一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物及其製備方法
2023-09-17 16:08:50
專利名稱：一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物及其製備方法。
背景技術：
關節軟骨缺損是臨床常見而又棘手的病症之一，外傷、炎症、腫瘤及自身免疫性疾病等原因均可造成關節軟骨缺損。缺損發生後，修復困難，這是因為關節軟骨為透明軟骨，有著不同於其他軟骨的特殊結構，主要由包埋在軟骨基質陷窩內的軟骨細胞構成，為一種單一的結締組織。軟骨基質主要由軟骨細胞合成並維持，主要成份為多種蛋白聚糖和以二型膠原為主的膠原纖維。關節軟骨組織中既無神經分布支配，也沒有血管或淋巴系統分布，主要依靠關節液而獲得營養。[Buckwalter等，「Articular CartilageInjury andRepair，」Injury and Repair of the Musculodkeletal Soft Tissues(Park Ridge，IIIAmerican Academy of Othopaedic Surgeons Symposium，1987)，465頁]。所以，軟骨組織發生缺損或損傷後依靠自身修復的能力很低，且修復形成的組織多為纖維軟骨組織而非原先的透明軟骨組織，其生物機械性能較差，而且會出現繼發性的退變崩解。[Buckwalter等，「Articular CartilageComposition，Structure，Response to Injury，」Articular Cartilage and Knee Joint FunctionBasicScience and Arthroscopy(New YorkRaven Press，1990)19-56頁]。通常認為軟骨軟骨組織在正常情況下，並不接觸到足量的修復刺激物質，如生長因子等，所以關節軟骨損傷常常導致早期創傷性關節炎的改變，不再能如正常軟骨組織那樣可以保證組成關節各骨之間幾乎無摩擦的運動[Gray’s Anatomy(New YorkBounty Books，(1977)]，而代之以疼痛、活動受限、關節僵硬等症狀。
傳統的軟骨修複方法主要有軟骨下鑽孔、磨削、微骨折等，其目的僅僅是促進骨髓內具有成軟骨潛能的各類細胞參與修復，但因修復的組織往往為纖維軟骨而非透明軟骨故效果不佳[Grande，-D-A等，「Cartilage tissueengineeringcurrent limitations and solutions」，Clin-Orthop.1999 Oct；(367Suppl)S176-85頁]。新近採用的各種移植修複方法也有許多問題，如自體軟骨移植存在供體來源有限的缺點[Gautier，-E等，「Treatment of cartilage defectsof the talus by autologous osteochondral grafts」，J-Bone-Joint-Surg-Br.2002 Mar；84(2)237-44頁]，而異體軟骨移植則有免疫排斥的問題[Aubin，-P-P等，「Long-term follow-up of fresh femoral osteochondral allografts for posttraumaticknee defects」，Clin-Orthop.2001 Oct；(391 Suppl)S318-27頁]。軟骨膜或骨膜移植則由於修復的組織不能較好地耐受應力[Bouwmeester，-P-S等，「Aretrospective analysis of two independent prospective cartilage repair studiesautogenous perichondrial grafting versus subchondral drilling 10 yearspost-surgery」，J-Orthop-Res.2002 Mar；20(2)267-73頁]，且有遠期退化及二期骨化的問題，也未廣泛應用[O′Driscoll，-S-W，「Articular cartilage regenerationusing periosteum」，Clin-Orthop.1999 Oct；(367 Suppl)S186-203頁]。單純的游離軟骨細胞移植易流失，即使控制了細胞流失，也往往因細胞缺乏三維立體空間來進行營養交換和生長代謝，形成的軟骨生物學性能欠佳[Peterson，-L，「Autologous chondrocyte transplantation」，Biomechanics and long-termdurability.Am-J-Sports-Med.2002 Jan-Feb；30(1)2-12頁]。類似的，自體軟骨的細胞來源問題和異體軟骨細胞的免疫學問題也限制了其應用。
在軟骨的修復過程中，生長因子在調控軟骨細胞的分化、增殖以及細胞外基質的合成中發揮了重要作用，在軟骨修復過程中一定時相引入適量的生長因子，已被證明是一種有效的促進軟骨修復的方法[Rizzino，A.，Dev.biol.，130，411-422(1998)頁]。轉化生長因子β1(TGF-β1)已被證明可以促進軟骨特異性分子如二型膠原和軟骨特異性蛋白聚糖的合成，可以在軟骨修復的各階段起作用，有利於軟骨缺損的修復[Seyedin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，2267-71頁，(1985)；Goessler UR等，「In-vitro analysisof the expression of TGFbeta-superfamily-members during chondrogenicdifferentiation of mesenchymal stem cells and chondrocytes duringdedifferentiation in cell culture」，Cell Mol Biol Lett.2005；10(2)345-62頁]。相對於直接應用外源性生長因子，將編碼生長因子的基因導入目的細胞中，通過基因表達產生內源性生物活性物質，調控自身增殖分化，具有高效可控、價格低廉等優點[Van Beuningen HM等，「Osteoarthritis-like changes in themurine knee joint resulting from intraarticular transforming growth factorinjections」，Osteoarthritis Cartilage，2000；825-33頁]。此外，其他的核酸如核酶、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、幹擾RNA等，本身就可以作為一種藥物，封閉或阻斷促進軟骨損傷相關的酶或因子的表達，起到基因水平調控的作用。
外源性基因要進入靶細胞並獲得表達有多重障礙，如體液中核酸酶的降解，細胞膜，以及胞漿內的吞噬泡-溶酶體系統等。要將特定的目的核酸轉運到相應受體細胞中並獲得特定的效果，需要藉助基因載體系統。基因載體必需滿足幾個條件，首先載體要能承載並在使用環境中保護DNA分子；其次要能夠與細胞膜結合，便於細胞內吞形成吞噬泡；在吞噬泡和細胞內溶酶體結合後，要保護基因不被溶酶體中的核酸酶降解並幫助外源基因從吞噬泡中逃逸，進入胞漿，在細胞分裂時穿過細胞核膜，進入胞核，完成整個基因轉運過程[Anderson，W.F等，Nature.392(supp.)，25-30頁(1998)]。當前使用的主要有三種DNA轉運系統，物理轉運系統、病毒類載體和非病素類載體。物理轉運系統主要有有顯微注射法，電穿孔法，基因槍轟擊法等，其特點是效果確切且效率極高，但因其需要的技術和設備要求很高，且對靶細胞有較大程度的損害，故難以在大規模的基因治療中使用[HoSH等，Biochem BiophysRes Commun，2004；321(4)759～766頁]。病毒轉運系統主要有逆轉錄病毒(RV，包括慢病毒)、腺病毒(Ad)、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)，是靠病毒對細胞的天然染能力將外源基因整合進宿主細胞，具有較高的轉染效率，容易獲得對外源基因的長時表達。其缺點是生產不便，毒性尤其是免疫源性大，不宜反覆使用，安全性存在隱患以及對所攜帶的外源基因片斷的大小有限制等。非病毒載體主要有磷酸鈣，脂質體，DNA-配體複合物，納米轉運體等，雖然在轉基因效率和獲得長時表達方面不如病毒載體，但不存在病毒載體的缺點，經過修飾改造後的非病毒載體在很大程度上提高了轉基因效率，同時可發揮自身安全、有效、靶向等方面的優勢，在某些應用情況下甚至優於上述兩種體系[王瑞等，「骨性關節炎基因治療進展」，人民軍醫，2006，49(8)，481-484頁]。因此，需要一種簡單，安全，可靠，有效的核酸傳輸系統，可以真正在軟骨修復過程中實現靶向、高效地基因導入。因此，針對軟骨修復過程和關節腔內的環境，本發明採用殼聚糖與轉化生長因子β1(TGF-β1)的質粒作為原料，對其進行加工後，利用其分子間的帶電性不同(殼聚糖為正，生長因子β1質粒為負)通過分子自組裝的方法使二者結合，形成納米核酸轉運複合物，並對其使用條件進行優化，得到了良好的效果。
殼聚糖是一種具有生物相容性和可生物降解性的新型醫用生物材料，其無刺激、致敏、溶血、致突變、抗原性及熱原等作用已為實踐所證明[Borchard，-G等，「Chitosans for gene delivery」，Adv-Drug-Deliv-Rev.2001Nov 5；52(2)145-50頁]。作為目前自然界已知的惟一帶正電的氨基多糖，在生理條件的帶正電的特性使其可以和帶負電的核酸分子結合。由於殼聚糖的分子結結構與關節軟骨中的結構氨基多糖結構有著很大的相似性，其體內降解產物可以被軟骨細胞所利用。體外的細胞學試驗提示殼聚糖可以增加軟骨基質的合成[Lahiji，-A等，「Chitosan supports the expression of extracellularmatrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes」，J-Biomed-Mater-Res，2000 Sep 15；51(4)586-95頁]，提示該物質可能更適合用於關節軟骨損傷的治療。
但是，未經降解的高分子量殼聚糖(High Molecular Weight Chitosan，HMWC)分子量過大，難溶於水，需要溶解於酸中，所形成的溶液粘度偏大，另外，由於其正電性過強，對細胞的損傷也較大，這些都限制了其直接作為基因轉運載體的運用。
發明內容
本發明的目的是利用殼聚糖的獨特性質並克服高分子量殼聚糖的缺點，提供一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物。
本發明的另一目的是提供一種上述非病毒納米核酸轉運複合物的製備方法。
本發明還有一目的的提供一種上述非病毒納米核酸轉運複合物的應用。
本發明將HMWC降解為低分子量殼聚糖(Low Molecular WeightChitosan，LMWC)後加以應用，不僅增加了材料的水溶性，降低了溶液的粘度，同時也減少了作為溶劑的酸性環境對細胞的影響，改良了殼聚糖作為基因載體的特性。更重要的是，使得所形成的微粒進入了納米材料所定義的範圍(1-100納米)，使其獲得了諸如表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等功能特性，成為一種優良的非病毒基因載體。
本發明的目的可以通過以下措施達到一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物，該複合物包括低分子量殼聚糖和核酸，其中低分子量殼聚糖的分子量為5KD～100KD，氨基百分含量為30％～70％；複合物中的N/P為0.2∶1～10∶1。
低分子量殼聚糖的分子量優選為15KD～25KD；其氨基百分含量優選為45％～60％。
複合物中的N/P優選為3.5～5.5∶1。N/P定義為殼聚糖骨架上帶正電的氨基(N)與核酸骨架上帶負電的磷酸根(P)的摩爾比。
複合物中的核酸為對軟骨缺損有治療作用的核酸，優選為pSV-β-Galactosidase質粒、pEGFP質粒、hTGF-β1質粒、反義核酸、幹擾RNA、小RNA或核酶，最優選為pSV-β-Galactosidase質粒、pEGFP質粒和hTGF-β1質粒。
一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物的製備方法，其特徵在於按以下步驟進行(1)低分子量殼聚糖的製備取高分子量殼聚糖，加入HCl溶液，在90～110℃並攪拌下反應5～50小時，冷卻後紙過濾，用無水乙醇洗滌濾液後，將沉澱物乾燥，溶於水中進行凍幹，得到白色粉末狀低分子量殼聚糖；採用凝膠滲透層析的方法測定其分子量，採用比色滴定法測定其氨基百分含量；(2)分別用生理鹽水配製濃度為0.1～1mg/ml的低分子量殼聚糖溶液和5～50μg/ml的核酸溶液；(3)將核酸溶液按N/P為0.2∶1～10∶1的比例加入低分子量殼聚糖溶液中，振蕩5～20秒，室溫靜置10～100min，獲得用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物顆粒。
在製備方法中，低分子量殼聚糖溶液的濃度優選為0.3～0.8mg/ml；核酸溶液的濃度優選為15～30μg/ml。
市售高分子量殼聚糖分子量在150KDa左右，85％脫乙醯化。
高分子量殼聚糖與HCl溶液的質量體積比為1∶20～30g/mL，HCl溶液的濃度為3～5M。
在步驟(3)中，靜置時間優選為15～40min。本非病毒納米核酸轉運複合物儘管經過長時間存貯實驗發現其客觀指標並未有明顯變化，但最好能夠現配現用，效果比較穩定。可以將低分子量殼聚糖溶液和核酸溶液事先配好，它們各自是穩定的，用之前混合振蕩靜置即可。
本發明的非病毒納米核酸轉運複合物在製備治療關節軟骨缺損藥物方面的應用。
本發明的目的具體可以通過以下措施來達到一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物及其製備方法，該複合物的有效成份為經過降解的低分子量殼聚糖與核酸的納米級複合物微粒，分散於生理鹽水中。
具體製備步驟如下
(1)低分子量殼聚糖的製備取5g市售高分子量殼聚糖(85％脫乙醯化)到250ml圓底燒瓶中，加入125ml的4M HCl，油浴100℃ 5～50小時，同時攪拌。冷卻後雙層擦鏡紙過濾，向所得到的溶液中加入等體積的無水乙醇，混勻，冰箱4℃過夜。然後10000rpm離心10分鐘，棄上清。沉澱加入50ml的50％的乙醇洗滌，重新懸浮，再在10000rpm離心10分鐘。重複上述洗滌，懸浮，離心過程三次。烘乾沉澱，溶於15ml雙蒸水，最後凍幹得到白色粉末狀固體，即為低分子量殼聚糖。產物的組成成分通過元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)確定，紅外圖譜由Nicolet 170SX FT-IR光譜儀測得。樣品分子量採用TSK-gelG3000SW層析柱(Tosoh公司產品)利用凝膠滲透層析的方法測定，其流動相為Milli Q水，流速為0.5ml/min，以三種蛋白質和一種多肽用作測定相對分子量的參照物，這些參照物在220nm的紫外光吸收處檢測洗脫峰。殼聚糖的相對分子量使用FITC標記的殼聚糖來測得，檢測信號為FITC在激發光489.7nm吸收光520nm的螢光特徵吸收峰。整個的測定分為紫外和螢光兩部分進行，檢測條件均保持一致。測試結果合併於同一條洗脫曲線中，並依據參照物計算出殼聚糖的相對分子量。標記殼聚糖的製備依據Qaqish[Qaqish，R.B等，Carbohyd.Pol.38，99-107頁(1999)]等報告的方法進行。所得的樣品分子量在5KD～100KD之間。樣品的氨基含量用以Xylidine Tonceau 2R(C.I.Acid Red 26)為指示劑的比色滴定法測定[Gummow，B.D等，「Studies on chitosan-induced metachromasy，1.Metachromatic behavior of sodium 2′-hydroxy-1，1′-azonaphthalene-4-sulfonate inthe presence of Chitosan」，Makromol.Chem.1861239-1244(1985)頁]。XylidineTonceau 2R是帶負電荷的染料，能與殼聚糖帶正電荷的氨基結合，從而使其在其最大吸收峰(505nm)的OD值會隨著體系中的帶正電荷的氨基濃度的上升而下降，達到一個最小值後，氨基的濃度的上升而OD值不再改變。以OD值為Y軸，體系中殼聚糖的體積為X軸作圖，得到兩條直線，這兩條直線的交點的X值代表的就是含有與體系中的染料的陰離子數相等的帶正電荷的氨基的殼聚糖的體積。由此就可推出殼聚糖的氨基百分含量。所得樣品的氨基百分含量在30％～70％之間。
(2)用生理鹽水配置濃度為0.1mg/ml～1mg/ml的低分子量殼聚糖溶液。用生理鹽水配置濃度為5μg/ml～50μg/ml的核酸溶液。核酸優選為pSV-β-Galactosidase質粒、pEGFP質粒、hTGF-β1質粒、反義核酸、幹擾RNA、小RNA或核酶；最優選為pSV-β-Galactosidase質粒、pEGFP質粒和hTGF-β1質粒。
(3)按照0.2∶1～10∶1的N/P，取一定體積步驟(1)溶液緩慢加入到相應體積步驟(2)溶液中，漩渦振蕩10秒，室溫靜置10～100min，獲得低分子量殼聚糖與核酸的納米複合物顆粒。
本發明的有益效果(1)採用殼聚糖用於針對軟骨細胞的體內轉染，一方面利用帶正電的殼聚糖本身與帶負電核酸形成的納米基因複合物的性質；另一方面利用了殼聚糖的結構與關節軟骨中的結構氨基多糖結構上的相似性，增強了該系統在關節腔注射中的生物相容性；此外殼聚糖體內降解後的產物-氨基葡萄糖，可以參與軟骨修復過程中基質的合成，具有獨特的優點。
(2)高分子量殼聚糖分子量過大，難溶於水，需要溶解於酸中，所形成的溶液粘度偏大，與核酸作用所形成的複合物尺寸過大，達不到納米材料的標準，甚至導致複合物團聚沉澱[K.Roy，H.-Q等，「Proceedings of theInternational Symposium on Controlled Release」，Bioactive Materials，24，673頁(1997).]。另外，由於其正電性過強，對軟骨細胞的損傷較大，不利於關節腔內的基因轉運。本發明將高分子量殼聚糖降解為低分子量殼聚糖，不僅增加了材料的水溶性，降低了溶液的粘度，同時也減少了作為溶劑的酸性環境對細胞的影響。同時，與核酸作用所形成的複合物尺寸大大減小，進入了納米材料所定義的範圍(1～100納米)[T.Kaehler，Clin.Chem，1994，40(9)，1797-1799頁]，獲得了諸如表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等功能特性，有利於對關節軟骨細胞進行基因傳遞。同時，通過降解消耗部分氨基，在保留足夠正電性的基礎上，適當降低了其電荷密度，減少了對軟骨細胞的損傷。
(3)低分子量殼聚糖與核酸通過分子間自組裝，兩者相互作用，可以幫助核酸分子摺疊，從而形成更小且更為緻密的結構，電子顯微鏡下呈類球形。不僅有利於基因傳遞，而且由於摺疊遮蔽了酶切位點，可以很大程度上保護目的核酸不被關節液中和溶酶體中的核酸酶降解。同時由於本發明形成的納米基因複合物所帶的淨電荷為正值，易於與表面帶負電荷的軟骨細胞相結合，便於細胞內吞形成吞噬泡。當在胞漿中吞噬泡與細胞內溶酶體結合後，如上所述不僅能夠保護核酸不被降解，更由於殼聚糖分子上所帶的氨基基團，可以使溶酶體中的Ph值下降，有利於外源核酸從吞噬泡中逃逸，進入胞漿[M.Kping-Hggrd等，「Chitosan as a nonviral gene delivery system.Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine invitro and after lung administration in vivo」，Gene Ther.81108-1121頁(2002)]。另外，在損傷的局部，細胞分裂非常頻繁，外源性核酸易於在細胞分裂時穿過細胞核膜，進入胞核，得到表達，所生成的生長因子又可以反過來促進細胞分裂，形成良性循環。
(4)本方法製備過程簡單，採用分子自組裝技術形成納米基因轉運體系。可以縮短從製備到使用之間的時間，可以早期使用進行幹預治療，這對於關節軟骨修復的是致關重要的。
(5)雖然本發明所屬非病毒體系，但體內外的試驗結果均表明，在針對關節軟骨和關節腔內的微環境做了選擇和優化後，轉染的效率對於軟骨缺損的修復已經非常充分，而且軟骨損傷為一過性修復過程，並不需要生長因子的長時表達，而且由於生長因子所具有的雙向性，過長和過度地表達反而不利於軟骨損傷的修復[Van Beuningen HM等，「Osteoarthritis-like changes in themurine knee joint resulting from intraarticular transforming growth factorinjections」，Osteoarthritis Cartilage 2000；825-33頁]。將轉化生長因子β1(TGF-β1)的質粒通過轉染軟骨細胞的手段作用於軟骨缺損部位，通過基因表達產生內源性生物活性物質，不僅相對於原核表達產物來說效價更高，也不會產生免疫反應[S.S.Kumaresh，等，J.Cont.Rel.2001(70)1-20頁]。而且，表達產物可以直接作用於軟骨細胞，發揮調控作用，且具有安全可控、針對性強的優點。
(6)本方法適用範圍廣泛，不僅可以與本發明中的pSV-β-Galactosidase質粒、pEGFP質粒和hTGF-β1質粒複合，還可以與多種核酸包括反義寡核苷酸、幹擾RNA、核酶等相互作用，形成不同用途的納米複合物顆粒。通過定義N/P，即殼聚糖骨架上帶正電的氨基(N)與核酸骨架上帶負電的磷酸根(P)的摩爾比，統一了配製不同類型核酸藥物的標準。只要知道了低分子量的殼聚糖的分子量和氨基百分含量，以及核酸的結構類型，就很容易配製出該複合物。
(7)本方法結構可控，由於殼聚糖和各種核酸的化學成分及結構是已知的，同時通過調整殼聚糖的分子量與N/P，可形成不同尺寸，不同帶電強度的納米基因轉運複合物，以滿足針對關節腔內不同需要的應用。並通過發明人進行大量實驗摸索總結得出最適合關節腔內注射軟染軟骨細胞的殼聚糖分子量與N/P。具體為將經降解10～20h，分子量為15KD～25KD，氨基百分含量在45％～60％的LMWC，配置成濃度為0.3mg/ml～0.8mg/ml的低分子量殼聚糖溶液，按照3.5～5.5∶1的N/P，取一定體積該溶液緩慢加入到相應體積的15～30μg/ml的核酸溶液中，漩渦振蕩10s，室溫靜置15～40min，使殼聚糖/DNA複合物充分形成。
(8)本發明通過納米核酸傳遞體系製備條件的摸索，並結合hTGF-β1質粒的應用，提供了一種簡單，安全，可靠，有效的方法治療軟骨缺損。該方法能很好地解決在無需手術、無需複雜設備及無需支架材料和種子細胞輔助條件下軟骨修復的技術難題，尤其是可以對損傷的軟骨進行早期幹預治療。並在一系列動物實驗上得到了證明。
圖1(a)為實施例1中所得到的低分子量殼聚糖樣品的紅外圖譜。
圖1(b)為實施例1中所得到的低分子量殼聚糖樣品的凝膠滲透層析洗脫時間-標準蛋白分子量的標準曲線圖。箭頭所示為低分子量殼聚糖的分子量，為18KD左右。
圖1(c)為實施例1中所得到的低分子量殼聚糖樣品的比色滴定曲線圖。可計算出氨基百分含量為51％左右。
圖2為實施例2中所得到的低分子量殼聚糖核酸納米複合物顆粒透射電鏡圖。
圖3為實施例3中所得到的不同N/P比例的低分子量殼聚糖與pSV-β-galactoidase質粒複合物體外轉染軟骨細胞的試驗結果圖。
圖4為實施例4中所得到的不同N/P比例的低分子量殼聚糖核酸納米複合物對核酸的保護作用圖。
圖5為實施例5中所得到的不同N/P比例的低分子量殼聚糖核酸納米複合物的體外表觀粒徑和表面電勢的測定結果圖。
圖6(a)和(b)為實施例6中所得到的低分子量殼聚糖核酸納米複合物動物體內轉染軟骨細胞的試驗結果圖。
圖7(a)和(b)為實施例7中所得到低分子量殼聚糖核酸納米複合物動物體內轉染促進軟骨損傷修複試驗的大體標本觀察結果圖。
圖7(c)～(h))為實施例7中所得到低分子量殼聚糖核酸納米複合物動物體內轉染促進軟骨損傷修複試驗的常規病理學觀察結果圖。其中圖7(c)、圖7(e)、圖7(g)為H.E.染色，圖7(d)、圖7(F)、圖7(h)為甲苯胺蘭染色。圖7(c)和(d)為低分子量殼聚糖核酸納米複合物組，圖7(c)和(d)為裸露質粒組，圖7(g)和(h)為空白對照組。圖中OC表示原有軟骨組織，RT表示修復形成的組織，箭頭所指為兩者的交界處。
圖7(i)～(j)為實施例7中所得到低分子量殼聚糖核酸納米複合物動物體內轉染促進軟骨損傷修複試驗的二型膠原免疫組織化學染色結果圖。圖中OC表示原有軟骨組織，RT表示修復形成的組織，箭頭所指為兩者的交界處。
圖7(k)～(l)為納米核酸傳遞體系動物體內轉染促進軟骨損傷修複試驗的TGF-β1免疫組織化學染色結果圖。圖中OC表示原有軟骨組織，RT表示修復形成的組織，箭頭所指為兩者的交界處。
具體實施例方式
實施例1 低分子量殼聚糖的製備取5g市售高分子量殼聚糖(St.Louis，MO，USA，分子量約為150KDa，85％脫乙醯化)到250ml圓底燒瓶中，加入125ml的4M HCl，油浴100℃ 15小時，同時攪拌。冷卻後雙層擦鏡紙過濾，得到85ml溶液，向該溶液中加入等體積的無水乙醇，混勻，冰箱4℃過夜。然後10000rpm離心10分鐘，棄上清。沉澱加入50ml的50％的乙醇洗滌，重新懸浮，再在10000rpm離心10分鐘。重複上述洗滌，懸浮，離心過程三次。烘乾沉澱，溶於15ml雙蒸水，最後凍幹得到白色粉末狀固體，即為低分子量殼聚糖。產物的組成成分通過元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)確定，紅外圖譜由Nicolet 170SX FT-IR光譜儀測得，結果如圖1(a)。樣品分子量採用TSK-gel G3000SW層析柱(Tosoh公司產品)利用凝膠滲透層析的方法測定，其流動相為Milli Q水，流速為0.5ml/min，以三種蛋白質和一種多肽用作測定相對分子量的參照物，這些參照物在220nm的紫外光吸收處檢測洗脫峰。殼聚糖的相對分子量使用FITC標記的殼聚糖來測得，檢測信號為FITC在激發光489.7nm吸收光520nm的螢光特徵吸收峰。整個的測定分為紫外和螢光兩部分進行，檢測條件均保持一致。測試結果合併於同一條洗脫曲線中，並依據參照物計算出殼聚糖的相對分子量。標記殼聚糖的製備依據Qaqish[Qaqish，R.B等，Carbohyd.Pol.38，99-107頁(1999)]等報告的方法進行。結果如圖1(b)所示，為18KD左右。樣品的氨基含量用以Xylidine Tonceau 2R(C.I.Acid Red 26)為指示劑的比色滴定法測定[Gummow，B.D等，「Studies on chitosan-induced metachromasy，1.Metachromatic behavior of sodium 2′-hydroxy-1，1′-azonaphthalene-4-sulfonatein the presence of Chitosan」，Makromol.Chem.1861239-1244(1985)頁]。Xylidine Tonceau 2R是帶負電荷的染料，能與殼聚糖帶正電荷的氨基結合，從而使其在其最大吸收峰(505nm)的OD值會隨著體系中的帶正電荷的氨基濃度的上升而下降，達到一個最小值後，氨基的濃度的上升而OD值不再改變。以OD值為Y軸，體系中殼聚糖的體積為X軸作圖，得到兩條直線，這兩條直線的交點的X值代表的就是含有與體系中的染料的陰離子數相等的帶正電荷的氨基的殼聚糖的體積。由此就可推出殼聚糖的氨基百分含量。結果如圖1(c)所示，可計算出氨基百分含量為51％左右。
實施例2 低分子量殼聚糖的製備取5g市售高分子量殼聚糖(St.Louis，MO，USA，分子量約為150KDa，85％脫乙醯化)到250ml圓底燒瓶中，加入140ml的4M HCl，油浴100℃ 25小時，同時攪拌。冷卻後雙層擦鏡紙過濾，得到90ml溶液，向該溶液中加入等體積的無水乙醇，混勻，冰箱4℃過夜。然後10000rpm離心10分鐘，棄上清。沉澱加入50ml的50％的乙醇洗滌，重新懸浮，再在10000rpm離心10分鐘。重複上述洗滌，懸浮，離心過程三次。烘乾沉澱，溶於15ml雙蒸水，最後凍幹得到白色粉末狀固體，即為低分子量殼聚糖。產物的組成成分通過元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)確定。樣品分子量採用TSK-gelG3000SW層析柱(Tosoh公司產品)利用凝膠滲透層析的方法測定為15KD左右。樣品的氨基含量為40％左右。
實施例3 低分子量殼聚糖的製備取5g市售高分子量殼聚糖(St.Louis，MO，USA，分子量約為150KDa，85％脫乙醯化)到250ml圓底燒瓶中，加入110ml的4M HCl，油浴100℃ 10小時，同時攪拌。冷卻後雙層擦鏡紙過濾，得到90ml溶液，向該溶液中加入等體積的無水乙醇，混勻，冰箱4℃過夜。然後10000rpm離心10分鐘，棄上清。沉澱加入50ml的50％的乙醇洗滌，重新懸浮，再在10000rpm離心10分鐘。重複上述洗滌，懸浮，離心過程三次。烘乾沉澱，溶於15ml雙蒸水，最後凍幹得到白色粉末狀固體，即為低分子量殼聚糖。產物的組成成分通過元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)確定。樣品分子量採用TSK-gelG3000SW層析柱(Tosoh公司產品)利用凝膠滲透層析的方法測定為25KD左右。樣品的氨基含量為60％左右。
實施例4 納米核酸轉運複合物的製備(1)取實施例1方法所得的低分子量殼聚糖，用生理鹽水配置濃度為0.5mg/ml的低分子量殼聚糖溶液。
(2)按照《分子克隆操作指南》操作，以CaCl2共沉澱法以pSV-β-Galactosidase質粒轉化大腸桿菌E.coli。以含氨苄青黴素的LB平板抗性篩選，以改良的SDS鹼裂解法抽提質粒。並依次以RNaseA處理，酚，酚∶氯仿(體積百分比1∶1)，氯仿抽提純化質粒，通過UV-2201型分光光度計測定其OD260、OD280以檢測樣品純度並計算DNA濃度。用生理鹽水配置濃度為20μg/ml的核酸溶液。
(3)按照4∶1的N/P(可根據氨基含量和磷酸根含量具體算出各需低分子量殼聚糖溶液和核酸溶液的量)，取步驟(1)溶液緩慢加入到步驟(2)溶液中，漩渦振蕩10秒，室溫靜置30min，獲得低分子量殼聚糖與核酸的納米複合物顆粒。所形成的納米級複合物顆粒如圖2所示。
實施例5按實施例4的方法配製N/P＝0.5∶1的含pSV-β-Galactosidase的納米核酸轉運複合物。
實施例6按實施例4的方法配製N/P＝1∶1的含pSV-β-Galactosidase的納米核酸轉運複合物。
實施例7按實施例4的方法配製N/P＝3∶1的含pSV-β-Galactosidase的納米核酸轉運複合物。
實施例8按實施例4的方法配製N/P＝6∶1的含pSV-β-Galactosidase的納米核酸轉運複合物。
實施例9按實施例4的方法配製N/P＝10∶1的含pSV-β-Galactosidase的納米核酸轉運複合物。
實施例10
按實施例4的方法配製N/P＝2∶1的含pSV-β-Galactosidase的納米核酸轉運複合物。
實施例11(1)取實施例2方法所得的低分子量殼聚糖，用生理鹽水配置濃度為0.8mg/ml的低分子量殼聚糖溶液。
(2)按照《分子克隆操作指南》操作，以CaCl2共沉澱法以pEGFP質粒轉化大腸桿菌E.coli。以含氨苄青黴素的LB平板抗性篩選，以改良的SDS鹼裂解法抽提質粒。並依次以RNaseA處理，酚，酚∶氯仿(體積百分比1∶1)，氯仿抽提純化質粒，通過UV-2201型分光光度計測定其OD260、OD280以檢測樣品純度並計算DNA濃度。用生理鹽水配置濃度為40μg/ml的核酸溶液。
(3)按照4∶1的N/P(可根據氨基含量和磷酸根含量具體算出各需低分子量殼聚糖溶液和核酸溶液的量)，取步驟(1)溶液緩慢加入到步驟(2)溶液中，漩渦振蕩10秒，室溫靜置30min，獲得低分子量殼聚糖與核酸pEGFP的納米複合物顆粒。
實施例12(1)取實施例3方法所得的低分子量殼聚糖，用生理鹽水配置濃度為0.4mg/ml的低分子量殼聚糖溶液。
(2)按照《分子克隆操作指南》操作，以CaCl2共沉澱法以hTGF-β1質粒轉化大腸桿菌E.coli。以含氨苄青黴素的LB平板抗性篩選，以改良的SDS鹼裂解法抽提質粒。並依次以RNaseA處理，酚，酚∶氯仿(體積百分比1∶1)，氯仿抽提純化質粒，通過UV-2201型分光光度計測定其OD260、OD280以檢測樣品純度並計算DNA濃度。用生理鹽水配置濃度為30μg/ml的核酸溶液。
(3)按照4∶1的N/P(可根據氨基含量和磷酸根含量具體算出各需低分子量殼聚糖溶液和核酸溶液的量)，取步驟(1)溶液緩慢加入到步驟(2)溶液中，漩渦振蕩10秒，室溫靜置30min，獲得低分子量殼聚糖與核酸hTGF-β1的納米複合物顆粒。
藥效實驗1、納米核酸轉運複合物的體外轉染軟骨細胞的試驗利用體外單層貼壁培養的軟骨細胞模擬關節腔內的轉染過程。具體方法如下取清潔級4周齡健康紐西蘭大白兔1隻，耳緣靜脈注射空氣處死，無菌操作下切取肱骨頭、股骨頭及膝關節等負重關節軟骨，剪碎至1mm3左右。加入以DMEM配製的0.2％II型膠原酶20ml，置於37℃5％CO2培養箱內，其間每隔1h振蕩離心管1次並吸取上清，1500rpm離心5min收取細胞團，直至肉眼觀察軟骨塊大部分被消化後為止。收集到的細胞團以無血清培養基清洗3次，充分吹打使細胞團使其分散為細胞懸液，按每瓶2.5×105/ml的密度接種到25ml的培養瓶中，加入含10％FBS的DMEM培養基5ml，置於37℃、飽和溼度、5％CO2的細胞孵箱中單層貼壁培養。
取實施例4所得的N/P為4∶1納米核酸轉運複合物體系，含有pSV-β-Galactosidase質粒DNA20μg，另取實施例5，6，7，8，9所得的N/P分別為0.5∶1，1∶1，3∶1，6∶1，10∶1納米核酸轉運複合物體系作為對照，也各含有pSV-β-Galactosidase質粒DNA20μg。
當軟骨細胞生長至對數期時，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化後以每孔2.0×105個細胞接種六孔板，繼續培養24小時，當細胞匯合度達到70％時，棄去培養基殘液並用磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4)清洗細胞表面。然後將配製好的納米核酸傳遞體系加入到培養孔中，4個小時後，棄去轉染溶液，然後加入5ml完全培養基，讓細胞正常生長48小時。以裸露DNA的轉染作為對照。pSV-β-galactosidase質粒的轉染效率則按照《分子克隆操作指南》操作，用ONPG顯色法來測定β-半乳糖苷酶的活性。結果如圖3所示，N/P＝4∶1時基因轉移效率最高，N/P＝3∶1和N/P＝6∶1時次之。整個轉染過程中細胞狀態良好，未見軟骨細胞生長受到影響，也未見到細胞出現毒性表現。
2、納米核酸轉運複合物的體外核酸保護試驗
採用含10％DNase I的生理鹽水溶液模擬關節腔內體液中以及溶酶體中存在的核酸降解酶。作為為一種DNA的非限制性內切酶，DNase I可以將DNA鏈非選擇性地切斷降解，直至成為單個的鹼基。具體方法如下將DNase I和10×Buffer各1μL分裝至6管中，每管1μL。
取實施例4所得的N/P＝4∶1的納米核酸轉運複合物，含有pSV-β-Galactosidase質粒DNA200ng。取實施例6，10，7，8，9所得的N/P＝1∶1，N/P＝2∶1，N/P＝3∶1，N/P＝6∶1和N/P＝10∶1的納米核酸傳遞體系作為對照，也各含有pSV-β-Galactosidase質粒DNA200ng。
將不同N/P的納米核酸傳遞體系加入含有DNase I溶液的各管中，以雙蒸水補足體系至10μL，漩渦混勻。放置於37℃孵箱中DNase I酶切半小時，反應完畢加入1μL0.5mol/L EDTA終止反應，1％瓊脂糖膠電泳並拍照。同樣以裸露的DNA作為對照。結果如圖4所示，隨著加入低分子量殼聚糖量的不同，逐漸顯示出不同程度的保護作用。N/P小於3∶1時，還不足以抵抗酶的剪切降解，基因的質粒被酶所切斷，切出的寡聚核苷酸顯示出彌散的條帶；N/P等於3∶1時抗酶切降解效果已經比較明顯；當N/P大於等於4∶1時，已完全看不到彌散條帶，絕大多數DNA被保護。
3、納米核酸轉運複合物的表觀粒徑與表面電勢的測定取實施例4所得的N/P＝4∶1的納米核酸轉運複合物體系，含有pSV-β-Galactosidase質粒DNA 20μg。取實施例5，6，7，8，9所得的N/P＝0.5∶1，N/P＝1∶1，N/P＝3∶1，N/P＝6∶1和N/P＝10∶1的納米核酸傳遞體系作為對照，也各含有pSV-β-Galactosidase質粒DNA 20μg。
取各新鮮配製的實施例的納米核酸傳遞體系500μL，以雙蒸水稀釋至3mL，以表觀粒徑及Zeta電位儀(Brookhaven Instruments Co.，Holtsville，NY，USA)測量形成微粒相對大小和表面電位。結果如圖5所示。反映了不同N/P比例對複合物尺寸大小和所帶淨電荷情況的影響。當N/P＝1的時候，殼聚糖與DNA的複合物的電位接近於電中性，此時表觀粒徑最大，當N/P大於1的時候，複合物表面分布有正電荷，且隨著N/P的增加，表面電位也越來越高，而表觀粒徑卻恰好相反，隨著N/P比例的增加而有小幅度的降低，當N/P大於等於4∶1時，複合物尺寸及所帶淨電荷量均在一個合適的範圍內。需要說明的是，由於該測量粒徑的方法為雷射散色法，由於分散系影響等原因，所測出的實際大小並不與實際大小(如電鏡大小)相一致，只能作為一種相對尺度，稱為表觀粒徑。根據其說明書，一般認為在水相中，其表觀粒徑約為實際粒徑的4倍左右。
4、納米核酸轉運複合物動物體內轉染軟骨細胞的試驗實驗動物選取成年紐西蘭大白兔一隻，體重1.5kg，雌性。
方法採用穿孔法子兔膝關節構建關節軟骨缺損模型，步驟如下取禁食6小時的家兔，耳緣靜脈注射1％的戊巴比妥(25mg/kg)使其全麻，雙膝關節術區脫毛後，固定於木板上。取膝關節前方偏內側直切口，1/3位於髕骨遠側，2/3位於髕骨近側，顯露膝關節及股骨下段。以直徑3mm的手搖鑽在股骨兩結節間的滑車上鑽孔，製造全層軟骨缺損，深及軟骨下骨。徹底止血及衝洗術野後，逐層關閉切口。
取實施例11所得的含有pEGFP的N/P＝4∶1的納米核酸傳遞體系，含有pEGFP質粒DNA20μg。
將上述新配鮮配製的納米核酸傳遞體系於兔膝關節軟骨缺損模型構建完成後，即刻注射入其一側膝關節腔內，對側以裸露DNA做為對照。
注射後72h，處死實驗動物，取出膝關節包埋後冰凍切片，置於螢光顯微鏡下觀察。低分子量殼聚糖核酸納米級複合物組的結果如圖6(a)所示，在缺損區域及其周圍的軟骨組織中，可廣泛地觀察到大量明亮的綠色的pEGFP質粒表達的產物，並且向周圍軟骨組織中擴散得較廣，約300μm左右。裸露DNA對照組的結果如圖6(b)所示，僅能在缺損的表淺部位觀察到較淡的螢光信號，且擴散距離有限。結果表明，無論是基因轉染表達的強度、被轉染細胞的數量還是轉染所及的範圍，應用納米核酸傳遞體系的結果都要明顯好於裸露DNA對照組。
5、納米核酸轉運複合物動物體內轉染促進軟骨損傷修復的試驗
實驗動物選取成年紐西蘭大白兔24隻，體重2.5-3.5kg，均為雌性。隨機分為甲，乙兩組，每組均為12隻，分別對應為軟骨損傷後關節腔內注射的不同藥物。甲組左膝注射納米核酸傳遞體系，右膝注射裸露DNA作為對照；乙組左膝注射納米核酸傳遞體系，右膝注射生理鹽水作為對照。
方法按照納米核酸轉運複合物動物體內轉染軟骨細胞試驗(實驗4)的方法構建關節軟骨缺損模型，12隻兔共形成膝關節軟骨缺損24個，左右對稱，由同一名外科醫生於一天內完成。
取實施例12所得的含有hTGF-β1的N/P＝4∶1的納米核酸傳遞體系，含有pEGFP質粒DNA20μg。
將上述新配鮮配製的納米核酸傳遞體系以及對照藥物，於兔膝關節軟骨缺損模型構建完成後，即刻注射入相應的膝關節腔內。並於第一次注射後，每隔一個月重複注射一次，直至實驗結束，每次注射前均以生理鹽水徹底衝洗關節腔。在首次注射後第三個月和第六個月時，從各組中隨機抽出6隻動物處死，取膝關節標本固定切片，進行大體標本觀察、病理組織學評價以及免疫組織化學染色。
結果(1)動物一般情況無感染，無死亡，無其他異常改變。
(2)大體標本觀察如圖7(a)和圖7(b)所示納米核酸傳遞體系注射組如術後三個月時，軟骨缺損區被透明軟骨樣組織所填滿，並與周圍原有的軟骨組織色澤一致，觸之質地堅實，與周圍組織連接緊密，無明顯界線。術後六個月時，關節外觀接近正常關節，幾乎分辯不出缺損部位，無肉眼可見的關節退變徵象。
注射裸露DNA對照組術後三個月時，軟骨缺損處僅見新生的灰白色半透明組織，基本上填滿缺損處，觸之質地偏軟，有纖維感，與周圍組織界線清。術後六個月時，修復組織仍未完全填滿缺損，並可見中等程度的關節軟骨退變，表現為關節表面毛糙，關節軟骨軟化，纖維樣變等。
注射生理鹽水對照組術後三個月時，軟骨缺損處僅見灰白色瘢痕樣組織，尚未填滿缺損處，觸之稍硬，與周圍織組界線清。術後六個月時，缺損部位未見近一步的修復，關節軟骨退變嚴重，表現為關節表面不平整，關節軟骨「蟹肉」(crab-meat)樣變，以及關節變形等。
(3)病理觀察如圖7(c)～(h)、圖7(i)～(j)和圖7(k)～(l)所示納米核酸傳遞體系注射組術後三個月時，軟骨缺損區所填充的組織與周圍軟骨組織結構接近，可見軟骨細胞呈典型的四層分布，與周圍軟骨組織連接好，部分區域可見軟骨與軟骨下骨結合部位有「潮線」出現，是修復理想時的標誌之一。在修復的軟骨組織中，細胞位於基質所形成的陷窩內，基質可為甲苯胺蘭所著色，軟骨織組特異性的二型膠原的免疫組織化學染色顯示基質中含有大量的二型膠原。hTGF-β1的免疫組織化學染色顯示位於缺損區域及周邊的軟骨細胞廣泛被轉染，並表達大量的TGF-β1蛋白，顯色劑顯色後可見多量棕黃色顆粒沉著。未見關節退變表現。術後六個月時，修復的組織已接近周圍的組織，缺損修復區域及周圍的軟骨未見明顯退行性變。
注射裸露DNA對照組術後三個月時，軟骨缺損處所填充的組織為纖維結締樣組織，與周圍組織連接不良。在修復的軟骨組織中，細胞散在於基質中，基質被甲苯胺蘭輕度著色，軟骨織組特異性的二型膠原的免疫組織化學染色顯示基質中只有很少量的二型膠原。hTGF-β1的免疫組織化學染色顯示只有位於缺損及周邊表面的少量細胞被轉染，表達少量的TGF-β1蛋白。缺損區域附近的軟骨可見輕度地磨損表現，其餘部分未見明顯的繼發性退行性變表現。術後六個月時，缺損修復區域及周圍的軟骨可見明顯退變表現，鏡下見局部細胞減少，甲苯胺蘭染色失染，軟骨表面呈絮狀或層狀改變。
注射生理鹽水對照組術後三個月時，軟骨缺損處所填充的組織為纖維瘢痕樣組織，附著於缺損底部。在其中少見細胞成分，基質不被甲苯胺蘭所著色，軟骨織組特異性的二型膠原的免疫組織化學染色顯示其中基本無二型膠原成分。hTGF-β1的免疫組織化學染色顯示無TGF-β1蛋白表達。此時即可見較為嚴重的軟骨退行性變。術後六個月時，退變加重，呈現早期創傷性關節炎表現，鏡下見整個關節軟骨表面非常不平整，細胞丟失，基質纖維化，不被甲苯胺蘭所著色，部分區域可見軟骨缺失，軟骨下骨暴露。
結果表明，本發明的納米核酸傳遞體系對於動物體關節軟骨缺損模型具有良好的促進修復作用，通過早期、高效、安全地將一定劑量的生長因子基因傳輸到軟骨缺損部位，表達相應的生長因子蛋白，促進了關節軟骨修復速度，提高了修復的質量，同時減少了退行性變等軟骨損傷繼發性改變的發生的程度。
6、納米核酸轉運複合物動物體內轉染安全性試驗實驗動物選取成年紐西蘭大白兔一隻，體重1.5kg，雌性。
方法按照納米核酸轉運複合物動物體內轉染軟骨細胞試驗(實驗4)的方法構建關節軟骨缺損模型。
按實施例11的方法配製10倍於實施例11的核酸劑量的納米核酸傳遞複合物體系以檢測有無異位轉染。
將上述新配鮮配製的納米核酸傳遞體系於兔膝關節軟骨缺損模型構建完成後，即刻注射入其一側膝關節腔內。注射後72h，處死實驗動物，取出心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器包埋後冰凍切片，置於螢光顯微鏡下觀察，通過檢測綠色的pEGFP質粒表達的產物來判斷有無異位轉染現象發生。結果顯示動物未見有異常表現，所有標本均未觀測到有綠色螢光，這表明該納米核酸傳遞體系用於關節腔內注射未造成異位轉染，是一種安全的基因傳遞方法。
權利要求
1.一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物，其特徵在於該複合物包括低分子量殼聚糖和核酸，其中低分子量殼聚糖的分子量為5KD～100KD，氨基百分含量為30％～70％；複合物中的N/P為0.2∶1～10∶1。
2.根據權利要求1所述的複合物，其特徵在於低分子量殼聚糖的分子量為15KD～25KD。
3.根據權利要求1所述的複合物，其特徵在於低分子量殼聚糖的氨基百分含量為45％～60％。
4.根據權利要求1所述的複合物，其特徵在於複合物中的N/P為3.5～5.5∶1。
5.根據權利要求1所述的複合物，其特徵在於所述的核酸為pSV-β-Galactosidase質粒、pEGFP質粒、hTGF-β1質粒、反義核酸、幹擾RNA、小RNA或核酶。
6.一種權利要求1所述的用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物的製備方法，其特徵在於按以下步驟進行(1)低分子量殼聚糖的製備取高分子量殼聚糖，加入HCl溶液，在90～110℃並攪拌下反應5～50小時，冷卻後紙過濾，用無水乙醇洗滌濾液後，將沉澱物乾燥，溶於水中進行凍幹，得到白色粉末狀低分子量殼聚糖；(2)分別用生理鹽水配製濃度為0.1～1mg/ml的低分子量殼聚糖溶液和5～50μg/ml的核酸溶液；(3)將核酸溶液按N/P為0.2∶1～10∶1的比例加入低分子量殼聚糖溶液中，振蕩5～20秒，室溫靜置10～100min，獲得用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物顆粒。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於低分子量殼聚糖溶液的濃度為0.3～0.8mg/ml，核酸溶液的濃度為15～30μg/ml。
8.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於高分子量殼聚糖與HCl溶液的質量體積比為1∶20～30g/mL，HCl溶液的濃度為3～5M。
9.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中靜置時間為15～40min。
10.權利要求1～5中任一項所述的複合物在製備治療關節軟骨缺損藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於關節腔內注射治療軟骨缺損的非病毒納米核酸轉運複合物，包括低分子量殼聚糖和核酸，其中低分子量殼聚糖的分子量為5KD～100KD，氨基百分含量為30％～70％；複合物中的N/P為0.2∶1～10∶1。本發明將高分子量殼聚糖降解為低分子量殼聚糖，不僅增加了材料的水溶性，降低了溶液的粘度，同時也減少了作為溶劑的酸性環境對細胞的影響；與核酸作用所形成的複合物尺寸進入了納米範圍，有利於對關節軟骨細胞進行基因傳遞；還可保護目的核酸不被關節液中和溶酶體中的核酸酶降解。本發明製備過程簡單，適用範圍廣泛，能很好地解決在無需手術、無需複雜設備及無需支架材料和種子細胞輔助條件下軟骨修復的技術難題。
文檔編號A61K48/00GK101085357SQ200710024750
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月29日 優先權日2007年6月29日
發明者趙建寧, 王瑞, 郭亭, 張峻峰 申請人:中國人民解放軍南京軍區南京總醫院