，且多聚核苷酸的輸注以小於或等於約2mL/min的流速持續至少約IO分鐘，且側心室前端、側心室下端、隔膜和右心室的心臟細胞的轉染可使用PCR進行檢測。在一些實施例中，疾病選自由以下組成的群組心力衰竭、局部缺血、心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、移植物排斥、異常心臟收縮性、非缺血性心肌病、二尖瓣關閉不全、主動脈瓣狹窄或主動脈瓣關閉不全、異常Ca"代謝和先天性心臟病。在一個實施例中，病毒載體為AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，血管為左或右冠狀動脈，且多聚核苷酸的輸注是以小於或等於約2.5mL/min的流速持續至少約8分鐘，其中側心室前端、側心室下端、隔膜和右心室的心臟細胞的轉染可使用PCR進行檢測，且與輸汴多聚核苷酸之前的側心室節段縮短相比，當在輸注後約4個月測量時，心臟細胞轉染使得側心室rr段縮短增加至少25%。在一個實施例中，哺乳動物為人類，病毒載體為AAV2/1,多聚核苷酸包含SERCA2a8編碼序列，血管為左或右冠狀動脈，且多聚核苷酸的輸注持續龜少約10分鐘。在一些實施例中，心血管系統疾病為充血性心力衰竭。在一些實施例中，多聚核苷酸的輸注是以約6mL/min的流速進行。在一些實施例中，心臟細胞的轉染引起選自由以f組成的群組的心臟功能量度的改進SERCA2a蛋白的表達、節段縮短、射血分數(ejectionfraction)、心輸出量、心室鬆弛的時間常數和反流體積(regurgitantvolume)。在一些實施例中，本發明進一步包含將多聚核苷酸輸注到冠狀循環的另一血管中，其中將多聚核昔酸經至少約二分鐘的時間輸注到所述另一血管中。在一些實施例中，哺乳動物為人類，病毒載體為AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，血管為左冠狀動脈，且將多聚核苷酸輸注到左冠狀動脈中持續至少約6分鐘，且所述另一血管為右冠狀動脈，且將多聚核苷酸輸注到右冠狀動脈中持續至少約3分鐘。在一些實施例中，心血管系統疾病為充血性心力衰竭。在一些實施例中，將多聚核苷酸輸注到左冠狀動脈和右冠狀動脈中是以約6mL/min的流速進行。在一些實施例中，心臟細胞的轉染引起選自由以下組成的群組的心臟功能量度的改進SERCA2a蛋fl的表達、節段縮短、射血分數、心輸出量、心室鬆弛的時間常數和反流體積。在些實施例屮，本發明為試劑盒，其包含醫藥組合物，其包含至少1X10"個AAV2/1載體DRP，所述載體含有編碼SERCA2a的多聚核苷酸；和說明書，其說明應將包含至少0.5x1011個AAV2/1載體DRP的溶液投與需要預防或治療心血管疾病的患者，所述載體含有編碼SERCA2a的多聚核苷酸，所述預防或治療是通過將所述溶液活體內輸注到冠狀循環的血管中來實現，其中所述冠狀循環未從患者的全身循環中分離或實質上分離，且其中將多聚核苷酸經至少約三分鐘的時間輸注到血管中。在一些實施例中，血管為左或右冠狀動脈，ti多聚核苷酸的輸注持續？少約8分鐘的時間。圖1為展示AAV2/l/SERCA2a(tgABG12)DNA的特徵的示意圖。圖2為野生型與重組AAVDNA的示意性比較。圖3為展小實例1屮所述實驗屮所收集的樣本的位置的心臟圖解。圖4展示用於檢測組織樣本中的AAV2/l/SERCA2aDNA的PCR引物的位置。圖5為展示實例1中所述實驗的結果的圖表，其表明相同量AAV2/l/SERCA2a的輸注時間的增加引起心臟組織樣本中AAV2/l/SERCA2a拷貝的增加。圖6為展示實例2中所述實驗的結果的圖表，其表明AAV2/l/SERCA2a輸注以劑量依賴性方式引起比靜脈內注射多的AAV2/1/SERCA2a拷貝。圖7A為展示實例3的非實驗性對照動物、調配物輸注動物(生理鹽水)和AAV2/l/SERCA2a治療動物中SERCA2a蛋白(上圖)禾QmRNA(下圖)的表達的聚丙烯醯胺凝膠；圖7B為比較實例3的三個治療組之間SERCA2a的止常化蛋白質表達的圖。圖8為展示實例3中所述實驗的結果的圖，其表明AAV2/l/SERCA2a的順行性心外膜冠狀動脈輸注引起左心室節段縮短的增加，其為心力衰竭模型中心臟功能改進的一種量度。罔9為第112天fcj第56天節段縮短的絕對變化的圖。圖10為第112天與第56天射血分數的絕對變化的圖。圖11為第112天與第56天心輸出量(mL/min.)的絕對變化的閣。圖12為第112天與第56天t(以msec.計的LV鬆弛的時間常數)的絕對變化的圖。圖13為第112天與第56天反流體積(mL)的絕對變化的圖。具體實施例方式木發明涉及治療心血管疾病的療法。木發明的一個實施例為適於轉染心臟細胞的治療性多聚核苷酸組合物用於製備供治療心臟病的藥劑的新穎用途，所述治療是通過轉染心臟組織以通過使心肌細胞鈣含量正常化來改進患有充血性心力衰竭(CHF)的患者的心肌收縮性實現。優選實施例使用基因轉移劑AAV2/l/SERCA2a，其在活體內直接輸注到冠狀循環中持續不少於約3分鐘的時間，其中所述冠狀循環未自動物的全身循環中分離或另外經非天然方式限制。如本文所使用，"多聚核苷酸"具有其在所屬領域中常見且慣用的含義，並且包括諸如DNA或RNA分子等任何聚合核酸以及所屬領域技術人員已知的化學衍生物。多聚核苷酸不僅包括編碼治療性蛋白質的多聚核苷酸，而且還包括^用於使用所屬領域中已知的技術減少靶核酸序列的表達的序列(例如，反義核酸、T擾核酸或小下擾核酸)。-個實例為減少或消除受磷蛋白的表達的序列。多聚核苷酸還可用於起始或增加心血管系統細胞內靶核酸序列的表達或靶蛋白質的產生。靶核酸和蛋白質包括(但不限於)通常見於耙組織屮的核酸和蚩白質、所述天然存在的核酸或蛋白質的衍生物、不常見於靶組織中的天然存在的核酸或蛋白質，或合成核酸或蛋白質。一種或一種以上多聚核苷酸可以組合形式使用，問時和/或依次投5以增加和/或減少一種或一種以上靶核酸序列或蛋白質。如本文所使用，術語"輸注"具有其在所屬領域中常見且慣用的含義，且指投藥持續實質上比技術認可的術語"注射"或"推注"(通常小T1分鐘)長的時間(通常為1分鐘或更長時間)。輸注的流速將至少部分取決於所投與的體積，然而，對T相同體積，"輸注"的流速比"注射"慢。"有效暈"具有其在所屬領域中常見Fl慣用的含義，且包括足以實現或獲得有益或所需治療作用的量。舉例來說，"有效量"為獲得以下效果中任一種的量側心室節段縮短的增加；和/或疾病狀態的進展或者病徵或症狀的減輕、改善、穩定、逆轉、減慢或延遲。有效量可以一次或一次以h投藥投與。如本文所使用，"與…一起"、"與…組合"、"同時"或"同時地"具有其在所屬領域中常見且慣用的含義，且包括除投與一種治療方法外還投與另一種治療方法。舉例來說，除將本發明的多聚核苷酸輸注到個體外，還將技術認可的醫藥組合物投與同一個體。如本文所使用，這些術語包括同時投藥以及依次投與治療方法。如本文所使用，"治療"疾病或疾病的"治療"具冇其在所屬領域中常見且慣用的含義，且包括使疾病穩定、治癒或不到完全治癒，包括疾病或者疾病病徵或症狀的進展的停止或減緩。術語"預防"具有其在所屬領域屮常見且慣用的含義，且包括完全或不完全預防疾病或者疾病病徵或症狀，或者延緩疾病或者疾病病徵或症狀的發作。術語"治療"、"治療作用"或"臨床作用"包括治療和預防兩者。打算使用本發明治療的與心血管系統有關的疾病的實例包括(但不限於)心力哀竭、局部缺血、心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、移植物排斥、異常心臟收縮性、非缺血性心肌病、二尖瓣關閉不全、牛.動脈狹窄或豐.動脈瓣關閉不全、異常Ca^代謝和先天性心臟病。舉例來說，有益或所需臨床結果或治療作用包括(但不限於)心血管疾病的病徵或症狀的較大緩和、疾病程度減少更多、疾病狀態穩定(即，未惡化)、疾病進展的延緩或減慢、疾病狀態的改善或減輕以及可檢測或不可檢測的緩解(部分或完全)。治療作用的其它實例包括(但不限於)側心室節段縮短增加、在細胞和整個動物水平上心肌收縮性增大、心臟重構逆轉和細胞內鈣的異常高的心舒張含量的正常化。利用本發明的實施例治療的個體中可改進的的其它臨床特徵包括(不限於)存活期；心臟代謝；心臟收縮性；心率；心室功能(例如，左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP));Ca2+代鎮^(例如，細胞內Ca2+濃度、峰伹或靜止[Ca"]、SRCa"三磷酸腺苷酶活性、受磷蛋A的磷酸化狀態)；心臟的力產生、鬆弛和壓力；力-頻率關係；心肌細胞存活或凋亡或者離子通道活性(例如，鈉鈣交換、鈉通道活性、鈣通道活性、鈉鉀三磷酸腺苷酶泵活性)肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶、肌球蛋f^輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2或肌球蛋白輕鏈3、IGF-1受體、PI3激酶、AKT激酶、鈉-鈣交換蛋白、鈣通道(L和T)、肌集鈣蛋白(calsequestrin)或鈣網蛋白(calreticulin)的活性。可改進的其它心臟病量度包括節段縮短、心輸出量、射血分數、t、反流體積、住院時間的縮短、生活質量的改進和踏車時間(treadmilltime)的增加。如木文所使用，"外源"核酸或基因為在CJ然界中不存在於用於核酸轉移的載體中的核酸或基因，例如非天然見於病毒載體中的核酸或基因，但所述術語不打算排除編碼天然存在於患者或宿主中的蛋白質或多肽(例如，SERCA)的核酸。如本文所使用，"心臟細胞"包括涉及維持結構或提供心臟功能的心臟中的任何細胞，諸如心肌細胞、心血管細胞或存在於心臟瓣膜中的細胞。心臟細胞包括心肌細胞(具有正常和異常電特性)、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、輸導組織的細胞、心臟起搏細胞(cardiacpacemakingcell)禾口神經元。如本文所使用，"分離"、"實質上分離"或"在很大程度上分離"和其變化形式為不需要完全或絕對分離冠狀靜脈、心臟靜脈、全身靜脈或全身循環的術語；相反，其打算意味分離多數、優選大部分或甚至實質上全部指定循環。如本文所使用，"部分分離"是指指定循環的任何重要部分經分離。如本文所使用，"以非天然方式限制"包括限制流體流過血管的任何方法，例如球囊導管、縫合等，但不包括天然存在的限制，例如斑塊堆積(狹窄)。非天然限制包括例如冠狀循環的實質或完全分離。如本文所使用，"調節"具有其一般含義，且涵蓋標靶表達或活性的增加和降低。如本文所使用，術語"最小侵襲性"打算包括不需要對心臟或與心臟緊密關聯的血管進行開放性手術接近的仟何程序。所述程序包括使用內窺鏡方式接近心臟，以及依賴經由諸如股動脈等大動脈和靜脈接近的基於導管的方式。如本文所使用，術語"腺相關病毒"或"AAV"涵蓋所有亞型、血清型和假型(pseudotype)以及天然存在形式和重組形式。多種AAV血清型和品系已為所屬領域中所知，且可從諸如ATCC和學術或商業來源等來源公開獲得。或者，可使用已知技術合成己公開和/或可從各種資料庫得到的AAV血清型和品系的序列。如本文所使用，術語"血清型"是指由對指定抗血清具反應性的衣殼蛋A鑑別且基於對指定抗血清具反應件的衣殼蛋白與其它AAV相區別的AAV。存在至少十二種己知人類AAV血清型，包括AAV1到AAV12，然而，不斷發現其它血清型並且涵蓋新近發現的血清型的使用。舉例來說，AAV2血清型用丁-指含有由AAV2的c叩基因編碼的衣殼蛋白以及含有來自相同AAV2血清型的5'和3'反向末端重複(ITR)序列的基因組的AAV。"假型"AAV是指含有來自一種血清型的衣殼蛋白以及包括不同或異種血清型的5'和3'反向末端重複(ITR)的病毒基因組的AAV。預期假型rAAV將具有衣殼血清型的細胞表面'結合特性和與ITR血清型一致的遺傳特性。假型rAAV可包含AAV衣殼蛋白，包括VP1、VP2和VP3衣殼蛋白；和來Q任何血清型AAV(包括AAV1到AAV12的任何靈長類動物AAV血清型)的ITR，只要所述衣殼蛋白為與ITR血清型異種的血清型。在假型i-AAV中，5'和3'ITR可為同種或異種的。假型rAAV是使用所屬領域中所述的標準技術產生。"嵌合"rAAV載體涵蓋包含異種衣殼蛋白的AAV載體也就是說，rAAV載體可關於其衣殼蛋白VP1、VP2和VP3來說為嵌合的，因此VP1、VP2和VP3並非都為相同血淸型AAV。如本文所使用，嵌合AAV涵蓋以下AAV，其中衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的血清型不同，例如包括(但不限於)來自AAV1和AAV2的衣殼蛋白；衣殼蛋白VP1、VP2和VP3為其它細小病遏(parvovirus)衣殼蛋白的混合物或包含艽它病毐蛋白或其它蛋白質，諸如以AAV到所需細胞或組織的遞送為標靶的蛋白質。如本文所使J1J，嵌合rAAV還涵蓋包含嵌合5'和3'ITR的rAAV。本發明涵蓋包含來自不同AAV血清型(例如，AAV1和AAV2)的ITR的嵌合rAAV載體，或嵌合rAAV可包含合成序列。rAAV病毒載體可通過所屬領域屮已知的多種方法屮的任'種(包括如美國專利第6,001,650號和第6,258,595號中所述的瞬時轉染策略)產生。rAAV載體產生通常需要四個常見要素1)容許供複製的宿主細胞，其包括適用於本文所述的載體產生系統中的所屬領域中己知的標準宿主細胞，包括293-A、293-S(從生物信賴公司(BioReliance)獲得)、VERO和海拉(Hda)細胞系；2)輔助病毒功能，3用於轉導產生系統中時，其是以表達5型腺病毒(Ad5)的E2a、E4-orf6和VA基因的質粒pAd輔助載體4.1的形式提供；3)轉包裝(transpackaging)rep-cap構築體和4)側接AAVITR序列的所關注基因。轉染產生可如沙達隆(Sandalon)等人，病毒學雜誌(J.Virology)，2004;7S(22):12355-12365的文章中所述一般執行。治療方法在本發明的優選實施例中，通過將治療劑(例如，下文較為詳細地描述的多聚核苷酸/病毒載體)經辛:少約三分鐘的時間在活體內輸注到跳動心臟的冠狀循環的血管中，來將所述治療劑投與個體的特定血管中。在人類心臟和心血管疾病的大型動物模型中，申請者已發現，出人意料的是，對T投與病毒載體來說，相對較長的輸注時間較為有效目.引起比相同量病毒載體的推注或短時間(例如，51分鐘)輸注優良的到心臟組織中的基因轉移效率。可以通過與注射相比，每個細胞較高的轉基因的拷貝數、在mRNA和/或蛋白質水、K上每個細胞或組織中轉基因表達的增加，和/或所轉染的特定組織中較高的細胞(例如，心肌細胞)百分含量來測量改進的輸注效率。申請者已證實，在大型動物模型中，這引起人類心血管疾病模型的成功治療。此外，申請者已發現，通過使用相對較長的輸注時間，無需將冠狀循環從全身循環中分離或另外使治療劑再循環，或無需人工限制冠狀靜脈循環，其為增加冠狀循環內的壓力或增加治療劑的停留時間的方式。也不需要利用諸如血管活性劑(例如組胺、組胺激動劑或血管內皮生長因子)等其它藥劑預先處理心臟組織以冷卻心臟、使心臟停止或將心臟從動物中取出以供灌注。相反，申請者的稈序可在標準導管插入實驗室環境中使用供投藥的現有導管實踐。因此，申請者已發現使用基因療法治療諸如人類等大型動物的心血管疾病的簡單、實際且有效的方式。在本發明的優選實施例中，通過將治療劑輸注到冠狀循環的血管中來對個體投與治療劑。冠狀循環將血液供應提供到心臟組織。存在多個冠狀動脈。以下四個主要的冠狀動脈通常將氧合血提供到心臟中以使其分布遍及心臟組織左主千和右冠狀動脈、左前降支動脈和左迴旋支動脈(leftcircumflexartery)。涵蓋這些動脈中的一個或組合的輸注，例如左和右冠狀動脈的輸注。優選實施例利用左和右主幹冠狀動脈的順行性心外膜輸注。還涵蓋冠狀動脈或者個或個以上順行性和逆行性冠狀動脈或靜脈的組合的逆行性輸注。冠狀血管的輸注是使用標準導線、導管和輸注泵執行。在優選實施例中，在螢光鏡的指導下，經由股動脈將輸注導管導向冠狀動脈。如本文所使用，"冠狀循環的血管"、"冠狀血管"或"心臟血管"包括冠狀血管上的移植物，例如由旁路手術產生者。如本文所使用，"心外膜"是指位於心臟外部(例如，左或右冠狀動脈)的血管。3輸注導管在靶冠狀血管的適3位置後，優選藉助於程序控制輸注泵將治療劑輸注到血管中。輸注治療劑所耗費的時間量為獲得有效且優良的基因轉移效率的重要因素。申請者G測定，至少約3分鐘的到特定血管的輸注時間比推注或較短輸注時間有效。儘管預期至少約15分鐘的輸注時間，但輸注時間優選為至少約8分鐘，更優選為至少約IO分鐘。申請者還預期輸注時間為、為約、為至少、為至少約、不超過或不超過約以下時間1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分鐘，或在由這些值中任兩個值所界定的範圍內。由於輸注通常涉及使用具有一定死容積的導管和連接管，因此輸注裝置通常填裝有不含任何治療劑的載體溶液，例如來自個體的血液。因此，當輸注泵開啟時，治療劑並未立即投、'冠狀循環。同樣，當排空含有治療劑的注射器時，一定量的治療劑通常存留在連接管和導管的死容積中。在輸注治療劑後，、Y.即用適當溶液優選以用丁-投與治療劑14的相同流速衝洗死容積。與排出輸注設備中的死容積相對，將治療劑實際遞送到冠狀動脈中的時間段在上文中稱為"輸注時間"。舉例來說，如果將3mL治療劑裝載到具有3mL死容積的輸注設備中，且輸注速率為1mL/min.，那麼將治療劑輸注到冠狀循環中所需的時間僅為3分鐘，而投與3mL治療劑和3mL死容積所需的總時間為6分鐘。在一些實施例中，導管和任何連接管都填裝有治療劑，以致死容積並不成為問題。類似地，可遞送有效量的治療劑而無需衝洗所述管。然而，這使得治療劑殘留於管中，從而浪費治療劑。申請者預期，將以一定流速輸注治療劑，所述流速為、為約、為至少、為至少約、不超過或不超過約以下速率0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0mL/min,或在由這些值的任兩個值所界定的範圍內。流速優選介於約0.2mL/min與約6.0mL/min之間，更優選介於約0.2mL/min與約2.5mL/min之間，更優選介於約0.2mL/min與約2.0mL/min之間。所屬領域技術人員將認識到，有可能在無輸注泵的情況下遞送治療劑，但使片j輸注泵可能以更為精確的流速均勻地遞送。通過輸注遞送從而提供有效量的病毒粒子或脫氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)的總量優選介於1xIO"個與約1xIO"個之間，更優選介於約3x1012個與1x10'2個之間且更優選為約1x1012個。然而，申請者還預期，病毒粒子或DRP的總量為、為約、為至少、為至少約、不超過或不超過約以下量1xIO"個、9x1013個、8x1013個、7x1013個、6xl0'3個、5xlO'3個、4xl0'3個、3xlO'3個、2xl0'3個、lxlO'3個、9x1012個、8xlO'2個、7xlO'2個、6xl0"個、5xl0'2個、4xl0'2個、3xlO'2個、2x1012個、lxl0'2個、9xl0"個、8xlO"個、7xl0"個、6xl0"個、5xlO"個、4xl011個、3xlO"個、2xl0"個、lxlO"個、9xl(T個、8xlO'。個、7xl0'。個、6x1010個、5x10|個、4x10|個、3x10'。個、2x101個、1x101個、9x109個、8x109個、7xl9個、6xl09個、5xl9個、4xl9個、3xl(f個、2xl9個、lxl(^個、9xl。8個、8xl8個、7xl8個、6xl。8個、5xl8個、4xl。8個、3xl。8個、2x10s個或1x108個，或在由這些值中任兩個值所界定的範圍內。經指定時間輸注的DRP的數量隨所輸注的溶液的濃度和流速而變化。DRP或病毒粒子輸注的速率優選介於約1x18個/min.與約1x10"個/min.之間，更優選介T約5x1(T個/min,與約5x10"個/min.之間，更優選介丁-約3x10'0個/min.與約1x10"個/min.之間，更優選介T約6x10'Q個/min.與約4x10"個/min之間。在優選實施例中，DRP或病毒粒子輸注的速率為1x10"個/min.,且在另一優選實施例中，其為1.25xIO"個/min。在一個實施例中，將治療劑投入心臟的單一血管中。在另一實施例中，將2/3總體積的治療劑遞送到心臟的一個血管中，目.將1/3投與心臟的另一血管。在另一實施例中，輸注2個以上冠狀血管(例如，3、4、5個或更多)並艮在適當時，可調整每個血管所投與的含有治療劑的總輸注體積的部分。輸注的目的在於經由順行性心外膜冠狀動脈輸注擴散AAV2/l/SERCA2a，使心肌均勻地暴露於AAV2/l/SERCA2a。存在多種基於側支化模式、堵塞疾病和解剖變異(例如，術後旁路解剖術)的輸注情形，但臨床醫生的目的為1/3的AAV2/l/SERCA2a遞送到前外側，1/3遞送到後外側且1/3遞送到下部/下外側心肌。解剖學是通過冠狀和旁路移植血管造影術確定以實現經灌注心肌的均勻遞送。此外，所屬領域技術人員將認識到，儘管綿羊和豬為認bJ—的人類心血管研究的動物模型，但綿羊和豬為90%左優勢型(leftdominant)。相比而P，約10%的人為左優勢型，且剩餘90%為右優勢型或共優勢型(沃爾達瓦Z.(VlodaverZ.)等人，冠心病臨床、血管造影禾口病5裡圖(CoronaryHeartDisease:Clinical,Angiographic,andPathologicProfiles.)施譜林格出版集團(Spinger-Verlag),紐約(NewYork.)1976)。-'個病理組表明71%的患者為右優勢型，17免為共優勢型，12%為左優勢型(麥卡爾平W.(McAlpineW.)心臟與冠狀動脈(HeartandCoronaryArteries)施譜林格出版集團(Spinger-Verlag)，1975)。丙此，為實現人類與豬/綿羊的左心室的類似灌注，最適宜輸注情形可不同。對於兩個血管，優選1/3和2/3的溶液體積分數，但輸注到特定血管中的注射體積的部分可為、為約、為至少、為至少約、不超過或不超過約總體積的20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80%或者在由這些值中任兩個值所界定的範圍內的體積。含有治療劑的溶液的總體積將根據所治療的動物的體格而變化。對於人類個體，優選60mL的總治療劑體積。然而，治療劑的總體積可為、為約、為至少、為至少約、不超過或不超過約以下體積1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、卯、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mL，或者在由這些值中任兩個值界定的範圍內。本文所述的治療劑町為溶液、優選為適於直接投入冠狀循環中的醫藥組合物的形式。可接受的醫藥組合物的成分為所屬領域技術人員所知，且可包括諸如緩衝劑和適當載劑等成分。在另一實施例中，含有治療劑、例如病毒載體且史優選AAV2/l/SERCA2a載體的醫藥組合物為試劑盒的部分。在一些實施例中，試劑盒含有治療劑的儲備溶液和用T稀釋儲備溶液的溶液。試劑盒中還包括有關投與病毒載體、優選通過直接輸注到冠狀循環中投與病毒載體(如本文所揭示的任何實施例中所述)的說明書。類似地，本文所述的治療劑可用T製造供治療本文所揭示的疾病的藥劑，其中所述藥劑將.肓接輸注到心臟循環中。多聚核苷酸遞送的方法木發明一方面涵蓋將治療性多聚核苷酸轉移到細胞中。所述轉移可使用基因轉移的病毒或非病毒方法。這一部分將提供基因或核酸轉移(包括反義序列、幹擾序列和小幹擾序列的轉移)方法和組合物的論述。在--個實施例中，將治療有效的多聚核苷酸併入病毒載體中以介導向細胞的轉移。編碼如本文所述的其它治療劑的其它表達構築體還可使用感染性病毒粒子經由病毒轉導(例如通過用本發明的腺相關病毒(AAV)轉化)來轉移。或者，可使用已經工程改造以供表達的逆轉錄病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒載體、慢病毒載體、牛痘病毒、多瘤病毐或感染病毐。類似地，可使用非病毐方法，其包括(但不限於)諸如通過灌注直接遞送DNA、裸DNA轉染、脂質體介導的轉染、包囊和受體介導的胞吞作用。這些技術為所屬領域技術人員眾所周知，且其細節並非本發明的關鍵且因此無需在本文中詳盡說明。然而，在-^個優選實例中，使用病毒載體轉導心臟細胞，以將治療有效的多聚核苷酸遞送到細胞。病毒可通過諸如受體介導的胞吞作用等特異方式或通過諸如胞飲作用等非特異方式進入細胞內部。現將描述多個例示性載體。應了解以下論述並不詳盡。腺相關病毒載體本發明的優選實施例利用經純化、無法複製的假型重組腺相關病毒(rAAV)粒子。腺相關病毒粒子(AAV)為屬於依賴病毒(Z)印e/Wm^w)屬的細小病毒。其為需要輔助病毒以便複製的無包膜單鏈小DNA病毒。為形成功能完全的AAV病毒體，需要與輔助病毒(例如，腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒)共感染。在活體外，在不存在與輔助病毒共感染的情況下，AAV形成一種使病毒基因組以附加體形式存在但不產生感染性病毒體的潛伏狀態。輔助病毒的後續感染"拯救"基因組，使得能將其複製且包裝於病毒衣殼中，從而重新構成感染件病毒體。最新數據表明，野生型AAV與重組AAV在活體內主要是以人的附加體連環體(episomalconcatemer)形式存在。AAV與任何已知的人類疾病無關，通常認為其不會致病並且在整合後似乎不會改變宿主細胞的生理特性。AAV可感染包括非分裂細胞的多種宿主細胞，並且能感染來自不同物種的細胞。已展示，與經細胞和體液反應迅速清除或失活的一些載體相比，AAV載體在活體內丁-各種組織中持久表達。活體內非分裂細胞中重組AAV載體的持續性可由原生AAV病毒基因的缺乏以及所述載體形成附加體連環體的能力引起。腺相關病毒(AAV)為引人注目的用於本發明的細胞轉導中的載體系統，這是因為其呈附加體連環體形式而具有較高的持續頻率，並目.其能感染非分裂細胞，從而使其能適用T將基因遞送到例如組織培養物和活體內的哺乳動物細胞中。展現AAV於基因遞送中的用途的研究包括弗洛特(Flotte)等人，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1993;90:10613-17;和威爾斯(Walsh)等人，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)，1994;94:1440-48。已將重組AAV載體成功地用於標記基因和涉及人類疾病的基因的活體外和活體內轉導(例如參看威爾斯(Walsh)等人，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.),1994;94:1440-48)。對於感染性，AAV具有較寬的宿主範圍。有關產生和使用rAAV載體的細節描述於美國專利第5,139,941號和/或美國專利第4,797,368號中。通常，通過共轉染含有側接兩個AAV末端重複的所關注基因的質粒和/或含有野生型AAV編碼序列而無末端重複的表達質粒(例如pIM45)來製造重組AAV(rAAV)病毐。還利用腺病鳥:和/或攜帶AAV輔助功能所必需的腺病毐基因的質粒來感染和/或轉染細胞。以所述方式製造的rAAV病毒儲備液被腺病毒汙染，必須將其與rAAV粒子物理分離(例如，通過氯化銫密度離心或柱層析)。或者，可使用含有AAV編碼區的腺病毒載體和/或含有AAV編碼區和/或-'些或全部腺病毒輔助基岡的細胞系。還可使用攜帶rAAVDNA的呈整合原病毒形式的細胞系。自然界中存在多種AAV血清型，其中目前己知至少12種血清型(AAV1-AAV12)。儘管具有高度同源性，但不同血清型對於不同組織具有向性。AAV1的受體尚未知，但己知AAV1對於轉導骨骼肌和心肌比AAV2有效。由於己利用假型載體(其中側接AAV2ITR的載體DNA是包裝於替代血清型的衣殼中)進行大部分研究，很明顯，牛物學差異與衣殼而非基因組有關。近來有證據表明，包裝於AAV1衣殼中的DNA表達盒在轉導心肌細胞方面比包裝於AAV2衣殼中的DNA表達盒有效至少1log!o倍。腺病毒載體遞送多聚核苷酸以用於基因療法的另一種方法涉及使用腺病毒表達載體。"腺病毒表達載體"打算包括含有足以(a)支持構築體的包裝和/或(b)最終表込其中已克降的組織和/或細胞特異性構築體的腺病毒序列的構築體。在本發明的一個形式中，表達載體包含經基因丄程改造的腺病毒形式。關於腺病毒遺傳構成(一種36kb的線性雙鏈DNA病毒)的知識允許利用至多7kb的外來序列取代大段腺病毒DNA(格倫豪斯(Grunhaus)和霍維茲(Horwitz)，病毒學研究文輯(SeminarinVirology),1992;3:237-252)。與逆轉錄病毒相比，腺病毒感染宿主細胞不會引起染色18體整合，因為腺病毒DNA可以附加體方式複製而無潛在的遺傳毒性。另外，腺病毒結構穩定，並且在廣泛擴增後，不會檢測到基因組重排。腺病毒生長和操縱為所屬領域技術人員所知，R其在活體外和活體內展現較寬的宿主範圍。這一組病毒可以例如每毫升109到10"個空斑形成單位的高滴度獲得，且其具有高感染性。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主細胞基因組中。由腺病毒載體遞送的外來基因為附加體且因此對宿主細胞具有低遺傳毒性。在利用野生型腺病毒的接種研究中尚無有關副作用的報導，表明其作為活體內基因轉移載體的安全性和/或治療潛力。己將腺病毒載體用於真核基因表達和疫苗研發中。近來，動物研究表明，可將重組腺病毒用於基因療法中(例如參看，斯特拉特福德-皮爾卡迪特(Stratford-Perricaudet)等人，人類基因療法(Hum.Gene.Ther.)，1991;1:242-256;瑞奇.(Rich)等人，1993)。關於將重組腺病毐投與不同組織的研究包括肌肉注射、周圍靜脈內注射和腦立體定向接種(stereotacticinoculation)。重組腺病毒和腺相關病毐可感染和轉導非分裂人類原代細胞。儘管涵蓋使用腺病毒載體，但在心血管基因療法試驗中的此種使用通常受短期轉基因表達限制(瓦薩利G(VassalliG)等人，國際心臟病學雜誌(Int.J.Cardiol.)，2003;90(2-3):229-38)。這歸肉於針對腺病毒抗原的細胞免疫性。改進的"無"腺病毒載體具有降低的免疫原性，但即使治療作用需要或必需持續超過六個月的最大轉基「天1表達，其仍然無效(吉爾伯特R(GilbertR)等人，人類分子遺傳學(Hum.Mol.Genet.)，2003;12(11):1287-99)。AAV載體己展現長期表達(>l年)且為其中需要長期表達的治療作用的優選載體(達利TM(DalyTM)等人，基因療法(GeneTher.),2001;8(17):1291-8)。逆轉錄病毒載體由於逆轉錄病毒能將其基因整合到宿主基因組中，從而轉移大量外來遺傳物質，感染廣譜物種和細胞類型且包裝於特定細胞系中，故可將其選作基I大J遞送載體。逆轉錄病毒基因組含有三種基因gag、pol和env，其分別編碼衣殼蛋O、聚合酶和包膜組分。見於gag基因上遊的序列含有將基因組包裝於病毒體中的信號。在病毒基因組的5'和3'端存在兩個長末端重複(LTR)序列。這些序列含有強啟動子和增強子序列且也是整合到宿主細胞基因組中所必需的。為構築逆轉錄病毒載體，將編碼所關注基因的核酸插入病毒基因組中某些病毒序列的位置處，以產生複製缺陷型病毒。為產生病毒體，將構築含有gag、pol禾卩/或env基因但無LTR和/或包裝組分的包裝細胞系。當將含有cDNA連同逆轉錄病毒LTR和包裝序列的重組質粒引入所述細胞系(通過例如磷酸鈣沉澱)中時，包裝序列使得重組質粒的RNA轉錄物包裝T病毒粒子中，病毒粒子隨後分泌到培養基中。接著收集含有重組逆轉錄病毒的培養基，任選濃縮且將其用於基因轉移。逆轉錄病毒載體能感染多種細胞類型。然而，整合和穩定表達需要宿主細胞分裂。皰疹病毒由於單純皰疹病毒(HSV)為嗜神經性的，故其在治療神經系統病症方面引起極大關注。此外，HSV能在不整合到宿主細胞染色體中或以其它方式改變宿主細胞的代謝的情況下潛在感染非分裂神經元細胞，並且由於存在f潛伏期具活性的啟動T，而使得HSV成為引人關注的載體。丘儘管較多注意力集中在HSV的嗜神經應用，但已知其a有廣泛宿主範圍，故還可開發用於其它組織的此種載體。使HSV成為引人關注的載體的另一因素在於基因組的大小和構成。由於HSV極大，故相比其它較小病毒系統，併入多個基因或表達盒不成問題。此外，具有不同性能(瞬時性、強度等)的不同病毐控制序列的口J用性使其可能以比其它系統高的程度控制表達。病毒具有相對較少的剪接信息也極為有益，這使得基因操縱更容易。HSV還相對易於操縱並且能生長達到較高滴度。因此，就得到足夠感染複數(MOI)所必需的休積和減少重複給藥的需求來說，遞送不是問題。關十HSV作為基因療法載體的綜述，參養格洛裡厄斯(Glorioso)等人，微生物學年度評述(Annu.Rev.Microbiol.),1995;49:675-710。己開發出HSV的無毒變異體且其可容易地用十基肉療法情形屮(美國專利第5,672,344號)。、慢病毒載休慢病毒為複雜的逆轉錄病毒，其除含有常見逆轉錄病毒基因gap、pol和env外，還含有具有調控或結構功能的其它基因。較卨複雜性使得此種病毒能例如隨著潛伏感染的過程調節其牛活周期。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。G通過倍增地減少HIV的毒力基因來產生慢病毒載體，舉例來說，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef會使載體在生物學上安全。慢病毒載體己為所屬領域中己知，參看美國專利第6，013，516號和第5,994,136號。一般來說，載體為基於質粒或基於病毒的，且其經配置以攜帶用於併入外來核酸、選擇和將核酸轉移到宿主細胞中的必需序列。所關注載體的gag、pol和env基因也為所屬領域中所知。因此，將相關基因克隆到所選載體中且隨後用於轉化所關注的靶細胞。美國專利第5,994,136號中描述能感染非分裂細胞的重組慢病毒，其中用兩個或兩個以上攜帶包裝功能(即，gag、pol和env以及rev和tat)的載體轉染適當宿主細胞。其描述能提供編碼病毒gag和pol基因的核酸的第一載體，以及能提供編碼病毒env的核酸從而產生包裝細胞的另一載體。將提供異種基因的載體引入所述包裝細胞中，得到釋放攜帶所關注的外來基因的感染性病毒粒子的生產細胞。env優選為允許轉導人類和其它物種細胞的兼嗜性包膜蛋白。牛痘病毒載體由於牛痘病毒載體易f構築、能獲得相對較高的表達量、具有較寬的宿主範圍和較大的載運DNA的能力，故己廣泛使用牛痘病毒載體。牛痘含有約186kb的線性雙鏈DNA基因組，其展現明顯的"A-T"偏好。所述基因組側接有約10.5kb的反向末端重複。大部分必需基因似乎定位於在痘病毒中最高度保守的中心區內。預計牛痘病毒中的開放式閱讀框編S為150到200。儘管兩條鏈都為編碼序列，但閱讀框的大量重疊並不常見。可將至少25kb插入牛痘病毒基因組中。原型牛痘載體含有經由同源重組插入病毒胸苷激酶基因中的轉基因。載體是根據tk表型選擇。包括腦心肌炎病毒的未翻譯前導序列會產生高於常規載體的表達量，其中這些轉基因在24小時內累積達到受感染細胞的蛋白質的10%或更多。多瘤病毒載體作為基因轉移的可能載體，諸如小鼠多瘤病毒等乳多空病毒的空衣殼已引起廣泛關注。空多瘤病毒的使州最初是在將多瘤病毒DNA和經純化空衣殼培f於無細胞系統中吋描述。保護新粒f的DNA免f受胰腺脫氧核糖核苷酸酶的作用。使用重新構成的粒子將轉化多瘤病毒DNA片段轉移到大鼠Fill細胞中。空衣殼和重新構成的粒子是由所有三種多瘤病毒衣殼抗原VP1、VP2和VP3組成。美國專利第6,046,173號揭示使用由乳多空病毒的主要衣殼抗原形成且排除次要衣殼抗原的假衣殼，其併入外源物質以供基因轉移。其它病毒載體其它病毒載體可以表達構築體形式用於本發明中，諸如由諸如辛德畢斯病毒(sindbisvmis)或巨細胞病毒等病毒衍生的載體。其向各種哺乳動物細胞提供若干引人關注的特徵(例如參看弗雷德曼(Friedmann)，科學(Science),1989;244:1275-1281;霍維奇(Horwich)等人，病毒學雜誌(J.Virol.)，1990;64:642-650)。通過識別缺陷型B型肝炎病毒，新發現不同病毒序列的結構-功能關係。活體外研究表明，病毒可保持輔助病毒依賴件包裝以及即使其基因組缺失多込80%也能逆轉錄的能力(霍維奇(Horwich)等人，病毒學雜誌(J.Virol.)，64:642-650(1990))。這表明可用外來遺傳物質置換大部分基因組。張(Chang)等人將氯黴素乙醯基轉移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)基因引入鴨R型肝炎病毒基因組中聚合酶、表面和/或前表面編碼序列的位置處。將其與野生型病毒共轉染到禽類肝癌細胞系中。使用含有高滴度重組病毒的培養基感染原代鴨肝細胞。在轉染後檢測穩定CAT基因表達至少24天(張(Chang)等人，肝臟病學(Hepatology)14:134A(1991))。經修飾病毒在木發明的其它實施例中，將待遞送的核酸放入經工程改造以表達特異性結合配體的感染性病毒內。因此病毒粒子將特異性結合到耙細胞的同源受體且將內容物遞送到細胞中。根據通過將乳糖殘基化學添加到病毒包膜中來化學修飾逆轉錄病毒，研發出經設計以允許逆轉錄病毒載體的特異性耙向的新穎方法。這種修飾可容許經由唾液酸糖蛋白受體特異性感染肝細胞。設計靶向重組逆轉錄病毒的另一方法，其中使用針對逆轉錄病毒包膜蛋白或針對特異細胞受體的生物素化抗體。通過使用抗生蛋白鏈菌素經由生物素組分偶合抗體。使用針對主要組織相容性複合物I類和/或II類抗原的抗體，其展現在活體外利用同向性病毒感染具冇那些表面抗原的多種人類細胞。非病毒轉移通常將本發明的DNA構築體遞送到細胞屮。然而，在某些實施例中，待轉移的核酸為非感染性的，並且可使lti非病毒方法轉移。本發明涵蓋用於將表達構築體轉移到經培養哺乳動物細胞屮的若干非病毒方法。用於本發明中的供核酸遞送的適:4方法包括如本文所述或如將為所屬領域技術人員所知的方法。所述方法包括(但不限於)經由脈管系統直接遞送"裸"DNA質粒(美國專利第6,867,1%號)；通過脂質體介導的轉染(尼克勞(Nicolau)和辛尼(Sene)，1982;弗拉雷(Fraley)等人，1979;尼克勞(Nicoiau)等人，1987;王(Wong)等人，1980;卡尼達(Kaneda)等人，1989;卡託(Kato)等人，1991)和受體介導的轉染(吳(Wu)和伍(Wu)，1987;吳(Wu)和伍(Wu)，1988);通過利用碳化矽纖維攪動(卡普勒(Kaeppler)等人，1990;美國專利第5,302,523號和第5，464，765號)；使用陽離子脂質；裸DNA;或通過微囊化DNA(美國專利申請案第2005/0037085號)。經由應用諸如這些技術等技術，可穩定或瞬時轉化靶細胞或組織。在將構築體遞送到細胞中之後，可於不同位點定位和表達編碼治療基因的核酸。在某些實施例中，可將編碼治療基因的核酸穩定整合到細胞基因組中。此整合可經由同源重組(基因置換)而處在同源位置和定向，或可將其整合到隨機、非特異性位置(基因增補)。在其它實施例中，可將核酸作為DNA的個別附加體區段穩定保持於細胞中。所述核酸區段或"附加體"編碼足以容許不依賴於宿主細胞周期或與宿主細胞周期同步的維持和複製的序列。如何將表達構築體遞送到細胞中以及將核酸保持丁-細胞中何處都取決T所使用的表達構築體的類型。在本發明的特定實施例中，可將表達構築體截留於脂質體中。脂質體為以磷脂雙層膜和內層水性介質為特徵的胞囊狀結構。多^脂質體具有多個由水性介質分隔的脂質JS。其是在將磷脂懸浮於過量水溶液中時t]發形成。脂質組分在形成封閉結構之甜經歷D身重排，且將水和溶解的溶質截留於脂質雙JzJ之間。將DNA添加到陽離子脂質體引起從脂質體到光學雙折射液晶凝集小球的拓撲學轉變。這些DNA-脂質複合物為用於基因療法中的潛在非病毒載體。脂質體介導的核酸遞送和活體外外來DNA的表達極為成功。使用P-內醯胺酶基因，研究人員證實脂質體介導的遞送和經培養雞胚胎細胞、海拉細胞和肝癌細胞中外來DNA的表達的。/行性。也已實現在靜脈內注射後大鼠中成功的脂質體介導的基因轉移。還包括涉及"脂轉染(lipofection)"技術的各種商業方法。在本發明的某些實施例中，PJ"將脂質休與血凝病毒fhemagglutinatmgvirus,HVJ)複合。已證實，這將冇利f"M細胞膜的融合併促進脂質休封裝的DNA的細胞進入。在其它實施例屮，可將脂質體與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)複合或與其'起使用。在其它實施例屮，可將脂質體與HVJ和HMG-1複合或與其'起使用。由於已成功地將所述表達構築體用-f活體外和活體內核酸的轉移和表達，故其適用f本發明。可用於將編碼治療基岡的核酸遞送到細胞中的其它載體遞送系統為受體介導的遞送媒介物。其利用受體介導的胞吞作用將大分子選擇性攝取到幾乎所有真核細胞中。由於各種受體的細胞類型特異性分布，故所述遞送可為高度特異性的(吳(Wu)和伍(Wu)，1993)。3使用脂質體時，可使用用於耙向和/或有助於攝取的結合到與胞吞作用有關的細胞表面膜蛋tl的其它蛋t]質，例如對特定細胞類型具嗜性的衣殼蛋白或其片段、在周期中經歷內化的蛋Cl質的抗體以及靶向細胞內定位並增強細胞內半衰期的蛋G質。受體介導的基因靶向媒介物通常是由兩種組分組成細胞受體特異性配體和DNA結合劑。巳將若干配體用於受體介導的基因轉移。最詳盡表徵的配體為脫唾液酸血清類粘蛋A(asialoorosomucoid,ASOR)和轉移配體(transferring)(fc格納(Wagner)等人，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)87(9):3410-14(1990))。已將與ASOR識別相同受體的合成擬糖蛋A用作基因遞送媒介物。還曾使用表皮生長因子(EGF)將基因遞送到鱗狀癌細胞。在其它實施例中，遞送媒介物可包含配體和脂質體。舉例來說，研究人員已使用併入脂質體中的乳糖基醯基神經醯胺(即，半乳糖封端神經節苷脂)目.觀察到肝細胞對胰23島素基因的攝取增加。因此，通過含有或不含脂質體的多種受體-配體系統將編碼治療基因的核酸特異性地遞送到諸如心臟細胞等細胞類型中也是可行的。在本發明的另一實施例中，表達構築體可簡單地由裸重組DNA或質粒組成。可通過上文所提及的以物理或化學方式穿透細胞膜的方法中的任一種執行構築體的轉移。這尤其適用於活體外轉移，但其也應用於活體內使用。預期也可在活體內以類似方式轉移治療性DNA。伍爾夫(Wolff)等人(美同專利第6,867,196號)教示，可通過將質粒DNA溶液注射到心臟靜脈或動脈中獲得到心臟組織中的有效基因轉移。伍爾夫還教示RNA、非質粒DNA和病毒載體的投與。適用於本發明中的載體具有不同轉導效率。因此，病毒或非病毒載體轉導大於、等於或至少約10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%的靶脈管區域的細胞。Bj同時或依次使用一種以上載體(病毒或非病毐載體，或其組合)。這可用於轉移一種以上多聚核苷酸和/或靶向一種以上細胞類型。當使用多種載休或多種試劑時，W引起一種以上轉導/轉染效率。治療物質利川適州十本發明屮的包括多聚核苷酸的治疔'物質治&心血管疾病。這些物質包括己知可治療心血管疾病的任何方面的化合物。多聚核苷酸可靶向心血管系統的任何已知核酸或蛋白質，從而導致調節心臟組織的細胞活性。特別值得關注的為心肌收縮所必需的核酸和蛋白質，包括調控心肌中的鈣濃度的核酸和蛋白質。每次肌肉收縮都需要Ca"進入肌細胞細胞質中，而鬆弛則需要去除活性Ca2、這使得收縮的C^+調控成為人體中最廣泛的活性之一。因此，涉及Ca"調控的蛋白質3突變時會引起多種5Ca2+調控缺陷有關的骨骼肌和心肌疾病也在意料之中。肌質網鈣三磷酸腺苷酶(SERCA)將鈣從哺乳動物細胞的細胞質泵送到諸如肌肉中的肌質網或非肌肉細胞中的內質網等細胞器結構中。其鈣活化的臨界值為約100-200nM，由此其設置胞質鈣的靜止含量(restinglevel)。異常鈣循環(實驗和人類心力衰竭的特徵)與肌質網鈣攝取活性的削弱有關。心臟/慢收縮同工型SERCA2a與受磷蛋fH(PLN)(-—種由三個結構域構成的52個胺基酸的均五聚體蛋A質)結合且受其調控。在肌肉收縮期間，受磷蛋閂抑制Ca"泵。在肌肉鬆弛期間，其可經磷酸化，此解除抑制並允許將Ca^再泵回肌質網中。認為所述調控主要是由受磷蛋A單體與所述泵之間的物理相互作用引起。然而，具有52個殘基的肽還締合成五聚體，經證實，所述五聚體對Ca"離子具選擇性。肌質網鈣攝取活性減弱反映cAMP路徑信號轉導的減少以及1型磷酸酶活性的增加。蛋白磷酸酶1活性的增加部分歸因於脫磷酸作用和其抑制劑-1的失活，這促進受磷蛋白的脫磷酸作用以及肌質M鈣泵的抑制。實際上，組成性活性抑制劑-1的心臟特異性表達引起受磷蛋白磷酸化作用的選擇性增強以及在細胞和整個動物水平上心臟收縮性的增大。值得注意的是，活性抑制劑-1的急性腺病毒基因遞送完全恢復功能，並R在預先存在心力衰竭的情況卜-，部分地逆轉重構，包括過度活化的p38的止常化(帕薩科(Pathak)等人，循環研究雜誌(CircRes.)，2005;96(7):756-66)。室性心律失常可引起具有正常心臟的患者以及患有諸如心力衰竭等潛在疾病的患者的心臟性猝死(SCD)。在患有心力衰竭的動物和忠有遺傳形式的運動誘髮型SCD的忠者中，雷諾;i受體-朽釋放通道(ryanodinereceptor-calciumreleasechannel)(RyR2)複合物中通道穩定蛋白穩鈣蛋白2(calstabin2)(FKBP12.6)的耗盡引起能觸發致死性心律失常的細胞內Ca"滲漏。穩鈣蛋白2的含量增加會使RyR2的關閉狀態穩定且防lh觸發心律失常的Ca"滲漏。因此，將增強穩鈣蛋白2與RyR2的結合視為常見室性心律失常的治療策略。SERCA的核酸和蛋白質、受磷蛋白、1型磷酸酶抑制劑-1、S100A1和肌脂蛋白以及對Ca"起作用的相關核酸和蛋白質都為本發明的多聚核苷酸的優選標靶。優選的病毒載體和轉基i天l為AAV2/l/SERCA2a，其包含AAV血清型1病毒衣殼，所述病毒衣殼封裝含有人類SERCA2a表達盒且側接得自AAV血清型2的ITR的竿.鏈4486個核苷酸的DNA。二十面體衣殼是由三個相關AAV血清型1衣殼蚩白VP1、VP2和VP3組成。AAV2/l/SERCA2aDNA含有以下組分在3'和5'端的基於AAV血清型2的ITR，其側接CMV-hSERCA2a-polyA表達盒。所述表達盒含有驅動序列轉錄的巨細胞病毒即刻早期增強子/啟動子(CMVie)，包括來自市售質粒pCI(普洛麥格(Promega)-基因庫(GenBank)U47119)的雜交內含子；hSERCA2AcDNA(與基因庫NM-001681相同的編碼序列)；和牛生L(激素多聚腺苷酸化信號[BGHpA，(基因庫M57764)]。使用來自人類b-球蛋O第一內含子的5'-供體位點和來自位於免疫球蛋白基因重鏈可變區的前導序列與主體之間的內含子的3'-受體位點設計雜交內含子(參看圖1)。AAV2/l/SERCA2a載體將野生型AAV(wtAAV)序列的不到300個核苷酸併入載體基因組中。wtAAV序列為源自AAV血清型2的ITR，其以順讀方式提供允許將SERCA2aDNA插入衣殼中的包裝信號(圖2)。在不受特定作用機制束縛的情況下，相信CHF患者的心肌細胞中的SERCA2a蛋白質含量降低，並R心肌細胞中此種蛋白質含量的增加將使CHF的細胞內鈣特性的異常高的心舒張含量正常化並改進臨床結果。如上文所論述，包括多聚核苷酸、多聚核苷酸與病毒和非病毒載體的組合在內的治療劑可用T製備供治療心血管疾病的藥劑，其中所述藥劑是通過直接輸注到冠狀循環中來投與。治療作用在優選實施例中，使用木文所揭示的治療劑的輸注來實現對於罹患心臟病的患者的治療作用。可監測經治療個體的伴隨心臟病症的臨床特徵。舉例來說，可監測個體的與心血管疾病相關的不利病徵和症狀的減少。舉例來說，在使用木發明的方法治療個體的充血性心力衰竭後，nj針對多個臨床參數的改進來評估個體，所述臨床參數包括(但不限於)側心室節段縮短的增加、在細胞和整個動物水平上心臟收縮性的增大、心臟重構逆轉和細胞內鈣的異常高的心舒張含量的正常化。利用本發明治療的個體中可監測的其它臨床特徵包括(不限f)存活期；心臟代謝；心臟收縮性；心率；心室功能(例如，左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)):Ca"代謝(例如，細胞內Ca"農度、峰值或靜止[Ca"]、SRCa"二磷酸腺苷酶活性、受磷蛋白的磷酸化狀態)；心臟的力產生、鬆弛和壓力；力-頻率關係；心肌細胞存活或凋亡或者離子通道活性(例如，鈉鈣交換、鈉通道活性、鈣通道活性、鈉鉀三磷酸腺苷酶泵活性)；肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2或肌球蛋白輕鏈3、IGF-1受體、PI3激酶、AKT激酶、鈉-鈣交換蚩白、鈣通道(L和T)、肌集鈣蛋白或鈣網蛋白的活性。可在治療之前、之後或期問執行評估。可監測的其它心臟病量度包括節段縮短、心輸出量、射血分數、t、反流體積、住院時問、牛活質量和踏車時間。所揭示的方法和本文所揭示的治療劑可與針對心臟病的諸如藥物或手術千預等現有治療組合，從而提供與單獨現有治療相比有所增強的治療作用。可例如通過與現有治療方案的平均或典型時間段相比，疾病病徵或症狀惡化之間時間段的延K:;或與單獨標準治療的平均或典型時間相比，需要額外治療之前所需的時間變L〈，來證實治療作用的增強。現將在以下非限制性實例中進一步描述本發明的實施例。實例1:輸注時間對正常小種豬體內AAV2/l/SERCA2a的短期生物分布的影響進行研究以通過量化在正常小種豬體內進行AAV2/1/SERCA2a的順行性心外膜冠狀動脈輸注後的載體特異性DNA來評估心肌的轉導。組群本研究的對照組(1隻動物)為未治療對照組。這隻動物經歷除投與AAV2/1/SERCA2a外與其它組相同的所有程序。使用程序控制注射泵經由冠狀動脈輸注導管輸注到左冠狀動脈中(第3-5組5隻動物)或者經由直接肌肉內(IM)注射(第2組1隻動物)來對實驗動物投與1x1012個DRPAAV2/l/SERCA2a。使各組以兩種載體濃度和不同輸注速率接收AAV2/l/SERCA2a。投與載體後，接收載體的所有組接收管和導管的死容積的僅血液衝洗。動物為至少四個月大的重量在8-12kg之間的哥廷根小種豬(GottingenMinipig)。如表1中所示，將動物分配到五個組中的一個中。表l:組指派tableseeoriginaldocumentpage27麻醉/血液樣本第o天時，使用標準程序使動物麻醉。將抗生素預防性地投與後腿肌肉中。監測生命指徵(心率、呼吸率和02脈搏血氧計)。獲得ECG以用於監測目的。投與AAV2/l/SERCA2a直接肌肉內注射投與AAV2/l/SERCA2a:第2組第0天時，使用標準肌肉內注射器和針將AAV2/1/SERCA2a注射到後方肌肉象限中。所投與的休積和濃度提供於下表2中。'將AAV2/l/SERCA2a冷凍儲存於-70±IO'C或以下待用。使用當天，在室溫下將AAV2/l/SERCA2a解凍且保存於冰上直到準備對動物給藥。通過倒轉小心混合後，將0.72mL每毫升1.4x1012個DRP的AAV2/l/SERCA2a儲備溶液在無菌條件下轉移到標準肌肉內注射器和針中。隨後，將1x1012個DRPAAV2/l/SERCA2a的總劑量的單次投藥經肌肉內注射到後方肌肉象限中。通用程序通過順行性心外膜冠狀動脈輸注投與AAV2/l/SERCA2a(第3-5組)直接輸注系統是由包括常規導引套管、0.014"導線、5F輸注(導引)導管以及兩個程序控制注射泵在內的標準(市售)組件構成。本方法的一個重要方面在於載體投勺所用的輸注時間。確切體積可根據起始載體濃度、管和導管單元的死容積等而變化。第O天時，直接輸注程序是以使用股動脈法引入導引套管開始。隨後，在螢光鏡指導下，將冠狀動脈輸注導管(例如，柯蒂斯公司維斯塔布賴特提普(CordisVistaBriteTip)導引導管或適用丁-左冠狀動脈主幹插入導管的類似模型)放入左冠狀動脈主幹中。當導管處.r適當位置後，使用標準裝管和清洗技術將其與第一程序控制注射泵(例如，NE-1000程序控制注射泵，新時代泵系統(NewEraPumpSystems))連接。隨後遞送AAV2/l/SERCA2a，接著利用第二程序控制注射泵僅用血液衝洗導管死容積。宵.接輸注方法的所需材料和程序步驟的詳細列表提供於表3和4中。稀釋液體積、輸注時間、輸注速率、僅血液衝洗甜所遞送的體積和完成僅血液衝洗所需的時間都提供於表2中。第3組投與(推注)AAV2/l/SERCA2a通過倒轉小心混合後，將0.72mL每毫升1.4x10|2個DRP的AAV2/l/SERCA2a儲備溶液和1.3mL調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES禾B1mMMgCl2，pH7.4)在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯容器中，產生每毫升5.0xIO"個DRP的濃度。在即將對動物給藥之前，使2.0mL稀AAV2/l/SERCA2a(5x10"個DRP/mL)達到室溫，且將其與1.0mL來自經給藥動物的原生全血混合，從而產生注射器中最終體積為3.0mL的3.3xIO"個DRP/mL的最終稀釋液。將線路用血液填裝且隨後歷經0.5分鐘時間將載體注射到左冠狀動脈主T中。之後僅用血液衝洗導管死容積。第4組投與UO分鐘載休輸注)AAV2/l/SERCA2a通過倒轉小心混合後，將0.72mL每毫升1.4x10'2個DRP的AAV2/l/SERCA2a儲備溶液和7.3mL調配緩衝液在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯容器屮，產生每毫升1.25x1U個DRP的濃度。在對動物給藥之前，使8.0mL稀AAV2/l/SERCA2a(1.25x1011個DRP/mL)達到室溫且將其勺4.0mL米自經給藥動物的原生全血混合。將輸注線路用血液填裝，且隨後使用程序控制注射泵歷經10分鐘時間將載體遞送到左冠狀動脈主幹中，隨後利用第二程序控制注射泵僅用血液衝洗導管死容積。第5組投與(15分鐘載體輸注)AAV2/l/SERCA2a通過倒轉小心混合後，將0.72mL每毫升1.4x1012個DRP的AAV2/l/SERCA2a儲備溶液和1.3mL調配緩衝液在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯容器中，產生每毫升5.0xIO"個DRP的濃度。在即將對動物給藥之前，使2.0mL稀AAV2/l/SERCA2a(5x1011個DRP/mL)達到室溫且將其與l.OmL來自經給藥動物的原生全血混合。將輸注線路用血液填裝，且隨後使用程序控制注射泵歷經15分鐘時間將載體遞送到左冠狀動脈主幹中，隨後利用第二程序控制注射泵僅用血液衝洗導管死容積。表2:稀釋/投藥方案治療組總劑量經稀釋血液經投與的載體輸輸注速率僅血液28tableseeoriginaldocumentpage29表3:直接輸注方法的材料tableseeoriginaldocumentpage29表4:直接輸注方法的程序步驟tableseeoriginaldocumentpage2916再啟動第二注射泵(以用於遞送AAV2/l/SERCA2a的相同流速)且輸注血液。17在完成導管死容積衝洗後，使注射泵停機。18將止血閥上的接頭轉向關閉位置且斷開管。19遵循標準程序移開導引導管(輸注)20遵循慣用程序處理管和注射器。第2天終末期處死和PCR組織樣本在投與麻醉劑後，收集血液樣本以用於臨床化學。隨後對動物通過靜脈內投與30mg/kg氯化鉀實施安樂死，且使用標準技術，從如圖3中所說明的心臟的以下區域收集PCR組織樣本左心室底層和中間層中的前壁、後壁、隔膜和游離壁；左心室頂層中的前壁和後壁以及右心室底層和頂層的游離壁。樣本的PCR分析使用定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢定檢測和量化所收集的組織樣本中的AAV2/l/SERCA2a。qPCR檢定使用ABIPrism7700序列檢測系統檢測AAV2/l/SERCA2a特有的107個鹼基對的序列。如圖4圖示中所述，qPCR引物跨越外顯子14和15。使用含有靶序列的質粒(pcDNA3.1—huSERCA2)的連續稀釋液作為標準物，量化從各組織樣木中提取的1微克基因組DNA中檢測到的AAV2/l/SERCA2a拷貝的數量。所述檢定的檢測下限為每微克DNA20個AAV2/l/SERCA2a拷貝量化的下限為每微克DNA200個拷貝。結果實驗結果描述於圖5中，其中報導每微克DNAAAV2/l/SERCA2a的拷貝數，以及推注後(30秒，第3組)所獲得的以含量百分比表示的相對量。對於各動物，將來自12個不同心臟樣本(圖3)的值平均為單一值，且報導每隻動物的值。IO分鐘的輸注時間產生比推注(0.5分鐘)多平均51.6%的拷貝數(32%-69%)，且15分鐘的輸注時間產生比推注多76%的拷貝數。申請者注意到，儘管直接肌肉內注射產生相當大的拷貝數，但這是第二天處死且網內皮系統(申.核細胞/巨噬細胞)正在清除AAV載體的動物的結果(布萊恩J.D.(BrainJ.D.)等人，美國生理學雜誌肺細胞和分子生理學(AmJPhysiol.LungCellMol.Physiol.)，1999;276:146-154)。AAV1載體的肌肉內注射不會引起心臟的有效長期轉導(瑞普J(RipJ)等人，人類基因療法(Hum.GeneTher.)，2005;16(11):1276-86)。相比之下，順行性心外膜冠狀動脈輸注引起如實例3中所展現的穩定的組織轉導。這些結果表明，即使每組投^相問量的AAV2/l/SERCA2a(1x1012個DRP)，延t(輸注時間也會產牛每微克DNA較多的AAV2/l/SERCA2a拷貝數。實例2:載體劑量和投藥途徑對綿羊體內AAV2/l/SERCA2a的短期生物分布的影響在正常綿羊中進行試驗性研究，以評估與靜脈內注射相比，在經由輸注到左冠狀動脈中進行單次投藥後2天時三種不同劑量的AAV2/l/SERCA2a的短期生物分布。組群使1隻動物接收使用程序控制注射泵通過冠狀動脈內導管輸注到左冠狀動脈中的1x1013個AAV2/l/SERCA2aDRP。第2組3隻動物接收3x1012個AAV2/l/SERCA2aDRP，且第3組2隻動物接收1x1012個AAV2/l/SERCA2aDRP，所有物質都是使用程序控制注射泵通過冠狀動脈內導管輸注到左冠狀動脈中。所有輸注組都歷經8分鐘以2.5mL/min的恆定流速接收AAV2/l/SERCA2a，隨後進行持續2分鐘的導管容積的僅血液衝洗。對對照組的單一動物投與2mL靜脈內注射液中的1x1012個DRPAAV2/l/SERCA2a。各組都展現於下表5中且投藥時程展現於表6中。表5:組指派tableseeoriginaldocumentpage31表6:稀釋/投藥方案tableseeoriginaldocumentpage31投與AAV2/l/SERCA2a通用程序通過順行性心外膜冠狀動脈輸注投與AAV2/l/SERCA2a(第l-3組)第0天時，對所有動物投與全劑量的肝素以獲得大於300的ACT。使用程序控制注射泵，使用冠狀動脈輸注導管將AAV2/l/SERCA2a輸注到冠狀動脈中。用丁-植入導管的材料和程序詳細描述於上文實例1以及表3和4中。遵循基本上相同的程序。第1組投與(8分鐘載體輸注)1.0x1013個AAV2/l/SERCA2a在通過倒轉小心混合後，將AAV2/l/SERCA2a儲備溶液在無菌條件f轉移到無菌聚丙烯管中，且用調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES禾卩1mMMgCl2，pH7.4)稀釋到10mL的總體積，產生1x10|2個DRP/mL的濃度。在即將對動物給藥之甜，使10mL稀AAV2/l/SERCA2a(1x1012個DRP/mL)達到室溫且將其與10mL來自經給藥動物的原生全血混合，從而產生20.0mL的最終體積。將輸注線路用血液填裝，且隨後使用程序控制注射泵歷經8分鐘時間以2.5mL/min的恆定流速將載體遞送到左冠狀動脈主十中，隨後利用第程序控制注射泵僅用血液衝洗導管死容積。第2組投與(8分鐘載休輸注)3.0x10'2個AAV2/l/SERCA2a在通過倒轉小心混合後，將AAV2/l/SERCA2a儲備溶液在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯管中，且用調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES和1mMMgCl2，pH7.4)稀釋到10mL的總休積，產生3x1011個DRP/mL的濃度。在即將對動物給藥之前，使10mL稀AAV2/l/SERCA2a(3x10"個DRP/mL)達到室溫且將其與10mL來自經給藥動物的原生全血混合，從向'產生20.0mL的最終體積。將輸注線路用血液填裝，且隨後使用程序控制注射泵歷經8分鐘時間以2.5mL/min的恆定流速將載體遞送到左冠狀動脈主幹中，隨後利用第二程序控制注射泵僅用血液衝洗導管死容積。第3組投卜j(8分鐘載體輸注)1.0x1012個AAV2/l/SERCA2a在通過倒轉小心混合後，將AAV2/l/SERCA2a儲備溶液在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯管中，且用調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES禾B1mMMgCl2，pH7.4)稀釋到10mL的總體積，產生1x1011個DRP/mL的濃度。在即將對動物給藥之前，使10mL稀AAV2/l/SERCA2a(1x1011個DRP/mL)達到室溫，且將其與10mL來自經給藥動物的原生全血混合，從而產生注射器中最終體積為20.0mL的0.5x1011個DRP/mL的最終稀釋液。將輸注線路用血液填裝，且隨後使用程序控制注射泵歷經8分鐘時間以2.5mL/min的恆定流速將載體遞送到左冠狀動脈主幹中，隨後利用第二程序控制注射泵僅用血液衝洗導管死容積。第4組投與(靜脈內注射)1.0x1012個AAV2/l/SERCA2a在通過倒轉小心混合後，將AAV2/l/SERCA2a儲備溶液在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯管中，冃-用調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES禾[]1mMMgCl2，pH7.4)32稀釋到2.0mL的總體積，產生1x1012個DRP/mL的濃度。使用標準靜脈內注射器和針通過靜脈內注射(約0.5分鐘)投與所述溶液。第2天終末期處死和PCR組織樣本在投與麻醉劑後，通過靜脈內投與30mg/kg氯化鉀對動物實施安樂死，目.使用標準技術收集PCR組織樣本。從心臟的以下區域中收集樣本左心室前壁、左心室內壁、室間隔膜和右心室游離壁。樣本的PCR分析使用實例1中所述的定量PCR檢止檢測和量化所收集的組織樣本中的AAV2/l/SERCA2a。結果實驗結果描述於圖6中，其中對於各動物，報導各心臟組織樣本中每微克DNA的AAV2/l/SERCA2a的拷貝數。與產生極低的不nj量化含量(20-200個拷貝)的AAV2/l/SERCA2a的靜脈內注射(約0.5分鐘)不同，8分鐘的輸注時間在1x1012、3x1012和1x1013濃度下產生相當大的拷貝數。圖6表明，1x1013個DRP的總劑量產生比3x1012個DRP的總劑量多的拷貝數，向3x10"個DRP的總劑量又產生比1x1012個DRP的總劑量多的拷貝數。重要的是，即使只將載體投與左冠狀動脈，也在右心室樣本'l'發現AAV2/l/SERCA2a拷貝。實例3:心力袞竭的豬二尖瓣關閉不全模型在由嚴重二尖瓣關閉不全(MR)所引起的心力哀竭的豬模型中進行試驗性研究以評估與媒劑對照相比，單次投與AAV2/l/SERCA2a對心臟功能的影響。二尖瓣關閉不全(MR)也稱為二尖瓣閉鎖不全(mitralinsufficiency),其為血.液從心臟的左心室通過二尖瓣異常地滲漏進入左心房。反流體積(MR嚴重性的量度)為反流回左心房中的血液的體積。組群將3個月人且重量介於30-40kg之間的約克夏-A德瑞斯豬(Yorkshire-Landraceswine)用f本研究中。使具有4隻動物的實驗組接收使用哈佛臨床技術(HarvardClinicalTechnology,HCT)輸注泵通過冠狀動脈內導管輸注到左冠狀動脈中的1x1012個AAV2/l/SERCA2aDRP。以2.5mL/min的恆定流速歷經8分鐘時間遞送AAV2/l/SERCA2a。在完成輸注後，從連接導引導管末端和泵的管中抽出剩餘溶液。隨後歷經約2分鐘的時間手丄輸注此剩餘溶液，隨後用lOmL生理鹽水緩慢手丄衝洗。對照組為5隻動物，其接收通過宵.接輸注(DI)或通過V-福克斯裝置(V-Focusdevice)投與的調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES禾Q1mMMgCl2，pH7.4)而非AAV2/l/SERCA2a。普雷瓦洛斯AC(PreovolosAC)等人，體外循環技術雜誌(J.ExtraCorpor.Technol.)2006;38(l):51-2。動物程序第0大一MR的產生和恢復麻醉、插管和抗凝經肌肉內(IM)注射泰拉唑(Tdazol)6.0mg/kg和阿託品(Atropine)2.0mL以引入麻醉。利用吸入性異氟垸(isoflurane)(1-2%)保持全身麻醉，且定期監測動脈血氣。使用無菌技術將靜脈針放入耳緣靜脈中，並且在必要時，經靜脈內(IV)投與生理鹽水。將適當尺寸的氣管導管插入動物體內，嵌入具有充氣管頭的位置以防止滲漏。將ECG墊和電極放於剃開的掌骨和蹠骨區，以監測引線I、II和III並將其記錄於記錄紙上。在整個程序中，以約5分鐘的間隔監測生命指徵(心率.、呼吸申.、02脈搏血氧訃、血壓)。投與肝紊以保持ACT大於300秒。插入套管獲得適當麻醉深度後，利ltj聚維酮碘(providone-iodine)和隨後70%乙醇消毒頸部來作準備。使ltJ通州無菌技術產生切口，且將8Fr套管插入頸動脈和靜脈屮。心臟功能測試執行基線超聲波心動圖。二尖瓣關閉不全的產生將鑷子通過頸動脈套管送入左心室(LV)中。在螢光鏡指導下，使用鑷子切開後乳頭肌的腱索以引起嚴重二尖瓣關閉不全(MR)。心力衰竭被定義為在利用第0天時的左心室造影照片經血管造影術確定患有嚴重MR後左心室腔擴張以及BP降低和EDP升高。恢復一旦生命指徵在完成程序後穩定達10分鐘，就封閉切口，關閉異氟垸且投與藥劑以預防急性心力衰竭。通常利用肌肉內給與的0.005-0.01mg/kg丁丙諾啡(buprenorphine)減輕任何潛在疼痛。還給與動物頭孢唑林(cefazolin)以防止感染(經靜脈內1g)。第1-3天一急性心力衰竭的監測和藥物治療MR產生後前3天，每天三次檢查動物。每天檢査動物的急性心力衰竭的病徵、頸部切口部位的創傷感染或者疼痛或不適的任何病徵。投與針對急性心力衰竭的藥物治療並加以記錄。第56天一有關心力衰竭、隨機選擇、血液樣本和媒劑對照或AAV2/l/SERCA2a投34與的文件編制心臟功能測試影像包括長軸、短軸、在乳頭肌插入物水平上的短軸M模式和二尖瓣環的彩色都卜勒(Doppler)。用計算機計算心輸出量、t、射血分數、LV節段縮短、LV游離壁和隔膜尺、t以及MR評估，並加以記錄。分組將存活到第56天(其滿足心力衰竭的定義)的動物分到兩個組中的一個中第1組1x1012個DRP劑量的AAV2/l/SERCA2a(n=4);或第2組媒劑對照(n=5)。通用程序通過順行性心外膜冠狀動脈輸注投與AAV2/l/SERCA2a或媒劑(第1-2組)第56天時，對所有動物投與全劑量肝紊以獲得大於300的ACT。使用HCT輸注泵，使用冠狀動脈輸注導管將AAV2/l/SERCA2a或媒劑輸注到左冠狀動脈中。植入導管的材料和程序詳細描述於上文實例2以及表3和4中。遵循基本上相同的程序。第l組投與(8分鐘載體輸注)1,0x10'2個AAV2/l/SERCA2a在小心混合後，將0.56mLAAV2/l/SERCA2a儲備溶液在無菌條件下轉移到無菌聚丙烯管中，且用10mL調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES禾q1mMMgCl2，pH7.4)稀釋，產生1x1011個DRP/mL的濃度。在即將對動物給藥之前，使10mL稀AAV2/10/SERCA2a(1x10"個DRP/mL)達到室溫，且將其與10mL來自經給藥動物的原生全血混合，從而產生注射器中最終體積為20mL的0.5x101'個DRP/mL的最終稀釋液。將輸注線路用血液填裝，且隨後使用HCT輸注泵歷經8分鐘時間將載體遞送到左冠狀動脈主幹中。在完成輸注後，從連接導引導管末端和泵的管中抽出剩餘溶液。隨後歷經約2分鐘的時間手丁.輸注此剩餘溶液，隨後用lOmL牛理鹽水緩慢手工衝洗。第2組投與(10分鐘輸注)媒劑將用於上述第1組的相同程序用於媒劑(調配緩衝液，130mMNaCl、20mMHEPES禾UlmMMgCl2，pH7.4)對照組中的一些動物，其中例外為未投與AAV2/l/SERCA2a。使用V-福克斯裝置歷經10分鐘將調配緩衝液(130mMNaCl、20mMHEPES和1mMMgCl2，pH7.4)投入其它對照組動物的左冠狀動脈中(普雷S:洛斯AC(PreovolosAC)等人，體外循環技術雜誌(J.ExtraCorpor.Technol.)2006;38(1):51-2)。順行性心外膜冠狀動脈輸注法和先前研究的V-福克斯心臟系統皆經IO分鐘時間將測試物或媒劑直接遞送到冠狀動脈中。未治療對照組與接收經由V-卡地亞(V-Kardia)心臟遞送系統投與的媒劑的對照動物之間並無差別。第112天一終末期處死程序麻醉、插管和抗凝在第112天時，將存活動物麻醉，插管並防止其凝血。心臟功能測試影像包括長軸、短軸、在乳頭肌插入物水平上的短軸M模式和二尖瓣環的彩色都卜勒。用計算機計算心輸出量、t、射血分數、LV節段縮短、LV游離壁和隔膜尺寸以及MR評估，並加以記錄。還執行組織都卜勒。終末期處死利用心停搏液(cardioplegiasolution)對動物實施安樂死並且收集組織樣本以供蛋白質和mRNA表達分析。製備豬心臟微粒體部分通過以下方法，由冷凍的豬心製備包括SR小泡的微粒體部分。在液氮中，將約5-10g清除脂肪和結締組織的心肌磨碎，並利用波特均質器(Potterhomogenizer)將其在含冇5mMTris-HCI(pH7.4)、2mMEDTA和8.5%蔗糖的緩衝溶液中均質化。以1000xg將勻漿離心10分鐘。隨後，以9000xg將上淸液離心15分鐘，且再以20000xg將所得上清液離心2次持續15分鐘。接著通過1小時的110OOOxg旋轉，使存在於所述後以20000xg離心的上清液屮的肌質網小泡成為球狀。將小球再懸浮於500pl均質化緩衝液中。所有離心步驟都是在0-4°C下執行。製備蛋白質提取物和免疫印跡分析由經分離豬微粒體部分製備來自正常未治療非實驗對照動物(對照)、經AAV-SERCA2a轉導的動物(SERCA2a)和經調配緩衝液(牛理鹽水)治療的動物的蛋tl質樣本，使蛋0質濃度相配(使用布賴特福德法(Bradfordmethod))並通過SDS-PAGE分離，且將其轉移到硝酸纖維素膜上。在4'C下，利用針對SERCA2a的抗體(親和生物試劑公司(AffinityBioreagents)，1:400稀釋液)將膜印跡培育整夜。通過化學發光(PE生命科技公司(PELifeSciences))檢驗反應性譜帶，且掃描來自至少三個獨立實驗的薄膜，並使用NIH影像軟體評佔免疫反應性譜帶的密度。將GAPDH的蛋A質含量用作內部對照。將SERAC2a的譜帶的密度值針對GAPDH值正常化。RNA分離和逆轉錄酶/聚合酶鏈式反應使用RT-PCR測量SERCA2a的mRNA含量。使用TRIzol試劑(英傑公w」(Invitrogen))從正常的未治療非實驗對照心臟(對照)、經AAV-SERCA2a轉導的心臟(SERCA2a)和經調配緩衝液(生理鹽水)治療的心臟中分離總RNA。完成組織破碎後，添加氯仿，36且充分振蕩樣本，隨後在室溫下短時間培育。接著將樣本離心，且在不幹擾下方的細胞碎片的情況下，小心地取出上清液(含有RNA)。通過添加等體積冰冷的異丙醇來使上清液中的RNA沉澱，目.通過在4。C下以12,000g離心10分鐘來使其成為小球，並用75%乙醇洗滌。將RNA小球再忌浮丁-無核糖核酸酶的水(英傑公司)中。使用埃斯普雷特(iScript)逆轉錄酶(伯樂公司(BioRad))以20|iL最終體積t31pg總RNA合成cDNA。將GAPDHmRNA的含量評估為內部對照。根據針對各特異性引物組的最佳退火溫度，調整PCR反應周期的退火溫度。結果實驗結果描述於圖7-13中。閣7A為展示二隻非實驗對照動物、二隻輸注調配物的動物(生理鹽水)和二隻經AAV2/l/SERCA2a治療的動物中SERCA2a蛋白質(上圖)和mRNA(下圖)的表達的聚丙烯醯胺凝膠。圖7B為比較二個治療組之間SERCA2a的蛋白質表達的圖，其中將蛋白質表達的含量正常化為GAPDH表達。本實驗表明，AAV2/1/SERCA2a組具有比非實驗對照組或輸注調配緩衝液的對照組高的SERCA2amRNA含量和蛋白質表達量。此外，圖7B還表明，SERCA2a輸注組中SERCA2a蛋白質表達的正常化含量在統計學上顯著高於實驗生理鹽水輸注對照組。圖8展示左心室節段縮短百分比，其為心室收縮功能的量度。在投與AAV2/l/SERCA2a載體兩個月後，與輸注調配緩衝液的對照組相比，治療組巾的節段縮短增加約25%，此為統計學上顯著的改進。圖9為第112天與第56天節段縮短的絕對變化的圖。實驗調配緩衝液對照組(V-福克斯和直接輸注(DI)動物)的節段縮短的中值變化為較小負數，而輸注AAV2/l/SERCA2a的組(藥物)展現相2大的正增加，表明心臟功能的改進。類似地，圖IO為第112天與第56天射血分數的絕對變化的圖。實驗調配緩衝液對照組(V-福克斯和直接輸注(DI)動物)的射血分數的中值變化為-5%，而輸注AAV2/l/SERCA2a的組(藥物)展現相當大的正增加(約10%)，表明心臟功能的改進。圖11為第112天與第56天心輸出量(mL/min.)的絕對變化的圖。實驗調配緩衝液對照組(V-福克斯和直接輸注(DI)動物)的心輸出量的中值變化小於3.5mL/min，而輸注AAV2/l/SERCA2a的組(藥物)為對照組的約2倍(約6mL/min.)，表明心臟功能的改進。圖12為第112天與第56天t(以msec.計的LV鬆弛的時間常數)的絕對變化的圖。t為需要心室內壓力記錄的心舒張性能的定量量度。實驗調配緩衝液對照組(V-福克斯和直接輸注(DI)動物)的鬆弛期的中值變化為大於+0.01msec,而輸注AAV2/l/SERCA2a的組(藥物)展現相當大的負降低f大T約0.005msec),表明心臟功能的改進。最終，圖13為展示第112天與第56天反流體積(mL)的絕對變化的圖。實驗調配緩衝液對照組(僅直接輸注(DI)動物)的反流體積的中值變化為約40mL，而輸注AAV2/l/SERCA2a的組(藥物)幾乎不展現改變，表明與對照相比的心臟功能改進。此外，左和右心室在AAV2/l/SERCA2a組中都比對照組(未展示)中小，表明與對照組相比，在治療組中因心力衰竭而引起的心臟組織的負面重構較小。總的說來，這些結果表明，在認可的心力衰竭動物模型中，AAV2/1/SERCA2a載體的順行性心外膜延長輸注成功地轉染心臟組織，從而引起AAV2/l/SERCA2amRNA和蛋白質表達的增加，以及認可的心力衰竭大型動物模型中心臟功能的若干量度的顯著長期改進。實例4:順行性心外膜輸注在第1期、隨機、雙盲、以安慰劑為對照的劑量遞增試驗中，測試患有充血性心力衰竭的患者體內單次冠脈內投與3個劑量濃度的AAV2/l/SERCA2a的安全性、可行性和功效。組群個休群為患有NYHA第in/IV類慢性心力衰竭的成年患者。將個體分為四組，且使其接收3xIO"個AAV2/l/SERCA2aDRP、3xl0'2個AAV2/l/SERCA2aDRP、1x1013個AAV2/l/SERCA2aDRP、3x1012個AAV2/l/SERCA2aDRP或安慰劑。使個體接收AAV2/l/SERCA2a達12個月。6個月後，安慰劑個體解除盲化，且對其提供AAV2/l/SERCA2a治療。投4AAV2/lSERCA2a輸注的冃的在於經由順行性心外膜冠狀動脈輸注擴散AAV2/l/SERCA2a，使心肌均勻地暴露於AAV2/l/SERCA2a。存在多種基於側支化模式、堵塞疾病和解剖變異(例如，術後旁路解剖術)的輸注情形，但臨床醫生的目的為1/3的AAV2/l/SERCA2a遞送到前外側，1/3遞送到後外側且1/3遞送到下部/下外側心肌。根據行業規範，適當時在局部麻醉(通常1-2%利多卡因(lidocaine))和清醒性鎮靜的情況下，使用賽丁格技術(Seldingertechnique)進行6Fr動脈(根據手術人員的判斷，股動脈、橈動脈或臂動脈)穿刺。經靜脈內/動脈內投與普通肝素以提供250-300秒的活化凝血時間(activatedclottingtime,ACT)。以常用方式執行冠狀和旁路移植血管造影術，否則在前2個月執行。確定解剖且選擇在投與AAV2/1/SERCA2A之前實現經灌注心肌和適當6Fr導引導管的均質遞送適當的策略。僅執行一或兩次輸注，且用於輸注的動脈或旁路移植物為促進最大部分心肌流動的一個或兩個移植物。在第一次輸注程序中，輸注2/3的AAV2/1/SERCA2A產物，且必要時在第二次(最後一次)輸注程序中輸注1/3。在血流入胸腔(backbleeding)/衝洗後，以常用方式將用T第一次輸注的所選的適當導引導管接合到第一個冠狀動脈/旁路移植物(對著最大區域)中。在無菌區，將麥德雷德(MEDRAD)輸注系統(城市，賓夕法尼亞州(City，PA))或等效物和60cc注射器用AAV2/1/SERCA2A混合物(參看卜'文)填充。將導引導管連接到30"高流動壓力管線男性-女性管道部件和麥德雷德高壓注射系統(Medradpowerinjectorsystem)以確保保證無流體-流體空氣空間。將血液抽出並將其與標準生理鹽水混合，隨後添加AAV2/1/SERCA2A以將以下混合物提供於麥德雷德高壓注射器中。重要的是，首先將血液/生理鹽水溶液添加到注射器中，隨後添加AAV2/1/SERCA2A:低劑量組3x1011個DRPAAV2/1/SERCA2A15mL血液45ml注射用標準生理鹽水0.3ml的1x1012個AAV2/1/SERCA2ADRP/毫升溶液中等劑量組3x10'2個DRPAAV2/1/SERCA2A15mL血液42ml注射片j標準生理鹽水3.0ml的1x10|2個AAV2/1/SERCA2ADRP/毫升溶液高劑量組1x1013個DRPAAV2/l/SERCA2a15mL血液35ml注射用標準牛理鹽水10.0ml的1x1012個AAV2/l/SERCA2ADRP/毫升各溶液安慰劑組15mL血液45ml注射用標準生理鹽水單次輸注程序以6mL/min的恆定流速輸注60mL溶液。執行最後的血管造影術以評估利用輸注的暫時解剖學改變。抽出導引導管。根據手術人員的判斷，執行股動脈套管取出和/或股動脈的封閉。兩次輸注程序在接收兩個動脈/圖輸注的個體中，第一次輸注為以6mL/min的恆定流速輸注40mL體積。目的在T將2/3的AAV2/1/SERCA2A產物輸注到較大心肌區域中。在第一部分輸39注後，執行最後的血管造影術以評估利用輸注的暫時解剖學改變。抽出導引導管。接下來，選擇適當的6Fr導引導管用於針對較小(1/3)灌注心肌區域的輸注程序。將導引導管接合到動脈/旁路移植物中，且按照先前描述，將其與麥德雷德注射部件連接，且輸注最後1/3的AAV2/1/SERCA2A產物(20mL體積，6mL/min的恆定流速)。執行最後的血管造影術以評估利用輸注的暫時解剖學改變。抽出導引導管。根據手術人員的判斷，執行股動脈套管取出和/或股動脈的封閉。解剖學簡介可存在多種解剖情況，其確定輸注的動脈選擇以實現將2/3產物遞送到"較大"灌注心肌K域且l/3輸注到"較小"K域中。(1)豐銜塞絲磁心瘋/iZr;r磁擾動欲，龍薪I經歷，狄動廚J^手^fC4SGJ—標準左冠狀動脈主十導引導管接合以及2/3輸注到左冠狀動脈(左前降支動脈和左迴旋支)系統中；標準右冠狀動脈(RCA)導引導管接合以及1/3輸注到RCA系統中。(2)龍薪未經^C45G、WC4乂全磁JT、左WA'冠汰動厥謬y支眾一左主T導引導管接合，遞送100%產物以輸注所有(LAD、LCx禾PRCA)區域。(3)it#A，^C4SG、LAC/7/或LCx完全錄蕃、/C4遊《，左;0夷一在此情況F，RCA變成"較大"區域且2/3產物遞送到RCA，1/3遞送到左冠狀動脈系統。(4)多逾,磁薯疾諒,光#術經厲2/3產物遞送到為大部分心肌工作的區域，1/3遞送到較小區域。(5)充厭經.銀CABG，^浮移潛激一2/3遞送到移植物中到達LAD，1/3遞送到移植物中到達RCA。(6)龍涼資厲C45G,》f^錄塞絲夯錄移潛激，i^C冠zZJ'裙一原生或旁路移植物2/3輸注到供應最大心肌區域的血管中，1/3輸注到較小區域中。應注意，解剖學變化將隨個體而不同，但對於典型個體，優選實施例是將2/3產物遞送到較大灌注區域且1/3遞送到較小區域(如果單一原生動脈或旁路移植物供應大部分心肌流量，那麼單次100%產物輸注的情形除外)。評估心臟功能在治療組內和治療組之間根據基線與投與AAV2/l/SERCA2a後3、6和12個月的變化評佔和比較的主要活性/功效終點包括以下中的一個或一個以上終點通過運動心肺測試評估的V02最大值；超聲波心動描記術評估，包括左心室射血分數、LV尺寸、局部室壁運動、心舒張功能和二尖瓣關閉不全；6分鐘步行測試期間所行進的距離；NYHA分類；和B型利鈉肽(BNP)含量。結果在治療組中可以發現與安慰劑組相比上述活性/功效終點中一個或一個以上終點的實質fl明顯的改進。權利要求1.一種適於轉染心臟細胞的治療性多聚核苷酸組合物的用途，其用於製備供治療或預防心臟病的藥劑，所述治療或預防是在不將冠狀循環從全身循環中分離的情況下，通過將所述多聚核苷酸經至少3分鐘的時間輸注到所述冠狀循環的血管中來實現。2.根據權利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是經至少5分鐘的時間輸注到所述血管中。3.根據權利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是經至少IO分鐘的時間輸注到所述血管中。4.根據權利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是經至少15分鐘的時間輸注到所述血管中。5.根據權利要求1所述的用途，其中到所述血管中的所述輸注是以小於或等於6.0mL/min的速率進行。6.根據權利要求1所述的用途，其中到所述血管中的所述輸注是以小於或等於2.5mL/min的速率進行。7.根據權利耍求6所述的用途，其中到所述血管中的所述輸注是以小T或等於2.0mL/min的速率進行。8.根據權利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述輸注是以小T或等丁-1.2mL/min的速率進行。9.根據權利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述輸注是以小於或等於1.0mL/min的速率進行。10.根據權利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述輸注是以小於或等於0.6mL/min的速率進行。11.根據權利要求1所述的用途，其中所述血管為左冠狀動脈。12.根據權利要求l所述的用途，其中所述冠狀循環的流出不是通過非天然方式限制。13.根據權利要求11所述的用途，其中側心室前端、側心室下端、隔膜和右心室的心臟細胞的轉染PJ使用PCR進行檢測。14.根據權利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸能夠表達能調節所述心臟細胞的細胞活性的蛋白質。15.根據權利要求14所述的用途，其中所述細胞活性為心肌細胞的鈣循環路徑。16.根據權利要求15所述的用途，其屮所述蛋白質為肌質網/內質網三磷酸腺苷酶(SERCA)。17.根據權利耍求16所述的用途，其中所述SERCA為SERCA2a。18.根據權利耍求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是存在丁-選自由以下組成的群組的病毒載體中腺相關病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、單純皰疹病毒、牛乳頭瘤病毒、慢病毒載體、牛痘病毒和多瘤病毒。19.根據權利要求18所述的用途，其中所述病毒載體為AAV病毒。20.根據權利要求18所述的用途，其中所述病毒載體為AAV2/1載體。21.根據權利要求20所述的用途，其中所述多聚核苷酸可操作性連接到基於CMV的啟動子且包裝於所述病毒載體中。22.根據權利要求21所述的用途，其中所述多聚核昔酸包含SERCA2a編碼序列。23.根據權利要求22所述的用途，其中所述心臟細胞的所述轉染使得側心室節段縮短增加。24.根據權利要求22所述的用途，所述疾病為充血性心力衰竭。25.根據權利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是包裝於病毒載體的脫氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)屮。26.根據權利要求25所述的州途，其「l」所輸注的DRP的總數小f或等於選自由以下組成的群組的量1x10'4、1x1013、3xl012、1x1012、lx1011、1x101Q、1x109禾口1x108。27.根據權利要求26所述的用途，其中所輸注的DRP的總數小於或等於lx1013。28.根據權利要求27所述的用途，其中所輸注的DRP的總數小於或等於1x1012，所述病毒載體為AAV2/1,所述多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，所述血管為左或右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸的所述輸注以小於或等於2mL/min的流速持續至少IO分鐘；且其中側心室前端、側心室下端、隔膜和右心室的心臟細胞的轉染可使用PCR進行檢測。29.根據權利要求1所述的用途，其中所述疾病選自由以下組成的群組心力衰竭、局部缺血、心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、移植物排斥、異常心臟收縮忡、非缺血性心肌病、二尖瓣關閉不全、主動脈瓣狹窄或主動脈瓣關閉不全、異常Ca"代謝和先天件心臟病。30.根據權利要求27所述的用途，其中所述病毒載體為AAV2/1,所述多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，所述血管為左或右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸的所述輸注以小卩或等丁'2.5mL/min的流速持續辛:少8分鐘；且其中側心室前端、側心室下端、隔膜和右心室的心臟細胞的轉染可使用PCR進行檢測；冃.其中與輸注所述多聚核苷酸之前的側心室節段縮短相比，當在所述輸注後4個月測暈時，所述心臟細胞的所述轉染使得側心室節段縮短增加至少25%。31.根據權利要求27所述的用途，其中所述病毒載體為AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，所述血管為左或右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸的所述輸注持續至少IO分鐘。32.根據權利要求31所述的用途，其中所述心血管系統疾病為充血性心力衰竭。33.根據權利要求31所述的用途，其中所述多聚核卄酸的所述輸注是以6mL/min的流速進行。34.根據權利要求31所述的用途，其中所述心臟細胞的所述轉染引起選自由以下組成的群組的心臟功能量度的改進SERCA2a蛋白的表達、節段縮短、射血分數、心輸出量、心室鬆弛的時間常數和反流體積。35.根據權利要求27所述的用途，其屮所述藥劑是經至少3分鐘的時間輸注到所述冠狀循環的另一血管中。36.根據權利要求35所述的用途，其中所述病毒載體為AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列；其中所述血管為所述左冠狀動脈，且所述多聚核苷酸到所述左冠狀動脈中的所述輸注持續至少6分鐘；且其中所述另一血管為所述右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸到所述右冠狀動脈中的所述輸注持續至少3分鐘。37.根據權利要求36所述的用途，其中所述心血管系統疾病為充血性心力衰竭。38.根據權利要求36所述的用途，其中所述多聚核苷酸到所述左冠狀動脈和所述右冠狀動脈中的所述輸注是以6mL/min的流速進行。39.根據權利要求36所述的用途，其中所述心臟細胞的所述轉染引起選自由以下組成的群組的心臟功能量度的改進SERCA2a蛋A的表達、節段縮短、射血分數、心輸出量、心室鬆弛的時間常數和反流體積。40.—種通過轉染大型動物的心臟細胞來治療或預防心血管疾病的方法，所述方法包含鑑別需耍治療或預防心血管疾病的哺乳動物；在活體內將治療性多聚核苷酸輸注到冠狀循環的血管中，其中所述治療性多聚核苷酸是經至少3分鐘的時間輸注到所述血管中；其中所述冠狀循環並未從所述哺乳動物的全身循環中分離或實質上分離；目.其中所述治療性多聚核苷酸轉染所述哺乳動物的心臟細胞，從而引起所述心血管疾病的治療或預防。41.根據權利要求40所述的方法，其中所述多聚核苷酸是包裝於病毒載體的脫氧核糖核酸酶抗性粒7(DRP)中，所輸注的DRP的總數小於或等於1x1013，且所述病毒載體為AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a編碼序列，所述血管為左或右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸的所述輸注持續至少IO分鐘。42.根據權利要求41所述的方法，其中所述心血管系統疾病為充血性心力衰竭。43.根據權利要求41所述的方法，其中所述心臟細胞的所述轉染引起選自由以下組成的群組的心臟功能量度的改進SERCA2a蛋白的表達、節段縮短、射血分數、心輸出量、心室鬆弛的時間常數和反流體積。44.一種組合物，其包含適於轉染心臟細胞的治療性多聚核苷酸，所述組合物用+在不將冠狀循環從仝身循環'l'分離的情況下，通過將所述多聚核苷酸經至少3分鐘的時間輸注到所述冠狀循環的血管中來治療或預防心臟病。45.根據權利要求44所述的組合物，其屮所述多聚核苷酸包含包裝於AAV2/1病毒載體的脫氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中的SERCA2a編碼序列，所輸注的DRP的總數小於或等於1x1013，所述血管為左或右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸的所述輸注持續至少IO分鐘。46.根據權利要求45所述的組合物，其中所述心血管系統疾病為充血性心力哀竭。47.—種試劑盒，其包含醫藥組合物，其包含至少1x1011個AAV2/1載體DRP，所述載體含有編碼SERCA2a的多聚核苷酸；和說明書，其說明應將包含至少0.5x10"個AAV2/1載體DRP的溶液投與需要預防或治療心血管疾病的患者，所述載體含有編碼SERCA2a的多聚核苷酸，所述預防或治療足通過將所述溶液活體內輸注到冠狀循環的血管中來實現，其中所述冠狀循環未從所述患者的全身循環中分離或實質上分離，且其中所述多聚核苷酸是經辛:少3分鐘的時間輸注到所述血管中。48.根據權利要求47所述的試劑盒，其中所述血管為左或右冠狀動脈，且所述多聚核苷酸的所述輸注持續至少8分鐘的時間。全文摘要本發明涉及治療心血管疾病、具體來說將治療劑通過直接輸注到冠狀循環中而遞送到心臟組織的療法。本發明的優選實施例為適於轉染心臟細胞的治療性多聚核苷酸組合物的用途，其用於製備供治療或預防心臟病的藥劑，所述治療或預防是在不將所述冠狀循環從全身循環中分離的情況下，通過將所述多聚核苷酸經至少三分鐘的時間輸注到所述冠狀循環的血管中來實現。在另一優選實施例中，所述多聚核苷酸包含包裝於AAV2/1病毒載體的脫氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中的SERCA2a編碼序列，所輸注的DRP的總數小於或等於1×1013，且所述血管為左或右冠狀動脈。文檔編號C12N9/14GK101495627SQ200780028361公開日2009年7月29日申請日期2007年7月16日優先權日2006年7月25日發明者克裡斯蒂娜·瑪麗亞·熱伯申請人:塞拉東公司