治療用再程序化、雜交幹細胞和成熟的製作方法

2023-09-14 12:01:15

專利名稱：治療用再程序化、雜交幹細胞和成熟的製作方法
技術領域：
本發明涉及治療用再程序化細胞的領域。具體地，本發明提供了治療用再程序化細胞，所述細胞不受衰老過程威脅，具有免疫相容性，植入後其將在合適的出生後(post-natal)細胞環境中發揮作用，以產生功能性細胞。此外，本發明提供了下述方法，用於提供適合用於治療用再程序化、移植和治療的雜交幹細胞。
背景技術：
幹細胞是能產生其它類型細胞的原始細胞。存在有數種幹細胞，它們也被稱為祖細胞。全能(totipotent)細胞被認為是機體的「主人(master)」細胞，因為它們含有產生機體加胎盤(為人類胚胎提供營養)所有細胞所需的全部遺傳信息。人類細胞僅在受精卵最初的極少數次分裂期間具有這種全能能力。全能細胞分裂三次或四次後，就出現了一系列的階段，其中細胞變得逐漸專門化。分裂的下一階段產生多能(pluripotent)細胞，其高度多用，能產生除了胎盤或子宮其它支持組織的細胞之外的任何細胞類型。在下一階段，細胞變為專能(multipotent)這意味著它們能產生數種其它細胞類型，但是這些類型數量有限。專能細胞的例子是造血細胞-能發育為數種血細胞的血細胞，但是不能發育為腦細胞。在使胚胎發展的細胞分裂長鏈末尾，是「終末分化(terminallydifferentiated)」細胞——被認為永遠定型為特定功能的細胞。
科學家長期持下述觀點分化的細胞不會被改變，或不會被導致以除了已天然定型的方式之外的任何方式來作用。但是在近來的幹細胞實驗中，科學家已能夠令血液幹細胞以類神經元的方式作用。因此，研究還聚焦於使專能細胞變為多能種類的方式(Kanatsu-shinohara M.et al.Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell 1191001-12，2004)。
幹細胞是細胞的稀少種群，它們能產生器官保持和功能所必需的大範圍的細胞組織種類。這些細胞被定義為具有下述兩種基本特徵的未分化細胞(i)它們具有自身更新的能力，(ii)它們還具有分化為一種或多種具有成熟表型的專門化細胞類型的能力。幹細胞有三大組(i)成年的或身體(出生後的)幹細胞，存在於所有出生後生物中，(ii)胚胎幹細胞，其能從胚胎前或胚胎發育階段獲得，以及(iii)胎兒幹細胞(產前)，其能從發育的胎兒中分離出。用於細胞再生療法時，每組幹細胞都具有其自身的優點和缺點，特別是在它們的分化潛力，以及在合適的或目標細胞環境中從頭移植(engraft)和發揮功能的能力。
在出生後動物中，存在系代(lineage)定型的祖幹細胞和系代未定型的多能幹細胞，它們存在於結締組織，向出生後生物提供連續的器官或器官系統保持和修復所需的細胞。這些細胞被定名為身體幹細胞或成年幹細胞，其可以是靜止的或非靜止的。典型地，成年幹細胞具有如下兩種特徵(i)它們能長期產生它們自身的相同拷貝(長期自身更新)；以及(ii)它們能產生具有特徵形態和專門功能的成熟細胞類型。
已從造血幹細胞及其骨髓移植後的行為，獲得了對幹細胞生物學的很多理解。在骨髓小環境中，存在數種成年幹細胞，每種都具有獨特的屬性和可變的分化能力，這與它們的細胞環境相關。在子宮內轉進免疫前綿羊胎的從人類骨髓分離得到的身體幹細胞，具有異種移植為多種組織的能力。在骨髓小環境中還存在間質幹細胞，其具有廣泛範圍的非造血分化能力，包括骨、軟骨、脂肪細胞、腱、肺、肌肉、骨髓基質和腦組織。此外，還發現了神經幹細胞，胰腺、肌肉、脂肪、卵巢和精原幹細胞。已通過使用骨髓移植，展示和實現了身體或出生後幹細胞的治療用途。但是，成年身體幹細胞具有已被衰老和細胞分裂所改變的基因組。衰老導致自由基傷害或氧化損傷的積累，這可使細胞容易形成腫瘤，降低了細胞的分化能力或者誘導凋亡。重複的細胞分裂與端粒變短直接相關，這是決定細胞功能性壽命的終極細胞鍾。結果，成年身體幹細胞具有與胚胎和產前幹細胞中發現的生理初期狀態足夠不同的基因組。
不幸的是，事實上，成年動物體內的每種身體細胞，包括幹細胞，都具有留有時間和重複細胞分裂破壞痕跡的基因組。因此，直到現在，獲得具有未受損害的或初期生理狀態的基因組的幹細胞的僅有的方法是從流產胚胎或使用體外授精技術形成的胚胎回收幹細胞。但是，科學和倫理考慮使得使用胚胎幹細胞的幹細胞研究進展緩慢。胚胎幹細胞細胞系的產生被認為提供了用於研究和治療的胚胎幹細胞的可更新來源，但是近來的報導表明，現有的細胞系已被免疫原性動物分子所汙染(Martin M.et al.，Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid.Nature Medicine 11228-32，2005)。
與使用成年幹細胞相關的另一問題是，這些細胞沒有免疫特權(privilege)，或者在移植之後會丟失它們的免疫特權。(術語「免疫特權」用來指下述狀態，其中，受體免疫系統不將細胞識別為外來的)。因此，當使用成年幹細胞時，大多數情況下，只能使用自體移植。因此，最近最為關注的幹細胞療法形式是本質上按照患者定製的醫療方案，因此與此類方案相關的經濟因素限制了它們廣泛的潛能。
對目前可獲得的用途的其它障礙。此外，幹細胞應被誘導為成熟為器官或細胞類型，所述類型是可用作治療所期待的。影響幹細胞體內成熟的因素很少被了解，體外的就更少被了解了。因此，目前的成熟技術依賴於偶然性和大大超出施用療法的科學家或接受者控制的生物過程。
目前的研究集中於開發胚胎幹細胞，作為全能或多能免疫特權細胞，用於細胞再生療法。但是，因為胚胎幹細胞本身不適合用於直接移植，原因是它們會在移植後形成畸胎瘤，所以它們被提出作為「通用供體」細胞，其能分化為適用於移植的針對患者定製的多能、專能或定型細胞。此外，關於從人類胚胎分離胚胎幹細胞存在道德和倫理議題。
因此，人們需要生物學上有用的、多能幹細胞的來源，所述幹細胞具有接近生理初期狀態的基因組。此外，人們需要下述生物學上有用的多能幹細胞的來源，所述幹細胞具有接近生理初期狀態的基因組，所述基因組能在受體中將免疫特權保持一段足夠用於治療的時期。此外，人們需要調節(condition)體內或體外的幹細胞移植，以使被移植的幹細胞成熟為目標組織的潛力最大化。

發明內容
本發明提供了生物學上有用的多能治療用再程序化細胞，其具有最小化的氧化損傷以及可與未受損傷的、產前或胚胎幹細胞的端粒長度相當的端粒長度(即，本發明的治療用再程序化細胞具有接近生理初期狀態的基因組)。此外，本發明的治療用再程序化細胞具有免疫特權，因此適合用於治療應用。本發明的其它方法提供了對雜交幹細胞的製造。此外，本發明包括下述相關方法，用於使按照本發明的教導製造的幹細胞成熟為特定的宿主組織。
在本發明的一種實施方式中，提供了治療用再程序化方法，所述方法包括分離幹細胞，將幹細胞與包含刺激因子的培養基接觸，所述刺激因子能誘導幹細胞發育為治療用再程序化細胞，從培養基中回收治療用再程序化細胞，將治療用再程序化細胞或由其成熟的細胞植入到需要治療用再程序化細胞的宿主中。適用於根據本發明的教導的治療用再程序化的幹細胞包括胚胎幹細胞、胎兒幹細胞、身體幹細胞、專能成年祖細胞、雜交幹細胞、經過修飾的生殖細胞、脂肪來源的幹細胞以及原性(primordialsex)細胞。在本發明的一種實施方式中，原性細胞是精原幹細胞。
在本發明的另一種實施方式中，用於本發明的治療用再程序化方法的刺激因子包括化學物質、生物化學物質和細胞提取物。本發明的化學物質刺激因子選自由5-氮雜-2』-脫氧胞苷、組蛋白去乙醯酶抑制劑、正丁酸和曲古菌素A(trichostatin A)構成的組。本發明的細胞提取物刺激因子選自由全細胞提取物、細胞質提取物和核質提取物所構成的組。用於本發明的治療用再程序化方法的細胞提取物分離自幹細胞，包括胚胎幹細胞、胎兒神經幹細胞、專能成年祖細胞、雜交幹細胞和原性細胞。
在本發明的一種實施方式中，需要治療用再程序化細胞的宿主是哺乳動物，更為具體地，人。在本發明的另一種實施方式中，幹細胞分離自需要治療用再程序化細胞的宿主。
在本發明的又一種實施方式中，治療用再程序化方法還包括使所述治療用再程序化細胞成熟從而定型為組織特異性系代的步驟。
在本發明的一種實施方式中，提供了一種治療用再程序化方法，所述方法包括分離精原幹細胞(SSC)；將SSC與包含刺激因子的培養基接觸，所述刺激因子能誘導SSC發育為全能細胞；從培養基中回收全能細胞；將全能細胞或由其成熟的細胞植入到需要治療用再程序化細胞的宿主中。
在本發明的另一種實施方式中，提供了一種治療用再程序化方法，所述方法包括提供雜交幹細胞；將雜交幹細胞與包含刺激因子的培養基接觸，所述刺激因子能誘導雜交幹細胞發育為全能細胞；從培養基中回收全能細胞；將全能細胞或由其成熟的細胞植入到需要治療用再程序化細胞的宿主中。
在本發明的又一種實施方式中，提供了一種治療用再程序化細胞，其中包含已被暴露給刺激因子的SSC，所述刺激因子已導致SSC成熟或分化為全能或多能細胞。
在本發明的一種實施方式中，提供了一種治療用再程序化細胞，其中包含已被暴露給刺激因子的多能幹細胞，所述刺激因子已導致多能幹細胞成熟或分化為更定型的細胞系代。
在本發明的另一種實施方式中，提供了製造雜交幹細胞的方法，所述方法包括獲得供體細胞，其中，供體細胞是雙倍體；獲得宿主細胞，對宿主細胞摘除細胞核；將供體細胞或其細胞核與宿主細胞融合；分離出雜交幹細胞。適合用於根據本發明的教導製造雜交幹細胞的供體細胞選自由胚胎幹細胞、身體細胞、原性細胞和治療用再程序化細胞構成的組。在本發明的另一種實施方式中，供體細胞處於G0期。
在本發明的又一種實施方式中，適用於根據本發明的教導製造雜交幹細胞的宿主細胞選自由胚胎幹細胞、胎兒神經幹細胞和專能成年祖細胞構成的組。
在本發明的一種實施方式中，用於製造雜交幹細胞的方法還包括如下步驟在獲得步驟之後並且在摘除細胞核步驟之前培養宿主細胞歷經四次傳代。
在本發明的另一種實施方式中，適合用於製造雜交幹細胞的供體細胞和宿主細胞來自哺乳動物。在本發明的又一種實施方式中，供體細胞和宿主細胞來自同一個體。
在本發明的一種實施方式中，通過選自由化學、機械、物理、x-射線照射以及雷射照射摘除細胞核所構成的組的方法，來摘除適用於製造雜交幹細胞的宿主細胞的細胞核。在本發明的另一種實施方式中，通過細胞鬆弛素D來摘除宿主細胞的細胞核。
在本發明的又一種實施方式中，製造雜交幹細胞的方法還包括如下步驟在與供體細胞融合之前，對已摘除細胞核的宿主細胞進行大約三天的培養。
在本發明的一種實施方式中，製造雜交幹細胞的方法的融合步驟包括選自由電融合、微注射、化學融合或基於病毒的融合構成的組的融合方法。
在本發明的另一種實施方式中，製造雜交幹細胞的方法的分離步驟包括螢光活化的細胞揀選。在本發明的又一種實施方式中，製造雜交幹細胞的方法還包括在分離步驟之後培養雜交幹細胞。


本專利或申請含有至少一幅彩色附圖。提出申請並交納所需費用後，專利局將提供具有彩色附圖的本專利或專利申請公開的拷貝。
圖1描述了按照本發明的教導從TgN(GFPU)5Nagy小鼠分離出的脂肪來源幹細胞(ADSC)。圖1a描述了通過螢光顯微法在細胞中表達的綠色螢光蛋白(GFP)。圖1b描述了相差顯微鏡下的與圖1a所示的同樣的細胞。
圖2描述了按照本發明的教導製備的分化ADSC。脂肪來源幹細胞被誘導分化為五種組織類型(神經原、脂肪原、骨原、軟骨原和心原的)，通過組織學，針對Oil Red O(脂肪發生)、Von Kossa(骨發生)和Alcian Blue(軟骨發生)，以及通過免疫組織化學針對巢蛋白(nestin)的表達(神經發生)和心臟肌鈣蛋白I(心臟細胞發生(cardiogenesis))對分化的和對照細胞進行了分析。
圖3描述了對按照本發明的教導製造的ADSC進行細胞核摘除。圖3a描述了摘除細胞核後用細胞鬆弛素D處理的ADSC。圖3b描述了對照細胞。圖3c描述了用細胞鬆弛素D處理的ADSC在處理後三小時的情況。
圖4描述了按照本發明的教導製造的融合後兩周的幹細胞雜交體。
圖5描述了按照本發明的教導製造的融合後四周的幹細胞雜交體。圖5a描述了幹細胞雜交培養中的GFP陽性染色細胞。圖5b描述了在相差顯微鏡下觀察到的與圖5a相同的細胞。
圖6描述了按照本發明的教導製造的融合後六周的幹細胞雜交體。圖6a描述了幹細胞雜交培養中的GFP陽性染色細胞。圖6b描述了在相差顯微鏡下觀察到的與圖6a相同的細胞。
圖7描述了對按照本發明的教導製備的雜交幹細胞進行的螢光活化細胞揀選(FACS)分析。對照(-)GFP的圖描述了不表達GFP的對照細胞；G3.8雜交體的圖描述了在G3.8幹細胞雜交體克隆中的GFP表達，G3.9雜交體的圖描述了在G3.9幹細胞雜交體克隆中的GFP表達。
圖8描述了從按照本發明的教導製造的雜交幹細胞克隆中對GFP進行單細胞聚合酶鏈式反應(PCR)放大的結果。
圖9描述了按照本發明的教導製造的雜交幹細胞的脂肪原性分化。
圖10描述了按照本發明的教導製造的雜交幹細胞的骨原性分化。
圖11描述了按照本發明的教導製造的雜交幹細胞的軟骨原性分化。
圖12描述了按照本發明的教導製造的雜交幹細胞的神經原性分化。
圖13描述了按照本發明的教導製造的雜交幹細胞的心原性分化。
術語定義化學修飾本文中使用的「化學修飾」指下述過程，其中使用化學物質或生物化學物質來誘導供體細胞或其細胞核中基因組變化，從而允許供體細胞或其細胞核在成熟期間能做出響應，以及是宿主細胞胞質能接收的。
定型本文中使用的「定型」指，細胞被認為永久定型為特定功能。定型的細胞也被稱為終末分化的細胞。
胞質提取物修飾本文中使用的「胞質提取物修飾」指下述過程，其中，由細胞的胞質內含物構成的細胞提取物被用於誘導供體細胞或其細胞核的基因組變化，從而允許供體細胞或其細胞核在成熟期間能做出響應，以及是宿主細胞胞質能接受的。
去分化本文中使用的「去分化」指形式或功能上的專門性的丟失。在細胞中，去分化導致較少定型的細胞。
分化本文中使用的「分化」指細胞被改造為特定的形式或功能。在細胞中，分化導致更為定型的細胞。
供體細胞本文中使用的「供體細胞」指從為雜交幹細胞貢獻其細胞核基因物質的前胚胎、胚胎、胎兒或出生後多細胞生物或原性細胞獲得的任何二倍體(2N)細胞。供體細胞不局限於終末分化的細胞或分化過程中的細胞。就本發明的目的而言，供體細胞指整個細胞或單獨的細胞核。
供體細胞製備本文中使用的「供體細胞製備」指下述方法，其中，供體細胞或其細胞核被製備以經歷成熟，或被製備以能被宿主細胞的細胞質接受和/或在出生後環境中做出響應。
胚胎本文中使用的「胚胎」指生長和分化早期階段(特徵為胚胎植入著床和原腸胚形成)的動物，其中，確定並建立了三種胚層，通過胚層分化成為分別的器官和器官系統。三種胚層是內胚層、外胚層和中胚層。
胚胎幹細胞本文中使用的「胚胎幹細胞」指全能的、從發育中的胚胎(已達到附著於子宮壁上的發育階段)獲得的任何細胞。在上下文中，胚胎幹細胞和前胚胎幹細胞是等同的術語。類胚胎幹細胞(類ESC)細胞是並非從胚胎直接分離出的全能細胞。類ESC細胞可從根據本發明的教導去分化的原性細胞獲得。
胎兒幹細胞本文中使用的「胎兒幹細胞」指專能的、從發育中的多細胞胎兒(不再處於早期或中期器官生成階段)獲得的細胞。
生殖細胞本文中使用的「生殖細胞」指，繁殖用的細胞，例如，精母細胞或卵母細胞或將發育為繁殖用細胞的細胞。
宿主細胞本文中使用的「宿主細胞」指，向雜交幹細胞貢獻細胞質的、從前胚胎/胚胎/胎兒或出生後多細胞生物獲得的任何專能幹細胞。
宿主細胞製備本文中使用的「宿主細胞製備」指其中對宿主細胞摘除細胞核的過程。
雜交幹細胞本文中使用的「雜交幹細胞」指從摘除了細胞核的宿主細胞以及多細胞生物的供體細胞或其細胞核獲得的任何專能細胞。雜交幹細胞還被公開於也待決的美國專利申請號10/864,788中。
核質提取物修飾本文中使用的「核質提取物修飾」指下述過程，其中，由細胞的細胞核內含物(缺少DNA)組成的細胞提取物被用於誘導供體細胞或其細胞核的基因組變化，從而允許供體細胞或其細胞核在成熟期間能做出響應，以及是宿主細胞胞質能接受的。
成熟本文中使用的「成熟」指下述過程，其中包括分化途徑中正向或反向的協同步驟，其可以指分化或去分化。用於本文所述的方法時，本文中使用的成熟與發育的動詞或名詞同義。
經過修飾的生殖細胞本文中使用的「經過修飾的生殖細胞」指下述細胞，其包含被摘除細胞核的宿主卵子以及來自精原細胞、卵原細胞或原性細胞的供體細胞核。被摘除細胞核宿主卵子和供體細胞核可以來自同一物種或不同物種。經過修飾的生殖細胞還可被稱為「雜交生殖細胞」。
專能本文中使用的「專能」指，細胞能產生數種其它細胞，但是這些類型數量有限。專能細胞的例子是造血細胞-能發育為數種血細胞但是不能發育為腦細胞的血液幹細胞。
專能成年祖細胞本文中使用的「專能成年祖細胞」指從骨髓中分離的、具有分化為間質、內皮和內胚層系代細胞的潛力的專能細胞。
前胚胎本文中使用的「前胚胎」指在細胞分裂之前的發育早期的受精卵。在前胚胎期間，發生最初的卵裂。
前胚胎幹細胞參見前文所述「胚胎幹細胞」。
出生後幹細胞本文中使用的「出生後幹細胞」指從出生後的多細胞生物獲得的任何專能細胞。
多能本文中使用的「多能」指能產生除了胎盤細胞或子宮的其它支持細胞之外的任何細胞類型的細胞。
原性細胞本文中使用的「原性細胞」指下述任何二倍體細胞，其是從雄性或雌性的成熟或發育中的性腺獲得的，能產生進行物種繁殖的細胞，並且含有二倍體基因組狀態。原性細胞可以是靜止的或活性分裂中的。這些細胞包括，雄性生殖母細胞、雌性生殖母細胞、精原幹細胞、卵巢幹細胞、卵原細胞、A型精原細胞、B型精原細胞。還被稱為生殖細胞系幹細胞。
原生殖細胞本文中使用的「原生殖細胞」指在胚胎發生早期存在的、預定成為生殖細胞的細胞。
再程序化本文中使用的「再程序化」指重建細胞的遺傳程序，使得細胞展示出多能性，並且具有產生完全發育的生物的潛力。
作出響應的本文中使用的「作出響應的」指細胞或一組細胞的下述狀況，其中，它們對細胞環境敏感並且相應地在其中發揮功能。作出響應的細胞能應答於特定細胞環境、組織、器官和/或器官系統，並且在其中發揮功能。
身體幹細胞本文中使用的「身體幹細胞」指二倍體專能或多能幹細胞。身體幹細胞不是全能幹細胞。
治療用克隆本文中使用的「治療用克隆」指，使用細胞核轉移方法(包括用另一種細胞或從內細胞團獲得的幹細胞的細胞核去置換卵子細胞核)進行的細胞克隆。
治療用再程序化本文中使用的「治療用再程序化」指下述成熟方法，其中，按照本發明的教導，幹細胞被暴露給刺激因子，以產生多能、專能或組織特異性的定型細胞。治療用再程序化細胞可用於植入宿主，以替換或修復患病的、被損傷的、有缺陷的或遺傳受損的組織。本發明的治療用再程序化細胞不具有非人類的唾液酸殘餘(residue)。
全能本文中使用的「全能」指，含有產生機體加胎盤的所有細胞所需的全部遺傳信息的細胞。人類細胞僅在受精卵最初的極少數次分裂期間具有這種全能能力。
全細胞提取物修飾本文中使用的「全細胞提取物修飾」指下述方法，其中，由細胞的胞質和細胞核內含物構成的細胞提取物被用於誘導供體細胞或其細胞核的基因組變化，從而允許供體細胞或其細胞核在成熟期間能做出響應，以及是宿主細胞胞質能接受的。
發明詳述本發明提供了生物學上有用的多能治療用再程序化細胞，其具有最小化的氧化損傷以及可與未受損傷的、產前或胚胎幹細胞的端粒長度相當的端粒長度(即，本發明的治療用再程序化細胞具有接近生理初期狀態的基因組)。此外，本發明的治療用再程序化細胞具有免疫特權，因此適合用於治療應用。本發明的其它方法提供了對雜交幹細胞的製造。此外，本發明包括用於使按照本發明的教導製造的幹細胞成熟為特定的宿主組織的相關方法。
幹細胞是能產生其它類型細胞的原始細胞。存在有數種幹細胞，它們也被稱為祖細胞。全能細胞被認為是機體的「主人」細胞，因為它們含有產生機體加胎盤(為人類胚胎提供營養)所有細胞所需的全部遺傳信息。人類細胞僅在受精卵最初的極少數次分裂期間具有這種全能能力。全能細胞分裂三次或四次後，就出現了一系列的階段，其中細胞變得逐漸專門化。分裂的下一階段產生多能細胞，其高度多用，能產生除了胎盤或子宮其它支持組織的細胞之外的任何細胞類型。在下一階段，細胞變為專能的，這意味著它們能產生數種其它細胞類型，但是這些類型數量有限。專能細胞的例子是造血細胞-能發育為數種血細胞的血細胞，但是不能發育為腦細胞。在使胚胎發展的細胞分裂長鏈末尾，是「終末分化」細胞——被認為永遠定型為特定功能的細胞。
科學家長期持下述觀點分化的細胞不能被改變，或不能被導致為能以除了已天然定型的方式之外的任何方式來作用。但是在近來的幹細胞實驗中，科學家已能夠令血液幹細胞以類神經元的方式作用。因此，研究還聚焦於使專能細胞變為多能種類的方式(Kanatsu-shinohara M.et al.Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell 1191001-12，2004)。
哺乳動物發育的個體發育提供了幹細胞的中心作用。在胚胎發生的早期，來自接近上胚層(epiblast)的、預定成為生殖細胞(原生殖細胞)的細胞沿著生殖腺嵴移動。這些細胞表達高水平的鹼性磷酸酶，並且表達轉錄因子Oct4。隨著移動和生殖腺嵴的定居，原生殖細胞經歷分化，成為雄性或雌性生殖細胞前體(原性細胞)。就本發明公開的目的而言，儀討論雄性原性細胞(PSC)，但是雄性和雌性原性細胞的質量和性質是等同的，並沒有暗示任何限制。在雄性原性細胞發育期間，原幹細胞開始與前體足細胞緊密聯繫，導致生精索(seminiferous cord)開始形成。當原生殖細胞被包括進生精索時，它們分化為有絲分裂靜止的生殖母細胞。這些生殖母細胞分裂數天，然後就停留於細胞周期的G0/G1階段。在小鼠和大鼠中，這些生殖母細胞在出生後數天內重新開始分裂，以產生精原幹細胞，並且最終經歷分化和精子發生相關的減數分裂。
原性細胞直接作出響應，以產生受精以及最終新一輪胚胎發生以產生新生物所需的細胞。原性細胞不經歷程序化死亡，其具有與胚胎階段可比的質量。
胚胎幹細胞是從前著床胚泡階段的胚胎的內細胞團獲得的細胞，其具有最大的分化潛力，能產生在胚胎本體(proper)全部三個胚層中發現的細胞。從實踐角度來看，胚胎幹細胞是人工製造的細胞培養物，因為，在它們天然的上胚層環境中，它們僅在胚胎發生期間短暫存在。在體外對胚胎幹細胞的操作已導致了寬範圍的細胞類型的產生和分化，包括心肌細胞、造血細胞、內皮細胞、神經、骨骼肌、軟骨細胞、脂肪細胞、肝和胰島。與成熟細胞共培養的、生長中的胚胎幹細胞可以影響和初始化胚胎幹細胞的分化，分化為特定系代。
就本討論的目的而言，基於與器官發生相關的發育階段，區分開胚胎和胎兒。前胚胎階段指，前胚胎經歷卵裂的最初階段的時期。早期胚胎發生的標誌為植入著床和原腸胚形成，其中，三種胚層確定並建立。晚期胚胎發生由胚層衍生物分化形成各個器官和器官系統所界定。胚胎到胎兒的轉變由絕大多數器官和器官系統的發育所界定，接著是快速的胎兒生長。
胚胎發生是下述發育過程，其中，被精子受精的卵母細胞開始分裂，並經歷第一輪胚胎發生，其中發生卵裂和囊胚形成。在第二輪中，發生植入著床、原腸胚形成和早期器官發生。第三輪的特徵為器官發生，最後一輪的胚胎發生(其中，胚胎不再被稱為胚胎而被稱為胎兒)是胎兒生長和發育發生的時候。
胚胎發生期間，產生自桑椹胚後卵裂和緊密化(compaction)的最初兩種組織系代是滋養外胚層和原始內胚層，其對於胎盤和胚胎外卵黃囊做出了主要貢獻。緊密化之後很短的時間內，在著床之前，上胚層或原始外胚層開始發育。
上胚層提供產生胚胎本體的細胞。隨著上胚層幹細胞小環境的發育，囊胚形成完全完成，此時胚胎從透明帶凸現出來，並著床到子宮壁上，在所述上胚層幹細胞小環境中，多能細胞處於其中，並在發育期間被定向來完成多種發育任務。
著床之後是原腸胚形成和早期器官發生。在第一輪器官發生的末尾，所有三種胚層將已經形成；外胚層、中胚層和明確的內胚層以及基本的身體規劃和器官原基被建立。早期器官發生之後，胚胎發生的標誌是大量的器官發育，此時，完成就標誌著發育中的胚胎向發育中的胎兒的轉化，其特徵在於胎兒生長和器官發育的最後一輪。一旦完成了胚胎發生，妊娠時期被胎兒出生所結束，此時生物體具有了所有需要的器官、組織和細胞小環境，以在出生後正常工作和生存。
胚胎發生的過程被用於描述胚胎發育時胚胎發育的整個過程，但是在細胞水平上，可以通過細胞成熟來描述和/或闡述胚胎發生。
已從胎兒骨髓(造血幹細胞)、胎兒腦(神經幹細胞)和羊水(多能羊膜幹細胞)分離出了胎兒幹細胞。此外，已在成年雄性和雌性組織中描述了幹細胞。胎兒幹細胞在器官發生和胎兒發育期間具有多種作用，最終其成為身體幹細胞儲備的一部分。
成熟指下述過程，其中包括分化途徑中正向或反向的協同步驟，其可以指分化或去分化。在成熟過程的一個例子中，在胚胎發生或器官發生期間，細胞或一組細胞與其細胞環境發生相互作用。隨著成熟的進行，細胞開始形成小環境，這些小環境或微環境，容納定向和調控器官發生的幹細胞。在出生時，成熟已發展為存在細胞和適合的細胞小環境，從而使生物能在出生後發揮功能和生存。發育過程在不同物種之間都高度保守，這允許將一種哺乳動物物種的成熟或分化系統延伸至實驗室中的其它哺乳動物物種。
在生物壽命期內，器官和器官系統的細胞組合物被暴露於廣泛範圍的導致細胞或基因組損傷的內在及外界因子。紫外線不僅對正常皮膚細胞具有影響，還對皮膚幹細胞群有影響。用於治療癌症的化療藥物對造血幹細胞具有破壞性的作用。具有反應活性的氧物質(細胞代謝的副產物)是威脅細胞基因組完整性的內在因子。在所有器官或器官系統中，細胞由幹細胞群持續地替換。但是，隨著生物衰老，細胞損傷就積累於這些幹細胞群中。如果損傷是可遺傳的，例如，基因組突變，所有後代也將會受到影響由此受到威脅。單個幹細胞克隆可用於在一年以上的時間內產生系代(例如淋巴或骨髓細胞)，因此如果幹細胞受損它們就具有了傳播突變的可能性。身體應答於受到威脅的幹細胞，這是通過誘導凋亡由此將其從庫中除去，以及防止潛在的功能障礙或腫瘤發生性質來實現的。凋亡從群中除去受到威脅的細胞，但是其也會減少將來可利用的幹細胞的數量。因此，隨著生物衰老，幹細胞數量減少。除了幹細胞庫的損失之外，還有證據表明，衰老會降低幹細胞制導(homing)機制的效率。端粒是染色體的物理末端，其含有高度保守的、串聯重複的DNA序列。端粒參與線性DNA分子的複製和穩定性，作為細胞中計數機制發揮作用；隨著每輪細胞分裂，端粒長度縮短，在預定的閾值，激活信號以起始細胞的老化。幹細胞和身體細胞產生端粒酶，這會抑制端粒的縮短，但是它們的端粒在衰老和細胞脅迫期間仍會逐漸縮短。
採用細胞療法醫治療多種疾病已有歷史，但是這些應用中的大多數都是針對造血障礙(包括惡性的)的骨髓移植。在骨髓移植中，個體免疫系統被來自另一個個體的移植骨髓所重建。長期以來，該重建被歸功於在骨髓中的造血幹細胞的作用。
越來越多的證據表明，幹細胞可在體外分化為特定細胞類型，其已顯示出通過移植進多種組織而具有專能潛力，並能穿過胚層，因此已成為針對細胞療法的很多研究的主題。採用傳統類型的移植時，免疫拒絕成為了細胞療法的局限因素。接受者個體的表型和供體的表型將決定細胞或器官植入體是否將被免疫系統忍受或拒絕。
因此，本發明提供了下述方法和組合物，用於提供用於細胞再生/修復療法的功能性免疫相容性幹細胞。
在本發明的一種實施方式中，提供了治療用再程序化細胞。治療用再程序化指下述成熟方法，其中，按照本發明的教導，幹細胞被暴露給刺激因子，以產生多能、專能或組織特異性的定型細胞。治療用再程序化的方法可用多種幹細胞來進行，包括但不限於，治療用克隆細胞、雜交幹細胞、胚胎幹細胞、胎兒幹細胞、專能成年祖細胞、脂肪來源的幹細胞(ADSC)和原性細胞。
治療用再程序化利用了下述事實某些幹細胞相對容易獲得，例如，精原幹細胞和脂肪來源的幹細胞，並且通過暴露給刺激因子對這些細胞進行外遺傳性(epigenetically)再程序化。這些治療用再程序化細胞已改變了突變狀態，成為更定型的細胞系代或更少定型的細胞系代。治療用再程序化細胞因此能修復或再生有疾病的、受損害的、有缺陷的或遺傳受損的組織。
治療用再程序化使用刺激因子，包括但不限於，化學物質、生物化學物質和細胞提取物，以改變細胞的外遺傳(epigenetic)程序化。這些刺激因子誘導供體DNA中的基因組甲基化改變，以及其它結果。本發明的實施方式包括從全細胞、細胞質和核質來製備細胞提取物的方法，但是其它類型的細胞提取物也被包括在本發明的範圍內。在非限制性的例子中，本發明的細胞提取物從幹細胞，特別是胚胎幹細胞製得。將供體細胞與化學物質、生物化學物質或細胞提取物一起培養預定的時間段，在非限制性的例子中為大約一小時至大約兩小時，然後，在培養時期之後表達胚胎幹細胞標記，例如Oct4的再程序化細胞被準備用於移植、低溫貯藏或進一步成熟。
在本發明的一種特定實施方式中，對原性細胞(PSC)進行治療用再程序化。原性細胞處於睪丸生精小管內層以及卵巢內層(分別為精原細胞和卵原細胞)，它們已被確定為具有二倍體(2N)基因組，明顯地未被衰老和細胞分裂影響所損害。因此，PSC具有接近生理初期狀態的基因組。特別有用於本發明一種實施方式中的PSC的非限制性例子是精原幹細胞。根據本文的教導，針對成熟方法製備治療用再程序化PSC細胞，其中所述成熟方法使用與胚胎發生和器官發生期間發育中的胚胎和胎兒中存在的幹細胞所經歷的過程類似的手段。
根據本發明的教導製造的治療用再程序化細胞可用於治療目的，它們可被低溫貯藏，用於進一步的用途，或者它們可在下述環境中進一步成熟為更定型的細胞系代(1)在發育中的胚胎中，(2)在發育中的胎兒中，(3)在發育中的全器官培養物中，或(4)在類似於胚胎發生或器官發生環境的體外細胞環境中。
本發明的實施方式提供了下述方法，用於使治療用再程序化細胞、幹細胞和原性細胞在出生後環境中進一步成熟或分化為更定型的細胞系代，以提供更為定型的細胞，用於細胞再生/修復療法。此外，成熟和分化過程提供了可用於治療或替換產前及出生後器官中受損的細胞的治療用細胞。
本發明還提供了被稱為經過修飾的生殖細胞(MGC)的組合物，其中包含哺乳動物原性細胞或其細胞核，它們被轉移進了摘除了細胞核的卵子，其中，PSC和卵子是從同一物種的動物或哺乳動物，或不同的動物或哺乳動物獲得的。哺乳動物PSC可來自任何動物，其包括但不限於，小鼠、大鼠、人、非人類靈長類、貓、狗、馬、豬、牛和綿羊。在一種實施方式中，PSC是哺乳動物精原細胞或其細胞核。在另一種實施方式中，PSC是哺乳動物卵原細胞或其細胞核。摘除細胞核和細胞核轉移的其它方法也被包括進本發明的範圍，其包括機械方法，以及使用電刺激的方法。可以使用來自精原細胞或卵原細胞的任何二倍體前體細胞的細胞核。
本發明的MGC是全能的、多能的、專能的或雙能的。即，MGC能形成至少一種類型的組織，或者更具體地，MGC能形成多於一種類型的組織。
一旦產生了MGC，就可以通過本文所述的多種方法進行操作，產生能進行細胞修復/再生療法的功能細胞。例如，可以以分步方式使MGC成熟至成熟幹細胞典型的發育特定階段。
在本文所述的分步方法中，MGC首先被擴展為6細胞階段。MGC能擴展為超過6細胞的階段，但是超過10細胞階段，生殖細胞就開始分化為祖細胞或前體細胞。然後使用來自從不同妊娠至出生後階段分離的細胞的暗示(cue)，以分步方式令6細胞階段的MGC成熟。來自妊娠至出生後供體的至少一組細胞被用於協助MGC的成熟。但是，MGC可能需要超過一組細胞來達到想要的成熟狀態。成熟MGC被稱為引物(primed)MGC。引物MGC具有足夠的階段特異性受體，使得在體內或體外，向宿主動物或組織中移植時，MGC發揮與成熟幹細胞類似的作用。用於篩選MGC已確定在它們的表面表達的受體群(constellation)的方法是本領域公知的。
此外，MGC和前胚胎、胚胎、胎兒或出生後幹細胞(即，精原幹細胞)可通過下述方法成熟在含有下述成熟和分化信號的細胞環境中，體內培養所述細胞，所述信號適用於MGC或幹細胞的目標用途。例如但不限於，胚胎幹細胞在發育中的骨髓小環境中於胚胎中成熟。被稱為造血的血細胞發育，在發育中的胚胎中的特定組織中歷經離散的階段，這在匯聚於骨髓之前發生，其在骨髓中在整個成年階段持續。在發育中的胚胎中，造血幹細胞前體首先在卵黃囊和被稱為大動脈-性腺-中腎的區域中發育。在胚胎發生和器官發生期間，造血幹細胞前體移動到肝臟，之後到脾，最後在出生之前定居到骨髓。因此，造血幹細胞、間質幹細胞以及專能成年祖細胞(MAPC)可由能從出生後生物分離得到的幹細胞和MGC產生。體內成熟的可能位置包括但不限於，發育中的胚胎或發育中的胎兒內的位置，包括胚泡、胎盤、卵黃囊、側大動脈胚髒壁、大動脈-性腺-中腎、子宮血管或胎兒肝臟。
本發明的一種實施方式提供了由任何動物產生的MGC，並且提供了用MGC進行治療的方法，所述方法包括，將引物MGC注射進宿主動物。MGC可用來自同一物種的細胞或來自不同物種的細胞獲得。此外，引物MGC可被移植進與組分細胞相同或不同物種的宿主。引物MGC可用於修復組織或治療疾病。
在本發明的另一種實施方式中，提供了雜交幹細胞，其可用於細胞再生/修復療法。本發明的雜交幹細胞是多能的，並且是針對目標受體定製的，從而使得它們能與受體免疫相容。雜交幹細胞是供體細胞或其細胞核與宿主細胞的融合產物。典型地，融合在供體細胞核和摘除了細胞核的宿主細胞間發生。供體細胞可以是任何二倍體細胞，其包括但不限於，來自前胚胎、胚胎、胎兒和出生後生物的細胞。更具體地，供體細胞可以是原性細胞，其包括但不限於，卵原細胞，或者分化的或未分化的精原細胞，或胚胎幹細胞。供體細胞的其它非限制性例子是，治療用再程序化細胞、胚胎幹細胞、胎兒幹細胞和專能成年祖細胞。優選地，供體細胞具有目標受體的表型。宿主細胞可以從組織中分離，所述組織包括但不限於，前胚胎、胚胎、胎兒和出生後生物，更具體地，其可包括但不限於，胚胎幹細胞、胎兒幹細胞、專能成年祖細胞和脂肪來源的幹細胞。在非限制性的例子中，用培養的細胞系作為供體細胞。供體和宿主細胞可來自相同個體或不同個體。
在本發明的一種實施方式中，淋巴細胞被用作供體細胞，使用兩步法來純化供體細胞。組織被分解之後，進行粘附步驟，以除去任何可能的汙染性附著細胞，接著進行密度梯度純化步驟。淋巴細胞的大多數是靜止的(G0階段)，因此可能具有甲基化狀態，能為再程序化賦予更高的可塑性。
在本發明的實施方式中用作供體細胞的專能或多能幹細胞或細胞系被功能性地定義為具有經歷分化至多種細胞類型(包括但不限於，脂肪原性、神經原性、骨原性、軟骨原性和心原性細胞類型)的能力的細胞。圖2描述了ADSC向這五種細胞類型的分化。在本發明的一種實施方式中，ADSC展示出了最大的分化潛力，如果它們在第四次傳代之前分化的話。
摘除宿主細胞的細胞核(以用於產生根據本發明教導的雜交幹細胞)可使用多種方法來進行。在非限制性的例子中，將ADSC放到塗布有纖連蛋白的組織培養玻片上，用細胞鬆弛素D或細胞鬆弛素B來處理細胞。處理之後，細胞可被胰蛋白酶處理，再次平板培養，在摘除細胞核後可存活大約72小時。圖3描述了按照本發明的教導製造的摘除細胞核的ADSC。
可使用本領域技術人員已知的大量融合方法中的一種來進行宿主細胞和供體細胞核的融合，這些方法包括但不限於電融合、微注射、化學融合或基於病毒的融合，細胞融合的所有方法都被包括在本發明的範圍內。圖4-6描述了融合後二至六周時根據本發明的教導製造的雜交幹細胞，顯示出，隨著培養時間的增加，被鑑定為供體細胞的細胞數量減少，大量的雜交幹細胞被觀察到。圖7和8描述了通過螢光活化細胞揀選(FACS)(圖7)和針對綠色螢光蛋白(GFP)表達進行的聚合酶鏈式反應(圖8)對雜交幹細胞進行的分析。
根據本發明的教導製造的雜交幹細胞具有來自被摘除細胞核的宿主細胞的表面抗原和受體，但是具有來自發育上更年輕的細胞的細胞核。結果，本發明的雜交幹細胞是細胞因子、趨化因子和其它細胞信號試劑能接受的，但具有不含衰老相關DNA損傷的細胞核。
根據本發明的教導製造的雜交幹細胞可被誘導分化為多種細胞類型。例如但不欲對本發明的雜交幹細胞的分化潛力加以限制，雜交幹細胞可分化為脂肪原性細胞、骨原性細胞、軟骨原性細胞、神經原性細胞和心原性細胞。分化可使用商業可獲得的試劑盒或按照本領域技術人員已知的方法來進行。從根據本發明的教導製造的雜交幹細胞產生的分化細胞的非限制性例子被描述於圖9(脂肪原性分化)、圖10(骨原性分化)、圖11(軟骨原性分化)、圖12(神經原性分化)和圖13(心原性分化)中。
根據本發明的教導製造的治療用再程序化細胞和雜交幹細胞可用於廣泛的治療應用，用於細胞再生/修復療法。例如但不作為限制，本發明的治療用再程序化細胞和雜交幹細胞可用於補充下述動物中的幹細胞，所述動物的天然幹細胞由於衰老或切除手術(例如癌症放療和化療)已損耗。在另一種非限制性的例子中，本發明的治療用再程序化細胞和雜交幹細胞可用於器官再生和組織修復。在本發明的一種實施方式中，治療用再程序化細胞和雜交幹細胞可用於恢復受損的肌肉組織，包括營養不良的肌肉以及萎縮事件(例如心肌梗塞)損害的肌肉。在本發明的另一種實施方式中，本文公開的治療用再程序化細胞和雜交幹細胞可被用於改善動物(包括人)中創傷或手術後的傷痕。在該實施方式中，本發明的治療用再程序化細胞和雜交幹細胞被全身性施予，例如通過靜脈方式，並移動到新鮮受傷的組織，所述組織由受損細胞分泌的循環細胞因子給養。在本發明的另一種實施方式中，治療用再程序化細胞和雜交幹細胞可被局部施予到需要修復或再生的治療位點。
幹細胞並非普遍對本發明的成熟方法敏感。因此，本發明的發明人開發了一種治療用再程序化方法，由此可將幹細胞誘導為對成熟因子敏感的狀態。該治療用再程序化方法可通過下述方法來完成在合適條件下與刺激因子培養一段時間，該時間足夠使得供體細胞對成熟敏感。
根據本發明的方法產生的MGC和雜交幹細胞還適用於使用本發明的方法進行的治療用再程序化和成熟。得到的成熟或分化的MGC、雜交幹細胞和治療用再程序化細胞提供了用於細胞再生/修復療法的功能性的免疫相容性幹細胞。
在用胚胎幹細胞(ESC)進行成熟的情況下，細胞可能需要製備步驟，以使ESC能對成熟作出響應。ESC的製備步驟的非限制性的例子是，在暴露給成熟方法之前，將其誘導為胚狀體或類似造血幹細胞的狀態。胚狀體是胚胎幹細胞的球形聚集物，其能經歷分化。該製備步驟也可通過使用化學物質或細胞提取物來誘導，所述化學物質或細胞提取物能影響供體細胞的基因組狀態，以在特定發育時期發揮功能。
下述實施例用於闡述本發明的一種或多種實施方式，但它們不被認為是將本發明限制到下述範圍。
實施例1成熟-前胚胎、胚胎移植將從129/SvJ株系小鼠獲得的胚胎幹細胞(ESC)注射到孕後3.5天的C57BL/6J胚泡中。在胚泡中是內細胞團小環境，其中含有用於胚層建立以及最終地胚胎中所有細胞的上胚層。ESC細胞識別該小環境，並通過被適當定向成為胚胎本體來做出響應。短暫的培養期後，將胚泡移回假孕雌鼠，令其發育足月。內細胞團和細胞環境定向下的ESC細胞成熟為胚胎發生和器官發生中特定時期所需的不同幹細胞和支持細胞。取決於ESC細胞響應於胚胎發生和器官發生期間存在的成熟因子的能力，誕生具有不同嵌合水平的嵌合小鼠。小鼠中的一些具有非常高的ESC細胞貢獻，一些具有低水平的。ESC細胞在各個器官和小環境(提供器官保持和修復所需的細胞)中整合為不同的程度。如果ESC細胞在生殖系的小環境(性腺保持和修復所需的細胞所在地)中佔一席之地(populate)，那麼得到的ESC來源的精原幹細胞就能產生配子。當得到的小鼠嵌合體交配時，有三種可能的結果100％的生殖系貢獻，其中，所有F1都是129/SvJ來源的；混合的生殖系貢獻，其中，F1是129/SvJ和C57BL/6J來源的；以及0％的生殖系貢獻，其中，所有F1都是C57BL/6J來源的。在性腺中有下述小環境，其被用來提供下述細胞，所述細胞對配子的保持、修復和產生作出貢獻，F1中混合群的存在表明，這些小環境允許了兩種不同的幹細胞(129/SvJ和C57BL/6J)群(population)共存在的可能性。類似於ESC細胞佔據生殖系小環境的方式，ESC細胞也可能佔據其它幹細胞小環境，例如骨髓，從而允許幹細胞(例如，造血、間質或專能成年祖細胞)的分離，並且治療性地對它們加以使用。
實施例2胚胎幹細胞在發育中的胚胎中的成熟在本實施例中，胚胎幹細胞在發育中的骨髓小環境中成熟。被稱為造血的血細胞發育，在發育中的胚胎中的特定組織中歷經離散的階段，這在匯聚於骨髓之前發生，其在骨髓中在整個成年階段持續。在發育中的胚胎中，造血幹細胞前體首先在卵黃囊和被稱為大動脈-性腺-中腎(AGM)的區域中發育。在胚胎發生和器官發生期間，造血幹細胞前體移動到肝臟，之後到脾，最後在出生之前定居到骨髓。在本具體的實施例中，產生造血、間質幹細胞和專能成年祖細胞(MAPC)，它們可從出生後生物中分離。
胚胎幹細胞(ESC)從129/SvJ株系小鼠獲得，用螢光報導基因(即GFP)對其進行了轉染。宿主C57BL/6J雌性小鼠被進行交配，探查到陰栓的日子被記為E0.5。在孕期中的特定時間點(E7.5-E18.0)，通過腹腔給予0.9％NaCl中的克他命(1.5mg/kg)和甲苯噻嗪(15mg/kg)來麻醉小鼠。通過皮下施予0.9％NaCl中的特布它林(0.5 mg/kg)，減少子宮收縮。然後進行受限低中線(1imited low midline)剖腹手術，子宮的兩端角狀物呈現。
將頂端直徑為大約＜10-50μm的熱拉拔(heat-pulled)玻璃微量移液管(Sutter Instrument Co.)連接到氣動微融合泵上，用於將大約1×104至大約1×106的ESC以5psi.運送到胚胎中的位置。用於注射用於成熟ESC的位置包括但不限於，胎盤、卵黃囊、側大動脈胚髒壁、大動脈-性腺-中腎、子宮靜脈和胎兒肝臟。然後將子宮放回到腹中，關閉腹腔，令雌性小鼠恢復，懷孕至足月。出生後大約3個月，含有移植的ESC細胞的宿主小鼠被安樂死，股骨和脛骨被移下，放置於冰上的HBSS+(Gibco-BRL)/2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES緩衝液(Gibco-BRL)中。清理骨頭，使其不含肌肉和脂肪組織，將其放到冰上，直到處理完成。然後用HBSS+/2％FBS/10mM HEPES緩衝液衝洗脛骨和股骨，產生骨髓細胞的懸浮液。然後通過Ficoll-Hypaque分離收集骨髓單核細胞(BMMNC)。將BMMNC以1×105/cm2放置於MAPC培養基(60％DMEM-LG(Gibco，BRL)，40％MCDB-201(Sigma)，1X胰島素-轉鐵蛋白-硒，1X亞油酸-牛血清清蛋白，10-9M地塞米松(Sigma)，10-4M 2-磷酸抗壞血酸酯(Sigma)，100個單位的青黴素，1000個單位的鏈黴素(GibcoBRL)，2％胎牛血清(FCS；Hyclone Laboratories)，10ng/mL hPPFG-BB(人類血小板來源的生長因子-BB，RD Systems)，10ng/mL mEGF(小鼠表皮生長因子，Sigma)以及1000個單位/mL的mLIF(小鼠白血病抑制因子，Chemicon))中塗布有纖連蛋白(FN；Sigma)的培養皿上。將BMMNC培養物保持為5×103/cm2，3-4周後，使用微磁珠分離器(Miltenyi Biotec)收穫細胞，除去CD45+/Terr119+細胞。將CD45-/Terr119-細胞級分(～20％)以10個細胞/孔放置於FN(10ng/mL)處理過的96孔板，按照0.5-1.5×103/cm2的密度塗開。大約1％的孔產生持續的生長中MAPC培養物。MAPC的特徵在於針對CD3、Gr-1、Mac-1、CD19、CD34、CD44、CD45、cKit和主要組織相容性複合物(MGC)組I和組II的染色陰性。
實施例3治療用克隆和成熟本實施例描述了對人類原性細胞(供體細胞)的製備，其能響應成熟信號，用於治療用的克隆。在一些情況下，供體細胞需要額外步驟來製備，以用於成熟。製備來自其它哺乳動物(包括人類)的原性細胞(PSC)所涉及的方法類似於本文中所述的，可能在對特異於該特定物種的培養基或化學物質的修飾方面有些例外。
進行卵巢刺激之後收集卵原細胞，並在G1.2培養基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)中體外成熟。選出具有第一極體的卵原細胞用於細胞核摘除。在HEPES緩衝的不含Ca2+的含胺基酸CR2培養基(hCR2aa，其中補充有10％的FBS和5μg/mL的細胞鬆弛素B(Sigma))中進行細胞核摘除。用固定吸管將卵原細胞保持在合適的位置，用細針在透明帶上製造出小裂縫。用針去掉含有中期II染色體的細胞質和第一極體。通過用Hoechst 33342(Sigma)對摘除細胞核的卵原細胞進行5分鐘的染色，並在落射螢光下觀察來驗證細胞核摘除。然後將摘除細胞核的卵原細胞放置於HEPES緩衝的TCM-199培養基(Life Technologies)中，所述培養基補充有10％FBS。按照實施例9所述來製備供體細胞。將單個供體細胞放進摘除細胞核的卵原細胞的卵周隙，所述卵原細胞已用hCR2aa中的100μg/mL植物血球凝集素(Sigma)處理過。融合通過下述方法來進行將供體PSC和摘除細胞核的卵子組合放置於融合培養基(0.26M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.5mM HEPES和0.05％(w/v)BSA)中，在BTX 453，3.2mm縫隙的腔中，於3分鐘平衡之後進行融合。使用BTX Electro-cell操作儀200，用兩次DC脈衝(1.75-1.85kV/cm，15秒)來誘導融合。供體細胞核和摘除細胞核的卵子的融合產物現在被命名為經修飾的生殖細胞。然後在融合後對經修飾的生殖細胞進行2小時的培養。激活通過下述方法來進行將經修飾的生殖細胞在G1.2培養基中暴露給10μM的鈣離子載體A23187達5分鐘，接著用2.0mM 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)進行培養，以及在6％CO2、5％O2、89％N2下在G1.2培養基中培養4小時。然後在G1.2培養基中對經修飾的生殖細胞進行10次清洗，再在G1.2培養基中培養48小時，接著在具有胺基酸的人類經修飾合成輸卵管液(SOF)(hmSOFaa)中培養6天。HmSOFaa是通過將10mg/mL的人血清清蛋白和1.5 mM果糖加入到hmSOFaa中製得的。通過用0.1％鏈黴蛋白酶(Sigma)消化，從經修飾的生殖細胞移除透明帶。通過免疫手術，從經修飾的生殖細胞分離出內細胞團(ICM)，用100％抗人血清抗體(Sigma)對ICM進行20分鐘的培養，接著再在37℃於5％CO2中暴露給豚鼠補體系統(Life Technologies)額外30分鐘。在0.1％明膠塗布的4孔組織培養皿中，在絲裂黴素C失活的小鼠胚胎原代成纖維細胞(PMEF)飼養層(feeder layer)上培養從經修飾的生殖細胞分離出的ICM。在該階段，經修飾的生殖細胞成熟為經修飾的胚胎幹細胞。經修飾的幹細胞被培養於DMEM/DMEM F12(1∶1)(Life Technologies)、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma Aldrich，Corp.)、1％非必要胺基酸、100個單位/mL的青黴素、100μg/mL鏈黴素以及4ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF；Life Technologies)中。此外，直到第一次傳代，將2000個單位/mL的人LIF(白血病抑制因子，Chemicon)加入到培養基中。然後在細胞上進行染色體組型分析(karyotyping)，僅保留整倍體的細胞系用於成熟。
實施例4
從睪丸中分離原性細胞睪丸被切開並去膜。使用細剪刀剪碎睪丸組織，將其轉移進培養基(DMEM/F12)，所述培養基含有1mg/mL的I型膠原酶(Sigma)和0.5mg/mL的DNase(Sigma)。在37℃于震蕩水浴(以110周期/分鐘運行)中進行10分鐘的消化。通過以單位重力沉澱10分鐘來分離間細胞，在DMEM/F12中清洗。
在與第一步消化步驟一樣的條件下，在I型膠原酶(1mg/mL)、DNase(0.5mg/mL)和透明質酸酶(Sigma；0.5mg/mL)的混合物中，對睪丸組織的基膜(basal lamina)組分進行最後的消化。用培養基和含有1mM EDTA(Sigma)和0.5％胎牛血清的PBS連續地清洗獲得的單細胞懸浮液。通過將細胞懸浮液經50μm的尼龍篩過濾來除去白膜的未被消化殘餘。整個過程中所有細胞都被保持於5℃。將分離的睪丸細胞懸浮(5×106個細胞/mL)於含有0.5％FBS的PBS(PBS/FBS)中。然後將細胞與初次抗體在冰上培養20分鐘，用過量的PBS/FBS洗兩次，用於FACS分析。初次抗體包括R-藻紅蛋白(PE)-橋聯的抗α6整聯蛋白、別藻藍蛋白(APC)-橋聯的抗c-kit以及生物素化的抗αv整聯蛋白。對於使用二級試劑的實驗，進一步地將細胞與APC-橋聯的鏈親合素一起培養20分鐘，以探測生物素化的抗體。所有抗體或二級試劑都以5μg/ml使用。對照細胞不用抗體處理。最後一次清洗之後，將細胞重新懸浮(107個細胞/mL)於2mL含有1μg/mL碘化丙啶(Sigma)的PBS/FBS中，經35μm孔徑的尼龍篩過濾至管中，在黑暗中於冰上保存，直到進行分析。基於抗體染色和它們的相對粒度或內部複雜性(側向角散射(side scatter)，SSC)對細胞進行揀選。通過裝備有488nm氬(200mW)和633nm氦氖(35mW)雷射的雙雷射FACStar Plus(Becton Dichinson)來進行細胞揀選。氬雷射被用於激發PE和碘化丙啶，並且575 DF 26濾光器用於收集PE的發射，610 DF 20濾光器用於收集碘化丙啶的發射。氖雷射被用於激發APC，用675 DF 20濾光器探測發射。在數據收集時，通過除去碘化丙啶陽性的事件，去除死細胞。在含有2mL冰冷的DMEM(補充有10％FBS)(DMEM/FBS)的5mL聚苯乙烯管中，對細胞進行揀選。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作供體細胞。
實施例5從卵巢分離原性細胞對動物進行麻醉，取下卵巢。或者，可以從對卵巢的打孔活檢來分離原性細胞(PSC)。然後在顯微鏡輔助下分離PSC。原性細胞具有幹細胞的形態(即，大、圓且光滑)，是從卵巢中機械取回的。
實施例6用化學因子進行治療用再程序化本實施例描述了對PSC的治療用再程序化，從而其能在成熟期間發揮功能，恰當響應，這是通過用化學物質誘導基因組甲基化的改變來實現的。
按照實施例4所述來分離原性細胞。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作供體細胞。然後將細胞或其中含有的細胞核物質暴露給不同濃度的DNA去甲基化試劑，它們包括但不限於，5-氮雜-2』-脫氧胞苷、組蛋白去乙醯酶抑制劑、正丁酸或曲古菌素A。在基因組修飾之後，原性細胞被準備用來經歷成熟過程。
實施例 7用全細胞提取物因子進行治療用再程序化本實施例描述了對PSC的治療用再程序化，從而其能在成熟期間發揮功能，恰當響應，這是通過用從胚胎幹細胞獲得的全細胞(核質/細胞質)提取物誘導基因組甲基化的改變來實現的。
按照實施例4所述來分離原性細胞。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作可再程序化的細胞。這些細胞被貯存於冰上，直到暴露給全細胞提取物。
為製備來自胚胎幹細胞(ESC)的全細胞提取物，用冰冷的PBS對細胞清洗三次，接著在細胞裂解緩衝液(50mM NaCl，5mM MgCl2，20mM Hepes，pH 8.2，以及1 mM二硫蘇糖醇)中清洗。然後在350xg下對細胞進行離心，重新懸浮於1.5倍體積的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩衝液中，在冰上培養45分鐘。然後通過脈衝超聲波對細胞進行均質化，在16,000xg下於4℃對全細胞裂解物進行20分鐘的離心。然後收集上清液，蛋白濃度測定為大約6mg/mL。
用冰冷的PBS對前面分離的PSC洗三次，再在HBSS中洗兩次。然後再在350xg下於4℃對細胞進行5分鐘的離心，以每14μL冰冷的HBSS中10,000個細胞的比例重新懸浮。然後在37℃對細胞進行2分鐘的培養，接著以115ng/mL至230ng/mL的終濃度(取決於細胞數量)加入鏈球菌溶血素O(SLO；Sigma)，持續震蕩下在37℃培養50分鐘，保持細胞不沉澱。然後在500xg下於4℃對細胞進行5分鐘的離心，移去上清液。然後將PSC與50μL前面製備的胚胎幹細胞全細胞提取物(含有ATP再生系統以及四種三磷酸核苷中的每種1mM)在37℃培養1-2小時。然後將細胞重新懸浮於準備培養基(1％非必要胺基酸，1％L-穀氨醯胺，100個單位/mL的青黴素，100μg/mL鏈黴素、0.1mMβ-巰基乙醇，3000個單位/mL的LIF，處於DMEM/20％FBS中)中的2mM CaCl2溶液中，放置於48孔皿的一個孔中，所述的皿已用0.1％的明膠(含有絲裂黴素C失活的胚胎原代成纖維細胞(PEF)層)預處理過。此外，還可以在48孔皿(已用0.1％的明膠(含有絲裂黴素C失活的PEF層)預處理過)中對用提取物處理過的PCS和50％滿盤(confluent)的ESC進行共培養。24小時後，將不附著於飼養層的細胞移出，用不附著的細胞重複進行第二次提取物暴露過程。培養再程序化的細胞(附著的細胞)，針對胚胎幹細胞特異性標記(即，REX1，OCT4)加以分析，在暴露給成熟過程之前檢驗體外分化潛力。
實施例8用細胞質提取物因子來進行治療用再程序化本實施例描述了對PSC的治療用再程序化，從而其能在成熟期間發揮功能，恰當響應，這是通過用來自胚胎幹細胞的細胞質提取物誘導基因組修飾來實現的。
按照實施例4所述來分離原性細胞。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作可再程序化的細胞。這些細胞被貯存於冰上，直到暴露給細胞質提取物。
為製備胚胎幹細胞提取物，將ESC培養至滿盤。使用含有10μg/mL細胞鬆弛素B的Ficoll-400(30％、25％、22％、18％和15％)的不連續密度梯度來製備ESC細胞質。小心地將12.5％Ficoll-400中的千萬ESC放置到梯度頂端，以40,000rpm於36℃進行30分鐘的離心。從15％和/或18％的水平收集細胞質。然後用冰冷的PBS對細胞質洗三次，接著在細胞裂解緩衝液中清洗。然後在350xg下對細胞質進行離心，重新懸浮於1.5倍體積的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩衝液中，在冰上培養45分鐘。然後通過脈衝超聲波對細胞質進行均質化，然後在16,000xg下於4℃對細胞質進行20分鐘的離心。然後收集上清液，蛋白濃度測定為大約6mg/mL。
按照實施例7所述的方法，將前文分離的PSC與細胞質提取物一起培養。
實施例9用核質提取物因子來進行治療用再程序化本實施例描述了對PSC的治療用再程序化，從而其能在成熟期間發揮功能，恰當響應，這是通過用來自胚胎幹細胞的細胞核(核質)提取物誘導基因組修飾來實現的。
按照實施例4所述來分離原性細胞。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作可再程序化的細胞。這些細胞被貯存於冰上，直到暴露給細胞核提取物。
為製備胚胎幹細胞細胞核(核質)提取物，將ESC培養至滿盤。使用含有10μg/mL細胞鬆弛素B的Ficoll-400(30％、25％、22％、18％和15％)的不連續密度梯度來製備ESC核質。小心地將12.5％Ficoll-400中的千萬ESC放置到梯度頂端，以40,000rpm於36℃進行30分鐘的離心。從30％的水平收集核質。然後用冰冷的PBS對核質洗三次，接著在細胞裂解緩衝液中洗。然後在350xg下對核質進行離心，重新懸浮於1.5倍體積的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩衝液中，在冰上培養45分鐘。然後通過脈衝超聲波對核質進行均質化，然後在16,000xg下於4℃對核質進行20分鐘的離心。然後收集上清液，蛋白濃度測定為大約6mg/mL。
按照實施例7所述的方法，將前文分離的PSC與核質提取物一起培養。
實施例10雜交幹細胞製造本實施例描述了雜交幹細胞的產生。本實施例展示的方法可用於使用任何摘除細胞核的(前胚胎、胚胎、胎兒或出生後)幹細胞作為宿主細胞以及使用PSC或任何細胞(前胚胎、胚胎、胎兒或出生後)作為供體來產生雜交幹細胞，僅有的限制是供體細胞是二倍體(2N)。此外，供體細胞或其細胞核可被遺傳修飾，以校正遺傳障礙，通過基於幹細胞的療法傳遞經校正的基因或轉基因體。供體細胞和宿主細胞可通過下述方法融合，所述方法包括但不限於，電、病毒、化學或機械融合。此外，可通過下述方法來摘除宿主細胞的細胞核，所述方法包括但不限於，化學手段、x-射線照射、雷射照射或機械手段。
按照實施例4所述來分離原性細胞。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作供體細胞。這些細胞被貯存於冰上，直到與摘除細胞核的胚胎幹細胞融合。
為製備胚胎幹細胞細胞質，將ESC培養至滿盤。然後使用含有10μg/mL細胞鬆弛素B的Ficoll-400(30％、25％、22％、18％和15％)的不連續密度梯度來製備ESC細胞質。小心地將12.5％Ficoll-400中的千萬ESC放置到梯度頂端，以40,000rpm於36℃進行30分鐘的離心。從15％和/或18％的區域收集細胞質，並貯存於冰上，直到細胞融合。
在細胞脈衝融合培養基(CytoPulse)中對供體細胞(PSC)或其細胞核洗三次，以5×106個細胞或細胞核重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。在細胞脈衝融合培養基中對摘除了細胞核的宿主細胞(ESC)洗三次，以1×106個細胞重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。輕柔混合兩種細胞群，將其放置於細胞脈衝(Cytopulse)融合腔中，採用下述參數進行電融合正弦前，開始電壓65伏，持續50伏，頻率0.8kHz，終點電壓65伏；脈衝，振幅200伏，持續0.05毫秒；以及正弦後，開始電壓65伏，持續50秒，頻率0.8kHz，終點電壓5伏。然後令細胞保留在腔中於37℃恢復30分鐘。融合後15分鐘，加入FBS至最終的血清濃度為10％，再培養15分鐘。然後通過在室溫下於500xg離心5分鐘，取出融合的細胞，在DPBS/20％血清中洗一次，重新懸浮於準備培養基中。再將融合的細胞放置於48孔板的孔中，所述的板已用0.1％的明膠(含有絲裂黴素C失活的PEF層)預處理過。此外，還可以在48孔皿(已用0.1％的明膠(含有絲裂黴素C失活的PEF層)預處理過)中對幹細胞雜交體和50％滿盤的ESC進行共培養。融合的細胞經歷多次傳代擴展，以確定雜交幹細胞的穩定性以及供體細胞基因組的再程序化。然後對雜交幹細胞進行染色體組型分析，僅保留整倍體的細胞系用於成熟。
在一種實驗中，對來自TgN(GFPU)5Nagy小鼠的脂肪來源幹細胞(ADSC)摘除細胞核，所述細胞本質地表達綠色螢光蛋白(GFP)，通過電融合令細胞質與來自R26R小鼠的淋巴細胞融合。該株系小鼠被選為本實驗的淋巴細胞來源，僅因為在它們的細胞核中存在Neo標記。宿主細胞中GFP的存在允許對宿主細胞加以跟蹤。培養通過該融合產生的雜交幹細胞，針對GFP的存在(指示帶細胞核的宿主細胞的存在，而非幹細胞雜交體的存在)進行分析。融合後兩周內，在培養物中可以看到個體GFP(-)細胞(圖4)，這是可能的融合產物；在四周內，存在GFP(-)細胞的克隆(圖5)。針對GFP(-)細胞對這些細胞進行揀選，通過培養來擴展。
針對GFP(宿主細胞核)和Neo(供體細胞核)的存在，用螢光活化細胞揀選(FACS)來對本發明上述實施方式中產生的雜交幹細胞進行進一步表徵。通過單細胞聚合酶鏈式反應分析，雜交幹細胞被驗證為供體細胞核和摘除細胞核的宿主細胞的雜交體(圖8)。
實施例11胚狀體產生通過從培養基中撤除LIF，誘導前面分離的DSC，形成胚狀體。通過將數滴20μL(每滴1200個細胞)放置到非粘著組織培養皿的蓋子上來誘導聚集，隨後顛倒滅菌PBS。培養基補充有成纖維細胞生長因子2和血管內皮生長因子A165。從培養基中移除LIF以及液滴形成的日子是第0天。液滴於37℃和5％CO2的環境中於培養皿蓋子上懸掛3-5天。3-5天後，液滴每滴被轉移到8孔培養玻片的孔中。所有分析都在四個或多個胚狀體上進行三或更多次。
實施例12用成熟的幹細胞來修復梗塞的心肌下述實施例描述了一種方法，其中，來自出生後來源的治療用再程序化PSC在異種移植胎綿羊模型中成熟為出生後幹細胞，其被用於基於細胞的療法，用於修復梗塞的心肌。除使用新鮮分離的PSC之外，還可使用冷凍的或貯藏的幹細胞。
按照實施例4所述來分離原性細胞。α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作可再程序化的細胞。通過暴露給不同濃度的DNA去甲基化試劑，例如5-氮雜-2』-脫氧胞苷、組蛋白去乙醯酶抑制劑、正丁酸或曲古菌素A，來對供體細胞或其中的細胞核物質進行治療用再程序化。在本實施例的治療用克隆中，在去甲基化之後，治療用再程序化PSC被準備用於經歷成熟過程。
進行卵巢刺激之後收集卵原細胞，其在G1.2培養基中體外成熟(中期II)。選出具有第一極體的卵原細胞用於細胞核摘除。在補充有10％的FBS和5μg/mL的細胞鬆弛素B的hCR2aa中進行細胞核摘除。用固定吸管將卵原細胞保持在合適的位置，用細針在透明帶上製造出小裂縫。用針去掉含有中期II染色體的細胞質和第一極體。通過用Hoechst 33342對摘除細胞核的卵原細胞進行5分鐘的染色，並在落射螢光下觀察來驗證細胞核摘除。然後將摘除細胞核的卵原細胞放置於HEPES緩衝的TCM-199培養基中，所述培養基補充有10％FBS。按照實施例9所述來製備供體細胞。將單個供體細胞放進摘除細胞核的卵原細胞的卵周隙，所述卵原細胞已用hCR2aa中的100μg/mL植物血球凝集素處理過。融合通過下述方法來進行將供體PSC和摘除細胞核的宿主細胞組合放置於融合培養基(0.26M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.5mM HEPES和0.05％(w/v)BSA)中，在BTX 453，3.2mm縫隙的腔中，於3分鐘平衡之後進行融合。使用BTX Electro-cell操作儀200，用兩次DC脈衝(1.75-1.85kV/cm，15秒)來誘導融合。供體細胞核和摘除細胞核的宿主細胞的融合產物現在被命名為經修飾的生殖細胞。然後在融合後對經修飾的生殖細胞進行2小時的培養。激活通過下述方法來進行將經修飾的生殖細胞在G1.2培養基中暴露給10μM的鈣離子載體A23187達5分鐘，接著與2.0mM DMAP一起進行培養，以及在6％CO2、5％O2、89％N2下在G1.2培養基中培養4小時。然後在G1.2培養基中對經修飾的生殖細胞進行10次清洗，再在G1.2培養基中培養48小時，接著在具有胺基酸的人類經修飾SOF(hmSOFaa)中培養6天。HmSOFaa是通過將10mg/mL的人血清清蛋白和1.5mM果糖加入到hmSOFaa中製得的。通過用0.1％鏈黴蛋白酶消化，從經修飾的生殖細胞移除透明帶。通過免疫手術，從經修飾的生殖細胞分離出ICM，用100％抗人血清抗體對ICM進行20分鐘的培養，接著再在37℃於5％CO2中暴露給豚鼠補體系統額外30分鐘。在0.1％明膠塗布的4孔組織培養皿中，在絲裂黴素C失活的PEF飼養層上培養從經修飾的生殖細胞分離出的ICM。在該階段，經修飾的生殖細胞成熟為經修飾的ESC。經修飾的ESC被培養於DMEM/DMEM F12(1∶1)、0.1mMβ-巰基乙醇、1％非必要胺基酸、100個單位/mL的青黴素、100μg/mL鏈黴素以及4ng/mL bFGF中。此外，直到第一次傳代，將2000個單位/mL的人LIF加入到培養基中。然後在細胞上進行染色體組型分析，僅保留整倍體的細胞系用於成熟。
在一些情況下，ESC可能必須在成熟前經歷製備步驟。非限制性的例子是在暴露給成熟過程之前誘導成為胚狀體或類造血幹細胞環境的ESC。此外，成熟製備可能通過下述方法來誘導，所述方法包括但不限於，胚胎幹細胞或其細胞核暴露給化學、生物化學或細胞提取物(細胞質和/或細胞核)。
使用羊膜氣泡方案，將一百萬雄性ESC注射進免疫前(懷孕第48-62天)的雌性胎綿羊接受者。簡言之，在48小時的禁食時期後，對母羊注射克他命(10mg/kg，肌注)，其通過氣管吸入獲得0.5-1.0％的氟烷-氧混合物。向頸外靜脈插管，用於施予流體和抗生素(二百萬U的青黴素和400mg卡納黴素)。通過中線切開暴露子宮，通過電烙術分開子宮肌層，保留羊膜完整。在直接觀察下，於羊膜囊內操作胎羊，將胚胎幹細胞注射進胎羊的腹膜腔。關閉子宮和母體壁，令胎羊至足月。
出生後大約3月，對含有移植的胚胎幹細胞的宿主綿羊安樂死。在用H2O裂解紅細胞以前，通過在Lymphocyte Separation Medium(BioWhittaker)上進行Ficoll密度分離，分離出單細胞核骨髓細胞(BMC)。通過Y染色體的存在選出雄性細胞，將1×106個BMC/ml放置於Teflon袋(Vuelife，Cell Genix)中，在補充有2％熱失活自體而漿的X-Vivo 15培養基(BioWhittaker)中對其進行培養。第二天，收穫BMC，在最終懸浮於肝素化鹽水之前，用肝素化鹽水洗三次。存活率被測定為大約93±3％。對細胞進行肝素化，過濾，以防止在冠狀動脈內移植期間出現細胞結塊和微栓塞。過夜培養之後收穫的單細胞核細胞的平均數最為2.8×107，其由0.65±0.4％的AC133-陽性細胞和2.1±0.28％的CD34陽性細胞構成。對臨床使用的細胞製劑進行的所有微生物試驗都證實為陰性。作為存活率和質量的體外對照，在H5100培養基(Stem CellTechnology)中生長的1×105個細胞被發現能在培養物中產生間質細胞。冷凍BMC細胞，將其貯藏於細胞存貯庫用於進一步的用途。
在心肌梗塞時，解凍低溫貯藏的細胞，並進行培養。急性梗塞發作五至九天後，將細胞直接植入到梗塞區域。這是使用放置於梗塞相關動脈的球囊導管來完成的。在之前梗塞血管閉塞的位置放置球囊之後，進行6至7次經皮冠狀動脈成形術(PTCA)，每次2至4分鐘。這段時間中，通過球囊導管進行冠狀動脈內的細胞移植，其中使用6至7份2至3ml細胞懸浮液的高壓灌注物，其中每份都含有大約1.5-4×106個單細胞核細胞。血管成形術完全防止了細胞的倒流，同時產生了在球囊膨脹位置外的流動停止(stop-flow)，協助細胞的高壓灌注物進入到梗塞區域。因此，允許用於細胞遷移的接觸時間延長。
實施例13製造脂肪來源的雜交幹細胞下面簡單描述了對雜交幹細胞的製備，從而其能在基於細胞的療法中發揮功能，恰當響應。該雜交幹細胞獲得自摘出了細胞核的脂肪來源幹細胞(宿主細胞)和PSC或其細胞核(供體細胞)。可選地，在用作用於雜交幹細胞的供體細胞之前，脂肪來源的幹細胞(ADSC)可被治療用再程序化。
脂肪來源的幹細胞獲得自129/SvJ小鼠。簡言之，取下包圍胃腸的內臟脂肪，用滅菌剪刀剪碎。然後用等體積的不含鈣/鎂的Dulbecco’s磷酸緩衝鹽水(DPBS-)對切開的脂肪進行三次清洗，每個清洗步驟之後在500×g下離心5分鐘，以除去漂浮的脂肪細胞。將I型膠原酶(0.075％，Sigma)加入到剪碎的脂肪組織中，混合物在37℃、輕柔攪拌下培養30分鐘，向混合物中加入等體積的DMEM(含有10％FBS)。然後在500xg下對混合物進行10分鐘的離心，將細胞沉澱重新懸浮於含有10％FBS的DMEM中。然後將混合物經100μm尼龍篩過濾，在500xg下離心10分鐘，重新懸浮於含有10％FBS和1X抗生素/抗真菌素的DMEM(基礎培養基)中。然後培養細胞進行四次傳代，將其塗布到25×75mm組織培養玻片上，所述玻片上塗布有10ng/mL纖連蛋白。在製造雜交幹細胞的當天，向培養基中加入2μg/mL的細胞鬆弛素D(終濃度)，在37℃對玻片進行120分鐘的培養。120分鐘的培養步驟之後，在浮桶式離心機中，基礎培養基中，於10,000xg對玻片進行1小時的離心。兩小時回收期後，對細胞進行胰蛋白酶處理，其被製備來進行細胞融合。
按照實施例4所述來製備原性細胞，α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作供體細胞。在細胞脈衝融合培養基(CytoPulse)中對供體細胞或其細胞核洗三次，以5×106個細胞或細胞核重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。前面分離的摘除了細胞核的宿主細胞(脂肪來源的幹細胞)從玻片上被胰蛋白酶處理，在細胞脈衝融合培養基中洗三次，以1×106個細胞重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。輕柔混合兩種細胞群，將其放置於細胞脈衝融合腔中，採用下述參數進行電融合正弦前，開始電壓65伏，持續50伏，頻率0.8kHz，終點電壓65伏；脈衝，振幅200伏，持續0.05毫秒；以及正弦後，開始電壓65伏，持續50秒，頻率0.8kHz，終點電壓5伏。然後令細胞保留在腔中於37℃恢復30分鐘。融合後15分鐘，加入FBS至最終的血清濃度為10％，再培養15分鐘。然後取出融合的細胞，在DPBS/20％血清中洗一次，重新懸浮於基礎培養基中。
實施例14產生專能成年祖雜交幹細胞下面簡單描述了對雜交幹細胞的製備，從而其能在基於細胞的療法中發揮功能，恰當響應。該雜交幹細胞獲得自摘出了細胞核的專能成年祖細胞(宿主)和PSC或其細胞核(供體細胞)。可選地，在用作用於雜交幹細胞的供體細胞之前，專能成年祖細胞(MAPC)可被治療用再程序化。
收集骨髓細胞(BMC)，將其重新懸浮於培養基中，並放置於冰上。通過Ficoll-Hypaque分離收集骨髓單核細胞(BMMNC)，將其以1×105/cm2放置於MAPC培養基中塗布有纖連蛋白的培養皿上。將BMMNC培養物保持為5×103/cm2，3-4周後，收穫細胞，使用微磁珠分離器除去CD45+/Terr119+細胞。將CD45-/Terr119-群(～20％)以10個細胞/孔放置於FN處理過的96孔皿上，按照0.5-1.5×103/cm2的密度塗開。大約1％的孔產生持續的生長中MAPC培養物。然後通過塗布到25×75mm組織培養玻片上，令這些細胞擴展，用於細胞核摘除，所述玻片上塗布有纖連蛋白。在製造雜交幹細胞的當天，向培養基中加入2μg/mL的細胞鬆弛素D(終濃度)，在37℃對玻片進行120分鐘的培養。120分鐘的培養步驟之後，在浮桶式離心機中，MAPC培養基中，於10,000xg對玻片進行1小時的離心。兩小時回收期後，對細胞進行胰蛋白酶處理，其被製備來進行細胞融合。
按照實施例4所述來製備供體細胞(PSC)，α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作供體細胞。在細胞脈衝融合培養基中對供體細胞或其細胞核洗三次，以5×106個細胞重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。前面分離的摘除了細胞核的宿主細胞(MAPC)從玻片上被胰蛋白酶處理，在細胞脈衝融合培養基中洗三次，以1×106個細胞重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。輕柔混合兩種細胞群，將其放置於細胞脈衝融合腔中，採用下述參數進行電融合正弦前，開始電壓65伏，持續50伏，頻率0.8kHz，終點電壓65伏；脈衝，振幅200伏，持續0.05毫秒；以及正弦後，開始電壓65伏，持續50秒，頻率0.8kHz，終點電壓5伏。然後令細胞保留在腔中於37℃恢復30分鐘。融合後15分鐘，加入FBS至最終的血清濃度為10％，再對細胞進行15分鐘的培養。然後取出融合的細胞，在DPBS/20％血清中洗一次，重新懸浮於MAPC培養基中。
實施例15用雜交幹細胞修復梗塞的心肌下文描述了一種方法，其中，雜交幹細胞被用於基於細胞的療法，以修復梗塞的心肌。在該實施例中，患者處於心肌梗塞的高風險中。雜交幹細胞獲得自摘除了細胞核的宿主細胞(骨髓細胞)和出生後供體細胞(PSC)。宿主細胞可以從患者或從幹細胞存貯庫或任何細胞來源獲得，不考慮HLA類型的免疫排斥，因為製造的雜交幹細胞將含有來自患者PSC的基因組物質。
按照實施例4所述來分離出生後供體細胞，α6-整聯蛋白hi/SSClo/c-kit(-)群被用作供體細胞。在一些情況下，供體細胞或其細胞核可以在與宿主細胞融合前經歷製備步驟，使其更容易被宿主細胞質所接受。製備步驟還可以包括但不限於，通過化學、生物化學或細胞提取物進行誘導，所述化學、生物化學或細胞提取物能影響供體細胞的基因組狀態，使其具有功能性，並且能被宿主細胞質接受。
在用H2O裂解紅細胞以前，通過在Lymphocyte Separation Medium上進行Ficoll密度分離，分離出單細胞核骨髓細胞(BMC)。為了過夜培養，將1×106個BMC/ml放置於Teflon袋中，在補充有2％熱失活自體血漿的X-Vivo 15培養基中對其進行培養。第二天，收穫BMC，在最終懸浮於肝素化鹽水之前，用肝素化鹽水洗三次。存活率為大約93±3％。進行肝素化，過濾，以防止在冠狀動脈內移植期間出現細胞結塊和微栓塞。過夜培養之後收穫的單細胞核細胞的平均數量為2.8×107，其由0.65±0.4％的AC133-陽性細胞和2.1±0.28％的CD34陽性細胞構成。對細胞製劑進行的所有微生物試驗都為陰性。作為存活率和質量的體外對照，在H5100培養基中生長的1×105個細胞被發現能在培養物中產生間質細胞。
然後培養新鮮的或前述低溫貯藏的宿主細胞，將其塗布到25×75mm組織培養玻片上，所述玻片上塗布有纖連蛋白。在製造雜交幹細胞的當天，向培養基中加入2μg/mL的細胞鬆弛素D(終濃度)，在37℃對玻片進行120分鐘的培養。120分鐘的培養步驟之後，在浮桶式離心機中，X-Vivo 15培養基(補充有2％熱失活自體血漿)或H5100培養基(含有2μg細胞鬆弛素D)中，於10,000xg對玻片進行1小時的離心。兩小時回收期後，對細胞進行胰蛋白酶處理，其被製備來進行細胞融合。從玻片對細胞進行胰蛋白酶處理，製備來進行細胞融合。在細胞脈衝融合培養基中對供體細胞或其細胞核洗三次，以5×106個細胞重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。在細胞脈衝融合培養基中對摘除了細胞核的宿主細胞(BMC)洗三次，以1×106個細胞重新懸浮於150μL冰冷的細胞脈衝融合培養基中。輕柔混合兩種細胞群，將其放置於細胞脈衝融合腔中，採用下述參數進行電融合正弦前，開始電壓65伏，持續50伏，頻率0.8kHz，終點電壓65伏；脈衝，振幅200伏，持續0.05毫秒；以及正弦後，開始電壓65伏，持續50秒，頻率0.8kHz，終點電壓5伏。然後令細胞保留在腔中於37℃恢復30分鐘。融合後15分鐘，加入FBS至最終的血清濃度為10％，再對細胞進行15分鐘的培養。然後取出融合的細胞，在DPBS/20％血清中洗一次，重新懸浮於X-Vivo 15培養基(補充有2％熱失活自體血漿)或H5100培養基中。對細胞進行培養和擴展，以用於HLA-類型相容性檢驗。然後冷凍細胞，貯藏於細胞存貯庫中，用於進一步的細胞療法使用。
在心肌梗塞時，解凍低溫貯藏的雜交幹細胞，並進行培養。急性梗塞發作五至九天後，將細胞直接植入到梗塞區域。這是使用放置於梗塞相關動脈的球囊導管來完成的。在之前梗塞血管閉塞的位置精確放置球囊之後，進行6至7次經皮冠狀動脈成形術(PTCA)，每次2至4分鐘。這段時間中，通過球囊導管進行冠狀動脈內的細胞移植，其中使用6至7份2至3ml細胞懸浮液的高壓灌注物，其中每份都含有大約1.5-4×106個細胞。血管成形術完全防止了細胞的倒流，同時產生了在球囊膨脹位置外的流動停止(stop-flow)，協助細胞的高壓灌注物進入到梗塞區域。因此，允許用於細胞遷移的接觸時間延長。
除非另有指明，本說明書和權利要求書中使用的表示成分數量，以及分子量、反應條件等性質的所有數字都應當被理解為在所有情況下，用術語「大約」加以了修飾。因此，除非有相反含義的說明，本說明書和所附權利要求書中示出的數量參數都是約數，它們可以根據本發明想要獲得的性質而變動。至少，並且並非對權利要求書範圍等同原則的應用加以限制，每個數量參數至少應按照報導的有效數字的數，以及應用普通的湊整技術來解釋。雖然示出本發明寬廣範圍的數字範圍和參數是約數，但是特別實施例中所示的數值卻被儘可能地精確報導。但是，任何數值，必然含有一定誤差，這是它們分別的檢驗測量方法中發現的標準偏差必然導致的。
除非本文另有指明，或與上下文明顯矛盾，描述本發明的上下文中使用的術語「一個」、「一種」和「這個」以及類似提法應當被理解為既包括單數又包括複數。本文中數值範圍的複述僅僅用作速記方法，用於該範圍內每個單獨的值。除非本文另有指明，每個單獨的值被包括進說明書，這與在本文個別複述一樣。本文所述的所有方法都可以以任何合適的順序來進行，除非本文另有指明，或與上下文明顯矛盾。除非另有指明，本文提供的任何及所有例子，或者示例性的語言(例如，「例如」)僅用來更好地闡述本發明，而非對發明範圍加以限制。說明書中任何語句都不應被解釋為表示對本發明的實踐來說必要的、不要求保護的要素。
本文公開的本發明的替換性要素或實施方式的分組不應被理解為限制。每個組成員可被個別提到或被個別要求保護，或以與該組其它成員或本文中找到的其它要素的任何組合被提到或要求保護。可以預見到，為了方便和/或可專利性的理由，組中的一個或多個成員可被包括進一組或從中刪除。當任何此類包括或刪除發生時，說明書在本文中被看作為含有經過改動的組，因此滿足所附權利要求書中所用的馬庫什組的撰寫描述。
本文中描述了本發明的優選實施方式，其包括發明人已知用來開展本發明的最佳模式。當然，在閱讀前述說明書的基礎上，對這些優選實施方式中的改動對於本領域普通技術人員來說將是明顯的。本發明的發明人期待本領域技術人員合適地採用此類改動，發明人希望本發明以除了本文特別描述的方式之外的方式被實現。因此，只要適用法律允許，本發明包括對所附權利要求中提到的主體進行的所有改動和等同物。此外，所有可能的變化中，上面提到的要素的任何組合都被包括進本發明，除非本文另有指明，或與上下文明顯矛盾。
此外，本說明書中提到了大量參考文獻，包括專利和印刷公開物。上述參考文獻和印刷公開物中的每種在此都通過引用被個別地整體包括進本文。
最後，應當理解，本文公開的本發明實施方式是為了闡述本發明的原理。可以進行的其它改動也落在本發明的範圍內。因此，舉例而言，而非限制，可按照本文的教導來使用本發明的替代性構造。因此，本發明不被限制為與本文所述和所示出的完全準確。
權利要求
1.一種治療用再程序化方法，所述方法包括分離幹細胞；將所述幹細胞與包含刺激因子的培養基接觸，所述刺激因子能誘導所述幹細胞發育為治療用再程序化細胞；從所述培養基中回收所述治療用再程序化細胞；以及將所述治療用再程序化細胞或由其成熟的細胞植入到需要治療用再程序化細胞的宿主中。
2.如權利要求1所述的治療用再程序化方法，其中，所述幹細胞選自由胚胎幹細胞、胎兒幹細胞、身體幹細胞、專能成年祖細胞、雜交幹細胞、經過修飾的生殖細胞、脂肪來源的幹細胞以及原性細胞構成的組。
3.如權利要求2所述的治療用再程序化方法，其中，所述原性細胞是精原幹細胞。
4.如權利要求1所述的治療用再程序化方法，其中，所述刺激因子選自由化學物質、生物化學物質和細胞提取物構成的組。
5.如權利要求4所述的治療用再程序化方法，其中，所述刺激因子是選自由5-氮雜-2』-脫氧胞苷、組蛋白去乙醯酶抑制劑、正丁酸和曲古菌素A構成的組的化學物質。
6.如權利要求4所述的治療用再程序化方法，其中，所述刺激因子是選自由全細胞提取物、細胞質提取物和核質提取物所構成的組的細胞提取物。
7.如權利要求6所述的治療用再程序化方法，其中，所述細胞提取物分離自幹細胞，所述幹細胞選自由胚胎幹細胞、胎兒神經幹細胞、專能成年祖細胞、雜交幹細胞和原性細胞構成的組。
8.如權利要求1所述的治療用再程序化方法，其中，所述宿主是哺乳動物。
9.如權利要求1所述的治療用再程序化方法，其中，所述幹細胞分離自所述宿主。
10.如權利要求1所述的治療用再程序化方法，還包括如下步驟使所述治療用再程序化細胞成熟，以定型為組織特異性系代。
11.一種治療用再程序化方法，包含分離精原幹細胞(SSC)；將所述SSC與包含刺激因子的培養基接觸，所述刺激因子能誘導所述SSC發育為全能細胞；從所述培養基中回收所述全能細胞；以及將所述全能細胞或由其成熟的細胞植入到需要治療用再程序化細胞的宿主中。
12.一種治療用再程序化方法，包括提供雜交幹細胞；將所述雜交幹細胞與包含刺激因子的培養基接觸，所述刺激因子能誘導所述雜交幹細胞發育為全能細胞；從所述培養基中回收所述全能細胞；以及將所述全能細胞或由其成熟的細胞植入到需要治療用再程序化細胞的宿主中。
13.一種治療用再程序化細胞，包含已被暴露給刺激因子的SSC，所述刺激因子已導致所述SSC成熟或分化為全能或多能細胞。
14.一種治療用再程序化細胞，包含已被暴露給刺激因子的多能幹細胞，所述刺激因子已導致所述多能幹細胞成熟或分化為更定型的細胞系代。
15.一種方法，用於製造雜交幹細胞，所述方法包含獲得供體細胞，其中，所述供體細胞是雙倍體；獲得宿主細胞；對所述宿主細胞摘除細胞核；將所述供體細胞或其細胞核與所述宿主細胞融合；以及分離出所述雜交幹細胞。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述供體細胞選自由胚胎幹細胞、身體細胞、原性細胞和治療用再程序化細胞所構成的組。
17.如權利要求15所述的方法，其中，所述供體細胞處於G0期。
18.如權利要求15所述的方法，其中，所述宿主細胞選自由胚胎幹細胞、胎兒神經幹細胞和專能成年祖細胞構成的組。
19.如權利要求15所述的方法，還包括如下步驟在所述獲得步驟之後並且在所述摘除細胞核步驟之前培養所述宿主細胞歷經四次傳代。
20.如權利要求15所述的方法，其中，所述供體細胞和所述宿主細胞來自哺乳動物。
21.如權利要求15所述的方法，其中，所述供體細胞和所述宿主細胞來自同一個體。
22.如權利要求15所述的方法，其中，通過選自由化學、機械、物理、x-射線照射以及雷射照射摘除細胞核所構成的組的方法，來摘除所述宿主細胞的細胞核。
23.如權利要求15所述的方法，還包括如下步驟在與所述供體細胞融合之前，對所述已摘除細胞核的宿主細胞進行大約三天的培養。
24.如權利要求15所述的方法，其中，所述融合步驟包括選自由電融合、微注射、化學融合或基於病毒的融合構成的組的融合方法。
25.如權利要求15所述的方法，其中，所述分離步驟包括螢光活化的細胞揀選。
26.如權利要求15所述的方法，還包括在所述分離步驟之後培養所述雜交幹細胞。
全文摘要
本發明提供了治療用程序化細胞，以及用於製造此類細胞的方法。治療用程序化細胞是已成熟的幹細胞，從而使得它們在與刺激因子接觸之後呈現較多分化的狀態或較少分化的狀態。治療用再程序化細胞適合用於細胞再生療法，其具有分化為更定型的細胞系代的潛力。此外，本發明提供了適用於治療用再程序化和細胞再生療法的雜交幹細胞。
文檔編號C12M3/00GK1973033SQ200580018783
公開日2007年5月30日 申請日期2005年2月16日 優先權日2004年6月8日
發明者昌西·B·賽亞, 弗朗西斯科·J·西爾瓦 申請人:普裡梅真比奧特斯公司