編碼新胞子蟲二氫葉酸還原酶－胸苷酸合成酶的dna的製作方法

2023-09-14 08:15:40 3

專利名稱：編碼新胞子蟲二氫葉酸還原酶－胸苷酸合成酶的dna的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物健康領域，涉及疫苗組合物和疾病診斷方法。更具體地說，本發明涉及含有編碼新胞子蟲(Neospora)二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子在抗新胞子蟲病(neosporosis)的疫苗生產中是很有用的，並可用作診斷試劑。
新胞子蟲是動物的一種病原性原生動物寄生蟲，已發現它是導致哺乳動物流產、新生兒死亡、先天性感染和腦炎疾病的主要原因(Dubey和Lindsay,1996，獸醫寄生蟲學,67:1-59；Dubey和Lindsay,1993，今日寄生蟲學，9:452-458)。N.caninum(Neospora caninum)可感染狗，並可先天性地感染小狗，通常會導致癱瘓。已經從天然感染的小狗內分離出了N.caninum的速殖體(Lindsay和Dubey,1989，寄生蟲學雜誌，75:163-165)。新胞子蟲是導致奶牛場中牛流產的主要原因。在山羊、綿羊和馬中也已有新胞子蟲相關性疾病即新胞子蟲病病例的報導。
儘管N.caninum表面上看起來與病原鼠弓形體(Toxoplasmagondii)類似，但N.caninum與鼠弓形體在抗原性和超微結構方面都互不相同(Dubey和Lindsay,1993，文獻同上)。另外，從流產的牛胎兒腦中分離出的並在體外持續培養的新胞子蟲樣原生動物寄生蟲與鼠弓形體和Hammondia hammondi在抗原性和超微結構方面都存在明顯差異，而與N.caninum最為相似(Conrad等，1993，寄生蟲學，106:239-249)。而且，對核小亞基核糖體RNA基因的分析結果表明分離自牛和狗的新胞子蟲株系之間無核苷酸差異，但新胞子蟲和鼠弓形體之間存在一致的差異(Marsh等，1995，寄生蟲學雜誌，81:530-535)。
已經證實新胞子蟲牛分離物在牛流產和先天性疾病中具有黃化作用(Barr等，1994，獸醫診斷與研究雜誌，6:207-215)。利用感染有N.caninum的近交BALB/c小鼠已建立了中樞神經系統新胞子蟲病的嚙齒類動物模型(Lindsay等，1995，寄生蟲學雜誌，81:313-315)。另外，分別由Cole等，1995，寄生蟲學雜誌，81:730-732，及Long等，1996，寄生蟲學雜誌，82:608-611描述了用於研究遠交和近交孕鼠中N.caninum的跨胎盤傳播的模型。而且，已證實N.caninum矮小山羊實驗模型與天然獲得的新胞子蟲誘導性牛流產非常相似(Lindsay等，1995，美國獸醫研究雜誌，56:1176-1180)。
在原生動物如鼠弓形體和新胞子蟲中，已知必需的代謝酶類二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷酸合成酶(TS)位於同一蛋白質分子內兩個不同的酶促結構域即「DHFR結構域」和「TS結構域」中。據報導，鼠弓形體中DHFR和TS結構域由一個約70個胺基酸的連接區所隔離(Roos,1993，生物化學雜誌，162:6269-6280)。至少在一種寄生蟲種類中已將此雙功能蛋白質用作缺失靶點以產生弱毒株系而用於活體疫苗中。因此，Titus等，1995，美國國家科學院院報，92:10267-10271描述了通過同源重組對來源於原生動物寄生蟲大型利什曼原蟲的DHFR-TS基因進行定位缺失，以產生DHFR-TS-無效突變體細胞從而用於抗大型利什曼原蟲強致病株的疫苗中。
本發明提供了含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子。在一個優選實施方案中，該新胞子蟲DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的胺基酸序列或由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。在一個非限制性的實施方案中，該分離的多核苷酸分子含有所說的新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一個優選實施方案中，含有新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列的該分離的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列，或與存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。在另一個非限制性的實施方案中，所述編碼DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本發明還提供了與含有一定核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子，其中所說的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DHFR-TS基因從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列，或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本發明還提供了含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸分子，其中所述新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
本發明還提供了由任一種前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。在一個優選實施方案中，所述多核苷酸分子由編碼任一種前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段(如由DHFR-TS蛋白的DHFR結構域或TS結構域所組成的多肽)的核苷酸序列所組成。
除了任一種前述DHFR-TS相關性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本發明的多核苷酸分子還含有或其組成可為N.caninum中DHFR-TS基因原位天然側翼的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示的旁側核苷酸序列或其部分。
本發明還提供了用於克隆和表達本發明的多核苷酸分子的組合物和方法，包括諸如克隆載體、表達載體，以及含有所述載體的轉化宿主細胞。在一個非限制性的實施方案中，本發明提供了含有具N.caninum NC-1株系的DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子的克隆載體，如命名為λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的λ噬菌體克隆載體。
本發明還提供了含有新胞子蟲DHFR-TS蛋白的胺基酸序列的部分或基本上純化好的蛋白質。在一個非限制性的實施方案中，所述蛋白質含有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或含有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。本發明還提供了與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽。本發明還提供了任一種前述蛋白或多肽的肽片段(如由分離的新胞子蟲DHFR或TS結構域所組成的多肽)。
本發明還提供了可抗新胞子蟲DHFR-TS蛋白或可抗所述蛋白質的肽片段的抗體。
本發明還提供了含有任一種前述多核苷酸分子的遺傳構建體，該多核苷酸分子比如是含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)中的核苷酸序列的多核苷酸分子；或者是由任一種所述核苷酸序列的基本部分的核苷酸序列所組成，但已被修飾而在其中具有一個或多個核苷酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸分子，或是含有N.caninum中DHFR-TS原位天然側翼的一種或多種核苷酸序列的多核苷酸分子，從而一旦該多核苷酸分子插入於野生型DHFR-TS基因中或用於取代其中一部分時，所產生的修飾型DHFR-TS基因序列將編碼部分無效或完全無效的蛋白質，或者根本不編碼或產生任何蛋白質。這類遺傳構建體可有效用於產生修飾型新胞子蟲細胞，這種細胞中DHFR-TS基因或其中一部分已被部分或全部失活，導致產生的細胞表現出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型(本文此後總稱為dhfr--ts-表型)。
本發明還提供了經修飾的活新胞子蟲細胞，其天然DHFR-TS基因或其中一部分已被部分或完全失活。在一個優選實施方案中，由於新胞子蟲細胞與本發明的遺傳構建體之間發生了同源重組，導致DHFR-TS基因的破壞，從而使該細胞表現dhfr--ts-突變體表型。在保護哺乳動物以抗新胞子蟲病的疫苗組合物中，這類經修飾的活新胞子蟲細胞具有很大的用處。本發明還提供了所述經修飾的活新胞子蟲細胞的製備方法。
本發明還提供了抗新胞子蟲病的疫苗，其中含有免疫有效量的本發明經修飾的活新胞子蟲細胞，以及獸醫可接受性載體。本發明還提供了保護哺乳動物以抗新胞子蟲病、以及任選地一種或多種會折磨哺乳動物的其它疾病或病理狀態的聯合疫苗，這種聯合疫苗含有免疫有效量的第一組分、免疫有效量的第二組分以及獸醫可接受性載體，其中所說的第一組分含有本發明經修飾的活新胞子蟲細胞，所說的第二組分可引發對摺磨哺乳動物的疾病或病理狀態的保護性反應。本發明還提供了本發明的疫苗的製備方法，包括聯合使用免疫有效量的本發明經修飾的活新胞子蟲細胞和獸醫可接受性載體。本發明還提供了對哺乳動物進行疫苗接種以抗新胞子蟲病的方法，包括對哺乳動物施用本發明的疫苗。
本發明還提供了用於對哺乳動物進行疫苗接種以抗新胞子蟲病的試劑盒，其中包括兩種容器第一種容器中具有含免疫有效量的本發明經修飾的活新胞子蟲細胞的組合物，第二種容器中具有獸醫可接受性載體或稀釋劑。
編碼新胞子蟲DHFR-TS的多核苷酸分子本發明提供了(ⅰ)含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，包括含有新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子；(ⅱ)與前述任一種多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子；(ⅲ)含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子；以及(ⅳ)由任一種前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，包括由編碼任一種前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。
如本文所用，術語「基因」、「多核苷酸分子」、「核苷酸序列」、「編碼序列」和「編碼區」意指包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子。也如本文所用，術語「基因」、「編碼序列」和「編碼區」意指與適當的調控元件有效相連時，能在宿主細胞表達系統中轉錄並翻譯(DNA)成或翻譯(RNA)成下述多肽或肽的多核苷酸分子；新胞子蟲DHFR-TS蛋白，或與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽，或前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段。該多核苷酸分子可包括但不限於一種或多種原核序列、真核序列、cDNA序列、基因組DNA序列(外顯子或內含子)，以及化學合成的DNA和RNA序列，或上述序列的任意組合。
本發明的分離的多核苷酸分子可具有來源於新胞子蟲任一種或株系的核苷酸序列，但優選來源於新胞子蟲的病原性種類如N.caninum。可用於分離或衍生本發明的多核苷酸分子的N.caninum株系的一個非限制性實例是NC-1株系，該株系存在於宿主MARC-145猴腎細胞，以NO.CRL-12231保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC),12301Parklawn Drive,Rockville,MD20852,USA。Dubey等，1988，美國獸醫醫學協會雜誌(J.Am.Vet.Med.Assoc.)，193:1259-63中也記載了NC-1株系，該出版物引入本文作為參考。或者可利用常規分離技術如上述出版物中所記載的那些技術，從被感染動物的器官、組織或體液中分離出可用於實施本發明的新胞子蟲病原性株系或品種。
本發明提供了含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子。在一個優選實施方案中，該新胞子蟲DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或含有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。在一個非限制性的實施方案中，該分離的多核苷酸分子含有新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一個優選實施方案中，該分離的多核苷酸分子含有N.caninum NC-1株系的DHFR-TS基因的核苷酸序列，該核苷酸序列含有SEQ ID NO:1中約第2405nt至約第8199nt的核苷酸序列，或含有與存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。SEQ ID NO:1中，由約第2405nt至約第4664nt間的核苷酸序列編碼DHFR-TS基因推斷的DHFR結構域，由約第4665nt至約第8199nt之間的核苷酸序列編碼DHFR-TS基因推斷的TS結構域。在另一個非限制性的實施方案中，編碼DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，其中由約第1nt至約第969nt編碼推斷的DHFR結構域，由約第970nt至約第1836nt編碼推斷的TS結構域。
本發明還提供了與含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQID NO:2的核苷酸序列。術語「基本上同源」用於指DHFR-TS相關性多核苷酸分子時，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與下述核苷酸序列編碼相同蛋白質的核苷酸序列SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或由於遺傳密碼的簡併性而在核苷酸序列中發生了一個或多個沉默改變的SEQ ID NO:2的核苷酸序列；或是(b)在中度嚴格條件下即在65℃、於0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中對結合於濾膜上的DNA進行雜交，在0.2×SSC/0.1％SDS中，42℃下洗滌(參見Ausubel等(編)，1989，分子生物學現代方法，第1卷，Green PublishingAssociates,Inc.，和John Wiley Sons,Inc.,New York，第2.10.3頁)的條件下，跟具有與下述核苷酸序列編碼相同蛋白質的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補體可雜交、並可用於實施本發明的核苷酸序列SEQ IDNO:1中大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一個優選實施方案中，所述基本上同源的多核苷酸分子在高度嚴格條件下即在65℃下，0.5MNaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中對結合於濾膜上的DNA進行雜交，在68℃下，0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，出處同前)的條件下，跟具有與下述核苷酸序列編碼相同蛋白質的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補體可雜交，並可用於實施本發明SEQ ID NO:1所示大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
如本文所用，多核苷酸分子「可用於實施本發明」是指如下文4.4所述，可將該多核苷酸分子用作診斷試劑以檢測來自新胞子蟲感染動物的體液或組織樣品中新胞子蟲特異性多核苷酸的存在，或者可利用該多核苷酸分子構建遺傳構建體以有效用於製備本發明經修飾的活新胞子蟲細胞。
本發明的基本上同源的多核苷酸分子不包括具有編碼鼠弓形體來源的DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子。
本發明還提供了含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸分子，所述新胞子蟲DHFR-TS具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。如本文所用，涉及多肽時，術語「基本上同源」是指具有下述胺基酸序列的多肽(a)與具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列優選有至少約70％、更優選有至少約80％、最優選有至少約90％相同的胺基酸序列，並且該基本上同源的多肽可有效用於實施本發明；和/或(b)其內存在於新胞子蟲DHFR-TS蛋白中的一個或多個胺基酸殘基已由不同的胺基酸殘基保守取代的胺基酸序列，該多肽可有效用於實施本發明，所述新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
保守胺基酸取代在本領域中是眾所周知的。比如，有理由預計，可利用具有相似電荷、大小或極性的胺基酸殘基保守地取代新胞子蟲DHFR-TS蛋白的一個或多個胺基酸殘基，所獲得的多肽在實施本發明時仍是有用的。設計這類取代的規則包括由Dayhof,M.D.,1978，國家生物醫學研究基金(Nat.Biomed.Res.Found.),Washington,D.C.，第5卷，Sup.3等所描述的那些規則。更具體地說，保守胺基酸取代是通常在其側鏈上相關的一個胺基酸家族內發生的那些取代。通常將遺傳編碼的胺基酸分為四組(1)酸性胺基酸——天冬氨酸，穀氨酸；(2)鹼性胺基酸——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性胺基酸——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電的極性胺基酸——甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。也可將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸類為芳族胺基酸。在任一特定組內發生的一個或多個替換，如由異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、由穀氨酸取代天冬氨酸、由絲氨酸取代蘇氨酸，或由結構相關性胺基酸殘基取代任一種其它胺基酸殘基，通常不會顯著影響所得多肽在實施本發明過程中的有效性。
如本文所用，若蛋白質或多肽可用於包括下述任意一種或多種用途，如可用於篩選特異地定向於新胞子蟲DHFR-TS蛋白的兩個酶促結構域之一的抑制性試劑，或可用於產生抗完整蛋白或其內兩個酶促結構域之一的抗體，則將該蛋白質或多肽視為「在實施本發明過程中是有用的」。
本發明還提供了由任一種前述多核苷酸分子的「基本部分」的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。如本文所用，任一種前述多核苷酸分子的「基本部分」意指一種多核苷酸分子，其組成少於特定的DHFR-TS相關性多核苷酸分子的完整核苷酸序列、但含有DHFR-TS相關性多核苷酸分子之核苷酸序列的至少約30％、更優選至少約50％，並在實施本發明過程中有用處，如上述定義多核苷酸分子的有用處一樣。在一個優選實施方案中，該多核苷酸分子具有的核苷酸序列編碼任一種前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段，如由DHFR-TS蛋白的DHFR結構域或TS結構域所組成的多肽。如本文所用，術語「肽片段」是指由新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的全部胺基酸序列的一個或多個亞序列所組成的多肽，這些亞序列在長度上短於全長分子，並且由此產生的肽片段在實施本發明過程中是有用處的，如上述定義多肽的有用處一樣。因此，若全長分子具有「n」個胺基酸殘基，那麼其肽片段可以是小於全長序列的任一種多肽，包括具有n-1個胺基酸殘基的多肽，並且這類多肽在本發明實施過程中是有用處的。優選本發明的肽片段長度至少大約10個胺基酸殘基。在一個非限制性的實施方案中，該肽片段由新胞子蟲DHFR-TS蛋白的DHFR結構域或TS結構域所組成。
若肽片段由DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的一個以上亞序列所組成，則可優化編碼該肽片段的多核苷酸分子以將全長蛋白或多肽中相應的不連續亞序列歸於一處並使它們在肽片段中互相連續。另外，可優化編碼肽片段的多核苷酸分子使含有肽片段的不同亞序列之間相對排列的次序與全長蛋白或多肽有所不同，或使所編碼的肽片段含有多拷貝的特定亞序列。例如，該多核苷酸分子可編碼多拷貝的DHFR結構域或TS結構域，選自其中的表位區，或其組合。
本發明除包括編碼大於天然蛋白的多肽包括長度達到大約2n的多肽的多核苷酸之外，還包括編碼全長(n)多肽的多核苷酸分子，該多肽中天然蛋白質的亞序列已互相發生了重排。這類多肽可含有多拷貝的完整蛋白質、單個結構域、表位區或它們的某種組合。
除了任一種前述的DHFR-TS相關性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本發明的多核苷酸分子還可含有或者組成為選自N.caninum的DHFR-TS基因原位天然旁側序列如SEQ ID NO:1所示的旁側核苷酸序列或其部分的一種或多種核苷酸序列。
本發明的多核苷酸分子的序列還為構建寡核苷酸分子提供了必要的信息，所述寡核苷酸分子可在擴增技術中用作引物或在差異疾病診斷中用作探針，根據本文的公開內容，本領域技術人員可很方便地設計出來。優選這類寡核苷酸長度至少約15個核苷酸。利用恰當設計的寡核苷酸，通過應用標準技術如聚合酶鏈反應(PCR)可進行擴增。Innis等(編)，1995,PCR策略，Academic Press,Inc.,San Diego；和Erlich(編)，1992,PCR技術，牛津大學出版社，紐約等出版物中記載了聚合酶鏈反應，這些出版物引入本文作為參考。進行診斷時，可將本發明的寡核苷酸用於PCR擴增中以檢測動物組織或體液樣品中新胞子蟲特異性多核苷酸分子的存在，這類樣品的例子包括諸如腦組織、肺組織、胎盤組織、血液、腦脊髓液、粘液、尿液、羊水等。特異性擴增產物的存在可支持已發生新胞子蟲感染的診斷結果，而缺乏擴增產物有可能表明未發生感染。通常對於PCR，可按照標準方法製備含有恰當設計的引物、含待擴增的核苷酸序列的模板以及適當的PCR酶和緩衝液的混合物，並進行反應以擴增該模板的特異性新胞子蟲DHFR-TS多核苷酸分子或其部分。也可利用本領域已知的其它擴增技術，如連接酶鏈反應。
除非另外特別指出，以後凡涉及「多核苷酸分子」均指包括本發明的任一種前述多核苷酸分子，包括含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子SEQ ID NO:1所示從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；與含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子SEQ ID NO:1所示從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列、或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列、或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中所述新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列；以及由作為任一種前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，包括由編碼任一種前述的新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。
除非另外特別指出，以後凡涉及「DHFR-TS蛋白」、「蛋白質」或「多肽」均指包括具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列的蛋白質；與任一種前述蛋白質基本上同源的多肽；以及任一種前述蛋白質或多肽的肽片段。
對本發明的多核苷酸和寡核苷酸分子進行生產和操作的方法在本領域的技術範圍內，並可按照已知的遺傳技術進行，這些技術記載於Maniatis等，1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，出處同前；Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等，1995(出處同前)；以及Erlich,1992(出處同前)等出版物中，上述文獻引入本文作為參考。
重組表達體系克隆和表達載體本發明還提供了含有本發明多核苷酸分子的重組型克隆和表達載體。在一個非限制性的實施方案中，本發明所提供的克隆載體是噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)，其含有具N.caninum NC-1株系的完整DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子。
優選將本發明的表達載體構建成使該多核苷酸分子與轉錄和翻譯必需的一種或多種調控元件有效相連。將表達載體用於表達體系如轉化的宿主細胞中，以生產重組型表達的DHFR-TS蛋白。
如本文所用，術語「調控元件」包括但不限於編碼下述元件的核苷酸序列誘導型和非誘導型啟動子、增強子、操縱基因，以及本領域已知可參與啟動和/或調控多核苷酸編碼序列表達的其它元件。如本文所用，若一種或多種調控元件可有效調控並提供DHFR-TS編碼序列的轉錄、或其mRNA的翻譯，或二者兼而有之時，該DHFR-TS編碼序列即是與所說的調控元件「有效相連」。
本領域熟知可用於構建含有與適當的調控元件有效相連的特定編碼序列的表達載體的方法，可利用這些方法實施本發明。這些方法包括如Maniatis等，1989(出處同前)；Ausubel等，1989(出處同前)；以及Sambrook等，1989(出處同前)等所記載的體外重組技術、合成技術和體內遺傳重組。
本領域已知可用於表達本發明多核苷酸分子的編碼序列的多種表達載體，包括含有DHFR-TS編碼序列的重組型噬菌體DNA、質粒DNA和粘粒DNA以用於轉化細菌或酵母，以及含有DHFR-TS編碼序列的重組型病毒表達載體如杆狀病毒以用於轉染昆蟲細胞，或含有DHFR-TS編碼序列的腺病毒或痘苗病毒以用於轉染哺乳動物細胞，等等。
可被加工成含有本發明的多核苷酸分子的典型原核表達載體質粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories,Richmond,CA)，以及pPL和pKK223(Pharmacia,Piscataway,NJ)，等等。
可被加工成含有本發明多核苷酸分子的典型真核生物表達載體包括蛻皮激素誘導型哺乳動物表達體系(Invitrogen,Carlsbad,CA)，基於巨細胞病毒啟動子-增強子的體系(Promega,Madison,WI；Stratagene,LaJolla,CA；Invitrogen)；以及基於杆狀病毒的表達體系(Promega)，等等。
在強度和特異性方面，這些和其它載體的調控元件可以各不相同。取決於所使用的宿主/載體體系，可以使用任何一種合適的轉錄和翻譯元件。比如，當在哺乳動物細胞體系中進行克隆時，可使用分離自哺乳動物細胞基因組的啟動子如小鼠金屬硫蛋白啟動子，或可使用分離自生長於這些細胞內的病毒的啟動子，如痘苗病毒7.5K啟動子或Moloney鼠肉瘤病毒長末端重複序列。也可利用通過重組DNA或合成技術所獲得的啟動子以提供插入序列的轉錄。另外，在存在特定誘導物的情況下，來自某些啟動子的表達可得到提高，比如鋅和鎘離子可提高金屬硫蛋白啟動子的表達。
轉錄調控區或啟動子的非限制性實例包括用於細菌的β-gal啟動子、T7啟動子、TAC啟動子、λ左向和右向啟動子、trp和lac啟動子、trp-lac融合啟動子等；用於酵母的糖酵解酶啟動子，如ADH-Ⅰ和ADH-Ⅱ啟動子、GPK啟動子、PGI啟動子、TRP啟動子等；用於哺乳動物細胞的SV40早期和晚期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子等。
為了足量翻譯插入的DHFR-TS編碼序列，還必需特定的起始信號。通常這些信號包括ATG起始密碼子和鄰接序列。當將本發明的多核苷酸分子連同其自身的起始密碼子和鄰接序列一起插入適當的表達載體中時，不再需要額外的翻譯控制信號。然而，在僅插入編碼序列的一部分的情形下，可能需要外源的翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可得自多種來源，既可以是天然的，也可以是合成的。另外，起始密碼子必須與DHFR-TS編碼區的讀框協調一致以確保整個插入片段讀框一致地翻譯。
可利用融合蛋白表達載體表達DHFR-TS融合蛋白。可利用已純化的融合蛋白產生抗DHFR-TS蛋白的抗血清，研究DHFR-TS蛋白的生物化學特性，加工DHFR-TS融合蛋白使其具有不同的酶促活性，或協助進行表達的DHFR-TS蛋白的鑑定或純化。可能的融合蛋白表達載體包括但不限於插入了編碼下述多肽的序列的載體β-半乳糖苷酶和trpE融合體、麥芽糖結合性蛋白融合體、穀胱甘肽-S-轉移酶融合體和多組氨酸融合體(攜帶者區)。可利用本領域已知的方法構建編碼這類DHFR-TS融合蛋白的表達載體。
如上所述，融合蛋白在協助進行表達蛋白的純化方面是有用的。比如，利用直鏈澱粉樹脂可純化DHFR-TS-麥芽糖結合性蛋白融合體；利用穀胱甘肽-瓊脂糖玻璃珠可純化DHFR-TS-穀胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白；利用二價鎳樹脂可純化DHFR-TS-多組氨酸融合體。或者，可將抗載體蛋白或肽的抗體用於融合蛋白的親和層析純化。例如，可將編碼單克隆抗體靶抗原決定基的核苷酸序列加工到表達載體中使其與調控元件有效相連，並且所處位置可使表達的表位與DHFR-TS蛋白相融合。例如，可通過標準技術，將編碼FLAGTM表位標記(International BiotechnologiesInc.)這樣一個親水性標記肽的核苷酸序列插入表達載體中的某個位點，比如DHFR-TS蛋白的羧基末端。然後利用可商購的抗FLAGTM的抗體，可對表達的DHFR-TS蛋白-FLAGTM表位融合產物進行檢測和親和純化。
也可將表達載體加工成含有編碼特定蛋白酶切割位點的多接頭序列，以便可通過特定蛋白酶處理而將表達的DHFR-TS蛋白從載體區或融合「搭擋」中釋放出來。例如，融合蛋白載體中可包括編碼凝血酶或Xa因子切割位點等的DNA序列。
通過已知方法，可將位於DHFR-TS編碼區上遊並與其讀框一致的信號序列加工到表達載體中以指導表達蛋白質的運輸和分泌。信號序列的非限制性實例包括來自α因子、免疫球蛋白、外膜蛋白、青黴素酶和T細胞受體等的那些信號序列。
為了協助篩選出已轉化或轉染了本發明表達載體的宿主細胞，可加工表達載體使其進一步含有報導基因產物或其它選擇性標記的編碼序列。如上述，優選這類編碼序列與調控元件編碼序列有效相連。在本發明中有用的報導基因在本領域中是眾所周知的，它們包括編碼氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白、熒火蟲螢光素酶以及人生長激素等的報導基因。編碼選擇性標記的核苷酸序列在本領域中是眾所周知的，它們包括編碼賦予對抗生素或抗代謝物的抗性的基因產物或可提供營養缺陷型需要的基因產物的那些核苷酸序列。這類序列的例子包括編碼胸苷激酶活性，或對氨甲喋呤、氨苄青黴系、卡那黴素、氯黴素、zeocin、乙嘧啶(pyrimethamine)、氨基糖苷或潮黴素抗性的那些序列，等等。
宿主細胞的轉化本發明提供了含有本發明多核苷酸分子或重組表達載體的轉化宿主細胞，以及由此衍生的細胞系。在實施本發明過程中有用的宿主細胞可以是真核細胞，儘管優選的是原核細胞。這類轉化宿主細胞包括但不限於微生物，如經重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；或經重組表達載體轉化的酵母；或動物細胞，如經重組病毒表達載體(如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞，或經重組病毒表達載體(如腺病毒或痘苗病毒)感染的哺乳動物細胞，等等。
可將細菌細胞用作宿主細胞。比如，可利用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，該菌株可從ATCC,Rockville,MD,USA(保藏號31343)或從Stratagene(La Jolla,CA)獲得。真核宿主細胞包括酵母細胞，儘管哺乳動物細胞如來自小鼠、倉鼠、牛、猴或人細胞系的細胞也可得到有效利用。可用於表達本發明重組蛋白質的真核宿主細胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(如ATCC保藏號CCL-61)，NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3(如ATCC保藏號CRL-1658)，Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞(ATCC保藏號CCL-22)，以及胸苷激酶缺陷型細胞，如L-M(TK-)(ATCC保藏號CCL-1.3)和tk--ts13(ATCC保藏號CRL-1632)。
優選將本發明的重組表達載體轉化或轉染到基本上均一的細胞培養物的一個或多個宿主細胞中。通常利用已知技術將表達載體導入宿主細胞，如磷酸鈣沉澱、氯化鈣處理、顯微注射、電穿孔、通過與重組病毒接觸進行的轉染、脂質體介導的轉染、DEAE-葡聚糖轉染、轉導、接合或微粒轟擊等方法。可通過標準方法篩選轉化體，如通過篩選表達與重組表達載體相關的選擇性標記(如抗生素抗性)的細胞等方法。
一旦已將表達載體引入宿主細胞，則可通過標準技術，比如Southern雜交分析、限制性酶分析、PCR分析包括逆轉錄酶PCR(rt-PCR)，或通過免疫測定以檢測預期蛋白質產物的存在等技術，證實本發明的多核苷酸分子的整合和維持情況(或者是在宿主細胞基因組中，或者是以附加體形式存在)。可通過至少四條常規途徑中的任一種鑑定含有和/或表達本發明多核苷酸分子的宿主細胞，這幾條途徑在本領域中是眾所周知的，它們包括(ⅰ)DNA-DNA、DNA-RNA、DNA-反義RNA雜交；(ⅱ)檢測「標記」基因功能的存在；(ⅲ)通過測量宿主細胞中諸如DHFR-TS特異性mRNA轉錄物的表達確定轉錄水平；或(ⅳ)比如通過免疫測定或通過檢測DHFR酶促活性如由NADPH氧化所催化的二氫葉酸轉變為四氫葉酸，或檢測TS酶促活性如脫氧尿苷一磷酸轉變為脫氧胸苷一磷酸等方法，檢測成熟多肽產物的存在，如同本領域所知的那樣。
重組多肽的表達和純化一旦已將本發明的多核苷酸分子穩定引入適當的宿主細胞內，則克隆性地增殖該經轉化的宿主細胞，並在有助於最大量生產編碼的DHFR-TS蛋白的條件下培養由此獲得的細胞。這樣的條件通常包括培養經轉化的細胞至高密度。若表達載體中含有誘導型啟動子，則給予所需的適當誘導條件以誘導表達，誘導條件的例子比如有溫度變動、營養衰竭、加入義務誘導物(如碳水化合物的類似物，比如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、過量代謝副產物的累積等等。
若表達的DHFR-TS蛋白被保留於宿主細胞內，則收集和裂解該細胞，並在本領域已知可將蛋白質降解減到最小的提取條件下如4℃下，或在存在蛋白酶抑制劑時，或同時具備這兩個要求的條件下，從裂解物中純化該產物。若表達的DHFR-TS蛋白已從宿主細胞內分泌出來了，則可簡單地收集已耗盡養分的培養基，並從中分離該蛋白質。
適當時，可利用標準方法，從細胞裂解物或培養基中純化表達的DHFR-TS蛋白，這些方法包括但不限於下述方法中的一種或多種硫酸銨沉澱、大小分級分離、離子交換層析、HPLC、密度離心，以及親和層析。若表達的DHFR-TS蛋白表現出酶促活性，如具有由NADPH氧化所催化的將二氫葉酸轉變為四氫葉酸的能力(DHFR)，或具有將脫氧尿苷一磷酸轉變為脫氧胸苷一磷酸的能力(TS)，則如本領域所知，通過使用適當的測定法，可在純化過程中的每一步驟檢測製備物的純度提高程度。若表達的蛋白質缺乏生物活性，則可基於諸如大小、或與特異於DHFR-TS蛋白的抗體的反應性，或通過融合標記的存在情況而對其進行檢測。為了應用於本發明實施過程中，該重組型表達的DHFR-TS蛋白可以是產生在培養物中或存在於細胞裂解物中的未純化狀態，或者已從其中部分地或基本上得到了純化。
因此本發明提供了一種製備DHFR-TS蛋白的方法，該方法包括在有利於DHFR-TS蛋白表達的條件下培養轉化了重組表達載體的宿主細胞，以及從細胞培養物中回收DHFR-TS蛋白，所說的重組表達載體含有與一種或多種調控元件有效相連的本發明多核苷酸分子。
本發明還提供了含有SEQ ID NO:3所示胺基酸序列的分離的新胞子蟲DHFR-TS蛋白，或含有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列的蛋白質；與這些蛋白質基本上同源的多肽；以及前述蛋白質或多肽的肽片段。比如，本發明的肽片段可以由新胞子蟲DHFR-TS蛋白的DHFR結構域或TS結構域所組成。新胞子蟲DHFR-TS蛋白的推定DHFR結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO:3中約第1位胺基酸殘基至約第323位胺基酸殘基，推定TS結構域的胺基酸序列為約第324位胺基酸殘基至約第612位胺基酸殘基。
DHFR-TS蛋白的用途一旦已獲得足夠純的DHFR-TS蛋白，則可通過標準方法對其進行表徵，這些標準方法包括SDS-PAGE、大小排阻層析、胺基酸序列分析、生物活性等等。可利用親水性分析(參見如Hopp和Woods,1981，美國國家科學院院報，78:3824)或相似的軟體系統對DHFR-TS蛋白作進一步表徵，以鑑定出疏水區和親水區。可進行結構分析以鑑定出DHFR-TS蛋白中表現特定二級結構的區域。通過各種生物物理方法，如X-射線結晶學(Engstrom,1974，生物化學與實驗生物學(Biochem.Exp.BioL),11:7-13)、計算機模型分析(Fletterick和Zoller(編),1986，分子生物學現代通信，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)以及核磁共振(NMR)等，可確定和分析DHFR-TS蛋白與其任一種底物之間相互作用的位點。可利用由上述研究得到的信息設計出更為有效的缺失突變體和疫苗組合物，或者設計或篩選出可在體內特異性阻斷新胞子蟲DHFR-TS蛋白的DHFR或TS結構域的酶促活性的治療用或藥用化合物。
本發明分離的DHFR-TS蛋白，不管是重組型的或其它形式的，都可用於多種目的。比如，可利用該蛋白質篩選出能特異性阻斷DHFR或TS結構域的酶促活性的抑制劑。這樣的篩選方法在本領域中是眾所周知的。也可將本發明的DHFR-TS蛋白用作抗原以產生可與該蛋白質特異性反應的多克隆或單克隆抗體，正如下文所述。可將這樣的抗體用作親和試劑，以純化天然或重組型DHFR-TS蛋白，或用作診斷試劑，以通過諸如ELISA或Western印跡測定等方法檢測動物細胞、組織或體液樣品中新胞子蟲特異性DHFR-TS蛋白的存在。
可利用已知方法製備抗DHFR-TS蛋白的抗體。可利用該部分或基本上純化好的抗原免疫多種宿主動物，包括豬、牛、馬、兔、山羊、綿羊和小鼠。可利用諸如下述的佐劑以提高抗體產量。通過標準方法可從被免疫動物的血清中獲取多克隆抗體，並測定其抗DHFR-TS蛋白的特異性。或者，通過培養的連續細胞系，利用可提供抗體分子生成的任何一種技術，可製備抗DHFR-TS蛋白的單克隆抗體。這些技術包括但不限於最初由Kohler和Milstein(自然，1975,256:495-497)所記載的雜交瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，1983，今日免疫學，4:72；Cote等，1983，美國國家科學院院報，80:2026-2030)，以及EBV雜交瘤技術(Cole等，1985，單克隆抗體和癌症治療，Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)。可對記載為用於生產單鏈抗體的技術(參見如美國專利4,946,778)作適當改進使其適合用於生產DHFR-TS抗原特異性單鏈抗體。這些出版物引入本文作為參考。
本發明也包括含有DHFR-TS抗原特異性結合位點的抗體片段，它們可通過已知技術產生。這樣的片段包括但不限於可通過胃蛋白酶消化完整抗體分子而產生的F(ab′)2片段，以及通過還原這些F(ab′)2片段的二硫橋而產生的Fab片段。或者，可構建Fab表達文庫(Huse等，1989，科學，246:1275-1281)以便快速鑑定出具有所需的對DHFR-TS抗原特異性的Fab片段。
生產單克隆抗體和抗體片段的技術在本領域中是眾所周知的，並且還記載於Harlow和Lane,1988，抗體:實驗室手冊，冷泉港實驗室，和J.W.Goding,1986，單克隆抗體原理和實踐，Academic Press,London等處，這些文獻引入本文作為參考。
新胞子蟲DHFR-TS基因的定向突變遺傳構建體基於本發明公開的多核苷酸分子，可製備出能用於失活新胞子蟲DHFR-TS基因的遺傳構建體。聯合使用適當設計的遺傳構建體和目前已知的或即將開發的遺傳技術，可失活新胞子蟲DHFR-TS基因。比如，利用本發明的具有以下功能的遺傳構建體，可失活新胞子蟲DHFR-TS基因(a)可缺失全部或部分DHFR-TS基因；或(b)可以一段不同的核苷酸序列置換DHFR-TS基因的一部分；或(c)可將一個或多個核苷酸、或者可能含有新胞子蟲或其它來源的核苷酸序列的寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入DHFR-TS基因中。
若與DHFR-TS基因未被失活的同一株系新胞子蟲細胞相比，DHFR-TS基因的失活降低了攜有已失活的DHFR-TS基因的新胞子蟲細胞的病原性，並且攜有已失活的DHFR-TS基因的新胞子蟲細胞可用於疫苗組合物、特別是經修飾的活疫苗中以誘導哺乳動物中抗新胞子蟲病的保護性反應，則其內DHFR-TS基因已經失活的新胞子蟲細胞在實施本發明過程中是有用的。
在一個非限制性的實施方案中，可利用本發明的遺傳構建體，通過用突變的新胞子蟲DHFR-TS基因或其部分置換野生型DHFR-TS基因或其部分，從而失活野生型新胞子蟲DHFR-TS基因。可通過各種已知方法製備能用於這樣的遺傳構建體中的突變新胞子蟲DHFR-TS基因序列，這些方法包括易錯聚合酶鏈反應，或盒式誘變等。例如，可應用寡核苷酸介導的誘變方法，以確定的方式改變野生型新胞子蟲DHFR-TS基因的ORF序列，比如將移框或終止密碼子引入序列內特定區域中。另一方面或者額外地，通過將一個或多個核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入新胞子蟲DHFR-TS基因中，或以一個或多個核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子置換新胞子蟲DHFR-TS基因的一部分，可製備出能用於本發明遺傳構建體的突變核苷酸序列。這樣的寡核苷酸分子或多核苷酸分子可得自任何天然來源，或可以是合成的。插入序列可以是僅用於破壞新胞子蟲DHFR-TS基因的讀框，或還可以編碼異源基因產物如選擇標記。也可利用隨機誘變法產生突變新胞子蟲DHFR-TS基因序列以用於本發明的遺傳構建體中。可利用任何一種已知的或即將開發的技術完成隨機誘變，這樣的技術比如是將攜有新胞子蟲DHFR-TS基因的細胞暴露於紫外線照射或X-射線，或化學誘變劑如N-甲基-N′-亞硝基胍、乙基甲磺酸、亞硝酸或氮芥類，然後篩選出在其DHFR-TS基因內攜有突變的細胞。有關誘變技術的綜述參見如Ausubel,1989，出處同前。
如上所述，用於生成在實施本發明過程中有用處的經修飾的新胞子蟲細胞的突變可發生在新胞子蟲DHFR-TS基因內的任何地方，包括ORF內、啟動子區內，或該基因或ORF旁側的任何其它序列內。這樣的新胞子蟲細胞是突變體，其內可能產生由新胞子蟲DHFR-TS基因所編碼的該蛋白質的修飾形式，或者根本不產生這樣的蛋白質。在一個優選實施方案中，這樣的新胞子蟲細胞表現出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型(以下總稱為dhfr--ts-表型)。此外，這樣的新胞子蟲細胞也可以是無效突變體、條件突變體或滲漏突變體。
或者本發明的遺傳構建體可含有如選自SEQ ID NO:1所示的旁側序列之類的新胞子蟲DHFR-TS基因或ORF的原位天然旁側核苷酸序列，其中僅存在極少數或根本沒有該基因本身的編碼序列的核苷酸序列。這樣的遺傳構建體可能在諸如缺失整個基因或ORF的工作中有用處。
在一個優選實施方案中，本發明的遺傳構建體中含有可用於失活新胞子蟲DHFR-TS基因的多核苷酸分子，其中含有(a)具有與編碼N.caninum的DHFR-TS蛋白的核苷酸序列差不多相同、但其中還含有一個或多個失活突變的核苷酸序列的多核苷酸分子；或(b)由新胞子蟲DHFR-TS基因的ORF的天然原位旁側的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。一旦轉化至新胞子蟲株系的細胞中，該遺傳構建體的多核苷酸分子能通過諸如同源重組等特異地定位到新胞子蟲DHFR-TS基因，由此替換該基因或其中一部分或者插入該基因中。此重組事件的發生導致本是新胞子蟲特定株系的天然的新胞子蟲DHFR-TS基因發生了失活。
在寄生性原生動物中進行同源基因替換的方法在本領域中是已知的，並描述於Cruz和Beverly,1990，自然，348:171-173；Cruz等，1991，美國國家科學院院報，88:7170-7174；Donald和Roos,1994，分子生物化學和寄生蟲學，63:243-253；以及Titus等，1995，美國國家科學院院報，92:10267-10271等文獻中，所有這些文獻均引入本文作為參考。
為通過同源重組進行定位基因突變，優選該遺傳構建體是含有上述突變的核苷酸序列的環狀或線性質粒。在一個非限制性的實施方案中，儘管長度更短的核苷酸也可能是有效的，但使用了突變序列中至少約200個核苷酸以將本發明的遺傳構建體特異地定位於新胞子蟲DHFR-TS基因，從而進行同源重組。此外，該質粒優選包含編碼報導分子基因產物或其它選擇標記的額外核苷酸序列，其構建方式將使其可插入至新胞子蟲基因組中與天然新胞子蟲DHFR-TS基因的調控元件編碼序列有效相連。可用於實施本發明的報導基因在本領域中是眾所周知的，包括編碼CAT、綠色螢光蛋白和β-半乳糖苷酶等的那些報導基因。編碼選擇標記的核苷酸序列在本領域中也是眾所周知的，包括編碼可賦予對抗生素或抗代謝物的抗性、或可提供營養缺陷型需要的基因產物的那些核苷酸序列。這樣的序列的例子包括編碼乙嘧啶抗性或新黴素磷酸轉移酶(可賦予對氨基糖苷類的抗性)或潮黴素磷酸轉移酶(可賦予對潮黴素的抗性)的那些序列。
可用於製備本發明遺傳構建體的方法在本領域中是眾所周知的，包括體外重組技術、合成技術以及體內遺傳重組等，這些方法描述於Maniatis等，1989(出處同前)；Ausubel等，1989(出處同前)；以及Sambrook等，1989(出處同前)等出版物中。
可將本發明遺傳構建體與已知技術如電穿孔法聯用從而對新胞子蟲細胞進行轉化或轉染。轉化體的篩選可利用標準方法，如通過篩選可表達與構建體相關的選擇標記的細胞。可通過遺傳分析如Southern印跡分析，或通過Northern分析檢測編碼DHFR-TS蛋白的mRNA轉錄物的缺乏，或通過新表型的出現如病原性降低，或通過如免疫分析確定的缺乏DHFR-TS蛋白的細胞的出現，或其中的一些組合方法而鑑定出已成功地完成了重組事件並且特定靶基因已被失活的轉化體。
可按照本發明進行修飾的新胞子蟲細胞優選是速殖體，但也可以是慢殖體或卵母細胞。儘管在新胞子蟲生命周期的某些階段的細胞是二倍體，但速殖體是單倍體。因此，由於速殖體僅需要一次成功的重組事件來破壞特定的新胞子蟲基因，故而優選利用速殖體產生表現適當突變體表型的經修飾的新胞子蟲細胞。或者，在新胞子蟲的二倍體細胞中，對各個基因來說都必須破壞兩個等位基因。這可以通過利用含有兩個不同的選擇標記的遺傳構建體依次導向第一個等位基因和第二個等位基因而完成。
在另一個非限制性的實施方案中，本發明遺傳構建體還額外含有從新胞子蟲或可感染動物的不同病原來源的不同基因或編碼區，該基因或編碼區編碼的抗原可用於在接種了本發明經修飾的活新胞子蟲細胞的動物中誘導分別的且截然不同的保護性免疫反應。可進一步加工所說的額外基因或編碼區，使其含有信號序列，所說的信號序列可促使所編碼的抗原從該經修飾的活新胞子蟲細胞中分泌出來，從而使該抗原可展示於接種動物的免疫系統內。
本發明因而提供了其內DHFR-TS基因已被破壞的經修飾的活新胞子蟲細胞。此外，本發明提供了製備經修飾的活新胞子蟲細胞的方法，該方法包括(a)用本發明遺傳構建體轉化新胞子蟲細胞；(b)篩選出其內DHFR-TS基因已被該遺傳構建體破壞的轉化細胞；以及(c)從步驟(b)的細胞中篩選出可用於疫苗中以保護哺乳動物以抗新胞子蟲病的那些細胞。
培養新胞子蟲細胞通過按照本領域所描述的已知技術，利用速殖體感染任何受體細胞系、優選哺乳動物細胞系，可在體外培養和維持新胞子蟲細胞以用於本發明中。可用於培養新胞子蟲的速殖體的哺乳動物細胞系包括諸如人包皮成纖維細胞(Lindsay等1993，美國獸醫研究雜誌，54:103-106)、牛心肺主動脈內皮細胞(Marsh等，1995，出處同前)，牛單核細胞(Lindsay和Dubey,1989，出處同前)和猴腎細胞等。例如，可在Hs68人包皮成纖維細胞(ATCC No.CRL-1635)的單層中培養N.caninum的速殖體(Lindsay等，1993，出處同前)；可用於本發明的感染了N.caninumNC-1株系的速殖體的MARC145猴腎細胞被保藏於ATCC中(保藏號為ATCCNo.12231)。可類似地對慢殖體進行培養和操作。
可在本領域所記載的多種類型培養基的任何一種中培養哺乳動物細胞培養物，維持已感染了新胞子蟲的細胞培養物。例如，可在補加了10％(V/V)熱滅活胎牛血清(FBS)或成年馬血清(ES)、2mM L-穀氨醯胺、50U/ml青黴素以及50μg/ml鏈黴素的Dulbecco′s基本培養基(DMEM,Gibco Laboratories,N.Y.)中培養感染了N.caninum的速殖體的牛心肺主動脈內皮細胞的穩定單層培養物(Conrad等，1993，出處同前)。可在含有2％(V/V)FBS、1.0mM丙酮酸鈉、1×104U/ml青黴素、1×104μg/ml鏈黴素、5×10-2mM 2-硫基乙醇和0.3mg/ml L-穀氨醯胺的RPMI 1640(維持培養基)中維持Hs68人包皮成纖維細胞。可在相同的培養基中維持感染了新胞子蟲的Hs68人包皮成纖維細胞的單層培養物，但要求該培養基中FBS水平提高到10％(V/V)(生長培養基)。
通常在標準組織培養條件下比如37℃、5％CO2中維持感染了新胞子蟲的哺乳動物細胞單層培養物。若培養物中70-90％的哺乳動物細胞已被感染(這可以利用標準技術顯微觀察而確定)，則通常將速殖體傳代到未感染的單層培養物中。通過利用任何一種標準方法裂解宿主細胞並通過諸如過濾或離心等方法收集速殖體，可以從被感染的哺乳動物細胞培養物中收穫速殖體。
可按照上述方法，在含有胸苷的培養基中，於哺乳動物細胞內培養本發明的已被修飾並表現出dhfr--ts-表型的新胞子蟲細胞。
抗新胞子蟲的疫苗本發明提供了抗新胞子蟲病的疫苗，其中含有免疫有效量的經修飾的活新胞子蟲細胞如前述的dhfr--ts-無效突變體，以及獸醫可接受性載體。
本發明還提供了製備可保護哺乳動物以抗新胞子蟲病的疫苗的方法，其中包括製備經修飾的活細胞如上述製備的表現dhfr--ts-表型的那些細胞，並以適於哺乳動物施用的形式將免疫有效量的經修飾的活細胞與獸醫可接受性載體組合起來。
如本文所用，術語「免疫有效量」是指經一次施用或分多次施用後，一種哺乳動物的一個成員被施用的本發明經修飾的活新胞子蟲細胞的量足以誘導抗新胞子蟲病的保護性反應。
詞語「足以誘導保護性反應」在此處廣泛使用，包括由於疫苗接種而在動物中誘導或增強任一種基於免疫的反應(包括抗體，或細胞介導的免疫反應，或兩種情況兼而有之)，這樣的反應可保護被接種動物以抗新胞子蟲病。此處所用的術語「保護性反應」和「保護」不僅指與同一種類的未被接種的感染動物相比，接種動物內可絕對避免新胞子蟲病或可絕對避免導致新胞子蟲病的病原的感染，還指其中這類病原感染的程度或速率有任何可測的降低，或該疾病的嚴重程度、或由於該抗原感染導致的任何症狀或狀態方面存在任何可測的降低，包括諸如在一種或多種組織中損傷的形成速率和絕對數量方面有任何可測的降低，或在流產發生、從懷孕哺乳動物到其胎兒或從哺乳動物親本到其後代的感染傳播等方面都存在任何可測的降低。
疫苗可簡單地含有小份培養液，所說的培養液中含有經修飾的活新胞子蟲細胞，該細胞或者游離存在於培養基中，或者存在於哺乳動物宿主細胞中，或者是它們的組合。這種疫苗可對哺乳動物直接施用；或代之以含有聯合使用了選自本領域所知的適於施用途徑的那些載體中的一種獸醫可接受性載體的經修飾的活新胞子蟲細胞。較好是疫苗組合物中經修飾的活新胞子蟲細胞仍保留了至少一定程度活性。例如，可利用標準緩衝液、載體、穩定劑、稀釋劑、保存劑和/或溶劑按照通用方法將本發明的疫苗組合物製成製劑，也可以製成製劑以便於持續性釋放。稀釋劑可以包括水、鹽溶液、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖等。穩定劑可包括白蛋白等。在經修飾的活疫苗中特別有用的合適的其它疫苗賦形劑和添加劑對本領域的技術人員來說是已知的，或者是顯而易見的。參見如Remington的藥物科學，第18版，1990,Mack Publishing，該書引入本文作為參考文獻。
可用於本發明疫苗中的經修飾的活新胞子蟲細胞優選是速殖體，但也可以是慢殖體或卵母細胞，或它們的某種組合。
只要該疫苗組合物中經修飾的活新胞子蟲細胞仍保持了至少一定程度的活性，則本發明疫苗中還可含有一種或多種額外的免疫調節組分如佐劑或細胞因子等。可用於本發明疫苗中的佐劑的非限制性例子有RIBI佐劑系統(Ribi Inc.,Hamilton,MT)，明礬、礦物質凝膠比如氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑比如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA),QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)和SAF-M(Chiron,Emeryville CA)，AMPHIGEN佐劑，皂苷、QuilA或其它皂苷組分，單磷酸類酯A和Avridine脂胺佐劑。在本發明疫苗中有用的水包油乳劑的非限制性的幾個特殊例子包括改進的SEAM62和SEAM 1/2配方。改進的SEAM62是一種水包油乳劑，其中含有5％(V/V)角鯊烯(Sigma)，1％(V/V)SPAN85去汙劑(ICI Surfactants),0.7％(V/V)TWEEN80去汙劑(ICI Surfactants),2.5％(V/V)乙醇，200μg/ml QuilA,100μg/ml膽甾醇以及0.5％(V/V)卵磷酯。改進的SEAM 1/2是一種水包油乳劑，其中含有5％(V/V)角鯊烯，1％(V/V)SPAN85去汙劑，0.7％(V/V)TWEEN80去汙劑，2.5％(V/V)乙醇，100μg/ml QuilA，以及50μg/ml膽甾醇。疫苗中可包含的其它免疫調節劑包括諸如一種或多種白細胞介素、幹擾素或其它已知的細胞因子。可將疫苗冷凍貯存，施用前再融化。
只要疫苗組合物中經修飾的活新胞子蟲細胞仍保留有至少一定程度的活性，則可任選地將本發明的疫苗配製成可使已經修飾的活新胞子蟲細胞持續性釋放的形式。這種持續性釋放劑型的例子包括聯合使用經修飾的活新胞子蟲細胞與生物適應性聚合物的組合物，比如聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物(poly(Lactic-co-glycolic acid)、甲基纖維素、透明質酸、膠原蛋白等。藥物傳遞賦形劑中可降解性聚合物的結構、選擇和使用在一些出版物中都有綜述，包括A.Domb等，1992，用於高等技術的聚合物，3:279-292，該文引入本文作為參考文獻。選擇和在藥物劑型中使用聚合物的其它規則可見於M.Chasin和R.Langer(編),1990，「生物降解性聚合物用作藥物傳遞系統」，藥物和醫藥科學一書第45卷，M.Dekker，紐約，該文也引入本文作為參考文獻。另一方面或額外地，只要疫苗組合物中經修飾的活新胞子蟲細胞仍保持了至少一定程度的活性，則可微囊包裝經修飾的活新胞子蟲細胞以提高施用和效力。微囊包裝抗原的方法在本領域中是眾所周知的，包括如美國專利3137631、美國專利3959457、美國專利4205060、美國專利4606940、美國專利4744933、美國專利5132117以及國際申請公開號WO95/28227等所記載的技術，所有這些出版物均引入本文作為參考文獻。
只要疫苗組合物中經修飾的活新胞子蟲細胞仍保持了至少一定程度的活性，也可使用脂質體以促使本發明經修飾的活新胞子蟲細胞持續性釋放。有關如何製備和使用脂質體劑型的細節可見於美國專利4016100、美國專利4452747、美國專利4921706、美國專利4927637、美國專利4944948、美國專利5008050和美國專利5009956，所有這些均引入本文作為參考文獻。
本發明還提供了一種聯合疫苗，以用於保護哺乳動物以抗新胞子蟲病和任選地會折磨哺乳動物的一種或多種其它疾病或病理狀態，該聯合疫苗含有免疫有效量的第一組分、免疫有效量的第二組分，以及獸醫可接受性載體，所說的第一組分含有經修飾的活新胞子蟲細胞，第二組分能誘導保護性反應以抗一些會折磨哺乳動物的疾病或病理狀態。
如本領域所知，聯合疫苗的第二組分的選擇是基於其能夠誘導保護性反應以抗新胞子蟲病或會折磨哺乳動物物種成員的其它疾病或病理狀態。只要在所獲得的疫苗組合物中經修飾的活新胞子蟲細胞仍保留有至少一定程度的活性，則已知可用於特定哺乳動物物種的疫苗組合物中的任何一種免疫組合物均可用於該聯合疫苗的第二組分中。這樣的免疫組合物包括但不限於可提供抵抗病原的保護性反應的那些組合物，所說的病原選自牛皰疹病毒(與「感染性的牛鼻氣管炎」同物異名)，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹瀉病毒，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒，鉤端螺旋體、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、支原體、克雷伯氏菌、沙門氏菌、輪狀病毒、冠形病毒、狂犬病病毒、溶血巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、梭狀芽孢桿菌屬種類(Clostridia spp.),Tetanus toxoid，大腸桿菌，隱孢子蟲屬種類(Cryptosporidium spp.)，艾美球蟲屬種類，毛滴蟲屬種類，以及其它真核生物寄生蟲等等。
只要該疫苗組合物中所說的細胞仍保留有活性，則如上所述，本發明的聯合疫苗還可含有一種或多種額外的免疫調節組分，包括諸如佐劑或細胞因子。可冷凍貯存該聯合疫苗的抗原，在施用前再將其融化。
本發明還提供了保護哺乳動物以抗新胞子蟲病的方法，包括給哺乳動物施用一種疫苗，該疫苗中含有免疫有效量的本發明經修飾的活新胞子蟲細胞以及獸醫可接受性載體。優選經胃腸外方式施用該疫苗，如皮下注射或肌肉內注射。然而，該疫苗的施用方式也可以是腹膜內或靜脈內注射，或其它途徑，包括諸如通過口腔、鼻內、直腸、陰道、眼內等途徑，或這些途徑的組合，也可通過本領域已知的延遲釋放器械等。本領域技術人員懂得如何按照選用的途徑製備疫苗組合物。
可通過常規途徑確定有效劑量，即先使用低劑量經修飾的活新胞子蟲細胞，然後提高劑量並測定效果。確定每隻動物的最佳劑量時，應考慮各種因素。最基本的是該動物的品種、大小、年齡和一般狀態，動物內是否存在其它藥物、該動物接種疫苗所抗的具體新胞子蟲品種或株系的毒性，等等。最好是參考其它動物的研究結果後再確定實際劑量。
也可依據上述因素選擇疫苗的接種方法。取決於一系列因素，包括諸如其它動物中暴發新胞子蟲病的時間等，可在特定動物一生中的任何時間施用本發明的疫苗。該疫苗可施用給處於斷奶年齡或更年幼的動物，也可施用給更成熟的動物，如作為繁殖前疫苗以抗與新胞子蟲相關的先天性疾病或流產。為達到有效保護，可能僅需要原始疫苗接種，或也可能需要一次或多次輔助性疫苗接種。檢測是否已獲得了適當免疫保護的一種方法是在接種疫苗後測定動物中的血清轉變和抗體滴度。最好由獸醫根據對所有相關因素(其中一些在前文已有敘述)的分析來確定接種疫苗的時間和輔助劑的數量(如果有的話)。
疫苗中經修飾的活新胞子蟲細胞的量優選為約1×103-1×108/ml，更優選為約1×105-1×107/ml。適當的劑量大小為大約0.5ml-10ml，更優選為大約1ml-5ml。
在保護哺乳動物以抗新胞子蟲病方面，本發明的疫苗有所用處。如本文所用，術語「哺乳動物」是指可利用本發明疫苗得到保護而抗新胞子蟲病的任何一種哺乳動物物種，包括狗、牛、山羊、綿羊和馬等等。該疫苗在懷孕和未懷孕哺乳動物的保護中都有用處。
本發明還提供了用於對哺乳動物接種疫苗以抗新胞子蟲病的試劑盒，所說的試劑盒中包含兩種容器，第一種容器中含有免疫有效量的本發明經修飾的活新胞子蟲細胞，第二種容器中含有獸醫可接受性載體或稀釋劑。可以冷凍形式貯存該試劑盒中經修飾的活細胞，在施用前再使其融化。
下述實施例僅是舉例說明，並不用來限制本發明的範圍。
實施例新胞子蟲DHFR-TS基因的分離擴增N.caninum的DHFR結構域的外顯子1依據已公開的鼠弓形體DHFR-TS基因的序列(Roos,1993，生物化學雜誌，268:6269-6280)，設計併合成特異於鼠弓形體DHFR-TS基因外顯子1 DNA序列5′和3′末端的長度為20個鹼基的寡核苷酸引物。使用GNOMETM試劑盒(Bio 101,La Jolla,CA)，利用生產商提供的試劑和方法，製備N.caninum的NC-1株系的基因組DNA。PCR反應中使用了0.5μg基因組DNA，引物Tgdhfrexon 1-5′(5′-ATGCAGAAACCGGTGTGTCT)(SEQ ID NO:4)和Tgdhfrexon1-3′(5′-AGGGAAGAGGAAACGACGAT)(SEQ ID NO:5)各120pmol,dATP、dGTP、dCTP和dTTP(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)各2.5mM,PCR緩衝液(Perkin-Elmer)，以及AMPLITAQTMDNA聚合酶(Perkin-Elmer)1.5單位。PCR循環設置為94℃1分鐘進行1個循環，94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘進行29個循環。
由上述得到約0.3kb的PCR片段，未經進一步處理，利用T4 DNA連接酶將該片段克隆到pCRⅡ載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通過雙脫氧鏈末端終止測序法對該克隆的0.3kb片段進行測序，並已確定該序列與鼠弓形體相應的DHFR-TS基因外顯子1的序列同源性大於85％。
新胞子蟲DHFR-TS基因的克隆和測序在噬菌體載體λDASHⅡ(Stratagene,La Jolla,CA.)中構建N.caninum NC-1株系的基因組DNA文庫。用α-32p-dCTP放射性標記上述的約0.3kb的片段，並通過噬菌斑雜交，對大約5×105個噬菌體克隆進行篩選以獲得對所說的標記片段具有反應性的克隆。經三輪篩選以富集反應性克隆後，鑑定出12個可與該約0.3kb的片段反應的噬菌體克隆。
利用λDNA分離系統(Qiagen,Chatsworth,CA)，按照生產商提供的方法，從所說的12個陽性克隆中的3個內製備噬菌體λ克隆的DNA。利用NotⅠ消化已定名為λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)(也被定名為4C13或λCY50)的這些λ噬菌體克隆之一的DNA，以釋放出11kb的DNA片段，並按照Sambrook等，1989(出處同前)所述的方法對該片段進行亞克隆。利用下述寡核苷酸，對含有該11kb DNA片段的質粒亞克隆的DNA進行PCR，這些寡核苷酸是依據DHFR-TS序列而設計的，序列分別為5′-CCCCTCGTGGACCGGCTGAATA(SEQ ID NO:6)；5′-TCCGTG CGTGCCAAGAGACTG(SEQ ID NO:7)；5′-ATGGAGATGGCGATGGGAGGAC(SEQ ID NO:8)；5′-AGTATGTACACGAAGCCTCAAT(SEQ ID NO:9).在PCR反應中以下述組合使用寡核苷酸SEQ ID NO:6與8,SEQ IDNO:6與9；SEQ ID NO:7與8；以及SEQ ID NO:7與9。經PCR得到了特異性產物，表明該11kb片段內存在新胞子蟲DHFR-TS基因。對含有該11kb片段的質粒亞克隆進一步的限制性分析表明在一個NotⅠ位點的1.5kb範圍內存在一個不對稱的HindⅢ位點。然後利用雙脫氧鏈末端測序方法，通過引物步行技術，確定從一側的NotⅠ位點到另一側的HindⅢ位點(約9.6kb)間的DNA序列。利用計算機軟體系統DNASTARTM(DNASTAR Inc.,Madison,WI)，對上述獲得的DNA序列進行分析。
上述測序片段的長度為9603bp(SEQ ID NO:1)，其中含有來自N.caninum NC-1株系的完整DHFR-TS基因的序列。將此新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列與已公開的鼠弓形體DHFR-TS基因序列相比較以推測外顯子與內含子的位置，以及DHFR和TS結構域的邊界。推測該新胞子蟲DHFR-TS基因含有10個外顯子和9個內含子，位置如下外顯子1——由2405之前至2724；外顯子2——由3212至3348；外顯子3——由3925至4262；外顯子4——由4491至4737；外顯子5——由5214至5307；外顯子6——由5678至5750；外顯子7——由6129至6270；外顯子8——由6685至6777；外顯子9——由7264至7574；以及外顯子10——由8116至8199以後。在內含子-外顯子連接處存在一致的剪切信號。根據其與已公開的鼠弓形體DHFR-TS序列的結構相似性，推測DHFR結構域為從大約第2405nt至大約第4664nt，推測TS結構域為從大約第4665nt至大約第8199nt。
推測的編碼來自N.caninum NC-1株系的DHFR-TS蛋白的開放閱讀框(ORF)長度為1839bp(SEQ ID NO:2)。編碼推測的DHFR結構域的ORF是從大約第1nt至大約第969nt，編碼推測的TS結構域的ORF是從大約第970nt至大約第1836nt。N.caninum NC-1株系的DHFR-TS蛋白推斷的胺基酸序列長度為612個胺基酸(SEQ ID NO:3)。含有推測的DHFR結構域的推斷胺基酸序列為從大約第1位胺基酸殘基至大約第323位胺基酸殘基；含有推測的TS結構域的推斷胺基酸序列為從大約第324位胺基酸殘基至大約第612位胺基酸殘基。序列分析表明，N.caninum推斷的胺基酸序列和推測的鼠弓形體DHFR-TS序列之間，在DHFR結構域內存在73個胺基酸差異，在TS結構域內存在15個胺基酸差異。
生物材料保藏於1997年12月3日將下述生物材料保藏於美國典型培養物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852，美國，並給予了下述保藏號噬菌體λNcIDHFRTS ATCC No.209512上面所舉例的所有專利、專利申請和出版物均全文引入本文作為參考文獻。
本發明並不限於本文所描述的特定實施方案的範圍，這些實施方案僅用於舉例說明本發明的各個方面。任何功能等同的組合物和方法也在本發明的範圍內。事實上，根據前述的說明，對本領域的技術人員來說，除了本文所示和記載的那些外，本發明的各種改進也是顯而易見的。這樣的改進也落入所附權利要求的範圍內。
序列表110Krishnan,B.RajendraYoder,S.ChristineDurtschi,Becky A.120編碼新胞子蟲二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶的DNA130DHFR-TS14014115060/067,5071511997-12-04160序列數9170Patent In Ver.2.0-beta210SEQ ID NO:1信息2119603212DNA213Neospora caninum220221基因222(2405)..(8199)400SEQ ID NO:1gcggccgccg gcacaatgcc gagggcagcg cagggaaaaa ccggtcgaag ctgcttcacg 60tgtctgaaaa tagagccagc gctactgtcg cttcaaagaa cgagacttcc gcgccacaaa 120tcggtagtga cggtggccgg aagcgaaaat tttacgacga gcagctgcca gtcggtgtgt 180accgtcacca gcagaagtat gtcgcgaact gggtagatcc gaaaacccgg agacaaatca 240aggtctgttt ccccatcgac gtgtgGggag actctcaagc tcgcaacatg gctgccgttg 300cgaggcgtga gcgctgcgtg gatgctgacg aggtggctgc tattttcaat cgtgaagagc 360gcaccaagac atcaggacgt catccgagtc cttcgaggga tgacagcaaa cagacagcgt 420ctttcaatag tgctgttagg atgccagcag tccagggtgt ggattcaaaa acggagacgc 480actcggctcc ggcgctcgaa agcgcgtaga gcctgaggcc acaccacttc tggttttcag 540agagggcgtc gcactcacaa tttttttcga cttctttccg cacactgggg ccgtgtgctc 600gaacactttt tacccgtgtg accatgtgcc cgaacacttt ttatccgtgt 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catacacgtg agaaattggt gcccgtcgtt gaaaaatgct cactcccatc 6660cctcctggcg ttgcccattt gcaggccagg gcgtagacca actgaagaag gtgatcaaca 6720tgctgagaac gaatccaaca gaccggcgca tgctcatgac cgcttggaac cctgcgggtg 6780agatctctgt cttcaatctc tcctttccag ataatacgtg catttcaact ggaagctctt 6840acacagccgt gtgcacaacg ggaagacgct gacacatacg tgttggtccc cccaacgtta 6900tcttccgtgc cgtatctgtg tggctgctcc tctaaggtta ttgcgccgtg gtgatgtctc 6960tcgtatctcg tctgtgcttt tcgctggatg cctctgtgcc tagacatctc aaagtgtccc 7020tcccgtgtgg ggtcccgcga aacacttgcc actggccttt tcgcctcttg ccgctgtcgt 7080ctgttcctcg ggattcccta ctcggggacc tgccggtttc agtgcctttc ctccgcgggt 7140gcttcttccc ccgtcctcgc gccttgtgtt tctttgccgt ggcgactgcg ccgccgtgca 7200tgctgctcac ttccccccgt gcgcgtgtgt tttgtcctcg ccgtctctct ctttcccgtt 7260cagcgctgga cgaaatggcg ttgccgcctt gccacttgct gtgtcagttc tacgtggaga 7320acgacagaga cttgtcttgc gtcatgtatc agcggtcctg cgacgttggc ctcggggtgc 7380cgttcaacat tgcgtcctat tcccttctga cgctcatggt tgcgcacgtc tgcaacctga 7440agccgaagga gttcattcac ttcatgggca acacgcacgt ctactcgaac cacgtcgagg 7500ccctgaagga gcagctgcgc agagaaccga gacctttccc catcgtgaac accctgaaca 7560aggaacgcat ccaggtgcga agcaactggg aaggaaacgg cacaacggac acgcaaacaa 7620gcagaagagg cgaaacggac gacggcagcc gaggccccgg ccactgcgag ccgagcgcag 7680acacgctgct tccagccggc ctatattcgg aaagaaaggg acagtgtcga agggagcaca 7740cgagacgcaa caacgaaaag gaaacgcgat gcgtcgcaga tcggctcacc tatgtggtgc 7800gcggtgcggc gcccagatgg cgcggctgca gcgctcgaag gaagactgtc tttgggtgcg 7860tgtgaacgtt tgtccctgac gcgcggctga cagaacatga gagggctttt ttctgtgttg 7920cacgctctcc ggatgcatct ctttctgtgc cacgggaagc aaagacgtgt gtgttccccg 7980ggaattcgga aaagacccga gcatccgctg ccggcgatgg ggggggaggg gccgggcatt 8040ggatgcctcc cgcctcgtct tgtcgacggc cccaaaaccc gtcagtgcca cgttgtttgt 8100gagtgtgttc gccaggaaat cgacgacttc accgccgagg atttcgaggt cgtgggctac 8160gtgccgcatg gacgaatcca gatggagatg gctgtttagt ggaaaaatct gaaatatata 8220tatatatata tatatatata tatatatagg ttcctggttt tgcaccgttt tttcttctcc 8280ctccgaaggc attggtgaga gagcggtgga tgcgagggcg ctgaggccaa ctcagcggct 8340gtttggtccc tcggggaagc aagaaacggg tttcgcttcg ccccgttgct ttccgaaaca 8400accttaccgc gtttcaaagt cttttctctt tgtcaatgag cgccactact ttgtgggagt 8460cacgaatgtg cgcgtatccg gccttgtatg gaggtgcggc tgccgcgctc gtcgccggaa 8520cgctggactg tctgttgctt tcggggcctc tggcgtgctg cggcgtgggc gggggagtgg 8580caggcgctac ccccccgtcg gtcctcggtg tgcttttgac tcttggcgag tgcgtgaaac 8640ctaaatctcg acttgtttcg ctcgataagc tgcacactga gcactgaaga gttccccgca 8700cattatgagg ccgcgcgctc tttcgcgcct ggcacacacg cctaacacag ggtagctgcc 8760tgataaactg cctatcgcca ccaagggagc tgcctagcca agttgtcggt ggacaaaagt 8820cctcacacgc cccgcagacc cggaagcaca cgtttcagag accaccggaa atgcatagtt 8880cttcgtgccc tcgtcgttaa atacgtttcc tgtctcgtct gctggttttt gcttcgtgcg 8940ttcgctcgcg ctaagatgtc tagaaacggt ggacgccgtt tgcggctctc tctgccgccc 9000ttccgctgtg acttttccga cctgacctca cgcgcgtgtt ccacgtgaga caaccggtcg 9060gcggccgagg caggagactt gcgagaaagg aaacaagtcg gatgcacgaa cgtacgtaac 9120cccgcctcca aagttccccg ctccaaagag gaacgcggcg aggcgactcc tccggcgttg 9180cctacctcgc ctccacgcct aaagaggact gcagtgggtc gacgctcccg tccgcattgt 9240aaaaaagggg aaacaagacg agattcacgt ggaagaacca gaaacaacac cgaagcgacg 9300ctgtcaatcc ccacgggcgc gcagccttct cccgaccgca ctccgccgca tgcaagagcc 9360ctcgagtgct cccccgcagc tggcctttcc ctgtcgcctt ggaagcagag tgaacacaaa 9420gagcagagac tagccagggc gaggaagcct cagaaaaact gacggcgagg aacggcagtc 9480cgccggaaac aggggaaggc agacggcgaa tccgccgccg aagagaggac aaaaagagaa 9540gaaaaaaggc aaccgcgtgc cgaaaactgg gtaacgggac gacaggcagg aggcataaag 9600ctt 9603210SEQ ID NO:2信息2111839212DNA213Neospora caninum220221CDS222(1)..(1839)400SEQ ID NO:2atg cag aaa cca gtg tct ctt att gcc gcg atg acc ccc agg agg ggc48Met Gln Lys Pro Val Ser Leu Ile Ala Ala Met Thr Pro Arg Arg Gly1 5 10 15atc ggc gtc aac aac ggc ctg cca tgg ccc cac ttg gcc aca gat ttc96Ile Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro His Leu Ala Thr Asp Phe20 25 30aaa cac ttt tct cgc gtg acg aaa acg acg gcc gac gaa gtc tct cgc 144Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu 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160gcc ctg tct ctg ggc gtg gtg tct cac ctc tac atc acc cgc gtg gcg 528Ala Leu Ser Leu Gly Val Val Ser His Leu Tyr Ile Thr Arg Val Ala165 170 175cgt gac ttt cca tgc gac gtt ttc ttt ccc gct ttc ccc gga gac tcc 576Arg Asp Phe Pro Cys Asp Val Phe Phe Pro Ala Phe Pro Gly Asp Ser180 185 190att ctt tca aac aag cag gcg gcc tcc gcg agt cag cct tcg gct gct 624Ile Leu Ser Asn Lys Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ser Ala Ala195 200 205gcg gaa ccg gtg ttt gtt ccg ttt tgc ccc cag ctc ggg aga gag aag 672Ala Glu Pro Val Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys210 215 220agc aat gaa gcg tcg tac cga ccc atc ttt att tca aag acc tac tcg 720Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro Ile Phe Ile Ser Lys Thr Tyr Ser225 230 235 240gac aac gga gtg ccc tac gac ttt gtg gtt ctt gaa aaa ggg agg aag 768Asp Asn Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys245 250 255gct gac gct tgc agc gcc acg gaa tcg tgc gag ctt cgc ggc cct tgg 816Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu Arg Gly Pro Trp260 265 270acc 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atc cgc ggt gac acg aac gcg aat cac ctc tct gaa aag1200Leu Trp Phe Ile Arg Gly Asp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys385 390 395 400ggc gta aag atc tgg gac aag aat gtg aca aga gag ttc ctt gat tca1248Gly Val Lys Ile Trp Asp Lys Asn Val Thr Arg Glu Phe Leu Asp Ser405 410 415cgc aat ctt tcc cac cga gag gtc gga gac atc ggc ccg ggt tac ggc1296Arg Asn Leu Ser His Arg Glu Val Gly Asp Ile Gly Pro Gly Tyr Gly420 425 430ttc cag tgg aga cac ttc ggc gcg acc tac aag gac atg cac acg gac1344Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Asp Met His Thr Asp435 440 445tac act ggt cag ggc gta gac caa ctg aag aag gtg atc aac atg ctg1392Tyr Thr Gly Gln Gly Val Asp Gln Leu Lys Lys Val Ile Asn Met Leu450 455 460aga acg aat cca aca gac cgg cgc atg ctc atg acc gct tgg aac cct1440Arg Thr Asn Pro Thr Asp Arg Arg Met Leu Met Thr Ala Trp Asn Pro465 470 475 480gcg gcg ctg gac gaa atg gcg ttg ccg cct tgc cac ttg ctg tgt cag1488Ala Ala Leu Asp Glu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Leu Leu Cys Gln485 490 495ttc tac gtg gag aac gac aga gac ttg tct tgc gtc atg tat cag cgg1536Phe Tyr Val Glu Asn Asp Arg Asp Leu Set Cys Val Met Tyr Gln Arg500 505 510tcc tgc gac gtt ggc ctc ggg gtg ccg ttc aac att gcg tcc tat tcc 1584Ser Cys Asp Val Gly Leu Gly Val Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ser515 520 525ctt ctg acg ctc atg gtt gcg cac gtc tgc aac ctg aag ccg aag gag 1632Leu Leu Thr Leu Met Val Ala His Val Cys Asn Leu Lys Pro Lys Glu530 535 540ttc att cac ttc atg ggc aac acg cac gtc tac tcg aac cac gtc gag 1680Phe Ile His Phe Met Gly Asn Thr His Val Tyr Ser Asn His Val Glu545 550 555 560gcc ctg aag gag cag ctg cgc aga gaa ccg aga cct ttc ccc atc gtg 1728Aia Leu Lys Glu Gln Leu Arg Arg Glu Pro Arg Pro Phe Pro Ile Val565 570 575aac atc ctg aac aag gaa cgc atc cag gaa atc gac gac ttc acc gcc 1776Asn Ile Leu Asn Lys Glu Arg Ile Gln Glu Ile Asp Asp Phe Thr Ala580 585 590gag gat ttc gag gtc gtg ggc tac gtg ccg cat gga cga atc cag atg 1824Glu Asp Phe Glu Val Val Gly Tyr Val Pro His Gly Arg Ile Gln Met595 600 605gag atg gct gtt tag 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cggtgtgtct20210SEQ ID NO:5信息21120212DNA213Neospora caninum400SEQ ID NO:5agggaagagg aaacgacgat 20210SEQ ID NO:6信息21122212DNA213Neospora caninum400SEQ ID NO:6cccctcgtgg accggctgaa ta22210SEQ ID NO:7信息21121212DNA213Neospora caninum400SEQ ID NO:7tccgtgcgtg ccaagagactg 21210SEQ ID NO:8信息21122212DNA213Neospora caninum400SEQ ID NO:8atggagatgg cgatgggagg sc22210SEQ ID NO:9信息21122212DNA213Neospora caninum400SEQ ID NO:9agtatgtaca cgaagcctca at2權利要求
1．一種分離的多核苷酸分子，其中含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列。
2．權利要求1的分離的多核苷酸分子，其中所說的DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或含有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
3．權利要求2的分離的多核苷酸分子，其中含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列，或與存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
4．與含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子(a)SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列；或(b)存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
5．含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
6．由下述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的分離的多核苷酸分子(a)含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸分子；(d)與(a)、(b)或(c)中的多核苷酸分子中的任何一種基本上同源的多核苷酸分子；或(e)含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
7．權利要求6的多核苷酸分子，其由編碼下述蛋白質或多肽的肽片段的核苷酸序列所組成(a)由SEQ ID NO:3的胺基酸序列或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列所組成的DHFR-TS蛋白；或(b)與一種新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白由SEQ ID NO:3的胺基酸序列或存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列所組成。
8．權利要求7的多核苷酸分子，其由編碼DHFR-TS蛋白的DHFR結構域或TS結構域的核苷酸序列所組成。
9．含有N.caninum的DHFR-TS基因的原位旁側區的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自如SEQ ID NO:1所示的旁側核苷酸序列。
10．一種重組載體，其含有(a)含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有與存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸分子；(d)與(a)、(b)或(c)中的多核苷酸分子中的任何一種基本上同源的多核苷酸分子；(e)含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或具有由存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列；或者(f)由(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸分子中任何一種的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。
11．權利要求10的重組載體，其中所說的多核苷酸分子含有SEQ IDNO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列。
12．按照權利要求11的重組載體，其是噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)。
13．一種轉化的宿主細胞，其含有權利要求10的重組載體。
14．一種基本上純化好的蛋白質，該蛋白質含有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或含有存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
15．一種基本上已純化好的多肽，該多肽與權利要求14的蛋白質基本上同源。
16．權利要求14或15的蛋白質的肽片段。
17．權利要求16的肽片段，其由分離的新胞子蟲DHFR或TS結構域所組成。
18．一種可與新胞子蟲DHFR-TS蛋白特異性反應的抗體，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的胺基酸序列，或含有噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的胺基酸序列。
19．可用於失活新胞子蟲DHFR-TS基因的遺傳構建體，所說的遺傳構建體包含(a)含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列或含有與存在於噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)與(a)或(b)中的任何一種多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子；或者(d)由(a)、(b)或(c)中的任何一種多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子；但其中(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸分子的核苷酸序列還含有一個或多個可失活新胞子蟲DHFR-TS基因或所說基因的一部分的突變；或者含有由新胞子蟲DHFR-TS基因開放閱讀框的原位旁側區的一種或多種核苷酸序列所組成的多核苷酸分子；從而使得用該遺傳構建體轉化新胞子蟲細胞會導致新胞子蟲DHFR-TS基因或其一部分的失活。
20．權利要求19的遺傳構建體，其中還含有選擇標記。
21．權利要求19的遺傳構建體，其在破壞DHFR-TS基因的DHFR結構域或TS結構域方面有用處。
22．經權利要求19的遺傳構建體轉化的新胞子蟲細胞。
23．權利要求22的新胞子蟲細胞，其表現出dhfr-或ts-或dhfr--ts-表型。
24．一種製備經修飾的活新胞子蟲細胞的方法，其中包括用權利要求19的遺傳構建體轉化新胞子蟲細胞，並篩選出由於所說的轉化而產生的表現dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型的轉化細胞。
25．一種用於保護哺乳動物以抗新胞子蟲病的疫苗，其中含有免疫有效量的表現dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型的經修飾的活新胞子蟲細胞，以及獸醫可接受性載體。
26．權利要求25的疫苗，其中由於經權利要求19的遺傳構建體轉化，所述經修飾的活新胞子蟲細胞表現出dhfr-或ts-或dhfr--ts突變體表型。
27．權利要求25的疫苗，其中還含有佐劑或細胞因子。
28．權利要求27的疫苗，其中所說的佐劑選自由下述組成之組RIBI佐劑系統，明礬，礦物質凝膠，水包油乳劑，油包水乳劑，嵌段共聚物，QS-21,SAF-M,AMPHIGEN佐劑，皂苷，Quil A，單磷酸類脂A,Avridine脂胺佐劑，SEAM62和SEAM 1/2。
29．一種製備抗新胞子蟲病的疫苗的方法，其中包括聯合使用免疫有效量的經修飾的活新胞子蟲細胞與獸醫可接受性載體，所說的經修飾的活新胞子蟲細胞表現出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型。
30．對哺乳動物進行疫苗接種以抗新胞子蟲病的方法，其中包括給哺乳動物施用免疫有效量的經修飾的活新胞子蟲細胞，所說的經修飾的活新胞子蟲細胞表現出dhfr-或ts-或dhfr--ts-的突變體表型。
31．用於保護哺乳動物以抗新胞子蟲病以及任選地會折磨哺乳動物的一種或多種其它疾病或病理狀態的聯合疫苗，該聯合疫苗中含有免疫有效量的第一組分、免疫有效量的第二組分以及獸醫可接受性載體，所說的第一組分中含有表現dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型的經修飾的活新胞子蟲細胞，所說的第二組分能夠誘導抗其它會折磨哺乳動物的疾病或病理狀態的保護性反應。
32．權利要求31的聯合疫苗，其中所說的第二組分能夠誘導抵抗病原的保護性反應，所說的病原選自由下述組成之組牛皰疹病毒，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹瀉病毒，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒，鉤端螺旋體，彎曲桿菌，金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌，支原體，克雷伯氏菌，沙門氏菌，輪狀病毒，冠形病毒，狂犬病病毒，溶血巴斯德氏菌，多殺巴斯德氏菌，梭狀芽孢桿菌屬種類，Tetanus toxoid，大腸桿菌，隱孢子蟲屬種類，艾美球蟲屬種類，毛滴蟲屬種類。
33．用於對哺乳動物進行疫苗接種以抗新胞子蟲病的試劑盒，其中含有兩種容器，第一種容器中具有免疫有效量的經修飾的活新胞子蟲細胞，該細胞表現dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型，第二種容器中具有獸醫可接受性載體或稀釋劑。
全文摘要
本發明提供了含有編碼新胞子蟲DHFR－TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子,該多核苷酸分子在製備抗新胞於蟲病的經修飾的活疫苗中有用處,並可用作診斷試劑。本發明還提供了克隆和表達載體,已被轉化的宿主細胞,基本上已純化好的DHFR－TS蛋白和肽片段,可用於定位基因缺失的遺傳構建體,以及疫苗組合物。
文檔編號A61P31/04GK1225945SQ9812298
公開日1999年8月18日 申請日期1998年12月2日 優先權日1997年12月4日
發明者B·R·克裡斯南, B·A·德茨奇, S·C·友德 申請人:輝瑞產品公司