用於異種蛋白製備的細胞及使用所述細胞的製備方法

2023-09-14 18:18:55 2

專利名稱：用於異種蛋白製備的細胞及使用所述細胞的製備方法
技術領域：
本發明涉及用於異種蛋白製備的細胞及使用所述細胞的製備方法，更具體涉及高 效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞及使用其製備多肽的方法。
背景技術：
在使用基因重 組技術生產醫藥上有用的蛋白質時，若使用動物細胞，則如原核細 胞無法進行的複雜的翻譯後修飾和摺疊成為可能，因此，動物細胞常用作用於生產重組蛋 白質的宿主細胞。近年來，抗體和生理活性蛋白質等較多生物醫藥製品輩出，使動物細胞高效地生 產重組蛋白質的技術關係到生物醫藥製品的低成本化，可以確保對患者的穩定供給。因此，期待開發出生產效率更高的蛋白質的製備方法。陰離子交換蛋白是交換轉運細胞膜內外的陰離子的轉運蛋白(膜轉運蛋白)。 SLC4家族為HCO3-的轉運蛋白的家族，附屬於其的ΑΕΙ、AE2及AE3這三個成員具有將細胞 膜外的Cl—與細胞膜內的HCO3-交換的功能。在腎臟中，AEl見於基底外側膜的集合管的α閏細胞中(非專利文獻1)。已知人 的AEl的變異會引起遠端腎小管性酸中毒(非專利文獻2及3)。另外，在腎臟中，還發現了 ΑΕ2的3種亞型AE2a、AE2b及AE2c。AE2被認為是用於 傳遞細胞信號從而控制細胞內PH平衡的(非專利文獻4)，AE2基因敲除小鼠死於斷奶期， 但並未發現腎性表型異常(非專利文獻5)。SLC26是比較新的陰離子交換蛋白家族，其多個成員(例如SLC26A3、SLC26A4、 SLC26A6、SLC26A9等)被提示為碳酸氫根交換蛋白(非專利文獻6 11)。另一方面，通過使具有碳酸氫根轉運蛋白功能的陰離子交換蛋白高效表達而人為 地促進介由陰離子交換蛋白的陰離子向培養細胞內的導入及向細胞外的排出，對培養細胞 中的期望重組蛋白質的產量提高的貢獻完全不清楚。非專利文獻1 :van Adelsberg JS. et. al.，J Biol Chem 1993 ；268 :11283_11289非專禾0 文獻 2 =Shayakui C. et. al.，Curr Opin Nephrol Hypertens2000 ；9 541-546非專利文獻3 =Alper SL. et. al.，Annu Rev Physiol 2002 ；64 :899_923##^lJ ^lK 4 =Komlosi P. et. al. , Am J Physiol Renal Physiol 2005 ；288 F380-F386非專利文獻5 =Gawenis LR. et. al.，J Biol Chem 2004 ；279 :30531_30539非專利文獻6 =Melvin et al, J Biol Chem 1999 ；274 :22855_22861非專利文獻7 :Ko et al.，EMBO J. 2002 ；21 :5662_5672非專利文獻 8 :Soleimani et al. , Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2001 ；280 F356-F364非專利文獻 9 =Wang et al.，Am. J. Physiol. Gastrointest. LiverPhysiol. 2002 ；282 :G573-G579非專利文獻 10 :Petrovic et al. , Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2004 ；286 F161-F169非專利文獻11 :Xu et al.，Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005 ；289 :C493_C505

發明內容
發明擬解決的技術課題本發明的目的在於，提供可以有效地生產多肽的方法。解決課題的技術方案本發明人等為了解決上述課題進行了專心研究，結果發現，通過使用高效表達碳 酸氫根轉運蛋白的細胞，可以增加期望多肽的產量，由此完成本發明。進而，通過使用共表 達碳酸氫根轉運蛋白和半胱亞磺酸脫羧酶(以下有時記為「CSAD」)或丙氨酸氨基轉移酶 (以下有時記為「ALT」)的細胞，可以進一步增加期望多肽的產量。本發明的主旨如下所述。(1)多肽製備方法，其包括培養高效表達碳酸氫根轉運蛋白、且導入有編碼期望 多肽的DNA的細胞，使其產生期望多肽。(2) (1)的製備方法，其中所述高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞為導入有編碼碳 酸氫根轉運蛋白的DNA的細胞。(3) (1)或(2)的製備方法，其中所述高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞還高效表 達半胱亞磺酸脫羧酶或丙氨酸氨基轉移酶。(4) (1) (3)的製備方法，其中所述碳酸氫根轉運蛋白為SLC4陰離子交換蛋白或 SLC26陰離子交換蛋白。(5) (1) (3)的製備方法，其中所述碳酸氫根轉運蛋白為SLC4陰離子交換蛋白。(6) (5)的製備方法，其中所述SLC4陰離子交換蛋白為AE1。(7) (1) (6)中任一項的製備方法，其中所述細胞為中國倉鼠卵巢細胞。(8)⑴ (7)中任一項的製備方法，其中所述期望多肽為抗體。(9) (4) (6)中任一項的製備方法，其中所述編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA為 以下(a) (e)中的任一種(a)編碼具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列的多肽的DNA ；(b)編碼具有在SEQ ID NO 2的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或 多個胺基酸所得的胺基酸序列、且具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA ；(c)編碼與SEQ ID NO 2的胺基酸序列具有50%以上的同一性、且具有SLC4陰離 子交換蛋白活性的多肽的DNA ；(d)具有SEQ ID NO 1的鹼基序列的DNA ；(e)在嚴格的條件下和與具有SEQ ID NO=I的鹼基序列的DNA互補的DNA雜交、 且編碼具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA。(10)藥品製備方法，其中所述藥品含有根據⑴ (9)中任一項的方法製備的多肽。(11)細胞，其導入有
編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA、和 編碼期望多肽的DNA。(12) (11)的細胞，其還導入有編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙氨酸氨基轉移酶的 DNA。(13)細胞，其導入有 編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA、和 編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙氨酸氨基轉移酶的DNA。發明效果根據本發明，可以生產大量的期望多肽。本說明書包含作為本申請的優選權的基礎的日本專利申請、特願2007-276182的 說明書及/或附圖所記載的內容。附圖簡述

圖1為由來源於人肝細胞的AEl的胺基酸序列、基於TMpred程序預測的跨膜區域 及方向並以 Exo Physiol 91. 1ρρ153_161，2006，SethL. Alper 的圖 1 為參考而製作的 AEl 膜拓撲。圖2為表達人AEl (911個胺基酸)的潮黴素(Hygromycin)篩選用質粒。圖3為表達人AEl (911個胺基酸)的嘌呤黴素(Puromycin)篩選用質粒。圖4為50ml搖瓶流加培養第12天的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量標繪 圖。pHyg-AEl導入細胞(η = 4)的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量優於pHyg導入細 胞(η = 4) (P < 0. 05)。圖5為50ml搖瓶流加培養第10天的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量標繪 圖。嚮導入了 pHyg-AEl的抗體高產生細胞的pHyg-AEl-42株中導入pPur_CSAD的共表達 細胞AE1/CSAD株(n = 9)的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量優於向pHyg-AEl-42株 中導入pPur的共表達細胞AEl/pPur(n = 8) (P < 0. 05)。圖6為50ml搖瓶流加培養第10天的存活率標繪圖。嚮導入了 pHyg-AEl的抗體 高產生細胞的pHyg-AEl-42株中導入pPur_CSAD的共表達細胞AE1/CSAD株(η = 9)的存 活率優於向pHyg-AEl-42株中導入pPur的共表達細胞AEl/pPur (η = 8) (P < 0. 01)。培養 第7天的存活率也為P < 0. 01 (未顯示數據)。圖7為50ml搖瓶流加培養第8天的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量標繪圖。 嚮導入了 pHyg-AEl的抗體高產生細胞的pHyg-AEl-42株中導入pPur_ALTl的共表達細胞 AE1/ALT1株(η = 10)的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量為AE1/CSAD株(η = 9)以 上，優於向pHyg-AEl-42株中導入pPur的共表達細胞AEl/pPur (η = 8) (P < 0. 01)。圖8為表示作為AE1/ALT1共表達株的ΑΑ53在IL Jar流加培養中的抗體產生量 的曲線圖。培養第7天的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量為1. 9g/L。圖9表示新克隆的來源於CHO細胞的倉鼠CSAD基因的鹼基序列及胺基酸序列。圖10為表達倉鼠CSAD (493個胺基酸)的嘌呤黴素(Puromycin)篩選用質粒。圖11為表達人ALTl (496個胺基酸)的嘌呤黴素(Puromycin)篩選用質粒。圖12為表示來源於AEl高效表達宿主的抗IL-6R抗體產生細胞AE1-S08在IL Jar 流加培養中的抗體產生量的曲線圖。培養第14天的抗IL-6R抗體產生量為3.0g/L。
圖13表示新克隆的來源於CHO細胞的倉鼠牛磺酸轉運蛋白(Taurine transporter)基因的鹼基序列及胺基酸序列。圖14為由新克隆的來源於CHO細胞的倉鼠TauT的胺基酸序列、基於TMpred程序 預測的跨膜區域及方向並以 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 89，pp. 8230-8234，September 1992, Shinichi Uchida et. al.的圖5為參考而製作的牛磺酸轉運蛋白膜拓撲。◎為倉鼠 TauT特異性胺基酸殘基，在第2環(EX 細胞膜外區域)、第12個跨膜區域(TM)及C末端 (IC 細胞內區域)存在許多與倉鼠TauT不同的胺基酸。圖15為表達倉鼠TauT (622個胺基酸)的潮黴素(Hygromycin)篩選用質粒。實施方式下面，對本發明的實施方式進行更詳細的說明。本發明提供多肽的製備方法，其包括培養高效表達碳酸氫根轉運蛋白、且導入有 編碼期望多肽的DNA的細胞，使其產生期望多肽。在本發明的方法中，細胞可以為能夠產生期望多肽的天然細胞，也可以為導入有 編碼期望多肽的DNA的轉化細胞，優選為導入有編碼期望多肽的DNA的轉化細胞。在本發明的方法中，期望多肽沒有特別限定，可以為抗體(例如，抗IL-6受體抗 體、抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體、抗⑶3抗體、抗⑶20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF 抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗 體、抗IgE抗體、抗CDlla抗體、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等)或生理活性蛋白質(粒細胞 集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素、幹擾素、 IL-I或IL-6等白細胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、PTH等)等任意的多 肽，但特別優選為抗體。抗體可以為天然抗體1油、8衝1%爾力2等低分子化抗體、嵌合抗 體、人源化抗體等任意的抗體。通過使用高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞，可以使細胞的多肽的產生量增加。碳酸氫根轉運蛋白在排出碳酸氫根陰離子(HCO3-)或碳酸根陰離子(CO/—)的同 時，導入氯陰離子及硫酸根陰離子等，為具有交換轉運功能的膜蛋白。作為碳酸氫根轉運蛋 白，可以例示SLC4陰離子交換蛋白、SLC26陰離子交換蛋白等。SLC4陰離子交換蛋白為控制細胞內PH平衡及細胞容積的膜蛋白。目前，已知 有 10 種(SLC4A1 (AEl)、SLC4A2 (AE2)、SLC4A3 (AE3)、SLC4A4 (NBCel)、SLC4A5 (NBCe2)、 SLC4A7(NBCnl)、 SLC4A8(kNBC3)、 SLC4A9(NBCn2)、 SLC4A10(NBCn3)、 SLC4A11(NaBCl)) SLC4家族，且存在至少1種以上亞型。此外，分別為作為Na+非依賴性的電中性的Cl_和 HC03_ 的交換蛋白的 SLC4A1 (AEl)、SLC4A2 (AE2)、ALC4A3 (AE3)、ALC4A9 (NBCn2 或 AE4)、 生電性的ALC4A4 (NBCel)、ALC4A5 (NBCe2)、作為電中性的Na+和HCO3^的共轉運蛋白的 ALC4A7 (NBCnl)、作為Na+依賴性的電中性的Cr和HCOf的交換蛋白的ALC4A8 (kNBC3)、 ALC4A10(NBCn3)、作為生電性的Na+和硼酸根(Borate)的共轉運蛋白的ALC4A11 (NaBCl)等 具有不同的功能。它們具有局部特異性作用。例如為AEl的情況下，有助於具有極性的上皮 細胞的經上皮分泌及酸鹼的再吸收，促進鱒的紅細胞的滲透物轉運。作為SLC4陰離子交換 蛋白，可以例示 SLC4A1 (AEl)、SLC4A2 (AE2)、SLC4A3 (AE3)、SLC4A4 (NBCel)、SLC4A5 (NBCe2)、 SLC4A7 (NBCnl)、SLC4A8 (kNBC3)、SLC4A9 (NBCn2)、SLC4A10 (NBCn3)、SLC4A11 (NaBCl)等，優 選 ΑΕΙ。
SLC26陰離子交換蛋白為在幾乎所有的器官系統中作用的多功能膜蛋白，存在進行硫酸根陰離子、碘陰離子、甲酸根陰離子、草酸根陰離子、氯陰離子、氫氧根陰離子、碳酸 氫根離子等的交換轉運的交換蛋白及氯陰離子通道、或者陰離子依賴性分子發動機。已 知有被認為於各種陰離子的平衡有關的10種(SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、 SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A11)陰離子交換蛋白家族。例如，作為 氫氧根陰離子、碳酸氫根陰離子的轉運蛋白的SLC26A3、SLC26A4、SLC26A6、SLC26A9與SLC4 陰離子交換蛋白同樣地控制膜內外的PH。在腎臟中發現的交換蛋白為SLC26A1、SLC26A2、 SLC26A4、SLC26A6、SLC26A9、SLC26A11。SLC26A1為了轉運硫酸根陰離子和草酸根陰離 子，SLC26A6為了導入氯化鈉，交換轉運各種陰離子。SLC26A1為腎結石的病因，SLC26A4 和SLC26A6為高血壓症的病因，SLC26A5為聽覺喪失的病因。SLC26A7與SLC26A4同樣，與 酸鹼的平衡及血壓控制相關。作為SLC26陰離子交換蛋白，可以例示SLC26A1、SLC26A2、 SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A11 等。高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞只要是與天然細胞相比碳酸氫根轉運蛋白的 表達量增加的細胞就沒有特別限定。天然細胞沒有特別限定，例如可舉出CH0細胞等製備 重組蛋白質時作為宿主使用的細胞。在細胞中高效表達的碳酸氫根轉運蛋白可為來源於任意生物的碳酸氫根轉運蛋 白，沒有特別限定。具體而言，可以舉出來源於人、或小鼠、大鼠、倉鼠等嚙齒類；黑猩猩、 牛、馬、狗、狼等哺乳類；雞等鳥類；斑馬魚、鰻等魚類；果蠅等昆蟲類等生物的碳酸氫根轉 運蛋白，優選為來源於人、嚙齒類或者與宿主細胞同種的生物的碳酸氫根轉運蛋白，例如， 高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)時，優選為來源於人或 者倉鼠的碳酸氫根轉運蛋白。高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞可以為動物細胞、植物細胞、酵母等真核細胞； 大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞等任意的細胞，優選為CHO細胞、COS細胞等動物細胞，特別 優選CHO細胞。另外，為了製備期望多肽，優選為適合於導入期望基因的CHO dhfr-細胞等 細胞。作為高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞，例如可以舉出人為導入有碳酸氫根轉 運蛋白基因(例如，SLC4陰離子交換蛋白基因、SLC26陰離子交換蛋白基因等)的細胞。人 為導入有碳酸氫根轉運蛋白基因的細胞可以通過本領域技術人員公知的方法進行製備，例 如，可以通過將碳酸氫根轉運蛋白基因插入載體、並用該載體轉化細胞來進行製備。進而， 本說明書中，通過基因活化技術(例如參照國際公開第W094/12650號的單行本)使內源性 碳酸氫根轉運蛋白基因活化，其結果，高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞也被包括在人為 導入有碳酸氫根轉運蛋白基因的細胞中。作為導入細胞的SLC4陰離子交換蛋白基因，可以舉出編碼SLC4陰離子交換蛋白 的以下(a) (e)中的任一種DNA:(a)編碼具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列的多肽的DNA ；(b)編碼具有在SEQ ID NO 2的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或 多個(例如數個)胺基酸所得的胺基酸序列、且具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的 DNA ；(c)編碼與SEQ ID NO 2的胺基酸序列具有50%以上的同一性、且具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA ；(d)具有SEQ ID NO 1的鹼基序列的DNA ；(e)在嚴格的條件下和與具有SEQ ID NO=I的鹼基序列的DNA互補的DNA雜交、且編碼具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA。所謂SLC4陰離子交換蛋白活性，為涵蓋為了維持細胞內PH的穩定性及細胞容積 而導入培養基中的Cl-及S042—、並排出細胞內的HCO3-及硼酸根的活性的概念。SLC4陰離子交換蛋白活性可以如下測定。用作為pH敏感性染料的BCECF-AM處理功能性地表達SLC4的細胞，比較灌注包 含Cl—及Na+的培養基和不包含Cl—及Na+的培養基時的螢光強度，由此，可以測定細胞內 pH(pHi)的變化(Dahl NK. et. al.，J Biol Chem 2003 ；278 44949-44958 ；Fujinaga J. et. al.，J BiolChem 1999 ；274 :6626_6633)。在本發明中，作為編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA，使用編碼具有SEQ ID N0:2的 胺基酸序列的多肽的DNA即可。此外，還可以使用編碼具有在SEQ ID NO :2的胺基酸序列 中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個(例如數個)胺基酸所得的胺基酸序列、且具有 SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA。SEQ ID NO :2的胺基酸序列為人AEl的胺基酸序 列。對於AEl，除人以外，由於在小鼠GenBanK NM_011403、大鼠GeneBank NM_012651、黑猩 猩 GenBankXM_001151353、牛 GeneBank NM_181036、馬 GeneBankNM_001081788、狗 GenBank AB242566、狼 GeneBankNM_001048031、雞 GenBank NM_205522、斑馬魚 GenBanKNM_198338 等 中註冊有小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、馬、狗、狼、雞、斑馬魚等序列信息，因此，也可以利用它們。 對於其它的SLC4陰離子交換蛋白，序列信息也註冊在各種資料庫中，也可以利用它們。具有在SEQ ID NO 2的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個(例 如數個)胺基酸所得的胺基酸序列、且具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽為與人、小鼠、 大鼠、雞、黑猩猩、牛、馬、狗、狼、雞、斑馬魚SLC4陰離子交換蛋白(以下有時記為「人等的 SLC4陰離子交換蛋白」)功能相同的多肽。這樣的多肽中，例如包括人等的SLC4陰離子交 換蛋白的突變體等。在後述的實施例中，使用公開的人SLC4陰離子交換蛋白基因(AEl基 因)編碼的胺基酸911個中、4個胺基酸(L88R、E693G、V712A、H834Y)被取代的突變體。作為用於製備和某多肽功能相同的多肽的本領域技術人員公知的方法，已知向多 肽中導入突變的方法。例如，本領域技術人員通過使用定點誘變法(Hashimoto-Gotoh，!1. et al. (1995)Gene 152,271-275、Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)Methods Enzymo1. 100， 468-500>Kramer,W. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456,Kramer W,and Fritz HJ (1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel，TA (1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82,488-492,Kunkel (1988)MethodsEnzymol. 85，2763-2766)等，向人等的 SLC4 陰離子交 換蛋白的胺基酸導入適宜突變，可以製備與人等的SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多肽。 另外，胺基酸的突變在自然界也可以發生。作為與人等的SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多肽，具體而言，可以舉出人等 的SLC4陰離子交換蛋白的胺基酸序列(例如，SEQ IDNO 2的胺基酸序列)中的1或2個 以上、優選1個以上30個以下、更優選1個以上10個以下胺基酸缺失的多肽；人等的SLC4 陰離子交換蛋白的胺基酸序列中附加1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優選1個 以上10個以下胺基酸的多肽；人等的SLC4陰離子交換蛋白的胺基酸序列中的1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優選1個以上10個以下胺基酸被其它胺基酸取代的多肽等。突變的胺基酸殘基沒有特別限定，優選突變為保存有胺基酸側鏈的性質的其它氨 基酸。例如作為胺基酸側鏈的性質，可以舉出疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水 性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側鏈的胺基酸(G、A、V、L、I、P)、具有 含羥基側鏈的胺基酸(S、T、Y)、具有含硫原子側鏈的胺基酸(C、M)、具有含羧酸及醯胺側鏈 的胺基酸(D、N、E、Q)、具有含鹼性側鏈的胺基酸(R、K、H)、具有含芳香族側鏈的胺基酸(H、 F、Y、W)(括號內的字母均為胺基酸的單字母縮寫)。需要說明的是，已知具有通過在某胺基酸序列中缺失、附加及/或用其它氨 基酸取代1個或多個胺基酸進行修飾所得的胺基酸序列的多肽可以維持其生物學 活性(Mark, D. F. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81，5662-5666、Zoller， Μ. J. &Smith， Μ. Nucleic AcidsResearch(1982) 10，6487—6500、Wang, A. et al. ， Science 224,1431—1433、Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。作為在人等的SLC4陰離子交換蛋白中附加有1個或多個胺基酸殘基的多肽，例如 可以舉出含有人等的SLC4陰離子交換蛋白的融合多肽。融合多肽是人等的SLC4陰離子交 換蛋白與其它多肽融合所得的多肽。對於製備融合多肽的方法，將編碼人等的SLC4陰離子 交換蛋白的基因和編碼其它的多肽的基因以框架一致的方式連結並將其導入表達載體中， 使其被宿主表達即可，可以使用本領域技術人員公知的方法。作為用於與人等的SLC4陰離 子交換蛋白融合的其它多肽，沒有特別限定。作為用於與人等的SLC4陰離子交換蛋白融合的其它多肽，例如可以舉出 FLAG (Ηορρ, Τ. P. et al.，BioTechnology (1988) 6，1204-1210)、6 個 His (組氨酸)殘基構 成的6XHis、10XHis、流感凝集素(HA)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、pl8HIV的片段、 T7-標籤、HSV-標籤、E-標籤、SV40T抗原的片段、Ick標籤、α -微管蛋白的片段、B-標籤、 蛋白C的片段、GST (穀胱甘肽-S-轉移酶)、ΗΑ (流感凝集素)、免疫球蛋白恆定區域、β -半 乳糖苷酶、MBP (麥芽糖結合多肽)等。通過使編碼市售的這些多肽的基因和編碼人等的SLC4陰離子交換蛋白的基因融 合，並使由此製備的融合基因表達，可以製備融合多肽。另外，作為製備和某多肽功能相同的多肽的本領域技術人員公知的其它方法，可 以舉出利用雜交技術(Sambrook，J et al. ,MolecularCloning 2nd ed. ,9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)的方法。即，作為本領域技術人員，通常以編碼人等的 SLC4陰離子交換蛋白的DNA序列(例如SEQ ID NO=I的DNA序列)或其一部分作為基礎， 分離與其同一性高的DNA，並從該DNA中分離和人等的SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多 肽。作為用於分離編碼和人等的SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多肽的DNA的雜交 條件，本領域技術人員可以適當選擇。作為雜交的條件，例如可以舉出嚴格性低的條件。 所謂嚴格性低的條件，例如可以舉出42°C、2XSSC、0. 1% SDS，優選為50°C、2XSSC、0. 1 % SDS。另外，更優選舉出嚴格性高的條件。所謂嚴格性高的條件，例如可以舉出65°C、2XSSC、 0. 1% SDS。在這些條件下，不僅可以得到溫度越低同一性越高的DNA，還可以得到只具有低 的同一性的DNA。相反，可以期待只得到溫度越高同一性越高的DNA。其中，作為影響雜交的嚴格性的要素，除溫度之外，還要考慮鹽濃度等多個要素，本領域技術人員可以通過適當 選擇這些要素而實現同樣的嚴格性。通過上述雜交技術而分離的DNA編碼的多肽為與人等的SLC4陰離子交換蛋白的 胺基酸序列具有70%以上的同一性的多肽即可，通常與人等的SLC4陰離子交換蛋白的氨 基酸序列具有高同一性。所謂高同一性，通常是指97%以上的同一性，優選98%以上的同 一性，更優選99%以上的同一性。多肽的同一性的確定遵循文獻(Wilbur，W. J. and Lipman, D. J, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80，726-730)中記載的算法進行確定即可。
多肽根據後述的產生其的細胞、宿主或純化方法的不同，胺基酸序列、分子量、等 電點或糖鏈的有無和形態等可以不同。但是，只要所得的多肽具有和人等的SLC4陰離子交 換蛋白相同的功能，就可以在本發明中利用編碼該多肽的DNA。例如，使多肽在原核細胞例 如大腸桿菌中表達時，蛋氨酸殘基被附加在原來的多肽的胺基酸序列的N末端。另外，使其 在真核細胞例如哺乳動物細胞中表達時，N末端的信號序列被除去。編碼這樣的多肽的DNA 也可以用於本發明。在本發明中，作為編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA，可以使用具有SEQ ID NO=I 的鹼基序列的DNA。此外，還可以使用在嚴格的條件下和與具有SEQ ID NO :1的鹼基序列 的DNA互補的DNA雜交、且編碼具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA。SEQ ID NO 1的鹼基序列為人AEl的鹼基序列。對於AEl，除人以外，由於在小鼠GenBanK ΝΜ_011403, 大鼠 GeneBank NM_012651、黑猩猩 GenBank ΧΜ_001151353、牛 GeneBank NM_181036、馬 GeneBankNM_001081788、狗 GenBank AB242566、狼 GeneBankNM_001048031、雞 GenBank NM_205522、斑馬魚GenBanKNM_198338等中註冊有小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、馬、狗、狼、雞、斑 馬魚等序列信息，因此，也可以利用它們。對於其它的SLC4陰離子交換蛋白，序列信息也注 冊在各種資料庫中，也可以利用它們。編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA除被用於如上所述的期望多肽的體內和體外生 產外，還可以用於製備高效表達SLC4陰離子交換蛋白的細胞。編碼SLC4陰離子交換蛋白 的DNA為可以編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA即可，可以為任意的形態。S卩，其可以為由 mRNA合成的cDNA、基因組DNA、化學合成DNA等。另外，只要可以對編碼SLC4陰離子交換蛋 白的DNA進行編碼，就包括具有基於遺傳密碼的簡併的任意的鹼基序列的DNA。編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA可以通過本領域技術人員公知的方法進行製備。 例如，可以如下操作進行製備由表達SLC4陰離子交換蛋白的細胞製備cDNA文庫，將SLC4 陰離子交換蛋白的DNA序列(例如，SEQ ID NO 1)的一部分作為探針進行雜交，由此進行制 備。cDNA 文庫可以通過例如 Sambrook, J. et al.，Molecularcloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)記載的方法進行製備，也可以使用市售的基因文庫。另外，也可以 如下操作進行製備由表達SLC4陰離子交換蛋白的細胞製備RNA，基於SLC4陰離子交換蛋 白的DNA序列(例如，SEQ ID NO=D合成寡聚DNA，並將其用作引物，進行PCR反應，使編碼 SLC4陰離子交換蛋白的cDNA擴增，由此進行製備。另外，通過確定所得cDNA的鹼基序列，可以確定其編碼的翻譯區域，可以得到 SLC4陰離子交換蛋白的胺基酸序列。另外，通過將得到的cDNA作為探針，對基因組DNA文 庫進行篩選，可以分離基因組DNA。具體而言，如下操作進行即可。首先，從表達SLC4陰離子交換蛋白的細胞、組織等中分離mRNA。mRNA的分離可以通過公知的方法例如胍超速離心法(Chirgwin，J. Μ. et al.，Biochemistry(1979) 18，5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski,P. and Sacchi，N. ,Anal. Biochem. (1987) 162，156-159)等製備總RNA,使用 mRNA 純化試劑盒(Pharmacia)等從總 RNA中純化mRNA。另外，通過使用quickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia)，可以直接製備 mRNA。使用逆轉錄酶由所得mRNA合成cDNA。cDNA的合成也可以使用AMV逆轉錄酶第一 鏈cDNA合成試劑盒(生化學工業)等進行。另外，可以使用引物等，遵循使用5』 -Ampli FINDER RACE試劑盒(clontech制)及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction :PCR) 的 5' -RACE 法(Frohman, Μ. Α. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988)85,8998-9002 ； Belyavsky，A. et al.，Nucleic Acids Res. (1989) 17，2919-2932)，進行 cDNA 的合成和擴增。由所得PCR產物製備目的DNA片段，將其與載體DNA連結。進而，利用其製備重組 載體，導入大腸桿菌等並選擇集落，製備期望的重組載體。目的DNA的鹼基序列可以通過公 知的方法例如雙脫氧核苷酸鏈終止法進行確認。另外，對於編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA，考慮表達時使用的宿主的密碼 子使用頻率，可以設計表達效率更高的鹼基序列(Grantham，R. et al. Nucelic Acids Research (1981) 9，r43_74)。另外，編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA可以通過市售的試劑盒 和公知的方法進行改變。作為改變，例如可以舉出利用限制性內切酶進行的消化、合成寡 核苷酸或適當的DNA片段的插入、接頭的附加、起始密碼子(ATG)及/或終止密碼子(TAA、 TGA或TAG)的插入等。編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA還包括為在嚴格的條件下和與具有SEQ ID NO 1的鹼基序列的DNA互補的DNA雜交的DNA、且編碼和SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多 肽的DNA。作為嚴格的條件，本領域技術人員可以適當選擇，例如可以舉出嚴格性低的條件。 所謂嚴格性低的條件，例如可以舉出42°C、2XSSC、0. 1% SDS，優選為50°C、2XSSC、0. 1% SDS。另外，更優選舉出嚴格性高的條件。所謂嚴格性高的條件，例如可以舉出65°C、2XSSC 及0.1% SDS。在這些條件下，可以得到溫度越高同一性越高的DNA。所述雜交的DNA可以 優選為天然DNA，例如cDNA或染色體DNA。通過上述雜交技術而分離的DNA通常與編碼人等的SLC4陰離子交換蛋白的DNA 的鹼基序列具有高同一性。編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA也包括編碼和人等的SLC4陰 離子交換蛋白功能相同的多肽、且和編碼人等的SLC4陰離子交換蛋白的DNA具有高同一性 的DNA。所謂高同一性，通常是指96%以上的同一性，優選98%以上的同一性，更優選99% 以上的同一性。鹼基序列的同一性可以通過Karlin和Altschul發明的算法BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873_5877，1993)確定。基於該算法，開發出了被稱為 BLASTN 和 BLASTX 的程序(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990)。基於 BLAST 並通過 BLASTN解析鹼基序列時，參數設定為例如score = 100、wordlength = 12。這些解析方法 的具體方法是公知的(http://www. ncbi. nlm. nih. gov.)。作為導入細胞的碳酸氫根轉運蛋白基因，也可以為SLC26陰離子交換蛋白基 因。在 GenBank AF331525(人推定的 SLC26A9)、GenBankNM_052934 (人 SLC26A9 變體 1)、GenBank_NM 134325 (人 SLC26A9 變體 2)、GenBank NM_134420(小鼠 SLC26A6)、GenBankNM_l77243 (小鼠 SLC26A9)、GenBank AY240025 (果蠅 Slc26d9702)、GenBank AY240023(果蠅 Slc26d6928)、GenBank AY240022(果蠅 Slc26d6125)、GenBank AY240021 (果蠅 Slc26d5002)、GenBankAB084425 (鰻 Slc26A6)等中註冊有 SLC26 陰離子交 換蛋白基因的鹼基序列及其編碼的胺基酸序列信息，因此，可以利用它們。將編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA插入載體中即可。作為載體，例如以大腸桿菌作為宿主時，為了使載體在大腸桿菌(例如，JM109、 DH5ci、HBlOU XLlBlue)等中大量擴增從而大量製備，優選具有用於在大腸桿菌中擴增的 「ori」、以及具有經轉化的大腸桿菌的篩選基因(例如，可以通過一些藥劑(氨苄西林或四 環素、卡那黴素、氯黴素)識別的藥劑抗性基因)。作為載體的例子，可以舉出M13類載 體、pUC類載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA的亞克隆、剪裁為目 的時，除上述載體外，還可以舉出例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。為了生產期望多肽而使 用載體時，表達載體尤其有用。作為表達載體，例如以在大腸桿菌中的表達為目的時，除 具有載體在大腸桿菌中擴增的上述特徵外，還優選在將宿主設定為JM109、DH5ci、HBlOU XLl-Blue等大腸桿菌時，具有可以在大腸桿菌中高效表達的啟動子，例如IacZ啟動子 (Ward 等，Nature (1989) 341，544-546 ；FASEB J. (1992) 6，2422-2427)、araB 啟動子(Better 等，Science (1988) 240，1041-1043)、或T7啟動子等。作為這樣的啟動子，除上述載體外，還 可以舉出pGEX-5X_l (Pharmacia 公司制)、「QIAexpress 系統」 (Qiagen 公司制)、pEGFP 或 pET(此時，宿主優選表達T7RNA聚合酶的BL21)等。另外，載體中也可以含有用於多肽分泌的信號序列。作為用於多肽分泌的信號 序列，使在大腸桿菌的周質產生時，使用PelB信號系列(Lei，S.P.et al J. Bacteriol. (1987) 169,4379)即可。宿主細胞中載體的導入可以使用例如氯化鈣法、電穿孔法進行。除以大腸桿菌作為宿主的情況外，例如，作為用於製備期望多肽的載體，可以舉 出來源於哺乳動物的表達載體(例如，pcDNA3 (Invitrogen公司制)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990,18(17), p5322)、pEF、pCDM8)、來源於昆蟲細胞的表達載體(例如，「Bac 至BAC杆狀病毒表達系統」(GIBCO BRL公司制)、pBacPAK8)、來源於植物的表達載體(例 如，pMHl、pMH2)、來源於動物病毒的表達載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、來源於逆轉 錄病毒的表達載體(例如，pZIpneo)、來源於酵母的表達載體(例如，「畢赤酵母表達試劑 盒」 (Invitrogen公司制)、pNVll、SP-QO1)、來源於枯草桿菌的表達載體(例如，pPL608、 pKTH50)等。以在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中的表達為目的時，為了使其在 細胞內表達，優選具有必要的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature (1979) 277, 108)、MMLV-LTR 啟動子、EFl α 啟動子(Mizushima 等，Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)、CMV啟動子等，更優選具有用於篩選向細胞轉化的基因(例如，通過藥劑(新黴素、 G418等)可以識別的藥劑抗性基因)。作為具有這些特性的載體，例如可以舉出pMAM、 pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、p0P13 等。進而，以使基因穩定地表達、且使細胞內的基因的拷貝數擴增為目的時，可以舉 出在缺損核酸合成路線的CHO細胞中導入具有彌補所述缺損的DHFR基因的載體(例如， pCHOI等)，並通過甲氨蝶呤(MTX)使其擴增的方法，另外，以基因的暫時表達為目的時，可以舉出使用在染色體上具有表達SV40T抗原的基因的COS細胞通過具有SV40的複製起點 的載體(pcD等)進行轉化的方法。作為複製起點，還可以使用來源於多瘤病毒、腺病毒、牛 乳頭瘤病毒(BPV)等的複製起點。進而，為了在宿主細胞類中擴增基因拷貝數，表達載體可 以包含氨基葡萄糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為篩選標記。
作為導入有編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA(可以插入載體中)的宿主細胞沒有特 別限定，例如，可以使用大腸桿菌或各種動物細胞等。若在導入有編碼碳酸氫根轉運蛋白 的DNA的宿主細胞中導入編碼期望多肽的DNA，則該宿主細胞可以高效表達碳酸氫根轉運 蛋白，且可以增加期望多肽的生產。在導入有編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA的宿主細胞中， 還可導入有編碼CSAD或ALT的DNA (可以插入載體中)。通過在導入有編碼碳酸氫根轉運 蛋白的DNA的宿主細胞中導入編碼期望多肽的DNA和編碼CSAD或ALT的DNA，可以使期望 多肽的產生量增加。用於多肽製備的產生系統有體外 及體內產生系統。作為體外的產生系 統，可以舉出使用真核細胞的產生系統和使用原核細胞的產生系統。
在使用人為導入有碳酸氫根轉運蛋白基因的細胞來製備期望多肽時，碳酸氫根轉 運蛋白基因和編碼期望多肽的基因的導入順序沒有特別限定，可以在導入碳酸氫根轉運蛋 白基因後導入編碼期望多肽的基因，也可以在導入編碼期望多肽的基因後導入碳酸氫根轉 運蛋白基因。另外，也可以同時導入碳酸氫根轉運蛋白基因和編碼期望多肽的基因。碳酸氫根轉運蛋白基因和編碼期望多肽的基因的導入可以通過單一的載體同時 導入，也可以使用多個載體分別導入。為了製備期望多肽，高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞優選還高效表達半胱亞磺 酸脫羧酶(CSAD)或丙氨酸氨基轉移酶(ALT)。通過在除高效表達碳酸氫根轉運蛋白以外還 高效表達CSAD或ALT的細胞中導入編碼期望多肽的基因，並在培養基中培養該細胞，可以 更大量地製備期望多肽。CSAD原本作為將3-亞磺酸丙氨酸變換為亞牛磺酸的酶而為人所知，通過使其在 CHO細胞內高效表達，合成過量的β-丙氨酸。高效表達CSAD的細胞為CSAD的表達量比天然細胞增加的細胞即可，沒有特別限 定。天然細胞沒有特別限定，例如可以舉出CH0細胞等在製備重組蛋白質時用作宿主的細 胞。作為在細胞中高效表達的CSAD，可為來源於任意生物的CSAD，沒有特別限定。具 體而言，可以舉出來源於人、小鼠、大鼠、倉鼠嚙齒類；河豚類的虎河豚、海鞘類的玻璃海 鞘等生物的CSAD，優選為來源於人、嚙齒類或者與宿主細胞同種生物的CSAD，例如，高效表 達CSAD的細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)時，優選為來源於人或者倉鼠的CSAD。作為高效表達CSAD的細胞，可以舉出例如人為導入有CSAD基因的細胞。人為 導入有CSAD基因的細胞可以通過本領域技術人員公知的方法進行製備，例如，可以通過將 CSAD基因插入載體、用該載體轉化細胞來進行製備。進而，在本說明書中，通過基因活化技 術(例如參照國際公開第W094/12650號的單行本)使內源性CSAD基因活化，其結果，CSAD 基因高效表達的細胞也被包括在人為導入有CSAD基因的細胞中。作為導入細胞的CSAD基因，可以舉出編碼CSAD的以下(al) (el)中的任一個 DNA。
(al)編碼具有 SEQ ID NO :4 的胺基酸序列或UniProtKnowledgebase (Swiss-Prot 和TrEMBL)大鼠 CSAD(Q64611)、小鼠 CSAD_(Q9DBE0)或者人 CSAD_(Q9Y600)的胺基酸序列 的多肽的DNA ；(bl)編碼具有在SEQ ID NO :4的胺基酸序列或 UniProtKnowledgebase(Swiss-Prot 和 TrEMBL)大鼠 CSAD(Q64611)、小鼠 CSAD_(Q9DBE0) 或者人CSAD_(Q9Y600)的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個(例如數 個)胺基酸所得的胺基酸序列、且具有CSAD活性的多肽的DNA ；(cl)編碼與 SEQ ID NO :4 的胺基酸序列或UniProtKnowledgebase (Swiss-Prot 和 TrEMBL)大鼠 CSAD(Q64611)、小鼠 CSAD_(Q9DBE0)或者人 CSAD_(Q9Y600)的胺基酸序列具 有70%以上的同一性、且具有CSAD活性的多肽的DNA ；(dl)具有 SEQ ID NO 3 的鹼基序列或 GenBank 大鼠 CSADNM_021750、小鼠 CSAD NM_144942或者人CSAD ΝΜ_015989的鹼基序列的DNA ；(el)在嚴格的條件下和與具有SEQ ID NO 3的鹼基序列或GenBank大鼠CSAD NM_021750、小鼠CSAD NM_144942或者人CSAD ΝΜ_015989的鹼基序列的DNA互補的DNA雜 交、且編碼具有CSAD活性的多肽的DNA。所謂CSAD活性，為涵蓋催化3-亞磺酸-L-丙氨酸=亞牛磺酸+CO2、使其脫碳酸的 活性的概念。也為使L-磺基丙氨酸脫碳酸的活性(EC-號4. 1. 1. 29)。CSAD活性可以如下測定。如Davis K. et. al.，J Biomed Sci 2001 ；8 :359_364 所示，定量利用 CSAD 的脫碳 酸酶活性由L-[I-14C]磺基丙氨酸生成的14CO2。在本發明中，作為編碼CSAD的DNA，使用編碼具有SEQ ID NO :4的胺基酸序列或 UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot 和 TrEMBL)大鼠 CSAD(Q64611)、小鼠 CSAD (Q9DBE0) 或者人CSAD(Q9Y600)的胺基酸序列的多肽的DNA即可。此外，也可以使用編碼具有在 SEQ ID NO :4 的胺基酸序列或 UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot 和 TrEMBL)大鼠 CSAD(Q64611)、小鼠CSAD_(Q9DBE0)或者人CSAD_(Q9Y600)的胺基酸序列中取代、缺失、附 加或/及插入1個或多個胺基酸所得的胺基酸序列、且具有CSAD活性的多肽的DNA。具有在SEQ ID NO :4 的胺基酸序列或 UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot 和 TrEMBL)大鼠 CSAD(Q64611)、小鼠 CSAD_(Q9DBE0)或者人 CSAD_(Q9Y600)的胺基酸序列中 取代、缺失、附加或/及插入1個或多個胺基酸所得的胺基酸序列、且具有CSAD活性的多肽 為與倉鼠、大鼠、小鼠、人(以下有時記為「倉鼠等的CSAD」)功能相同的多肽。這樣的多肽 中，例如包括倉鼠等的CSAD的突變體等。作為用於製備與某多肽功能相同的多肽的本領域技術人員熟知的方法，已知向多 肽導入突變的方法。例如，本領域技術人員通過使用定點誘變法(Hashimoto-Gotoh，Τ. et al. (1995)Gene 152,271-275、Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)Methods Enzymol. 100， 468-500>Kramer,W. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12，9441_9456、Kramer W,and Fritz HJ (1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acad Sci U S A. 82,488-492,Kunkel (1988)MethodsEnzymol. 85,2763-2766)等，適當向倉鼠等的 CSAD 的 胺基酸導入適宜突變，可以製備與倉鼠等的CSAD功能相同的多肽。另外，胺基酸的突變在 自然界中也可以發生。
作為與倉鼠等的CSAD功能相同的多肽，具體而言，可以舉出倉鼠等的CSAD的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO :4的胺基酸序列或UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot和 TrEMBL)大鼠 CSAD (Q64611)、小鼠 CSAD_(Q9DBE0)或者人CSAD_(Q9Y600)的胺基酸序列)中 的1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優選1個以上10個以下胺基酸缺失的多肽； 倉鼠等的CSAD的胺基酸序列中附加有1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優選1個 以上10個以下的胺基酸的多肽；倉鼠等的CSAD的胺基酸序列中的1或2個以上、優選1個 以上30個以下、更優選1個以上10個以下胺基酸被其它胺基酸取代的多肽等。突變的胺基酸殘基沒有特別限定，優選突變為保存有胺基酸側鏈的性質的其它氨 基酸。例如作為胺基酸側鏈的性質，可以舉出疏水性胺基酸仏、1丄^4、？、1、￥、力、親水 性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側鏈的胺基酸(G、A、V、L、I、P)、具有 含羥基側鏈的胺基酸(S、T、Y)、具有含硫原子側鏈的胺基酸(C、M)、具有含羧酸及醯胺側鏈 的胺基酸(D、N、E、Q)、具有含鹼性側鏈的胺基酸(R、K、H)、具有含芳香族側鏈的胺基酸(H、 F、Y、W)(括號內的字母均為胺基酸的單字母縮寫)。需要說明的是，已知具有通過在某胺基酸序列中缺失、附加及/或用其它氨 基酸取代1個或多個胺基酸進行修飾所得的胺基酸序列的多肽可以維持其生物學 活性(Mark, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81, 5662-5666, Zoller, Μ. J. &smith， Μ. Nucleic AcidsResearch (1982) 10，6487-6500> Wang, A. et al. ， Science 224,1431—1433、Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。作為在倉鼠等的CSAD中附加有1個或多個胺基酸殘基的多肽，例如可以舉出含 有倉鼠等的CSAD的融合多肽。融合多肽是倉鼠等的CSAD和其它多肽融合所得的多肽。對 於製備融合多肽的方法，將編碼倉鼠等的CSAD的基因和編碼其它的多肽的基因以框架一 致的方式連結並將其導入表達載體中，使其被宿主表達即可，可以使用本領域技術人員公 知的方法。作為用於與倉鼠等的CSAD融合的其它多肽，沒有特別限定。作為用於與倉鼠等的CSAD融合的其它多肽，例如可以舉出FLAG(Hopp，Τ. P. et al.，BioTechnology (1988) 6，1204-1210)、6 個 His (組氨酸)殘基構成的 6XHis、10XHis、 流感凝集素(HA)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、plSHIV的片段、T7-標籤、HSV-標籤、 E-標籤、SV40T抗原的片段、Ick標籤、α-微管蛋白的片段、B-標籤、蛋白C的片段、GST(谷 胱甘肽-S-轉移酶)、HA(流感凝集素)、免疫球蛋白恆定區域、β -半乳糖苷酶、MBP (麥芽 糖結合多肽)等。通過使編碼市售的這些多肽的基因和編碼倉鼠等的CSAD的基因融合，並使由此 製備的融合基因表達，可以製備融合多肽。另外，作為製備和某多肽功能相同的多肽的本領域技術人員公知的其它方法，可 以舉出利用雜交技術(Sambrook，J et al. ,MolecularCloning 2nd ed. ,9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)的方法。即，作為本領域技術人員，通常以編碼倉鼠等的 CSAD 的 DNA序列(例如 SEQ ID NO 3 的 DNA 序列或GenBank 大鼠 CSADNM_021750、小鼠 CSAD NM_144942或者人CSAD ΝΜ_015989的DNA酸序列)或其一部分作為基礎，分離與其同一性 高的DNA，並從該DNA中分離和倉鼠等的CSAD功能相同的多肽。作為用於分離編碼和倉鼠等的CSAD功能相同的多肽的DNA的雜交條件，本領域技術人員可以適當選擇。作為雜交的條件，例如可以舉出嚴格性低的條件。所謂嚴格性低 的條件，例如可以舉出42°C、2XSSC、0. 1% SDS，優選為50°C、2 X SSC、0. 1% SDS0另外，更 優選舉出嚴格性高的條件。所謂嚴格性高的條件，例如可以舉出65°C、2XSSC、0. 1% SDS。 在這些條件下，不僅可以得到溫度越低同一性越高的DNA，還可以得到只具有低的同一性的 DNA0相反，可以期待只得到溫度越高同一性越高的DNA。其中，作為影響雜交的嚴格性的要 素，除溫度之外，還要考慮鹽濃度等多個要素，本領域技術人員可以通過適當選擇這些要素 而實現同樣的嚴格性。通過上述雜交技術而分離的DNA編碼的多肽為與倉鼠等的CSAD的胺基酸序列具 有70%以上的同一性的多肽即可，通常與倉鼠等的CSAD的胺基酸序列具有高同一性。所謂 高同一性，通常是指97%以上的同一性，優選98%以上的同一性，更優選99%以上的同一 性。多肽的同一性的確定遵循文獻(Wilbur, W. J. and Lipman, D. J, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80，726-730)中記載的算法進行確定即可。多肽根據後述的產生其的細胞、宿主或純化方法的不同，胺基酸序列、分子量、等 電點或糖鏈的有無和形態等可以不同。但是，所得的多肽只要具有和倉鼠等的CSAD相同的 功能，就可以在本發明中利用編碼該多肽的DNA。例如，使多肽在原核細胞例如大腸桿菌中 表達時，蛋氨酸殘基被附加在原來的多肽的胺基酸序列的N末端。另外，使其在真核細胞例 如哺乳動物細胞中表達時，N末端的信號序列被除去。編碼這樣的多肽的DNA也可以用於 本發明。在本發明中，作為編碼CSAD的DNA，可以使用具有SEQ ID NO :3的鹼基序列或 GenBank 大鼠 CSAD NM_021750、小鼠 CSAD NM_144942 或者人 CSAD ΝΜ_015989 的鹼基序列 的DNA。此外，也可以使用在嚴格的條件下和與具有SEQ ID NO 3的鹼基序列或GenBank大 鼠 CSAD NM_021750、小鼠 CSAD NM_144942 或者人 CSAD ΝΜ_015989 的鹼基序列的 DNA 互補 的DNA雜交、且編碼具有CSAD活性的多肽的DNA。編碼CSAD的DNA除被用於如上所述的期望多肽的體內和體外生產外，還可以用於 製備高效表達CSAD的細胞。編碼CSAD的DNA為可以編碼CSAD的DNA即可，可以為任意的 形態。即，其可以為由mRNA合成的cDNA、基因組DNA、化學合成DNA等。另外，只要可以對 編碼CSAD的DNA進行編碼，就包括具有基於遺傳密碼的簡併的任意的鹼基序列的DNA。編碼CSAD的DNA可以通過本領域技術人員公知的方法進行製備。例如，可以 如下操作進行製備由表達CSAD的細胞製備cDNA文庫，將CSAD的DNA序列(例如，SEQ ID NO 3 的鹼基序列或 GenBank 大鼠 CSAD NM_021750、小鼠 CSAD NM_144942 或者人 CSAD NM_015989的鹼基序列)的一部分作為探針進行雜交，由此進行製備。cDNA文庫可以通過例 如Sambrook,J. et al.，Molecularcloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 記載的方法進行製備，也可以使用市售的基因文庫。另外，也可以如下操作進行製備由表 達CSAD的細胞製備RNA，基於CSAD的DNA序列(例如，SEQ ID NO 3的鹼基序列或GenBank 大鼠CSAD NM_021750、小鼠CSAD NM_144942或者人CSAD ΝΜ_015989的鹼基序列)合成寡 聚DNA，並將其用作引物，進行PCR反應，使編碼CSAD的cDNA擴增，由此進行製備。另外，通過確定所得cDNA的鹼基序列，可以確定其編碼的翻譯區域，可以得到 CSAD的胺基酸序列。另外，通過將得到的cDNA作為探針，對基因組DNA文庫進行篩選，可以 分離基因組DNA。
具體而言，如下操作進行即可。首先，從表達CSAD的細胞、組織等中分離 mRNA。mRNA的分離可以通過公知的方法例如胍超速離心法(Chirgwin，J. Μ. et al.， Biochemistry (1979) 18,5294-5299)> AGPC 法(Chomczynski, P.and Sacchi, N. ， Anal. Biochem. (1987) 162，156-159)等製備總 RNA，使用 mRNA 純化試劑盒(Pharmacia)等從總 RNA中純化mRNA。另外，通過使用QuickPr印mRNA純化試劑盒(Pharmacia)，可以直接製備 mRNA。使用逆轉錄酶由所得mRNA合成cDNA。cDNA的合成也可以使用AMV逆轉錄酶第一 鏈cDNA合成試劑盒(生化學工業)等進行。另外，可以使用引物等，遵循使用5』 -Ampli FINDER RACE試劑盒(clontech制)及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction :PCR) 的 5' -RACE 法(Frohman, Μ. Α. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988)85,8998-9002 ； Belyavsky，A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17，2919-2932)，進行 cDNA 的合成和擴增由所得PCR產物製備目的DNA片段，將其與載體DNA連結。進而，利用其製備重組 載體，導入大腸桿菌等並選擇集落，製備期望的重組載體。目的DNA的鹼基序列可以通過公 知的方法例如雙脫氧核苷酸鏈終止法進行確認。另外，對於編碼CSAD的DNA，考慮表達時使用的宿主的密碼子使用頻率，可以 設計表達效率更高的鹼基序列(Grantham，R. et al. Nucelic Acids Research(1981)9, r43-74)。另外，編碼CSAD的DNA可以通過市售的試劑盒和公知的方法進行改變。作為改變， 例如可以舉出利用限制性內切酶進行的消化、合成寡核苷酸和適當的DNA片段的插入、接 頭的附加、起始密碼子(ATG)及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)的插入等。編碼CSAD的DNA還包括為在嚴格的條件下和與具有SEQ IDNO 3的鹼基序列或 GenBank 大鼠 CSAD NM_021750、小鼠 CSAD NM_144942 或者人 CSAD ΝΜ_015989 的鹼基序列 的DNA互補的DNA雜交的DNA、且編碼與CSAD功能相同的多肽的DNA。作為嚴格的條件，本領域技術人員可以適當選擇，例如可以舉出嚴格性低的條件。 所謂嚴格性低的條件，例如可以舉出42°C、2XSSC、0. 1% SDS，優選為50°C、2 X SSC、0. 1 % SDS0另外，更優選舉出嚴格性高的條件。所謂嚴格性高的條件，例如可以舉出65°C、2XSSC 及0.1% SDS。在這些條件下，可以得到溫度越高同一性越高的DNA。所述雜交的DNA可以 優選為天然DNA，例如cDNA或染色體DNA。通過上述雜交技術而分離的DNA通常與編碼倉鼠等的CSAD的DNA的鹼基序列具 有高同一性。編碼ALT的DNA中還包括編碼和倉鼠等的CSAD功能相同的多肽、且和編碼 倉鼠等的CSAD的DNA具有高同一性的DNA。所謂高同一性，通常是指96%以上的同一性， 優選98%以上的同一性，更優選99%以上的同一性。鹼基序列的同一性可以通過Karlin 和 Altschul 發明的算法 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)確定。基 於該算法，開發出了被稱為 BLASTN 和 BLASTX 的程序(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 403-410，1990)。基於BLAST並通過BLASTN解析鹼基序列時，參數設定為例如score = 100、 wordlength = 12。這些解析方法的具體方法是公知的(http://www. ncbi. nlm. nih. gov.)。另外，ALT原本作為使丙氨酸的氨基轉變為2-酮戊二酸、生成穀氨酸的酶而為人 所知，但只要通過使其在CHO細胞等宿主細胞內高效表達，如果可以促進由丙氨酸生物合 成丙酮酸或穀氨酸的反應，則可以用於TCA循環中的代謝及糖異生的葡萄糖生成，改善細胞的培養，可以期待期望多肽的高產。高效表達ALT的細胞為ALT的表達量比天然細胞增加的細胞即可，沒有特別限定。天然細胞沒有特別限定，例如可以舉出CH0細胞等製備重組蛋白質時用作宿主的細胞。作為高效表達ALT的細胞，例如可以舉出人為導入有ALT基因的細胞。人為導入 有ALT基因的細胞可以通過本領域技術人員公知的方法進行製備，例如，可以通過將ALT基 因插入載體、通過用該載體轉化細胞來進行製備。進而，在本說明書中，通過基因活化技術 (例如參照國際公開第W094/12650號的單行本)使內源性ALT基因活化，其結果，ALT高效 表達的細胞也被包括在人為導入有ALT基因的細胞中。在細胞中高效表達的ALT為來源於任意的生物的ALT即可，沒有特別限定。具體 而言，公知的有人、小鼠、大鼠、狗、非洲爪蟾、果蠅、線蟲、日本米、原始紅藻、釀酒酵母、絲 狀菌-Ashbya gossypii、真菌-白色念珠菌(Candida albicans)、裂殖酵母、真菌-構巢麴黴菌(Aspergillus nidulans)、真菌－煙麴黴菌(Aspergillus fumigatus) 、清酒酒麴－米麴黴菌(Aspergillus oryzae)、真菌-新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、細胞性 粘菌-盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)、布魯斯錐蟲(Trypanosoma brucei)、細 胞內寄生性原蟲-碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、痢疾阿米巴-溶組織內阿米巴 (Entamoeba histolytica)或細胞內寄生性原蟲-克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi)等的 ALT,可以使用上述ALT，但優選為來源於人、嚙齒類或與宿主細胞為同種的生物的ALT，例 如，使ALT高效表達的細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)時，優選為來源於人或倉鼠的 ALT。人、小鼠、酵母等的ALT存在變體(ALT1和ALT2)。ALT2與ALTl的胺基酸有80%以上 的同一性。在後述的實施例中，使ALTl強制表達。作為導入細胞的ALT基因，可以舉出編碼ALT的以下(a2) (e2)中的任一種DNA。(a2)編碼具有下列的胺基酸序列的多肽的DNA KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(Homo sapiens)(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(Homo sapiens)(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(Mus musculus)(小鼠):76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(Mus musculus)(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(Canis familiar is)(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(Xenopus laevis)(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蠅)=Dme 1_ CG1640、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(Caenorhabditiselegans)(線蟲) C32F10. 8、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(Oryza sativa japonica)(日本米)4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(Oryza sativa japonica)(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻(Cyanidioschyzonmerolae) :CMM066C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :YLR089C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_AGR085W、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 白色念珠菌(Candida albicans) :Ca019_346、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe) :SPBC582. 08、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌(Aspergillus nidulans) :ΑΝ1923· 2、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 煙麴黴菌(Aspergillus fumigatus) :AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 米麴黴菌(Aspergillus oryzae) :A0090003000164、KEGG/ENZYME :2· 6· 1· 2/ 新型隱球菌(Cryptococcusneoformans) JEC21 CNGO1490、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌(Dictyosteliumdiscoideum) :DDB_0232139、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲(Trypanosoma brucei) :Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲(Leishmaniamajor) :LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴(Entamoebahistolytica) 233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴(Entamoebahistolytica) 24. t00016、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi) :506529· 420、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi) :506529· 430、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi) :510889· 120、或KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi) :510889· 140 ；(b2)編碼具有在下列的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個(例 如數個)胺基酸所得的胺基酸序列、且具有ALT活性的多肽的DNA KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii):AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、
KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140 ；(c2)編碼與下列的胺基酸序列具有70%以上的同一性、且具有ALT活性的多肽的 DNA KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲:Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、
KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、
KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140 ；(d2)具有下列的鹼基序列的DNA KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140 ；
(e2)在嚴格的條件下和與具有下列的鹼基序列的DNA互補的DNA雜交、且編碼具 有ALT活性的多肽的DNA
KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140。所謂ALT活性，為涵蓋催化胺基酸和α _酮酸之間的氨基轉移的酶活性的概念。ALT活性可以如下測定。使用自動分析用丙氨酸氨基轉移酶測定試劑(，> 7 U # 7 F S-ALT，B^m 20900ΑΜΖ00597000) R, RajamohanF. et. al. Protein Expression and Purification (2006) 48，81-89中所示的方法求出ALT活性值。
在本發明中，作為編碼ALT的基因，使用編碼具有下列的胺基酸序列的多肽的DNA 即可KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、
KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME :2·6.1.2/Ashbya gossypii(Eremotheciumgossypii) :AG0S_AGR085W、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140。此外，也可以使用編碼具有在上述胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個胺基酸所得的胺基酸序列、且具有ALT活性的多肽的DNA。具有在下列的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個胺基酸所得的 胺基酸序列、且具有ALT活性的多肽為與人、小鼠、大鼠、狗、非洲爪蟾、果蠅、線蟲、日本米、 原始紅藻、釀酒酵母、絲狀菌-Ashbya gossypii、真菌-白色念珠菌、裂殖酵母、真菌-構巢 麴黴菌、真菌_煙麴黴菌、清酒酒麴-米麴黴菌、真菌_新型隱球菌、細胞性粘菌_盤基網柄 菌、布魯斯錐蟲、細胞內寄生性原蟲-碩大利什曼原蟲、痢疾阿米巴-溶組織內阿米巴或細 胞內寄生性原蟲-克魯斯錐蟲ALT(以下有時記為「人等的ALT」)功能相同的多肽KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、
KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅)=Dmel CG1640、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140。這樣的多肽中，例如，包括人等的ALT的突變體等。在後述的實施例及參考例中， 使用公開的在人ALTl基因編碼的胺基酸496個中、4胺基酸(R53S、Q72R、F286S、M332K)被 取代的突變體。作為用於製備與某多肽功能相同的多肽的本領域技術人員公知的方法，已知向多 肽中導入突變的方法。例如，本領域技術人員通過使用定點誘變法(Hashimoto-Gotoh，!1. et al. (1995)Gene 152,271-275、Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)Methods Enzymo1. 100， 468-500>Kramer,W. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456>Kramer W,and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acad Sci U S A. 82,488-492,Kunkel (1988)MethodsEnzymol. 85,2763-2766)等，向人等的 ALT 的胺基酸導入適宜突變，可以製備與人等的ALT功能相同的多肽。另外，胺基酸的突變在自然界中也 可以發生。作為與人等的ALT功能相同的多肽，具體而言，可以舉出人等的ALT的胺基酸序列中的1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優選1 個以上10個以下胺基酸缺失的多肽；人等的ALT的胺基酸序列中附加有1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優 選1個以上10個以下胺基酸的多肽；人等的ALT的胺基酸序列中的1或2個以上、優選1個以上30個以下、更優選1 個以上10個以下胺基酸被其它胺基酸取代的多肽等，所述人等的ALT的胺基酸序列為例如下列的胺基酸序列KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌ΑΝ1923· 2、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 米麴黴菌Α0090003000164、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233· t00009、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24· t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、
KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889· 120、或KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889· 140。突變的胺基酸殘基沒有特別限定，優選突變為保存有胺基酸側鏈的性質的其它氨 基酸。例如作為胺基酸側鏈的性質，可以舉出疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水 性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側鏈的胺基酸(G、A、V、L、I、P)、具有 含羥基側鏈的胺基酸(S、T、Y)、具有含硫原子側鏈的胺基酸(C、M)、具有含羧酸及醯胺側鏈 的胺基酸(D、N、E、Q)、具有含鹼性側鏈的胺基酸(R、K、H)、具有含芳香族側鏈的胺基酸(H、 F、Y、W)(括號內的字母均為胺基酸的單字母縮寫)。需要說明的是，已知具有通過在某胺基酸序列中缺失、附加及/或用其它氨 基酸取代1個或多個胺基酸進行修飾所得的胺基酸序列的多肽可以維持其生物學 活性(Mark, D. F. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81，5662-5666、Zoller， Μ. J. &Smith， Μ. Nucleic AcidsResearch(1982) 10，6487—6500、Wang, A. et al., Science 224,1431 — 1433、Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。作為在人等的ALT中附加有1個或多個胺基酸殘基的多肽，例如可以舉出含有人 等的ALT的融合多肽。融合多肽是人等的ALT和其它多肽融合所得的多肽。對於製備融合 多肽的方法，將編碼人等的ALT的基因和編碼其它多肽的基因以框架一致的方式連結並將 其導入表達載體中，使其被宿主表達即可，可以使用本領域技術人員公知的方法。作為用於 與人等的ALT融合的其它多肽，沒有特別限定。作為用於與人等的ALT融合的其它多肽，例如可以舉出FLAG(Hopp，Τ. P. et al.， BioTechnology (1988)6,1204-1210)、6 個 His (組氨酸)殘基構成的 6 XHis、10 XHis、流感 凝集素(HA)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、plSHIV的片段、T7-標籤、HSV-標籤、E-標 籤、SV40T抗原的片段、Ick標籤、α -微管蛋白的片段、B-標籤、蛋白C的片段、GST (穀胱 甘肽-S-轉移酶)、HA(流感凝集素)、免疫球蛋白恆定區域、β -半乳糖苷酶、ΜΒΡ(麥芽糖 結合多肽)等。通過使編碼市售的這些多肽的基因和編碼人等的ALT的基因融合，並使由此製備 的融合基因表達，可以製備融合多肽。另外，作為製備與某多肽功能相同的多肽的本領域技術人員公知的其它方法，可以舉出利用雜交技術(Sambrook，J et al. ,MolecularCloning 2nd ed. ,9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press，1989)的方法。即，作為本領域技術人員，通常以編碼人等的ALT 的DNA序列或其一部分為基礎，分離與其同一性高的DNA，並從該DNA中分離與人等的ALT 功能相同的多肽， 所述編碼人等的ALT的DNA序列為例如下列的DNA序列KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、
KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌ΑΝ1923· 2、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 米麴黴菌Α0090003000164、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233· t00009、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24· t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889· 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889· 140。作為用於分離編碼和人等的ALT功能相同的多肽的DNA的雜交條件，本領域技術 人員可以適當選擇。作為雜交的條件，例如可以舉出嚴格性低的條件。所謂嚴格性低的條 件，例如可以舉出42°C、2X SSC、0. 1%SDS,優選為50°C、2X SSC、0. 1 % SDS。另外，更優選舉 出嚴格性高的條件。所謂嚴格性高的條件，例如可以舉出65°C、2XSSC、0. 1%SDS。在這些 條件下，不僅可以得到溫度越低同一性越高的DNA，還可以得到只具有低的同一性的DNA。 相反，可以期待只得到溫度越高同一性越高的DNA。其中，作為影響雜交的嚴格性的要素，除 溫度之外，還要考慮鹽濃度等多個要素，本領域技術人員可以通過適當選擇這些要素而實 現同樣的嚴格性。通過上述雜交技術而分離的DNA編碼的多肽為與人等的ALT的胺基酸序列具有70%以上的同一性的多肽即可，通常與人等的ALT的胺基酸序列具有高同一性。所謂 高同一性，通常是指97%以上的同一性，優選98%以上的同一性，更優選99%以上的同一 性。多肽的同一性的確定遵循文獻(Wilbur, W. J. and Lipman, D. J, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80，726-730)中記載的算法進行確定即可。多肽根據後述的產生其的細胞、宿主或純化方法的不同，胺基酸序列、分子量、等電點或糖鏈的有無和形態等可以不同。但是，所得的多肽只要具有和人等的ALT相同的功 能，就可以在本發明中利用編碼該多肽的DNA。例如，使多肽在原核細胞例如大腸桿菌中表 達時，蛋氨酸殘基被附加在原來的多肽的胺基酸序列的N末端。另外，使其在真核細胞例如 哺乳動物細胞中表達時，N末端的信號序列被除去。編碼這樣的多肽的DNA可以用於本發 明。在本發明中，作為編碼ALT的DNA，使用具有下列的鹼基序列的DNA KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME :2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌ΑΝ1923· 2、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 米麴黴菌Α0090003000164、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233· t00009、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24· t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889· 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889· 140。此外，也可以使用在嚴格的條件下和與具有上述鹼基序列的DNA互補的DNA雜交、 且編碼具有ALT活性的多肽的DNA。
編碼ALT的DNA除被用於如上所述的期望多肽的體內和體外生產外，還可以用於 製備高效表達ALT的細胞。編碼ALT的DNA為可以編碼ALT的DNA即可，可以為任意的形 態。即，其可以為由mRNA合成的cDNA、基因組DNA、化學合成DNA等。另外，只要可以對編 碼ALT的DNA進行編碼，就包括具有基於遺傳密碼的簡併的任意的鹼基序列的DNA。編碼ALT的DNA可以通過本領域技術人員公知的方法進行製備。例如，可以由表達ALT的細胞製備cDNA文庫，將ALT的DNA序列的一部分作為探 針進行雜交，由此進行製備，所述ALT的DNA序列為例如下列的DNA序列KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140。
cDNA 文庫可以通過例如 Sambrook，J. et al. ，Molecular cloning、Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)記載的方法進行製備，也可以使用市售的基因文庫。另夕卜，也可以由表達ALT的細胞製備RNA，基於ALT的DNA序列，合成寡聚DNA，並 將其用作引物，進行PCR反應，使編碼ALT的cDNA擴增，由此進行製備。所述ALT的DNA序列為例如下列的DNA序列KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140。另外，通過確定所得cDNA的鹼基序列，可以確定其編碼的翻譯區域，可以得到ALT 的胺基酸序列。另外，通過將得到的cDNA作為探針，對基因組DNA文庫進行篩選，可以分離 基因組DNA。
具體而言，如下操作進行即可。首先，從表達ALT的細胞、組織等中分離 mRNA。mRNA的分離可以通過公知的方法例如胍超速離心法(Chirgwin，J. Μ. et al.， Biochemistry(1979) 18,5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski, P. and Sacchi, N. ， Anal. Biochem. (1987) 162，156-159)等製備總 RNA，使用 mRNA 純化試劑盒(Pharmacia)等從總 RNA中純化mRNA。另外，通過使用quickPr印mRNA純化試劑盒(Pharmacia)，可以直接製備 mRNA。使用逆轉錄酶由所得mRNA合成cDNA。cDNA的合成也可以使用AMV逆轉錄酶第一 鏈cDNA合成試劑盒(生化學工業)等進行。另外，可以使用引物等，遵循使用5』 -Ampli FINDER RACE試劑盒(clontech制)及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction :PCR) 的 5' -RACE 法(Frohman, Μ. Α. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988)85,8998-9002 ； Belyavsky，A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17，2919-2932)，進行 cDNA 的合成和擴增
由所得PCR產物製備目的DNA片段，將其與載體DNA連結。進而，利用其製備重組 載體，導入大腸桿菌等並選擇集落，製備期望的重組載體。目的DNA的鹼基序列可以通過公 知的方法例如雙脫氧核苷酸鏈終止法進行確認。另外，對於編碼ALT的DNA，考慮表達時使用的宿主的密碼子使用頻率，可以設 計表達效率更高的鹼基序列(Grantham，R. et al. Nucelic Acids Research(1981)9， r43-74)。另外，編碼ALT的DNA可以通過市售的試劑盒和公知的方法進行改變。作為改變， 例如可以舉出利用限制性內切酶進行的消化、合成寡核苷酸和適當的DNA片段的插入、接 頭的附加、起始密碼子(ATG)及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)的插入等。編碼ALT的DNA還包括為在嚴格的條件下和與具有下列的鹼基序列的DNA互補的 DNA雜交的DNA、且編碼與ALT功能相同的多肽的DNA KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):2875、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 智人(人):84706、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)76282、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 小家鼠(小鼠)108682、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 褐家鼠(大鼠):81670、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 家犬(狗):609510、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 光滑爪蟾(非洲爪蟾):444533、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 黑腹果蠅(果蠅):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 漂亮新小杆線蟲(線蟲):C32F10. 8、KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米):4342210、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 日本水稻(日本米)4348524、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 原始紅藻CMM066C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YLR089C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 釀酒酵母YDR111C、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/Ashbya gossypii (Eremotheciumgossypii) :AG0S_ AGR085W、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 白色念珠菌Ca019_346、
KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 裂殖酵母SPBC582. 08、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 構巢麴黴菌AN1923. 2、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 煙麴黴菌AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 米麴黴菌A0090003000164、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 新型隱球菌 JEC21 =CNGO 1490,KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 盤基網柄菌DDB_0232139、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 布魯斯錐蟲Tb927. 1. 3950、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 碩大利什曼原蟲LmjF12. 0630、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴233. t00009、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 溶組織內阿米巴24. t00016、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 420、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲506529. 430、KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 120、或KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/ 克魯斯錐蟲510889. 140。作為嚴格的條件，本領域技術人員可以適當選擇，例如可以舉出嚴格性低的條件。 所謂嚴格性低的條件，例如可以舉出42°C、2XSSC、0. 1% SDS，優選為50°C、2 X SSC、0. 1 % SDS。另外，更優選舉出嚴格性高的條件。所謂嚴格性高的條件，例如可以舉出65°C、2XSSC、 0. 1% SDS0在這些條件下，可以得到溫度越高同一性越高的DNA。所述雜交的DNA可以優 選為天然DNA，例如cDNA或染色體DNA。通過上述雜交技術而分離的DNA通常與編碼人等的ALT的DNA的鹼基序列具有高 同一性。編碼ALT的DNA包括編碼和人等的ALT功能相同的多肽、且和編碼人等的ALT的 DNA具有高同一性的DNA。所謂高同一性，通常是指96%以上的同一性，優選98%以上的同 一性，更優選99 %以上的同一性。鹼基序列的同一性可以通過Karl in和Altschul發明的算 法BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873_5877，1993)確定。基於該算法，開發了被稱為 BLASTN 禾口 BLASTX 的程序(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 403-410,1990)。基於 BLAST 並通過BLASTN解析鹼基序列時，參數設定為例如score = 100、wordlength = 12。這些解 析方法的具體方法是公知的(http://www. ncbi. nlm. nih. gov.)。製備期望多肽時，可以通過在高效表達碳酸氫根轉運蛋白和CSAD或ALT的細胞中 導入編碼期望多肽的基因、並在培養基中培養該細胞來進行製備。使用人為導入有碳酸氫根轉運蛋白基因和CSAD或ALT基因的細胞製備期望多肽 時，碳酸氫根轉運蛋白基因和CSAD或ALT基因和編碼期望多肽的基因的導入順序沒有特別 限定，可以在導入碳酸氫根轉運蛋白基因和CSAD或ALT基因後導入編碼期望多肽的基因， 也可以在導入編碼期望多肽的基因後導入碳酸氫根轉運蛋白基因和CSAD或ALT基因。另 夕卜，也可以同時導入碳酸氫根轉運蛋白基因和CSAD或ALT基因、和編碼期望多肽的基因。碳酸氫根轉運蛋白基因、CSAD或ALT基因及編碼期望多肽的基因的導入可以通過 單一的載體同時進行，也可以使用多個載體分別進行。高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞(也可以高效表達CSAD或ALT)的培養中，可 以使用通常的細胞(優選動物細胞)培養中使用的培養基。這些培養基中通常含有氨基 酸、維生素類、脂質因子、能源、滲透壓調節劑、鐵源、PH緩衝劑。對於這些成分的含量，通常，胺基酸在0. 05 1500mg/L、維生素類在0. 001 10mg/L、脂質因子在O 200mg/L、能源 在1 20g/L、滲透壓調節劑在0. 1 10000mg/L、鐵源在0. 1 500mg/L、pH緩衝劑在1 10000mg/L、微量金屬元素在0. 00001 200mg/L、表面活性劑在0 5000mg/L、生長輔助因 子在0. 05 10000 μ g/L及核苷在0. 001 50mg/L的範圍是合適的，但並不限定這些範圍， 可以根據培養的細胞的種類、期望多肽的種類等適當決定。除上述成分以外，例如，還可以添加微量金屬元素、表面活性劑、增殖輔助因子、核苷等。具體而言，例如可以舉出包含以下成分的培養基· L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷 氨醯胺、L-穀氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-鳥 氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸 、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等， 優選L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-穀氨醯胺、L-穀氨酸、 甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨 酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等胺基酸類；· i_肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、煙醯胺、煙酸、對氨基苯甲酸、泛酸鈣、鹽酸吡哆 醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12、抗壞血酸等，優選生物素、葉酸、硫辛酸、煙 酸醯胺、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12、抗壞血酸等維生素類； 氯化膽鹼、酒石酸膽鹼、亞油酸、油酸、膽固醇等，優選氯化膽鹼等脂質因子； 葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，優選葡萄糖等能源； 氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等，優選氯化鈉等滲透壓調節劑；^EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等，優選氯化 鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵源類； 碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等，優選碳酸氫鈉等pH緩衝劑。除上述成分以外，例如，還可以添加 硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞矽酸鈉等，優選硫 酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素；· Tween80、普流尼克F68等表面活性劑；及 重組型胰島素、重組型IGF-I、重組型EGF、重組型FGF、重組型PDGF、重組型 TGF-α、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、視黃酸、鹽酸腐胺等，優選亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型 IGF-1、鹽酸腐胺等增殖輔助因子； 脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷、腺苷、胞苷、鳥苷、尿苷等核苷等。需要說明的是，在上述培養基的優選例中，還可以含有 鏈黴素、青黴素G鉀及慶大黴素等抗生素、及 酚紅等pH指示劑。培養基的pH根據所培養的細胞的不同而不同，通常在ρΗ6. 8 7. 6是合適的，多 數情況下為ΡΗ7. 0 7. 4是合適的。培養基還可以使用市售的動物細胞培養用培養基，例如D-MEM(Dulbecco』 s改 良的Eagle培養基)、D-MEM/F-121 1混合物(Dulbecco' s改良的Eagle培養基營養 混合物 F-12)、RPMI1640, CHO-S-SFM II (Invitrogen 公司)、CH0-SF (Sigma-Aldrich 公司)、EX-CELL 301 (JRH biosciences 公司)、CD_CH0 (Invitrogen 公司)、IS CHO-V (Irvine Scientific 公司)、PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich 公司)等培養基。另外，培養基還可以為無血清培養基。高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞(也可以高效表達CSAD或ALT)為CHO細胞時， CHO細胞的培養可以使用本領域技術人員公知的方法進行。例如，通常，可以在氣相的CO2 濃度0 40%、優選2 10%的氣氛下，在30 39°C、優選37°C左右下培養。使用高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞(也可以 高效表達CSAD或ALT)產生期望 多肽的適當的培養時間通常為1天 3個月、優選為1天 2個月、更優選為1天 1個月。另外，作為動物細胞培養用各種培養裝置，例如，可以使用發酵槽型槽培養裝置、 氣升型培養裝置、培養瓶型培養裝置、旋轉瓶(Spinner flask)型培養裝置、微載體型培養 裝置、流動層型培養裝置、中空纖維型培養裝置、滾瓶(Roller Bottle)型培養裝置、填充槽 型培養裝置等。培養也可以使用分批培養(batch culture)、流加培養(fed-batchculture)、連續 培養(continuous culture)等中的任一種方法，優選流加培養或連續培養，更優選流加培養。通過本發明的方法製備的多肽具有可用作藥物的生物學活性時，可以通過將該多 肽與藥學可接受的載體或添加劑混合而進行製劑化，從而製備藥品。作為藥學可接受的載體及添加劑的例子，可以舉出水、藥學可接受的有機溶劑、 膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水 溶性右旋糖酐、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、 瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、 甘露醇、山梨糖醇、乳糖、容許用作醫藥添加劑的表面活性劑等。實際的添加劑可以根據本發明治療劑的劑型從上述添加劑單獨或適當組合選擇， 當然並不限定於這些物質。例如，作為注射用製劑使用時，可以使用將純化的多肽溶解在溶 劑例如生理鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液等中，並在其中加入防吸附劑例如TweenSO、Tween20、 明膠、人血清白蛋白等所得的物質。或者，為了在使用前形成溶解再構成的劑型，可以為凍 結乾燥過的物質，作為用於凍結乾燥的賦形劑，可以使用例如甘露醇、葡萄糖等糖醇和糖 類。多肽的有效給藥量根據多肽的種類、作為治療和預防對象的患者的種類、患者的 年齡、疾病的嚴重程度等進行適當選擇。例如，多肽為抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖抗體時，抗磷 脂醯肌醇蛋白聚糖抗體的有效給藥量為一次每Ikg體重為0. OOlmg IOOOmg的範圍。或 者，可以選擇每個患者為0. 01 IOOOOOmg/人的給藥量。但並不限定於上述給藥量。多肽的給藥方法可以為經口、非經口給藥中的任一種，優選為非經口給藥，具體而 言，可以舉出注射(例如通過靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等的全身或 局部給藥)、經鼻給藥、經肺給藥、經皮給藥等。本發明還提供導入有編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA和編碼半胱亞磺酸脫羧酶或 丙氨酸氨基轉移酶的DNA的細胞(DNA均可以插入載體中)。使用真核細胞時，例如，可以使用動物細胞、植物細胞、真菌細胞作為宿主。作為 動物細胞，已知有哺乳類動物細胞，例如CHO (J.Exp. Med. (1995) 108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa、Ver0 ；兩棲類動物細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞(Valle，etal.， Nature (1981) 291，358-340))或昆蟲細胞，例如，Sf9、Sf21、Tn5。作為CHO細胞，可以特別 優選使用作為缺損 DHFR 基因的 CHO 細胞的 dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77， 4216-4220)和 CHO K_1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1968) 60，1275)。以在動物細胞中大量 表達為目的時，特別優選CHO細胞。DNA(可以插入載體中)向宿主細胞的導入可以通過例 如磷酸鈣法、DEAE右旋糖酐法、使用陽離子脂質體DOTAP (Boeringer Marmheim公司制)的 方法、電穿孔法、脂轉染等方法而進行。作為植物細胞，已知有例如來源於菸草(Nicotiana tabacum)的細胞作為 多肽生產系統，使其進行愈傷組織培養即可。作為真菌細胞，已知有酵母，例如酵母 (Saccharomyces)屬，例如酸酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；絲狀菌，例如曲霄 (Aspergillus)屬，例如黑麴黴(Aspergillus niger)。使用原核細胞時，有使用細菌細胞的產生系統。作為細菌細胞，可以舉出大腸桿菌 (E. coli)，例如JM109、DH5a、HBlOl等，此外，已知有枯草桿菌。通過利用以這些細胞為目的的基因進行轉化，並將轉化所得的細胞在體外進行培 養，可以得到目的基因編碼的多肽。培養可以通過公知的方法進行。例如，作為動物細胞的 培養液，可以使用例如01^11、1^11、1 ^11640、11 !。此時，可以並用胎牛血清(FCS)等血清 補液，也可以進行無血清培養。培養時的PH優選為約6 8。培養通常在約30 40°C下 進行約15 200小時，並根據需要進行培養基的交換、通氣、攪拌。另一方面，作為在體內產生多肽的系統，例如可以舉出使用動物的產生系統和使 用植物的產生系統。向這些動物或植物中導入目的基因，在動物或植物體內產生多肽、並回 收。本發明中的「宿主」包括這些動物和植物。使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲的產生系統。作為哺乳類動物，可以使用山 羊、豬、綿羊、小鼠、牛(Vicki Glaser, SPECTRUMBiotechnology Applications，1993)。另 夕卜，使用哺乳類動物時，可以使用轉基因動物。例如，可將目的基因以與編碼山羊β酪蛋白這樣的乳汁中固有產生的多肽的基 因的融合基因的形式進行製備。接著，將含有該融合基因的基因片段注入山羊的胚胎中，將 該胚胎移植到雌山羊中。從由接受胚胎的山羊生下的轉基因山羊或其子孫產生的乳汁中， 可以得到目的多肽。為了增加轉基因山羊產生的含有多肽的乳汁量，可以在轉基因山羊中 使用適量激素(Ebert, K. M. et al.，Bio/Technology (1994) 12，699-702)。另外，作為昆蟲，可以使用例如蠶。使用蠶時，通過使蠶感染插入有編碼目 的多肽的基因的杆狀病毒，可以從該蠶的體液中得到目的多肽(Susumu，M.et al., Nature(1985)315，592-594)。進而，使用植物時，可以使用例如菸草。使用菸草時，將編碼目的多肽的基因插入植物表達用載體例如PMON 530中，將該載體導入根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)這樣的細菌中。使菸草例如Nicotiana tabacum感染該細菌，從而可以由該 菸草的葉子得到期望多肽(Julian K. -C. Ma et，al.，Eur. J. Immunol. (1994)24,131-138) 由此得到的多肽可以從宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離，並純化為基本上 純且均勻的多肽。多肽的分離、純化使用通常的多肽的純化中使用的分離、純化方法進行即 可，沒有任何限制。例如，通過適當選擇並組合色譜法、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、重結晶等，可以分離、 純化多肽。作為色譜法，例如可以舉出親和色譜法、離子交換色譜法、疏水性色譜法、 凝膠過濾、反相色譜法、吸附色譜法等(Strategies forProtein Purification and Characterization ；A Laboratory CourseManual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1996) 這些色譜法可以使用液相色譜例如HPLC、FPLC 等液相色譜進行。本發明也包括使用這些純化方法進行高度純化所得的多肽。需要說明的是，通過在多肽純化前或純化後使適當的多肽修飾酶作用，可以任意 添加修飾而部分除去肽。作為多肽修飾酶，例如可以使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、賴氨醯內肽 酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。需要說明的是，在本發明中，所謂「導入有DNA的細胞」或「導入DNA的細胞」，為除 通過基因重組技術導入有外來性DNA的細胞外，還包括通過基因活化技術(例如參照國際 公開第W094/12650號的單行本)使內源性DNA活化、從而對應於該DNA的蛋白質的表達或 該DNA的轉錄開始或增加的細胞的概念。
實施例以下，通過實施例對本發明進行具體說明。需要說明的是，這些實施例為用於說明 本發明的示例，並不限定本發明的範圍。實施例1 人肝細胞陰離子交換蛋白(陰離子交換蛋白1,帶3)基因克降將市售的人肝QUICK-克隆cDNA(Clontech公司制)作為模板，通過PCR法得到來 源於人肝臟的陰離子交換蛋白(AEl)基因。測定克隆所得基因的鹼基序列，從與公開的人 AEl的同一性確認編碼AEl。所得AEl基因在2733個鹼基中，有8個位點(t263g、t357c、 a645t、a672c、c951t、a2078g、t2195c、c2500t)發生突變，編碼的胺基酸在911個中、有4個 胺基酸(L88R、E693G、V712A、H834Y)不同。但預測為具有13個跨膜區域的轉運蛋白(圖 1)，因此，作為來源於人肝臟的AEl用於細胞改變中。^MM 2 通丄寸導入人陰離子交換g白基因來 曾力D抗體產牛量在通過實施例1的PCR克隆得到的人AEl (以下稱為AEl)基因中加入Kozak序列， 構築CMV啟動子表達質粒pHyg-AEl (圖2)、pPur_AEl (圖3)。將不含有pHyg-AEl或AEl基 因的PHyg表達質粒(構築將Clontech公司的來源於pTK5的潮黴素抗性基因表達單元導 入pSV2-dhfr質粒(ATCC No. 37146)中的質粒後，除去dhfr表達單元所得的質粒。)通過 電穿孔法導入作為親本株的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生CHO細胞(參照國際公開 第WO 2006/006693號的單行本)，在潮黴素(200 μ g/ml)的存在下靜置培養，擴大高增殖的 細胞株後，由PHyg-AEl細胞株製備總RNA，通過TaqMan法篩選高效表達人AEl的5株。進 而通過振動培養，將和作為對照的PHyg導入細胞(4株)的增殖程度相同的4株作為人AEl 導入細胞，進行抗體產生量比較。在利用初始密度2 X IO5細胞/mL的50ml搖瓶的流加培 養中，搖瓶培養後期第12天的pHyg-AEl導入細胞(4株)的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗 體產生量優於pHyg導入細胞(4株)(t檢驗P < 0. 05，圖4)。接著，WpHyg-AEl導入細胞4株中抗體產生量最高的AEl表達株作為親本株，通過電穿孔法導入含有嘌呤黴素抗性基因的半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)表達質粒pPur-CSAD (圖10、後述的參考例2)、含有嘌呤黴素抗性基因的丙氨酸氨基轉移酶(ALTl)表達質粒pPur-ALTl (圖11、後述的參考例4)，對照質粒pPur (Clontech公司的pPUR(嘌呤黴 素抗性表達載體))。在嘌呤黴素(6yg/ml)的存在下靜置培養，擴大高增殖的細胞株後， 製備總RNA，篩選高效表達新導入的基因的AE1/CSAD共表達株(9株)、AE1/ALT1共表達株 (10株)、AEl/pPur共表達株(8株)，比較抗體產生量及存活率。在以初始密度2 X IO5細 胞/mL利用50ml搖瓶進行流加培養時，AE1/CSAD共表達株(9株)與對照AEl/pPur共表 達株(8株)相比，搖瓶培養後期第10天的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3抗體產生量(t檢驗P <0. 05，圖5)、存活率(t檢驗P <0.01，圖6)均優異。3種共表達株中，抗磷脂醯肌醇蛋白 聚糖_3抗體產生量最高的細胞株為AE1/ALT1共表達株(10株)，在搖瓶流加培養第8天， 優於對照AEl/pPur共表達株(8株)(t檢驗P < 0. 01，圖7)。且，AE1/ALT1共表達株(10 株)中，在搖瓶流加培養研究中，將抗體產生量最高且高效表達ALTlmRNA的AA53 (1497mg/ L/8天)以初始密度IOX IO5細胞/mL進行IL Jar流加培養時，在培養第7天為1. 9g/L/7 天，通過短期培養產生大量的抗體(圖8)。在培養第21天為5. 3g/L的TauT/ALTl表達株 TA41 (後述的參考例4)在培養第7天為1. 5g/L，因此認為，AA53在TA41以上具有可在短 期產生大量抗體的可能，適合用於實際生產。以上結果表明，通過人為地使陰離子交換蛋白(AEl)高效表達、或通過使AEl和 CSAD或ALTl同時高效表達，可以得到產生大量抗體的細胞。AEl高效表達效果還可以通過使用AEl高效表達宿主細胞的抗IL-6R抗體產生株 的構築來表示。通過電穿孔法在通常的宿主細胞DXBll中導入pHyg-AEl (圖2)，在潮黴素 (200μ g/ml)的存在下靜置培養，篩選高增殖的細胞株並擴大後，利用TaqMan法將高效表 達人AEl的細胞作為AE1/DXB11宿主細胞。在AE1/DXB11宿主細胞中導入抗IL-6R抗體表達 質粒、並進行單克隆的AE1-S08細胞產生大量抗IL-6R抗體，如圖12所示，初始密度7X IO5 細胞/mL的IL Jar流加培養第14天的產生量為3. Og/L。可以確認，產生大量抗體的細胞 AE1-S08及宿主細胞AE1/DXB11在繼代培養的穩定性試驗中均穩定、且維持AEl高表達。以上結果表明，AEl基因導入效果在抗體基因導入前後均積極作用。本發明可以應用於所有多肽(優選抗體)產生細胞。參考例1 來源於CHO細胞的倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)基因克隆從在CHO DXBll細胞中導入有抗IL_6受體抗體基因的抗IL_6受體抗體產生細胞 (日本特開平8-99902號公報)中提取總RNA後，依賴於多聚A合成cDNA。通過將以Sail、 XhoI,EcoRI三種限制性內切酶進行片段化的cDNA作為模板，利用PCR得到倉鼠CSAD基因。 對於PCR引物，設計已知的在大鼠與小鼠間保存有基因序列的含有5』，3』的引物進行使用。 測定克隆的基因的鹼基序列，從和已知生物種的CSAD的同一性確認編碼倉鼠CSAD(圖9)。 預測倉鼠CSAD與小鼠(96%同一性)、大鼠(96%同一性)、人(91%同一性)的已知的氨基 酸具有高同一性，為具有相同的活性的酶。倉鼠的CSAD的鹼基序列如SEQ ID N0:3所示。 倉鼠的CSAD的胺基酸序列如SEQ ID NO 4所示。參考例2 表達倉鼠CSAD的嘌呤黴素篩選用質粒的構築在參考例1的通過克隆得到的倉鼠CSAD (以下CSAD)基因中加入Kozak序列，構 築CMV啟動子表達質粒pPur/CSAD (圖10)。參考例3 人肝細胞丙氨酸氨基轉移酶(Alanineaminotransferase)基因克隆
以市售的人肝QUICK-克隆cDNA(Cl0ntech公司)為模板，利用PCR法得到來源 於人肝臟的丙氨酸氨基轉移酶(ALTl)基因。測定克隆的基因的鹼基序列，從與公開的人 ALTl的同一性確認編碼ALT1。得到的ALTl基因中，1488鹼基中有5個位點(C157a、a215g、 c765t、t857c、t995a)發生突變，編碼的胺基酸中，496個中有4個胺基酸(R53S、Q72R、 F286S、M332K)不同，作為來源於人肝臟的ALT1PCR克隆用於細胞改變。#剩列4 誦過導A λ賄賄雜_棚力口秘種量在參考例3的通過克隆得到的人ALTl (以下ALT1)基因中加入Kozak序列，構築 CMV啟動子表達質粒pPur-ALTl (圖11)。通過電穿孔法將不含有pPur_ALTl或者ALTl基 因的pPur表達質粒導入作為親本株的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生CHO細胞(參照 國際公開第WO 2006/006693號的單行本)，在嘌呤黴素(6 μ g/ml)存在下靜置培養，篩選高 增殖的細胞株(pPur-ALTl 7株，pPur :3株)。擴大後，由pPur-ALTl細胞株製備總RNA，通 過TaqMan法篩選高效表達人ALTl的6株，進而通過振動培養，將和作為對照的pPur導入細 胞(3株)的增殖程度相同的4株作為人ALTl導入細胞，進行抗體產生量比較。在利用初 始密度2 X IO5細胞/mL的50ml搖瓶的流加培養中，搖瓶培養後期第17天的pPur-ALTl導 入細胞(4株)的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量(1236士 149mg/L)優於pPur導入 細胞(3株)的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量(871 士 119mg/L) (t檢驗P<0.01)。 在搖瓶流加培養研究中，將抗體產生量分別最高的pPur-ALTl表達株A72及Pur表達株P41 以初始密度IOXlO5細胞/mL進行IL Jar流加培養時，A72的抗體產生量在培養第19天為 2.9g/L，為P41的抗體產生量(2.2g/L)以上，為高產生量。在培養第14天以後，未發現P41 的產生量增加，因此認為產生大量A72的抗體是由存活率維持效果獲得的(培養第14天存 活率，pPur-ALTl 表達 A72 為 60 %、pPur 表達株 P41 為 23 % )。接著，以pHyg-TauT導入細胞TlO (參照後述的參考例6)為親本株，共同導入 pPur-ALTl或者pPur，篩選高增殖且高度表達人ALTl的TauT/ALTl共表達細胞(6株)及 高增殖的TauT/pPur共表達細胞(8株)，以初始密度10 X IO5細胞/mL利用50ml搖瓶進行 流加培養。作為ALT表達細胞的TauT/ALTl共表達株的搖瓶培養第4天的抗磷脂醯肌醇蛋 白聚糖_3抗體產生量(745士87mg/L)優於TauT/pPur表達株的搖瓶培養第4天的抗磷脂 醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量(616士29mg/L) (t檢驗P < 0. 01)。將搖瓶流加培養研究中抗體產生量最高且ALTlmRNA最大表達的TauT/ALTl共表 達株TA41 (881mg/L/4天)以初始密度IOX IO5細胞/mL進行IL Jar流加培養時，其抗體 產生量在培養第7天為1. 3g/L，在培養第10天為3. Og/L,在培養第12天為3. 5g/L，在培養 第17天為4. 6g/L，在培養第21天為5. 3g/L，明顯高於TauT/pPur共表達株中產生量最高 的對照株TP08 (656mg/L/4天)(在培養第10天為2. 4g/L)。參考例5 來源於CHO細胞的倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因克隆從在CHO DXBll細胞中導入有抗IL-6受體抗體基因的抗IL-6受體抗體產生細胞(日本特開平8-99902號公報)中提取總RNA後，依賴於多聚A合成cDNA。通過將以Sail、 XhoI、EcoRI三種限制性內切酶進行片段化的cDNA作為模板，利用PCR得到倉鼠牛磺酸轉運 蛋白(TauT)基因。對於PCR引物，設計已知的在大鼠/小鼠TauT間保存有基因序列的含有 5』，3』的引物進行使用。測定克隆的基因的鹼基序列，從和已知生物種的TauT的同一性確 認編碼倉鼠TauT (圖13)。預測倉鼠TauT胺基酸序列對小鼠(96%同一性)、大鼠(96%同一性)、人(93%同一性)TauT具有高同一性，為具有12個跨膜區域的牛磺酸轉運蛋白(圖 14)。6 誦i寸導入儲輔騰運舶!_舌_棘、_藝一精射曾 加杭體產牛量
在參考例5的通過克隆得到的倉鼠TauT (以下稱為TauT)基因中加Kozak序列， 構築CMV啟動子表達質粒pHyg/TauT (圖15)。將不含有pHyg/TauT或TauT基因的對照質 粒PHyg通過電穿孔法導入作為親本株的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生CHO細胞(參 照國際公開第WO 2006/006693號的單行本)。在潮黴素(400 μ g/ml)的存在下篩選表達 質粒導入細胞後，擴大所有穩定地增殖的細胞株(pHyg/TauT :8株，pHyg:7株)。製備TauT mRNA後，通過TaqMan法，將可以確認優於親本株的表達的7株作為pHyg/TauT導入細胞。 導入細胞(7株)的mRNA平均表達量為對照(7株)的約40倍。總計14株的細胞以2 X IO5 細胞/mL的初始密度通過50ml搖瓶進行分批(batch)培養及流加(fed-batch)培養，比 較培養後期第7天的活細胞密度、乳酸產生量、抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量。在 分批培養中，隨著細胞增殖，在培養液中積蓄乳酸等生長抑制物質，增殖受到抑制，但PHyg/ TauT導入細胞的活細胞密度(9. 28士3. 27 X IO5細胞/ml)及乳酸產生量(1. 54士0. 20g/L) 優於PHyg導入細胞(活細胞密度5. 69士2. 09X IO5細胞/ml、乳酸產生量1. 75士0. 15g/ L) (t檢驗P < 0. 05)。對於抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量，pHyg/TauT導入細胞的 7株中4株(平均抗體產生量440. 6mg/L)為pHyg導入細胞的最高值以上(389. 6mg/L)。 進而，由於通過流加培養使PHyg/TauT導入細胞的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體產生量的 優勢(t檢驗P < 0. 01)變得更明顯，因此進行上述4株中增殖潛能最高的pHyg/TauT導入 細胞(TlO)和親本株的IL Jar流加培養時，即使在培養第32天，TlO也維持80%以上的 存活率，乳酸的產生受到抑制。其結果，抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖_3抗體的產生量在培養第 35天達到2. 9g/L。通過流式細胞儀分析確認TauT導入TlO細胞在細胞膜上表達TauT分 子。由以上結果可知，通過人為地使倉鼠TauT表達，抗體產生細胞的潛能增加，得到抗體高 產生株。本說明書中引用的全部刊物、專利及專利申請均通過引用整體併入本說明書中。工業實用性本發明可以用於多肽的生產。序列表說明SEQ ID NO 1表示編碼人AEl的基因的鹼基序列(GenBankM27819)。SEQ ID NO :2 表示人 AEl 的胺基酸序列(UniProtKB/Swiss_ProtP02730)。SEQ ID NO 3表示編碼倉鼠CSAD的基因的鹼基序列。SEQ ID NO 4表示倉鼠CSAD的胺基酸序列。SEQ ID NO 5表示編碼人ALTl的基因的鹼基序列(KEGG/ENZYME 2. 6. 1. 2/智人(人):2875)。SEQ ID NO 6 表示人 ALTl 的胺基酸序列(KEGG/ENZYME :2· 6. 1. 2/ 智人(人)2875)。SEQ ID NO :7表示編碼倉鼠牛磺酸轉運蛋白的基因的鹼基序列。SEQ ID NO :8表示倉鼠牛磺酸轉運蛋白的胺基酸序列。
權利要求
多肽製備方法，其包括培養高效表達碳酸氫根轉運蛋白、且導入有編碼期望多肽的DNA的細胞，使其產生期望多肽。
2.權利要求1的製備方法，其中所述高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞為導入有編碼 碳酸氫根轉運蛋白的DNA的細胞。
3.權利要求1或2的製備方法，其中所述高效表達碳酸氫根轉運蛋白的細胞還高效表 達半胱亞磺酸脫羧酶或丙氨酸氨基轉移酶。
4.權利要求1 3的製備方法，其中所述碳酸氫根轉運蛋白為SLC4陰離子交換蛋白或 SLC26陰離子交換蛋白。
5.權利要求1 3的製備方法，其中所述碳酸氫根轉運蛋白為SLC4陰離子交換蛋白。
6.權利要求5的製備方法，其中所述SLC4陰離子交換蛋白為AE1。
7.權利要求1 6中任一項的製備方法，其中所述細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
8.權利要求1 7中任一項的製備方法，其中所述期望多肽為抗體。
9.權利要求4 6中任一項的製備方法，其中所述編碼SLC4陰離子交換蛋白的DNA為 以下(a) (e)中的任一種(a)編碼具有SEQID NO 2的胺基酸序列的多肽的DNA ；(b)編碼具有在SEQID NO :2的胺基酸序列中取代、缺失、附加或/及插入1個或多個 胺基酸所得的胺基酸序列、且具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA ；(c)編碼與SEQID NO :2的胺基酸序列具有50%以上的同一性、且具有SLC4陰離子交 換蛋白活性的多肽的DNA ；(d)具有SEQID NO 1的鹼基序列的DNA ；(e)在嚴格的條件下和與具有SEQID NO 1的鹼基序列的DNA互補的DNA雜交、且編 碼具有SLC4陰離子交換蛋白活性的多肽的DNA。
10.藥品製備方法，其中所述藥品含有根據權利要求1 9中任一項的方法製備的多肽。
11.細胞，其導入有 編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA、和 編碼期望多肽的DNA。
12.權利要求11的細胞，其還導入有編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙氨酸氨基轉移酶的DNA。
13.細胞，其導入有 編碼碳酸氫根轉運蛋白的DNA、和 編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙氨酸氨基轉移酶的DNA。
全文摘要
本發明提供一種可以有效地生產蛋白質的方法。多肽製備方法，其包括培養高效表達碳酸氫根轉運蛋白、且導入有編碼期望多肽的DNA的細胞，使其產生期望多肽。
文檔編號C12P21/08GK101821403SQ20088011101
公開日2010年9月1日 申請日期2008年10月23日 優先權日2007年10月24日
發明者杉山朋也, 泰中智史, 田淵久大 申請人:中外製藥株式會社